JPH03505920A

JPH03505920A - 検出方法

Info

Publication number: JPH03505920A
Application number: JP50570489A
Authority: JP
Inventors: スハスフォールト，リハルドス　ベルナルドス　マリア; グレーフェ，ヤン; コーイマン，ロブ　ペーテル　ヘルマン; ベルクフェルト，ピート
Original assignee: ユニバーシテイト　ツヴェンテ
Priority date: 1988-04-26
Filing date: 1989-04-26
Publication date: 1991-12-19
Also published as: EP0413742A1; NL8801073A; WO1989010556A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】紅１本発明は、試験サンプル中において互いに特異結合する二つ以上の物質量の反応の成分を、該反応の生成物が結合する電極の応答に基づいて分析する方法に関する。かような方法は、米国特許公報第４，０２０，８３０号に記載されている。

そこに記述されている方法は、特に、イオン、酵素、抗体、抗原の濃度を測定するために用いられる。該方法においては、イオンに感応するイオン選択電界効果トランジスタ（１ｏｎ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｆｉｅｌｄ　ｅｆｆｅｃｔ　ｔｒａｎｓｉｓｔｏｒ　：　Ｉ　Ｓ　Ｆ　Ｅ　Ｔ　）が電極として使用されている。

かような方法は、直接的な分析を可能にするために開発されたものであり、測定すべき物質と測定プローブとの相互作用の結果としてプローブ内に直接測定可能な物質的な変化を生じさせるもので、これは、例えば、医療診断の場合に有力である。医療診断において重要な物質の代表例としては、通常、病気の症候、感染有機体等に関連する抗原または部分抗原と、それに対抗する抗体またはその断片のような免疫化学的に活性である物質がある。一方の抗原または部分抗原と、他方の対抗する抗体または断片は、互いに特異反応することができる。

かような免疫化学反応に関与する成分を決定するために、検出可能な物質を結合した少なくとも１個の反応成分に対して間接分析方法が一般に用いられる。検出可能な物質は−過常１次に放射性原子（ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏ−ｉｍ＋１ｕｎｏａｓｓａｙ）の場合）、酵素（酵素イムノアッセイ（ｅｎｚｙｍａｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）の場合）または赤血球、ラテックス粒子、金属ゾル粒子または色素粒子（凝集アッセイ（ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎａｓｓａｙ）の場合）で標識される。これら全ての間接法の欠点は、時間がかかることである。

（免疫化学的な）特異反応を直接かつ迅速に記録することは不可能である。

文献（米国特許第４，２３８，７５７号および３，９６６．５８ｏ号）に記述されているｌ５ＦＥＴによる直接分析法においては、化学的に選択性を有する膜を被検出成分と反応する免疫化学成分を含有しているｌ５ＦＥＴのくゲート〉ゾーンに付着させる。それ故にＩＭＦＥＴなる術語が用いられる。

しかしながら、かような装置は１分析する免疫化学成分の存在量に関し、信頼でき明瞭で再現性のある測定信号をもたらさないことは明かである。（Ｃｏｌｌｉｎｓ　＆　Ｊａｎａｔａ（１９８２）、分析臨床学会報１３６号、９３−９９頁）。

相互に特異結合する２つ以上の物質量の反応成分を、例えば、前記のｌ５ＦＥＴのようなイオン感知電極を用いて分析するための改良方法が発見された。この方法は、定量分析される成分を少なくとも一つの特異結合物質とともに温室（ｉｎｃｕｂａｔｅ）するが、この特異結合物質を１置以前に、電極に結合させるか、或は、被検出成分と共に湿態後、反応生成物を電極に結合させ、次に、この電極を異なるイオン組成液に連続して曝露し、イオン組成液の取り替えにより惹起された膜電位の変化を測定し、この変化をサンプル中の分析成分の型と量の測定値とすることを特徴とする。

この電極は、特異結合物質が結合する側を特に、異なるイオン組成液に被爆させる。好適な実施例の場合、電解液を変えることにより異なるイオン組成を得る。

前記の電位変化は、例えば、塩組成の変化後の経過時間の関数として測定でき、あるいは、例えば、前記変化後の一定時点において測定してもよい。特に、電極は最初は腹側、即ち、特異結合する物質が結合する電極側に配置した原塩溶液と平衡状態にあり、塩組成の変化後に平衡状態が再び達成されることが発見された。しかしながら、電極が特異的に感応するどのイオンの濃度も、測定の全過程を通して一定に保つことが望ましい。これは、例えば、ｐＨ検出ｌ５ＦＥＴを使用した場合は、溶液組成変化に係わりなくｐＨ値を一定に維持しなければならず、また１例えば、Ａ　ｇ　／　Ａ　ｇ　Ｃｌ電極を使用する場合は、塩素（Ｃ１）イオン濃度を実験の全過程を通し一定に維持しなければならないことを意味する。また、例えば、免疫化学的な理由からこのｐＨ値を一定に維持しなければならない場合もある。

本発明による方法においては、新しい濃度は、電極側の膜上において徐々に均一になり、一方、溶液の塩濃度は変化し続けるが、しかし、発生した成る特定の特異結合反応の特性を示す膜の帯電状態の結果、陽イオンと陰イオンは電極を取り囲む媒質中に同一速度では拡散しないことは、１１！察した現象を説明しなくとも確実に推定出来よう。この結果、膜の電位は過渡的に発生し、電位の形状は１例えば、最大振幅、幅、上昇及び下降時間の点において、固有な膜の帯電状態であり、従って分析成分の特有な型と量を示すものである。

電位の過渡的な変化の形状は、電極を被爆させるイオンの変化前と変化後の濃度と濃度差、濃度が変わるイオンの型。

膜厚及び試験液のｐＨ値に依存する。

ここで、く膜〉とは、電極上に付着して電解液中の電荷担体の少なくとも一部分を伝導出来、また、被検出成分と特異結合する成分を含んでいる層を意味する。

これは５特異結合する一つまたは複数の成分よりなる単分子層であってもよく、また、一つまたは複数の特異結合する成分と不活性物質との混合物よりなる層としてもよい。

被測定成分により、異なるイオン濃度、濃度変化の規模と方向、試験溶液の緩衝作用およびｐＨ値を、測定速度と精度に関する要求ならびに条件にあわせて調節することが出来る。

塩組成を変化させること自体は１種々の方法で、異なるＰＨ値において任意に反復実施出来る。電極は１例えば、サンプル内に湿態後２つ以上の塩溶液に連続して浸せきさせるか、あるいは、異なる組成の塩溶液を連続流セル中で電極上に流してもよい。電極を最少寸法にすることにより、測定速度並びに測定液の所要容積に有利な効果が得られる。発生電極を用いて電気化学的に液の組成に影響を与えることも出来る。かように、ｌ５ＦＥＴの場合、例えば、ゲートの回りにリング電極を付加して急速で局部的なｐＨ値の変化を電量分析的に発生させることが出来る。かような方法は、特異結合を中和させる（電極の再生）ためにも使用することが出来よう。

イオン組成は、追加金属カップル用い、例えば、短絡させて、膜の内または付近にイオンを発生させる電気化学的方法により変化させることも可能である。いわゆるアクチュエータである、かようなカップルを電極上に装着できる。Ｚｎ／Ａｇ−ＡｇＣ１のカップルは、かような一体型電極の例である。一体型電極の長所は異なる塩溶液を使用する必要がなく、測定環境中に随意直接導入できることである。

この発明は、また、特異結合する物質が結合する電極に関する。

本発明による方法において使用する好適な電極は、特に、例えば、先に記述したｌ５ＦＥＴ（米国特許第４，０２０゜８３０号）、Ａｇ／ＡｇＣ１電極、ガラス電極等のようなイオン検知電極である。いわゆるＲＥＦＥＴも、また、試験液の組成と濃度に関係なく該試験液と安定した接触を実現し得るならば、使用できる（米国特許第４，２６９，６８２号）。

一般的には、電位に感応し、好ましくは安定した作動点を有する電極が適している。

本発明による方法において使用する（イオン検出）電極には、例えば、ある特定の蛋白質の特異吸収により、膜を予備処理後随意に被覆することができる。この任意の膜準備状態を本発明において記述せる検出方法で試験することも可能である。膜内または膜上の固有の電荷は、サンプルからの互いに特異結合する二つ以上の物質量の反応の結果であり、被検出成分の結合相手は事前の準備段階において（固定化した）膜内または膜に結合されていたものである。この結合相手を、例えば、共有結合式に電極に直接結合させることもまた可能である。

本発明による方法は、免疫反応物質（抗体−抗原）の分析にも有利に用いられる。さらに、核酸（ＤＮＡプローブ。

ＲＮＡプローブ）および電極上に形成せる膜内に固定化されるか又はパリノマイシンのように（共有的に）直接結合される他の特異結合物質または複合物質、または特異イオン検出用のクラウンエーテル、酸素用のヘモグロビンを本発明による方法において有利に使用することが出来る。帯電標識を付けることにより中性物質を検出することも可能である。かようにして、例えば、黄体ホルモンを分析出来る。

〈電解液の濃度変化〉は前記の通り、電位の変化を生み出すが、その電位変化の形状は膜により錯化されたイオンまたは分子の型および量に関し固有である。

本発明による方法は、従って、定性分析と定量分析の両者を兼ねる。各々をもう１つの特異結合物質で処理した一連の電極を使用することにより、対応する一連の関連物質を分析することが出来る。

本方法により成分分析するサンプルは、例えば、土壌サンプル、微生物、野菜または動物を起源とするサンプルのように、生物サンプルでも非生物サンプルであってもよい。もし望むらな、上記タイプのサンプルの一つからの抽出物または分画物（ｆｒａｃｔｉｏｎ）でもよい。動物を起源とする成分を検出する場合、特に１体液、細胞物質または、例えば、その排出物または抽出物をサンプルとして使用出来る。

本発明による方法においては、溶液の組成変化に応答しない基準電極、例えばカロメル電極を、試験液中で使用することが必要である。しかしながら、２本の同一タイプの測定電極を使用する場合は、１本の電極に前記の内の１つの型の結合相手を任意に膜状に塗布し、もう１本の電極はブランクにして、電位差を測定することが出来、この場合は、基準電極に対する安定条件は適用されない、不安定な電極電位は、電位差測定における共通信号として自動的に消去されるので。

基準電極は、例えば、貴金属製としてもよい。完全な電極構成、即ち、１本の被覆電極と、１本のブランク電極と、１本の金属基準電極を、調べるサンプルと共に同時に湿態し１次に、塩組成の異なる複数の溶液に、共に被爆させる９本発明による方法は、非特異結合または吸収を示すサンプルの分析にもまた有効である１分析される成分による電位変化は、特異結合物質を被覆した電極と、非特異結合物質を被覆した電極の電位差を測定することにより得られる。

失−胤一叢上述の方法を用いて、ｌ５ＦＥＴ　（イオン選択電界効果トランジスター）のゲート領域上の抗体のみの存在と、該ゲート領域上の抗体と抗原の免疫複合体の存在を、下記に述べるように区別した。

１、ゲート領域上の抗体のみの検出１ミリリットル当り１．２ミリグラムの抗ヒト血清アルブミンを含む溶液を１０マイクロリツトル、ピペットで２個のｌ５ＦＥＴの内の１個のｌ５ＦＥＴのゲート領域に移し、室温で１時間部属した０次に、２．５重量パーセントのグルタルアルデヒド溶液を１０マイクロリツトル、同じゲート領域にピペットで移し、室温で１５分間温１した。次に、両ゲート領域を蒸留水でよく洗い流し、（ａ　）　ｐｉ（６，４５のＯ，ＯＯ１ｍｏｌ／　Ｑ　ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衛液または（ｂ　）　ｐＨ７，０５のＯ，０Ｏ１ｎ＋ｏｌ／　Ｑ　ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衛液よりなるイオン濃度ショック媒質１の中で室温で１時間放置し平衡状態にした。媒質１を、次に、（ａ　）　ｐＨ６，４５の０．１ｍｏｌ／　Ｑ　ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衛液または（ｂ　）ｐＨ７，０５のＯ，１ｍｏｌ／　Ｑ　）ＩＥＰＥｓ／Ｎａ０）１緩衛液よりなるイオン濃度ショック媒質２に即時に取り替えた。イオン濃度ショック媒質交換後直ちに２個のｌ５ＦＥＴのゲート領域間の電位差を、ソースとドレーン間の電流を一定にし、時間の関数として記録した（第１図（ａ）、（ｂ）参照）。

２、ｌ５ＦＥＴ対のゲート領域上の免疫複合体の検出１ミリリットル当り１．２ミリグラムの抗ヒト血清アルブミンを含む溶液を１０マイクロリツトル、ピペットで２個″のｌ５ＦＥＴの内の１個のｌ５ＦＥＴのゲート領域に移注し、引続きただちに、１ミリリットル当り１．２ミリグラムのヒト血清アルブミンを含む溶液をさらに１０マイクロリツトル移注した。この混合物を室温で１時間部属し、その後、先の第１項に記述した同じ方法をグルタルアルデヒド溶液での湿態より始め実施した。２つのゲート間で記録された電位差を第１図（ａ）、（ｂ）に示しである。

第１図は、タンパク質を被覆したｌ５ＦＥＴのゲートとタンパク質を被覆していないｌ５ＦＥＴのゲート間の電位差（ΔＶ）を、イオン濃度ショック後に時間の関数として記録マたものである。

（ａ）はｐＨ６，４５のイオン濃度ショック媒質の場合（ｂ）はｐ）１７．０５のイオン濃度ショック媒質の場合で、実線は、タンパク質＝ヒト血清アルバミンと抗ヒト血清アルバミンの複合体の場合を示し、破線は、タンパク質＝抗ヒト血清アルバミンだけの場合を示す。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１．特許出願の表示国際出願番号　ＰＣＴ／ＮＬ　８９１０　ＯＯ２９２、発明の名称検　　　出　　　方　　　法３、特許出願人住　所　　　　オランダ、７５ｏＯ工−イーエンセデドリエネル口、ピー、オー、ボックス２１７名　称　　　ユニバージティト　ツヴエンテ代表者　ヴアンルーケレンカンパーコニ、カレル国　籍　　　オランダ４、代理人住　所　　　　〒２３１　神奈川県横浜市中区不老町１−２−１中央第６関内ビル１００１５、補正書の提出年月日１９９０年４月１０日６、添付書類の目録補正書の写しく翻訳文）　　１通相互に特異結合する２つ以上の物質量の反応成分を、前記のｌ５ＦＥＴのようなイオン感知電極を用いて、例えば、電位を測定することにより、分析するための改良方法が発見された。この方法は、定量分析される成分を少なくとも一つの特異結合物質とともに湿態（ｉｎｃｕｂａｔｅ）するが、この特異結合物質を部属以前に、膜を介して電極に結合させるか、或は、被検出成分と共に湿態後、反応生成物を膜を介して電極に結合させ、次に、この電極を異なるイオン組成液に連続して曝露し、イオン組成液の取り替えにより惹起された膜電位の変化を、第２の電極を基準として測定し、この変化をサンプル中の分析成分の型と量の測定値とすることを特徴とする。

ここで、〈膜〉とは、電極上に付着して電解液中の電荷担体の少なくとも一部分を伝導出来、また、被検出成分と特異結合する成分を含んでいる層を意味する。

これは、特異結合する一つまたは複数の成分よりなる単分子層であってもよく。

また、一つまたは複数の特異結合する成分と不活性物質との混合物よりなる層としてもよい。

稲」ヨし拐ｋｆＩＬｌ求ｍ（１）（補正された）　試験サンプル内において互いに特異結合する２つ以上の物質量の反応の成分を、該反応の生成物が結合する見上生電極の応答に基づき分析する方法において、分析する成分を少なくとも１つの特異結合物質と共に湿態し、前記特異結合物質は湿態前に１１介旦工前記電極に結合しているか、あるいは、前記反応生成物を分析する成分と共に湿態後前２膜を介し前記電極に結合させ、次に、前記電極を異なるイオン組成に続けて被爆させ、該イオン組成の交換により生じた前記膜の電位変化を　２の　　と　　して測定し。

該変化が前記サンプル中の分析成分の型と量の測定値であることを特徴とする方法。

（２）前記の異なるイオン組成が異なる電解液であることを特徴とする請求項第１項に記載の方法。

（３）前記の異なるイオン組成を電気化学的なイオン生産により得ることを特徴とする請求項第１項に記載の方法。

（４）前記の分析する成分が免疫反応成分であることを特徴とする請求項第１項乃至第３項のいずれか１項に記載の方法。

（５）前記の分析する成分が核酸であることを特徴とする請求項第１項乃至第３項のいずれか１項に記載の方法。

（６）　（９）　　特異結合物質も反応生成物も結合しない第３の電極を電位の変化を差として測定するために使用することを特徴とする請求項第１項乃至第５項のいずれか１項に記載方法。

（７）（１久にエム）　　非特異結合物質が結合する第３の電極を電位の変化を差として測定するために使用することを特徴とする請求項第１項乃至第５項のいずれか１項に記載の方法。

（８）（補正されたクレイムロ）　特異結合物質がｍ互結合し、金属カップルのような二」ＬΩ」Ｌ虱逼」１材−を装備し、カップル　　　にノなくとも１１カツプルの　　の　　がでイオンの　　　なし′ることを特徴とする請求項第３項に記載の方法において用いる電極。

国際調査報告国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

（１）試験サンプル内において互いに特異結合する２つ以上の物質間の反応の成分を、該反応の生成物が結合する電極の応答に基づいて分析する方法において、分析する成分を少なくとも１つの特異結合物質と共に温置し、前記特異結合物質は温置前に前記電極に結合しているか、あるいは、前記反応生成物を分析する成分と共に温置後前記電極に結合させ、次に、前記電極を異なるイオン組成に続けて被爆させ、該イオン組成の交換により生じた膜の電位変化を測定し、該変化が前記サンプル中の分析成分の型と量の測定値であることを特徴とする方法。
（２）前記の異なるイオン組成が異なる電解液であることを特徴とする請求項第１項に記載の方法。
（３）前記の異なるイオン組成を電気化学的なイオン生産により得ることを特徴とする請求項第１項に記載の方法。
（４）前記の分析する成分が免疫反応成分であることを特徴とする請求項第１項乃至第３項のいずれか１項に記載の方法。
（５）前記の分析する成分が核酸であることを特徴とする請求項第１項乃至第３項のいずれか１項に記載の方法。
（６）特異結合物質が結合し、異なるイオン溶液を電気化学的に得るために、金属カップルを装備していることを特徴とする請求項第３項に記載の方法において用いる電極。