KR20010092728A - 포스파타제-표적 독소의 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 리간드가 고정되어 있는 고상 지지체를 (i) 독소에 오염된 것으로 추정되는 시료 및 (ii) 비고정 리간드와 접촉시키는 단계 - 여기서, 상기 고정된 리간드는 하나 이상의 상기 독소, 상기 비고정 리간드, 또는 상기 독소와 상기 비고정 리간드의 복합체와 결합할 수 있으며, 상기 비고정 리간드는 하나 이상의 상기 고정된 리간드, 상기 독소, 또는 상기 독소와 상기 고정된 리간드의 복합체와 결합할 수 있으며, 따라서 상기 독소가 결합된 상기 고정된 리간드, 상기 비고정 리간드, 또는 상기 독소와 상기 비고정 리간드의 복합체의 비율은 상기 시료 중의 독소의 함량에 따라 달라지며, 여기서 상기 고정된 리간드는, 복합체를 이루지 않는 경우, 상기 독소와 복합체를 이루는 경우, 상기 독소 및 상기 비고정 리간드의 복합체와 복합체를 이루는 경우 또는 상기 비고정 리간드와 복합체를 이루는 경우에 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있거나 또는 상기 비고정 리간드는 복합체를 이루지 않는 경우 또는 복합체를 이루는 경우에 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있음 -,
결합된 단편을 비결합 단편으로부터 분리하는 단계 및
고정된 리간드에 결합된 비고정 리간드(결합된 단편) 또는 수용액 중에서 복합체를 이루지 않는 비고정 리간드(비결합 단편)를 직접적 또는 간접적으로 결정하는 단계를 포함하며,
상기 (i) 및 (ii)는 고상 지지체에 순서에 관계없이 따로따로, 연속으로 또는 동시에 첨가할 수 있는, 단백질 포스파타제를 저해하는 포스파타제 표적 독소를 결정하는 분석 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 시아노박테리아 및 와편모조류(渦鞭毛藻類, dinoflagellate)와 같은 미세조류(microalgae)에 의해 통상적으로 생산되는 포스파타제-표적 독소를 검출하기 위한 분석 방법에 관한 것이다.
와편모조류는 통상적으로 단세포로, 편모가 2개인 광합성 조류이다. 몇몇 해양 와편모조류(예를 들어, 프로로센트룸(Prorocentrum) 종 및 디노피지스(Dinophysis) 종)는 사람이 섭취하게 되면 위장관 관련 질환을 일으키는 오까다산 및 디노피지스(dinophysis) 독소와 같은 포스파타제-표적 독소를 생산한다. 따라서, 이러한 조류로 식용 갑각류의 서식지가 오염되는 경우에는 문제가 될 수 있다.
또한, 흔히 청록색 조류라고 불리는 시아노박테리아도 광합성 생물이며 대체로 수생 생물로 근해, 외양 및 대양, 강, 호수 및 지표수에 서식하지만 육상에 서식할 수도 있고 낙엽층 및 토양에서도 발견된다.
많은 시아노박테리아 종 및 균주, 특히 마이크로시스티스(Microcystis) 종, 아파니조메논(Aphanizomenon) 종, 아나베나(Anabena) 종, 노둘라리아(Nodularia) 종 및 오실라토리아(Oscillatoria) 종은 사람 또는 다른 포유동물, 조류 및 어류가섭취하면 질병을 일으킬 수 있는 독소를 생산한다. 이 독소는 주로 2가지 경로, 즉 오염된 물을 마시거나 또는 오염된 해산 식품을 먹음으로써 섭취된다.
2가지 특정 유형의 독소가 시아노박테리아 및 와편모조류에 의해 생산된다. 신경독소, 예를 들어 아나톡신(anatoxin) 및 색시톡신(saxitoxin)은 개체에서 마비를 일으키기 때문에 이 증상을 흔히 마비성 패류 중독이라고 한다. 이 신경독소에 의한 중독은 드물지만 치명적인 것일 수 있다.
다른 형태의 독소는 체내의 세포에서 단백질 포스파타제 효소와 결합하고 그의 활성에 영향을 주어 단백질 기질을 탈인산화함으로써 이 효소를 실활화한다. 이러한 독소는 비교적 흔한 것이며, 몇몇 독소(예를 들어, 와편모조류 독소인 오까다산 및 디노피지스 독소)는 오심, 구토 및 설사를 일으킬 수 있기 때문에 이 증상을 흔히 설사성 패류 중독이라고 한다. 일부 단백질 포스파타제-표적 독소는 종양 촉진제이며 이 독소에 노출되면 암이 유발될 수 있다. 다른 독소, 예를 들어 시아노박테리아 독소인 마이크로시스틴 및 노둘라린은 간독성이며 간손상을 일으킨다. 가장 일반적인 포스파타제 표적 독소는 마이크로시스틴, 노둘라린 및 오까다산이다.
와편모조류 독소 중독의 가장 일반적인 공급원은 갑각류 및 어류의 간이며, 시아노박테리아 독소 중독의 가장 일반적인 원인은 오염된 식수 및(또는) 목욕물에 있다. 그러나, 시아노박테리아 독소 및 와편모조류 독소는 둘다 갑각류 및 물에 존재할 수 있다. 조류 독소 중독의 특히 일반적인 공급원은 홍합인데, 이는 홍합이 독소-생산 조류를 먹게 되면 조류 독소가 홍합에 축적되기 때문이다. 또한, 다른 갑각류, 예를 들어 굴, 대합 및 가리비도 영향을 받을 수 있다.
또한, 가정용수원은 그가 지하수로부터 비롯된 용수라면 시아노박테리아에 오염될 수 있으며, 따라서 독소 섭취에 대한 직접적인 경로를 제공한다.
조류 및 시아노박테리아를 고-단백질 건강 식품 및 다이어트 보조제로 섭취하는 것에 많은 우려가 된다. 채집된 조류 및 시아노박테리아가 독소 생산 균주에 의해 오염되었는지를 검사하는 공인된 지침은 없으며, 아나베나 및 아파니조메논과 같은 속(genus)의 균주를 판매하는 것은 이러한 균주들 중에서 독소 생산 균주가 많이 발견될 수 있기 때문에 특히 우려할 만한 일이다.
조류 독소에 노출됨으로써 유발되는 것으로는 단기간의 불쾌감, 의료 비용, 갑각류 산업에 있어서의 상업적 비용 및 작업 시간의 손실뿐 아니라, 상기 언급한 바와 같이 포스파타제 표적 독소인 마이크로시스틴 및 노둘라린은 종양 촉진제인 것으로 밝혀졌으며, 특히 알콜을 많이 섭취하거나 또는 많은 흡연은 임상 수준 또는 증상없는 수준으로 이러한 독소에 반복적으로 노출되면 암, 특히 간암에 걸릴 수 있을 것으로 생각된다.
현재, 조류 및 시아노박테리아 유래의 포스파타제 표적 독소를 검출 및 정량화하기 위한 많은 여러가지 방법이 있다. 한가지 표준 방법에는 홍합 또는 포스파타제 표적 독소의 다른 잠재적인 공급원을 잘게 부수어 잘게 부수어진 홍합 조직의 추출물을 마우스에게 주사하는 것이 포함된다. 그 후에, 마우스의 생존율과 상관관계가 있는 포스파타제-표적 독소의 오염 여부 및 오염 수준을 결정하였다[스타벨(Stabell) 등의 문헌[(1992), Food. Chem. Toxicol. 30(2):139-44]]. 분명히, 이 방법은 식품 안전성 및 품질 규제를 평가하는 방법으로는 시간 소모적이고 미숙하며 비용이 많이 드는 방법이다.
다른 방법에는 외부에서 포스파타제를 첨가하여 효소 활성의 저하를 측정함으로써 갑각류에서 포스파타제 표적 독소의 존재를 검출하는 것이 포함된다. 다시 말하면, 이 방법에는 홍합 또는 다른 갑각류의 조직을 잘게 부수고, 외부에서 첨가한 포스파타제를 방해하는 내생적인 포스파타제를 방출시키고, 테스트[심(Sim) 및 머지(Mudge)의 문헌[(1994) Detection Methods for Cyanobacterial Toxins Eds. Codd, Jeffries, Keevil and Potter, Royal Society of Chemistry]]의 감도 및 정확도를 조정하는 것이 포함된다.
따라서, 포스파타제-표적 독소, 특히 물, 갑각류 및(또는) 조류 또는 시아노박테리아의 식용 산물 중의 조류 및 시아노박테리아의 포스파타제-표적 독소를 정성적 및(또는) 정량적으로 결정할 수 있는 빠르고 민감하며 비용이 적게 드는 분석법 또는 방법에 대한 요구가 크다. 특히, 비교적 숙련되지 않은 사람 또는 전혀 숙련되지 않은 사람, 예를 들어 생선 장수 또는 수도 위생 설비 업자가 현장에서 수행할 수 있을 정도로 충분히 간단하며 분석을 수행하는데 있어서 실험 장비 또는 특수 시설이 필요치 않은 분석 방법이 필요하다.
따라서, 본 발명의 제1 측면으로, 본 발명은,
리간드가 고정되어 있는 고상 지지체를 (i) 독소에 오염된 것으로 추정되는 시료 및 (ii) 비고정 리간드와 접촉시키는 단계 - 여기서, 상기 고정된 리간드는 하나 이상의 상기 독소, 상기 비고정 리간드, 또는 상기 독소와 상기 비고정 리간드의 복합체와 결합할 수 있으며, 상기 비고정 리간드는 하나 이상의 상기 고정된 리간드, 상기 독소, 또는 상기 독소와 상기 고정된 리간드의 복합체와 결합할 수 있으며, 따라서 상기 독소가 결합된 상기 고정된 리간드, 상기 비고정 리간드, 또는 상기 독소와 상기 비고정 리간드의 복합체의 비율은 상기 시료 중의 독소의 함량에 따라 달라지며, 여기서 상기 고정된 리간드는, 복합체를 이루지 않는 경우, 상기 독소와 복합체를 이루는 경우, 상기 독소 및 상기 비고정 리간드의 복합체와 복합체를 이루는 경우 또는 상기 비고정 리간드와 복합체를 이루는 경우에 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있거나 또는 상기 비고정 리간드는 복합체를 이루지 않는 경우 또는 복합체를 이루는 경우에 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있음 -,
결합된 단편을 비결합 단편으로부터 분리하는 단계 및
고정된 리간드에 결합된 비고정 리간드(결합된 단편) 또는 수용액 중에서 복합체를 이루지 않는 비고정 리간드(비결합 단편)를 직접적 또는 간접적으로 결정하는 단계를 포함하며,
상기 (i) 및 (ii)는 고상 지지체에 순서에 관계없이 따로따로, 연속으로 또는 동시에 첨가할 수 있는, 단백질 포스파타제를 저해하는 포스파타제 표적 독소를 결정하는 분석 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 한 실시태양으로, 독소를 결정하는 것은 고정된 리간드와 직접적 또는 간접적으로 결합하지 못한 비고정 리간드를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 비고정 리간드가 고정된 리간드와 결합하는데 있어서 독소와 경쟁하는 경우, 비결합 리간드의 수준이 높다는 것은 독소의 농도가 높다는 것을 나타낸다. 비고정 리간드가 고정된 리간드에 결합된 독소와 복합체를 이룰 수 있는 경우, 비결합 리간드의 수준이 높다는 것은 독소의 농도 수준이 낮다는 것을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시태양으로, 독소를 결정하는 것에는 고정된 리간드와 직접적 또는 간접적으로 결합한 비고정 리간드를 결정하는 것이 포함된다. 독소 및 비고정 리간드가 고정된 리간드와 경쟁적으로 결합하는 경우, 결합된 리간드의 수준이 높다는 것은 독소 수준이 낮다는 것을 나타낸다. 비고정 리간드가 고정된 리간드에 결합된 독소와 복합체를 이룰 수 있는 경우, 결합된 리간드의 수준이 높다는 것은 독소의 농도 수준이 높다는 것을 나타낸다.
그러나, 본 발명의 방법에는 바람직하게는 포스파타제-표적 독소, 특히 조류 및 시아노박테리아의 독소를 검출하는 경쟁적 결합 분석법이 포함되며, 여기서 시료중에 존재하는 독소 분자는 고정된 리간드에 있는 제한된 수의 결합 부위를 놓고 비고정 리간드와 경쟁하며, 상기 시료중에 존재하는 임의 독소는 고정된 리간드의 결합 부위와 결합하거나 또는 결합하지 않는 비고정 리간드의 수준에 비례해 결정된다.
본 명세서에 사용된 것으로, "검출하는", "결정하는," 또는 "평가하는"이란 용어는 시료 중에 존재하는 포스파타제-표적 독소의 양 또는 농도에 대한 절대값을 구하는 의미로의 정량화, 및 반-정량적 및 정성적인 평가 또는 결정 모두를 포함한다. 존재하는 독소의 수준 또는 양에 대한 지수, 비율, 퍼센트 또는 몰수를 결정하거나 또는 다른 방법으로 시료 중 상기 독소의 존재 또는 부재를 간단히 수로 나타낼 수 있다. 본 발명의 바람직한 한 측면으로, 독소의 존재 또는 부재를 간단히 결정하거나 또는 독소의 존재를 반-정량적으로 측정한다. 여기서, 독소의 "부재"는 독소의 농도가 분석 방법의 검출 한계치보다 낮거나 또는 안전하거나 허용될 수 있는 것으로 생각되는 수준보다 낮은 것을 의미한다.
본 발명의 분석 방법에 사용된 시료는 아마도 포스파타제-표적 독소 생산 미생물에 노출됨으로써 포스파타제-표적 독소에 노출된 것으로 추정되는 임의 시료로, 예를 들어 물(해수, 담수, 지하수, 또는 호수, 강, 우물, 개울, 저수지 또는 가정용수원에서 채수한 물일 수 있거나, 또는 예를 들어 피펫을 사용한 단순 배수 또는 추출에 의해 갑각류로부터 추출한 수분 또는 갑각류가 빨아들인 물일 수 있음)이거나 또는 조류 또는 시아노박테리아에 의해 생산되거나 또는 이들로부터 생산된 식료품, 식품 첨가제, 영양 보조제, 대체 치료제 또는 유사 산물일 수 있다. 갑각류가 자유수를 포함하는 경우(예를 들어, 굴에서와 같이), 분석에는 흡습성 기재(고상 지지체)를 물에 담그는 것이 포함될 수 있다. 또는, 분석에는 간단하게 예를 들어 껍데기를 깨뜨려서 열리게 한 다음, 흡습성 기재를 갑각류의 축축한 살갗에 대고 누르는 것이 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면으로, 조사 대상 시료는 갑각류의 표면이거나 또는 갑각류에서 얻은 자유 수분이다.
본 발명의 분석 방법에는 모든 유형의 갑각류, 예를 들어 가리비, 참새우, 홍합 및 굴이 허용되지만, 본 발명의 바람직한 한 측면으로 갑각류는 홍합이다. 본 발명의 다른 바람직한 측면으로 조사 대상 시료는 상기 갑각류가 사는 서식지에서 채수한 물이며, 본 발명의 다른 바람직한 한 측면으로 시료는 가정용수원에서 채수한 물이다.
분석에 사용되는 시료는 본질적으로 무처리 방식으로 사용될 수 있지만, 경우에 따라 분석에 앞서 임의 공지된 방법에 의해 여과하거나 또는 물, 완충액 또는 임의 다른 수성 매질을 가하여 희석시킬 수 있으며, 예를 들어 분석에 앞서 냉각 또는 동결시킴으로써 저장 또는 보존할 수 있다.
본 발명의 방법에서는 고정된 또는 비고정 리간드로서 임의 독소 결합 리간드를, 예를 들어 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 또는 항체 단편, 예를 들어 F(ab), F(ab')2또는 F(v) 단편을 사용할 수 있다. 이 항체 또는 항체 단편은 1가 또는 2가일 수 있으며 하이브리도마 기술에 의해 생산되거나 또는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성법의 산물과 같은 합성 기원의 것일 수 있다. 예를 들어, 단쇄 항체 또는 다른 항체의 유도체 또는 모방체를 사용할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 임의 에피톱인 적합한 포스파타제-표적 독소의 성분 또는 구조에 대항해 지시되거나 또는 생성될 수 있다. 또는, 독소에 친화성을 지닌 화합물, 예를 들어 조합 화학법(combinatorial chemistry) 또는 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 특이적 결합체, 또는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 서열과 같은, 독소와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고펩티드 또는 폴리펩티드와 같은 작은 유기 분자 또는 펩티드를 사용할 수 있다.
그러나, 본 발명의 독소 결합 리간드는 단백질 포스파타제 효소인 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 결합 리간드 단백질 포스파타제 2A(pp2A)가 분석 방법에 사용된다.
마찬가지로, 본 발명의 방법에 사용되는 제2 리간드는 제1 리간드와 경쟁적 또는 비경쟁적으로 독소에 결합하는 임의 리간드일 수 있다. 또는, 제2 리간드는 제1 리간드와 결합하는 독소와 경쟁하는 임의 리간드일 수 있다. 바람직하게는, 제1 리간드는 독소 결합 리간드, 보다 바람직하게는 단백질 포스파타제 효소이다. 이러한 두 리간드 중 하나는 고정되어야 하고 다른 하나는 고정되지 않아야 하며 이들 중 하나는 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 것이어야 한다. 본 발명의 바람직한 한 실시태양에서, 비고정 리간드는 독소와 고정된 리간드의 결합을 경쟁적으로 저해하며 검출가능한 신호를 직접적 또는 간접적으로 발생시킬 수 있어야 한다는 기능적인 요건을 충족시켜야 하는 것으로, 예를 들어 비고정 리간드는 임의 알려진 형태의 잔기를 형성하는 직접적 또는 간접적인 신호를 사용하여 표지할 수 있는 분자일 수 있다. 이러한 리간드는 마찬가지로 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있는 항체, 또는 예를 들어 F(ab), F(ab')2또는 F(b) 단편과 같은 항체 단편의 형태를 띨 수 있다. 이 항체 또는 항체 단편은 1가 또는 2가일 수 있으며 하이브리도마 기술에 의해 생산되거나 또는 재조합 DNA 기술 또는 화학 합성법에 의한 합성 기원의 것일 수 있다. 예를 들어, 단쇄 항체 또는 다른 항체 유도체 또는 모방체, 및 조합 화학법 또는 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 작은 유기 분자, 펩티드, 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 사용할 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 임의 에피톱인 포스파타제-표적 독소 분자의 성분 또는 구조, 또는 적합한 포스파타제 표적화 분자와 결합하는 리간드에 대항해 지시되거나 또는 생성될 수 있다. 또는, 이러한 독소, 또는 독소와 결합하는 리간드에 대해 친화성을 지닌 화합물, 예를 들어 독소 또는 독소와 결합하는 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 작은 유기 분자 또는 펩티드, 예를 들어 올리고펩티드 또는 폴리펩티드, 조합 화학법 또는 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 특이적 결합체, 또는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합하는 서열을 사용할 수 있다.
이러한 리간드 중 하나가 함유하는 리포터 잔기는 일반적으로 직접적으로 검출가능한 잔기, 예를 들어 금속 졸(metal sol)(예를 들어, 골드 졸), 크로모포르(chromophore) 또는 플루오로포르(fluorophore)(예를 들어, 시아닌, 프탈로시아닌, 메로시아닌트, 트리페닐메틸, 에퀴난스 등)[문헌[Topics in Applied Chemistry, Infrared Absorbing Chromophores, edited by M. Matsuoka, Plenum Press, New York, NY, 1990], 문헌[Topics in Applied Chemistry, The Chemistry and Application of Dyes, Waring et al. Plenum Press, New York, NY, 1990], 및 문헌[Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Haugland, Molecular Probes Inc. 1996] 참조], 방사 표지, 효소, 자성 입자, 혼탁 유도 물질 등이거나 또는 이미 이러한 직접적으로 검출가능한 잔기를 함유할 수 있다. 고정된 리간드가 리포터 잔기를 함유하는 경우, 리포터 잔기는 일반적으로 리간드가 복합체화되는 경우에 결합 부위가 활성화되거나 또는 보다 일반적으로 실활화되는 직접적으로 검출가능한 잔기에 대한 결합 부위일 것이다.
바람직하게는, 리포터 잔기는 비고정 리간드가 함유한다.
본 발명의 바람직한 한 실시태양에서, 비고정 리간드는 예를 들어 표지된 효소, 또는 크로모포르 또는 플루오로포르 표지된 펩티드 간독소, 예를 들어 노둘라린, 마이크로시스틴 LC 또는 마이크로시스틴 YR 또는 오까다산으로부터 선택된 간독소이다.
방사표지로 표지할 수 있는 경우, 분석은 주로 비전문 사용자가 현장에서 사용하기 위한 것이기 때문에, 눈에 보이는 신호를 나타내는 리포터 잔기, 예를 들어 크로모포르, 플루오로포르, 인광성 잔기, 혼탁 유도 물질, 가스 방출 유도 물질 등을 사용하는 것이 바람직하다.
신호 형성 잔기가 리간드 중 하나의 결합 부위에 결합하는 물질인 경우에는 이 잔기를, 경우에 따라 결합된 단편 또는 비결합 단편을 분리한 다음에 결합된 단편 또는 비결합 단편과 접촉시키는 것이 이로울 것이다.
일반적으로, 신호가 결합된 단편으로부터 유도되는 것인 경우, 기재를 예를 들어 물로 헹굼으로써 리간드가 검출되거나 또는 생성되어 검출되기에 앞서 비결합 단편을 씻어내는 것이 바람직할 것이다.
본 발명에서는 포스파타제-표적 독소를 생산하는 조류 또는 시아노박테리아의 어떤 종 또는 균주라도 사용할 수 있지만, 특히 시아노박테리아의 독소 생산 균주, 예를 들어 마이크로시스티스 애로기노사(Microcystis aeroginosa), 아나베나 종, 노둘라리아 스푸라게나(Nodularia spuragena) 및 아나베나 플루스-아쿠애(Anabena flus-aquae) 또는 조류를 사용할 수 있다. 따라서, 예를들어 독소 마이크로시스틴-LR 및 마이크로시스틴-YR은 마이크로시스티스 종에 의해 생산되고 독소 노둘라린은 노둘라리아 종에 의해 생산되며 독소 오까다산은 프로로센트룸 종에 의해 생산된다.
본 발명의 방법에 의해 결정되기 쉬운 독소는 마찬가지로 조류 또는 시아노박테리아에 의해 생산되는 임의 포스파타제-표적 독소일 수 있지만, 바람직한 측면으로는 펩티드 독소는 간독소(그 중에서, 마이크로시스틴 및 노둘라린이 가장 일반적임) 또는 오까다산이다.
따라서, 가장 일반적으로는 본 발명의 방법에는 간단하게 포스파타제-표적 독소로 오염된 것으로 추정되는 시료를, 리간드의 결합 부위에 대해 상기 독소와 경쟁할 수 있는 독소 결합 리간드 및 리포터 분자(조사 대상 시료에 노출되기에 앞서 결합 리간드와 임의로 결합함)와 동시에 또는 순서에 관계없이, 연속적으로 또는 따로따로 접촉시키는 단계 및 고상에 결합되어 있거나 또는 용액중에 유리되어 있는 리포터 분자를 측정하는 단계가 포함된다.
결합된 단편은 리포터를 평가하기에 앞서 임의 적합한 방법, 예를 들어 침전법, 원심분리법, 여과법, 크로마토그래피법, 모세관작용 또는 간단하게 배수하는 방법에 의해 비결합 단편으로부터 분리시킬 수 있다. 고상은 예를 들어 임의 알려진 형태의 딥스틱 또는 고상 매트릭스, 예를 들어 다이나비즈(Dynabeads(등록상표, Dynal AS사 제품))와 같은 고분자성 또는 자성 비드의 형태일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 독소 결합 리간드가 고정된 고상은 다이나비즈(등록상표)의 형태이다.
리포터 분자는 본 발명의 특정 실시태양에 따라 결합된 단편 또는 비결합 단편에 함유될 수 있는데, 바람직하게는 결합된 단편에 함유된다.
고정된 리간드는 임의 공지된 방법에 의해, 예를 들어 분리 또는 고정하는데 있어서 현재 폭넓게 사용되거나 또는 제안되는 임의 잘 알려진 고상 지지체 또는 매트릭스에 상기 리간드를 결합 또는 연결시킴으로써 고정시킬 수 있으며, 예를 들어 고상은 입자, 시이트, 겔, 필터, 막, 섬유 또는 모세관 또는 마이크로타이터 조각, 튜브 또는 웰의 플레이트 등의 형태를 가질 수 있으며 바람직하게는 유리, 실리카, 라텍스, 고분자 물질 또는 자성 비드를 소재로 만들 수 있다. 리간드를 고상 지지체에 결합시키는 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며 많은 문헌에 기재되어 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 포스파타제-표적 독소 결합 리간드가 고정되어 있는 고상은 다이나비즈(등록상표)의 형태이다.
본 발명의 분석 방법은 이점은 복잡한 실험 장비의 도움 없이도 분석을 수행할 수 있으며 비교적 숙련되지 않은 사람 또는 전혀 숙련되지 않은 사람도 분석을 수행할 수 있다는 점이다. 따라서, 본 발명의 분석 방법은 가정, 상점, 또는 많은 노력 또는 위험한 화학물질을 필요로 하지 않으면서도 이 방법을 빠르고 쉽게 수행할 수 있는 분야에 사용하기에 적합하다.
본 발명의 분석 방법의 구체적인 이점은 예를 들어 음료수를 시험하거나 또는 포스파타제 표적 독소의 오염 가능성을 평가하는데 있어서 독소가 매우 낮은 수준으로 존재하는 시료를 분석하는 경우에 결정적으로 중요한 것인 감도가 매우 높다는 것이다. 통상적으로, 이 분석 방법으로 피코몰 농도, 예를 들어 10 pM 정도의 낮은 농도의 독소를 검출할 수 있다. 바람직하게는, 이 분석 방법을 이용하여 15 내지 560 pM 농도 범위의 독소를 검출할 수 있다.
특히, 종래의 기술에 비해서 본 발명의 분석 방법의 추가의 이점은, 예를 들어 시료가 갑각류로부터 얻어지는 경우 분석 대상 시료중에 존재할 수 있는 내생적인 포스파타제의 존재에 의해 영향받지 않는다는 점이다.
본 발명의 한 실시태양에서, 단백질 포스파타제는 고상 지지체에 고정되고, 고정된 포스파타제는 조사 대상 시료와 접촉하며, 시료중에 존재하는 임의 포스파타제-표적 독소는 고정된 포스파타제와 결합한다. 포스파타제 결합 부위에 대해 독소와 경쟁하는 리포터 분자의 공급원이 첨가된다. 리포터 분자는 결합 부위로부터 독소 분자를 이동시키는데, 그 정도는 독소 분자 및 리포터 분자의 상대 농도에 따라 달라진다. 리포터 분자의 결합 정도로 조사 대상 시료중에 존재하는 독소를 쉽게 결정할 수 있다. 바람직한 리포터/표지에는 색발생성 또는 형광발생성 산물을 생성하는 방사표지, 크로모포르(플루오로포르를 포함) 및 효소가 포함된다. 신틸레이션 프록시머티(scintillation proximity) 표지 및 빛 산란으로 측정가능한 변화를 일으키는 표지도 고려할만 하다.
다른 실시태양에서, 고상 지지체에 고정되어 있는, 리포터에 의해 차단된 포스파타제 분자를 조사 대상 시료와 접촉시키면 시료중에 존재하는 임의 포스파타제-표적 독소는 포스파타제에 결합된 리포터 분자와 경쟁하여 이 분자들을 시료중에 존재하는 독소의 양에 비례하는 정도로 고상에서 수상으로 이동시킨다. 그 다음, 고상에 결합되어 있는 리포터 분자의 양을 평가하여 조사 대상 시료중에존재하는 독소를 쉽게 측정할 수 있다.
다른 측면에서 살펴보면, 본 발명은
리간드가 고정되어 있는 고상 및 바람직하게는 수용액중에 있거나 또는 고정된 리간드와 복합체를 이루는 비고정 리간드를 포함하며, 상기 고정된 리간드 및 비고정 리간드 중 어느 것도 직접 또는 간접적으로 검출가능한 잔기, 상기 고정된 리간드 및 비고정 리간드 중 하나와 결합하여 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 리포터 잔기(바람직하게는, 상기 검출가능한 잔기 또는 신호는 실험 장비 없이도 직접 판독할 수 있음)를 포함하지 않는 것인, 본 발명에 따른 시아노박테리아 또는 조류의 포스파타제-표적 독소를 검출하는 킷트를 제공한다.
바람직한 한 실시태양에서, 본 발명의 킷트는 포스파타제-표적 독소 결합 리간드가 고정되어 있는 고상, 및 포스파타제-표적 독소와 상기 독소 결합 리간드의 결합을 경쟁적으로 저해하며 실험 장비 없이도 판독할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있는 리포터 분자를 포함한다.
특히 바람직한 형태의 본 발명의 킷트는
단백질 포스파타제가 고정되어 있는, 자기력에 의해 이동가능한 고분자 미소구 및
상기 단백질 포스파타제와 결합하는 시아노박테리아 독소를 경쟁적으로 저해할 수 있는, 골드 졸로 표지된 펩티드 간독소 분자
를 포함한다.
보다 특히 바람직한 형태의 본 발명의 킷트는
단백질 포스파타제가 고정되어 있는, 자기력에 의해 이동가능한 고분자 미소구 및
상기 단백질 포스파타제와 결합하는 조류 독소를 경쟁적으로 저해할 수 있는, 골드 졸로 표지된 오까다산 분자
를 포함한다.
다른 바람직한 측면으로, 킷트의 사용에는 독소 결합 리간드가 고정되어 있고 경쟁적으로 결합하는 크로모포르(또는 플루오로포르 등)로 표지된 리간드로 포화되어 있는 다공성 셀룰로스 기재를 물 또는 갑각류 체액의 시료중에 담가서, 상기 포화된 기재를 미리 설정된 기간 동안 인큐베이션하고(시료로부터 제거하거나 또는 시료를 미리 설정된 부피로 제거함), 예를 들어 기재를 독소-무함유 물로 씻어내거나 또는 기재를 미리 설정된 기간 동안 미리 설정된 부피의 독소-무함유 물중에 담금으로써 결합되지 않은 표지된 리간드를 제거하고, 기재 또는 기재를 담근 물의 색을 조사하는 것이 포함된다. 바람직하게는, 기재를 바람직하게는 측정 색으로 표시한 지지체 상에 올려놓아 기재 또는 기재를 담근 물의 색 비교를 용이하게 함으로써 독소 농도를 결정하거나 또는 독소 농도가 하나 이상의 한계값보다 높은지 또는 낮은지를 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명에 대한 설명이지만, 본 발명은 이것으로 한정되지 않는다.
재료
마이크로시스틴 YR, 마이크로시스틴-LR, 오까다산, 노둘라린, 칼리쿨린 A 및 타우토마이신은 칼바이오켐(Calbiochem, San Diego, CA)사로부터 구입하였다. 담체-무함유 Na125I 및 [γ-32P]ATP는 아머샴(Amersham, Little Chalfont, UK)사에서 구입하였다. 알부민(RIA 등급), 암모늄 아세테이트, 클로라민 T, 디메틸 술폭시드(DMSO), 디티오에리트리톨(DTE), EDTA, EGTA, 글리세롤, Hepes, 히스톤 II-AS, 소듐 메타비술피트 및 트립신 저해제(대두)는 시그마(Sigma, St Louis, MO)사로부터 구입하였다. 아세토니트릴 및 트리플루오로아세트산(TFA)은 라트번(Rathburn, Walkerburn, Scotland)사로부터 구입하였다. 부분 정제된 단백질 포스파타제 2A는 업스테이트 바이오테크놀러지(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)사로부터 구입하거나 또는 레신크(Resink) 등의 문헌[Eur.J.Biochem. 133:455-461 (1983)]에 따라서 정제하였다.
마이크로시스틴-YR의 요오드화 반응
시차노버(Ciechanover) 등의 문헌[PNAS 77:1365-1368 (1980)]에 설명된 바와 같이 클로라민 T를 사용하여 마이크로시스틴 YR(10 ㎍)을 담체-무함유 Na125I(37 MBq)로 요오드화하였다. 요오드화 반응 후에, 룬네거(Runnegar) 등의 문헌[Toxicon 24:506-509 (1986)]의 방법에 따라 Sep-Pak(등록상표) Plus 카트리지(Waters, Milford, MA)를 사용하여 요오드 [125I]마이크로시스틴-YR로부터분리하였다. [125I]마이크로시스틴-YR을 크롬팩(Chrompack, Raritan, NJ)사의 3 ×250 mm 이너트실(Inertsil) ODS-2 HPLC 컬럼에 가하고 아세토니트릴 구배로 용출시켰다.
경쟁적 결합 분석
경쟁적 결합 분석을 50 mM Hepes(pH 7.2), 1 mM EDTA, 0.3 mM EGTA, 1 mM DTE, 5 mM MnCl2, 0.5 mgㆍml-1BSA 및 0.2 mgㆍml-1트립신 저해제로 완충된 0.5 ml의 부피로 수행하였다. 분석에서는 100 % DMSO 중에 희석된 조류 독소를 0-100 nM로 첨가하여 최종 농도를 10 % DMSO로 하였다. [125I]마이크로시스틴-YR(1 Ci/13 ng)을 35 pM으로 첨가하였다. 마지막으로, 단백질 포스파타제 2A(30 pM)를 첨가하고, 반응 혼합물을 얼음에서 밤새 인큐베이션하였다. 바이오-라드(Bio-Rad, Hercules, CA)사 제품인 0.7 ×15 cm 컬럼내에서 파마시아(Pharmacia, Uppsala, Sweden)사 제품인 세파덱스(등록상표) G-50 파인을 사용한 겔 여과법에 의해 단백질 포스파타제 2A에 결합된 [125I]마이크로시스틴-YR을 유리 [125I]마이크로시스틴-YR로부터 분리하였다. 이 분리는 1 mM EDTA 및 0.3 mM EGTA를 함유한 50 mM Hepes 완충액(pH 7.2)을 사용하여 4 ℃에서 수행하였다. 단백질 포스파타제 2A와 결합하는 [125I]마이크로시스틴-YR을 함유하는 분획을 수획하여 섬광계수법에 의해 방사활성을 정량하였다. 마이크로시스틴-LR을 과다(1 μM) 첨가한 대조 반응에서는[125I]마이크로시스틴-YR의 비특이적 결합을 조사하였다.
<실시예 1>
단백질 포스파타제 2A를 자성 비드에 연결시켰다(비드에 직접 연결하거나 또는 포스파타제의 비오티닐화를 통해 연결함). 그 후에, 고정된 단백질 포스파타제를 시료 및 방사표지된 독소(예를 들어, [125I]마이크로시스틴-YR)와 혼합하였다. 고정된 단백질 포스파타제를 자기력에 의해 반응 혼합물로부터 분리하였다. 섬광계수법에 의해 단백질 포스파타제(자성 비드)와 결합된 방사활성을 검출하였다. 단백질 포스파타제와 결합된 방사표지의 양은 시료중의 포스파타제 결합 독소의 작용에 따라 감소하였다.
<실시예 2>
단백질 포스파타제 2A를 자성 비드에 연결시켰다(비드에 직접 연결하거나 또는 포스파타제의 비오티닐화를 통해 연결함). 그 후에, 고정된 단백질 포스파타제를 시료, 및 착색된 비드에 연결된 독소와 혼합하였다. 고정된 단백질 포스파타제를 자기력에 의해 반응 혼합물로부터 분리하였다. 단백질 포스파타제(자성 비드)와 결합한 착색된 비드를 육안으로 또는 저배율 현미경(예를 들어, 니콘(Nikon) TMS)으로 평가하였다. 단백질 포스파타제(자성 비드)와 결합한 착색된 비드의 양은 시료중의 포스파타제 결합 독소의 작용에 따라 감소하였다.
<실시예 3>
단백질 포스파타제 2A를 자성 비드에 연결시켰다(비드에 직접 연결하거나 또는 포스파타제의 비오티닐화를 통해 연결함). 그 후에, 고정된 단백질 포스파타제를 시료, 및 고정된 효소를 함유하는 비드상에 고정된 독소와 혼합하였다. 이 효소는 색발생성 또는 형광발생성 기질과 함께 적절히 인큐베이션하게 되면 (착색되거나 또는 형광성의) 검출가능한 산물을 생성할 수 있다. 고정된 단백질 포스파타제를 자기력에 의해 반응 혼합물로부터 분리하였다. 단백질 포스파타제(자성 비드)와 결합한 색 또는 형광을 각각 분광법 또는 형광측정법에 의해 측정하였다. 자성 비드와 결합한 색/형광의 양은 시료중의 포스파타제 결합 독소의 작용에 따라 감소하였다.
<실시예 4>
신틸레이션 프록시머티 분석
단백질 포스파타제를 비오티닐화하여 스트렙타비딘 및 신틸런트(예를 들어, NEN사 제품인 플래쉬플레이트 플러스 스트렙타비딘(FlashPlate PLUS Streptavidin) SMP103)로 미리 코딩한 웰에 고정하였다. 시료 및 [125I]마이크로시스틴-YR을 웰에 가하였다. 고정된 단백질 포스파타제와 결합한 [125I]마이크로시스틴-YR의 양을 섬광계수법에 의해 조사하였다.
<실시예 5>
다양한 독소의 존재시 [125I]마이크로시스틴-YR과 단백질 포스파타제 2A의 결합의 저해
| 시험 화합물1 | IC50 2(pM) |
| 노둘라린 | 15 |
| 마이크로시스틴-LR | 17 |
| 마이크로시스틴-YR | 75 |
| 오까다산 | 100 |
| 칼리쿨린 A | 251 |
| 타우토마이신 | 562 |
| 1시험 화합물을 상기 기재된 바와 같이 [125I]마이크로시스틴-YR 및단백질 포스파타제 2A와 함께 인큐베이션하였다.2IC50값은 [125I]마이크로시스틴-YR과 단백질 포스파타제 2A의 결합을50 % 저해하는데 필요한 농도를 나타낸다. 이 값은 도 3에 따라 결정하였다.이 데이타는 3회 이상의 각 실험의 평균값을 나타낸다. |
<실시예 6>
경쟁적 결합 분석 및 단백질 포스파타제 분석에 있어서, 외부 첨가 화합물의 효과 비교
| 시험 화합물1 | 활성2(%) | |
| 경쟁적 결합 분석 | 단백질 포스파타제 분석 | |
| 2 mM ATP | 103.3 ±0.2 | 9.8 ±3.4 |
| 0.5 mM ATP | 101.6 ±1.7 | 29.8 ±5.6 |
| 0.05 mM NaPPi | 101.4 ±4.1 | 14.2 ±1.2 |
| 50 mM NaF | 101.5 ±1.9 | 7.7 ±1.4 |
| 5 mM NaF | 102.0 ±3.3 | 62.6 ±0.4 |
| 1 mg/ml 카세인 | 98.6 ±4.5 | 3.4 ±0.2 |
| 0.02 mg/ml 카세인 | 98.9 ±6.1 | 33.3 ±4.9 |
| 5 mg/ml 히스톤 2A | 91.9 ±1.8 | 1.4 ±0.1 |
| 0.002 mg/ml 히스톤 | 95.2 ±4.7 | 63.6 ±4.0 |
| 0.5 M NaCl | 41.2 ±0.7 | 44.4 ±1.6 |
| 해수 | 34.8 ±0.4 | ND |
| 10% 해수 | 87.3 ±0.4 | ND |
| 10% DMSO | 72.8 ±2.3 | 97.9 ±3.3 |
| 10% MeOH | 73.9 ±0.5 | 87.4 ±4.1 |
| 10% 아세토니트릴 | 90.4 ±5.4 | 88.2 ±2.7 |
| 0.4% 트리톤(Triton) X-100 | 122.3 ±1.0 | 60.2 ±5.7 |
| 0.4% 노니데트(Nonidet)P-40 | 106.0 ±2.0 | 61.1 ±1.3 |
| 0.4% CHAPS | 90.9 ±9.9 | 138.0 ±34.4 |
| 1단백질 포스파타제 2A를 50 mM Hepes(pH 7.2)중에 용해된 화합물과 함께 또는완충액 단독(대조군)과 함께 얼음에서 30분 동안 예비 인큐베이션하였다.포스파타제 활성은 기재된 바와 같이 포스포히스톤을 탈인산화하여 측정하였다.활성(%)은 대조 반응에 대한 상대값이다.2경쟁적 결합 분석에서의 활성은 완충액중에 용해된 외부 첨가 화합물의 존재하에[125I]마이크로시스틴-YR과 결합하는 단백질 포스파타제 2A의 능력을 완충액 단독으로하였을 때와 비교하여 나타낸다. 이 데이타는 3회 이상의 각 실험의 평균값 ±SEM을나타낸다. |
<실시예 7>
노둘라린 및 마이크로시스틴-LR에 대한 결합 분석의 감도
| [125I]마이크로시스틴-YR 결합의 저해율(%)1 | |||||
| 독소 | (M) | milliQ 물 | 음료수 | 해수 | 해수, 1/102 |
| 노둘라린 | 1E-10 | 88.37 ±0.31 | 88.75 ±0.16 | 72.18 ±0.82 | 67.24 ±0.66 |
| 5E-11 | 36.37 ±2.28 | 36.12 ±1.04 | 48.47 ±0.79 | 52.98 ±1.98 | |
| 마이크로시스틴-LR | 1E-10 | 84.91 ±0.42 | 86.97 ±1.12 | 73.31 ±1.20 | 46.41 ±5.97 |
| 5E-11 | 13.87 ±3.16 | 12.85 ±0.88 | 49.34 ±3.82 | 38.61 ±1.49 | |
| 1노둘라린 및 마이크로시스틴-LR을 상기와 같은 농도로 MilliQ 물, 음료수 또는해수중에 용해시켰다. 이 용액의 300 ㎕ 분획을 단백질 포스파타제 2A와결합하는데 있어서 [125I]마이크로시스틴-YR과 경쟁하는 능력에 대해상기 기재된 바와 같이 시험하였다.2milliQ 물중에 1/10로 희석된 해수이 데이타는 평균 ±SEM으로 나타낸 것이다. |
<실시예 8>
HPLC 분석 및 단백질 포스파타제 결합 분석에 의해 결정된 갑각류 추출물중의 오까다산의 당량
| 추출물1 | HPLC 분석2에 의한 오까다산의 당량 | 결합 분석3에 의한 오까다산의 당량 | |
| 간췌장(㎍/g ) | (nM) | (nM) | |
| 1 | 0 | 0 | 85 |
| 2 | 0 | 0 | 45 |
| 3 | 0 | 0 | 70 |
| 4 | 4 | 2480 | 2100 |
| 5 | 1.2 | 748 | 755 |
| 6 | 0.8 | 496 | 805 |
| 1추출물은 노르웨이 연안에서 채집한 홍합의 간췌장으로부터 수득하였다.2HPLC에 의해 추출물의 오까다산 당량을 분석하였다.3추출물을 100% DMSO중에 희석하고 단백질 포스파타제 2A와 결합하는데 있어서[125I]마이크로시스틴-YR과 경쟁하는 능력에 대해 상기 기재된 바와 같이결합 분석을 이용하여 시험하였다. 이 데이타와 100% DMSO중에 용해된 오까다산의표준 곡선과 비교하여 오까다산 당량의 농도를 결정하였다. |
<실시예 9>
첨부된 도면
첨부된 도면 중 도 1은 단백질 포스파타제 결합 독소를 검출하기 위한 경쟁적 결합 분석에 대한 개략도이다.
단백질 포스파타제 2A를 [125I]마이크로시스틴-YR 및 단백질 포스파타제 2A로 지시되는 다른 독소와 함께 인큐베이션하였다. 이 독소는 상기 포스파타제와 결합하는데 있어서 [125I]마이크로시스틴-YR과 경쟁한다. 다량의 독소를 첨가하면 [125I]마이크로시스틴-YR과 상기 포스파타제의 결합은 감소되며 소량의 독소를 첨가하면 [125I]마이크로시스틴-YR과 상기 포스파타제의 결합은 증가한다. 결합이 평형에 도달한 다음, 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 단백질 포스파타제 2A와 결합한 [125I]마이크로시스틴-YR을 유리 [125I]마이크로시스틴-YR로부터 분리하였다. 상기 포스파타제와 결합한 [125I]마이크로시스틴-YR을 함유하는 분획을 수획하여 섬광계수법에 의해 방사활성량을 결정하였다.
첨부된 도면 중 도 2는 [125I]마이크로시스틴-YR과 단백질 포스파타제 2A의 결합에 있어서 여러가지 조류 독소의 양을 증가시킨 결과를 나타낸다.
단백질 포스파타제 2A(30 pM)를 도 2에 나타나 있는 35 pM [125I]마이크로시스틴-YR(1 Ci/13 ng) 및 0-100 nM의 다른 조류 독소들중에서 인큐베이션하였다. 겔 여과 크로마토그래피법에 의해 단백질 포스파타제 2A와 결합한 [125I]마이크로시스틴-YR을 단리하여 섬광계수법에 의해 방사활성을 결정하였다. 각각의 선은 3회 이상의 각 실험의 평균을 나타낸다.
첨부된 도면 중 도 3은 경재적 결합 분석에 있어서 마이크로시스틴-LR의 결합에 대한 IC50을 나타낸다.
[125I]마이크로시스틴-YR과 단백질 포스파타제 2A의 결합은 마이크로시스틴-LR의 농도에 대한, 결합되지 않은 [125I]마이크로시스틴-YR(Co-Cx)과 결합된 [125I]마이크로시스틴-YR의 비율로 플롯팅하였다. Co는 마이크로시스틴-YR의 부재하에 결합된 [125I]마이크로시스틴-YR의 양을 나타내며, Cx는 다양한 농도의 마이크로시스틴-LR의 존재하에 결합된 [125I]마이크로시스틴-YR의 양을 나타낸다.
첨부된 도면 중 도 4는 과량의 마이크로시시튼 LR의 존재하에 단백질 포스파타제 2A와 결합한 [125I]마이크로시스틴-YR의 안정성을 나타낸다.
단백질 포스파타제 2A(1 nM)를 [125I]마이크로시스틴-YR(100 pM)의 존재하에 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마이크로시스틴-LR(2 μM)을 0시간에서 반응 혼합물에 첨가하였다. 정해진 시점에서 단백질 포스파타제 2A와 결합한 [125I]마이크로시스틴-YR의 양을 상기 설명한 바와 같이 겔 여과법 및 섬광계수법에 의해 결정하였다. 이 그래프는 4회 실험한 값의 평균을 나타낸다.
Claims (21)
- 리간드가 고정되어 있는 고상 지지체를 (i) 독소에 오염된 것으로 추정되는 시료 및 (ii) 비고정 리간드와 접촉시키는 단계 - 여기서, 상기 고정된 리간드는 하나 이상의 상기 독소, 상기 비고정 리간드, 또는 상기 독소와 상기 비고정 리간드의 복합체와 결합할 수 있으며, 상기 비고정 리간드는 하나 이상의 상기 고정된 리간드, 상기 독소, 또는 상기 독소와 상기 고정된 리간드의 복합체와 결합할 수 있으며, 따라서 상기 독소가 결합된 상기 고정된 리간드, 상기 비고정 리간드, 또는 상기 독소와 상기 비고정 리간드의 복합체의 비율은 상기 시료 중의 독소의 함량에 따라 달라지며, 여기서 상기 고정된 리간드는, 복합체를 이루지 않는 경우, 상기 독소와 복합체를 이루는 경우, 상기 독소 및 상기 비고정 리간드의 복합체와 복합체를 이루는 경우 또는 상기 비고정 리간드와 복합체를 이루는 경우에 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있거나 또는 상기 비고정 리간드는 복합체를 이루지 않는 경우 또는 복합체를 이루는 경우에 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있음 -,결합된 단편을 비결합 단편으로부터 분리하는 단계 및고정된 리간드에 결합된 비고정 리간드(결합된 단편) 또는 수용액 중에서 복합체를 이루지 않는 비고정 리간드(비결합 단편)를 직접적 또는 간접적으로 결정하는 단계를 포함하며,상기 (i) 및 (ii)는 고상 지지체에 순서에 관계없이 따로따로, 연속으로 또는 동시에 첨가할 수 있는, 단백질 포스파타제를 저해하는 포스파타제 표적 독소를 결정하는 분석 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 포스파타제-표적 독소가 조류 또는 시아노박테리아에 의해 생산되는 것인 분석 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 결정하려는 독소가 간독소 또는 오까다산인 분석 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 시료중에 존재하는 독소 분자가 고정된 리간드에 있는 제한된 수의 결합 부위를 놓고 비고정 리간드와 경쟁하고, 상기 시료중에 존재하는 임의 독소는 고정된 리간드의 결합 부위와 결합하거나 또는 결합하지 않는 비고정 리간드의 양에 비례해 결정되는 것인 분석 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 포스파타제-표적 독소의 존재 또는 부재가 결정되는 것인 분석 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 조사 대상 시료가 갑각류의 표면, 또는 갑각류로부터 얻은 자유 수분, 또는 갑각류가 사는 서식지로부터 채수한 물, 또는 가정용수원으로부터 채수한 물인 분석 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 고정된 리간드 및(또는) 비고정 리간드가 항체 또는 항체 단편인 분석 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 독소 결합 리간드가 단백질 포스파타제 효소인 분석 방법.
- 제8항에 있어서, 단백질 포스파타제 효소가 결합 리간드 단백질 포스파타제 2A인 분석 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 고정된 리간드 또는 비고정 리간드가 리포터 잔기를 함유하는 것인 분석 방법.
- 제10항에 있어서, 비고정 리간드가 리포터 잔기를 함유하는 것인 분석 방법.
- 제11항에 있어서, 비고정 리간드가 표지된 펩티드 간독소 또는 표지된 오까다산인 분석 방법.
- 제12항에 있어서, 간독소가 노둘라린, 마이크로시스틴 LC 또는 마이크로시스틴 YR로부터 선택되는 것인 분석 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 고상 지지체가 딥스틱 또는 고상 매트릭스인 분석 방법.
- 제14항에 있어서, 고상 매트릭스가 고분자 비드 또는 자성 비드인 분석 방법.
- 리간드가 고정되어 있는 고상 및 바람직하게는 수용액중에 있거나 또는 고정된 리간드와 복합체를 이루는 비고정 리간드를 포함하며, 상기 고정된 리간드 또는 비고정 리간드 중 어느 것도 직접적 또는 간접적으로 검출가능한 잔기, 상기 고정된 리간드 또는 비고정 리간드 중 하나와 결합하여 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 리포터 잔기(바람직하게는, 상기 검출가능한 잔기 또는 신호는 실험 장비 없이도 직접 판독할 수 있음)를 포함하지 않는 것인, 본 발명에 따른 포스파타제-표적 독소를 검출하는 킷트.
- 제16항에 있어서, 상기 포스파타제-표적 독소가 조류 또는 시아노박테리아에 의해 생산되는 것인 킷트.
- 제16항 또는 제17항에 있어서,포스파타제-표적 독소 결합 리간드가 고정되어 있는 고상, 및포스파타제-표적 독소와 상기 독소 결합 리간드의 결합을 경쟁적으로 저해하며 실험 장비 없이도 판독할 수 있는 신호를 생성시킬 수 있는 리포터 분자를 포함하는 킷트.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,단백질 포스파타제가 고정되어 있는, 자기력에 의해 이동가능한 고분자 미소구 및상기 단백질 포스파타제와 결합하는 시아노박테리아 독소를 경쟁적으로 저해할 수 있는, 골드 졸로 표지된 펩티드 간독소 분자를 포함하는 킷트.
- 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,단백질 포스파타제가 고정되어 있는, 자기력에 의해 이동가능한 고분자 미소구 및상기 단백질 포스파타제와 결합하는 조류 독소를 경쟁적으로 저해할 수 있는, 골드 졸로 표지된 오까다산 분자를 포함하는 킷트.
- 포스파타제-표적 독소를 결정하는데 있어서 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항의 킷트의 용도.
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