KR100289673B1 - 넙치의효소분석으로얻어진생화학지표에의한해양오염진단법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 저서류(低棲類)로서 연안에 널리 서식하고 있는 넙치(Paralichthys olivaceus)를 시료로 하여 넙치중에 존재하는 효소분석을 통하여 해양오염 진단용 생화학 지표(biomarkers)의 개발에 관한 것이다.
본 발명은 해양 생태계의 파괴에 대한 오염의 방지대책 수립을 위한 기초자료를 제공하고, 연안어장과 양식어장의 오염방지로 오염되지 않는 수산물의 안정적 공급을 위한 해양오염의 진단법을 개발하는데 있다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 해양오염의 생화학지표로서 생체의 병변시에 혈중 유출로 인하여 증가하는 것으로 알려진 혈청중의 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase: LDH)를 분석하고 뇌조직중에 존재하는 오염지표로서 각광을 받고 있는 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 및 부티릴콜린에스테라아제(BChE)의 활성을 분석하여 그 비(LDH/AChE; LDH/BChE)를 활용하여 해양오염의 생화학지표를 개발한 것이다.

Description

넙치의 효소분석에 의한 해양오염 진단용 생화학지표의 개발
본 발명은 넙치의 효소분석에 의한 해양오염 진단용 생화학지표의 개발에 관한 것이다.
날로 심각해져가는 해양의 오염을 평가하고 진단하기 위해서 여러가지 방법이 사용되고 있다. 일반적으로 해양에서 현재 존재하는 오염물질의 농도를 화학적으로 분석하는 방법이 널리 사용되나 오염의 실제영향 및 환경상태를 판단하기 위해서는 생물에의 영향이 직접 조사되어야 한다. 생물에 대해서는 보통 오염물질에 의한 치사량을 조사하거나 장기적인 생태계구조의 변화를 조사하였다.
종래의 이러한 방법으로 오염을 진단했을 때에는 이미 해양의 오염이 심하게 진행되어 환경회복을 위한 대책수립이 불가능해지는 경우가 많다. 따라서 세계적으로 오염의 영향을 조기에 미리 감지할 수 있는 기술의 개발이 활발한데 해양에 서식하는 생물의 생화학적지표가 매우 효율적인 진단방법으로 평가받고 있다.
본 발명은 종래의 이러한 문제를 시정하기 위하여, 저서성 어류인 넙치의 효소분석을 통해 해양오염을 효과적으로 평가할 수 있는 생화학적 오염지표를 개발하엿다.
즉, 인간의 질병의 진단에 활용되고 있는 방법과 농약개발을 위한 신경전달물질의 파괴에 관계하고 있는 뇌과학적 방법을 실제 해양오염의 진단을 위한 생화학 지표의 개발에 응용한 것이다. 인간의 여러 가지 질병에 따라 젖산탈수소효소(lactate dehydrogenase: LDH)의 혈중 유출이 급속히 증가되는 사실에 착안하여 혈청중의 LDH의 활성을 측정한다. 또한 생체내에서 가장 중요한 모노아민계(monoamine series) 콜린(Ch)의 신경전달물질을 파괴하는 효소로서 환경오염에 의하여 파괴되는 것으로 알려진 아세틸콜린에스테라아제(acetylcholinesterase: AChE) 및 부티릴콜린에스테라아제(butyrylcholinesterase: BChE)의 활성을 측정하여 그 비(LDH/AChE, LDH/BChE)로써 해양오염 진단을 위한 생화학지표로 삼는 것이다.
남해안 양식산 넙치의 혈청중의 탈수소효소(lactate dehydrogenase: LDH)의 활성을 분석하고 아울러 콜린(Ch)계의 신경전달물질을 파괴하는 효소로서 환경오염에 의하여 파괴되는 것으로 알려진 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 및 부티릴콜린에스테라아제(BChE)의 활성을 측정하여 그 비(LDH/AChE, LDH/BChE)로써 비교·평가한다. 오염이 비교적 적은 동해안 포항산 자연산 넙치를 대조군으로 하여 본 발명에 사용한 남해안 양식산 넙치를 시료로 하여 오염진단을 평가하기 위한 생화학 지표를 설정한다.
1. 실험방법
1. 실험용 시료
본 발명에 사용한 양식산 및 자연산 넙치 시료(Paralichthys olivaceus)는 남해안의 삼천포(Samchunpo), 고성(Gosung), 한산도(Hansando), 통영(Tongyong), 마산(Masan)에서 채집한 양식산 넙치(체장 22.5∼31.0cm, 체중 350∼550g), 그리고 대조군은 오염도가 비교적 적은 동해안의 포항(Pohang)에서 채집한 자연산 넙치(체장 24.5∼32.0cm, 체중 370∼650g)를 각각 7∼10마리씩 구입하여 사용하였다.
2. 사용시약
해양 오염의 지표어류로서 넙치의 오염 진단법의 개발을 위하여 사용한 생화학실험용 분석시약으로서 젖산탈수소효소(LDH), 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 및 부티릴콜린에스테라아제(BChE) 등의 효소 및 분석시약은 모두 시그마제 특급 내지 1급시약을 구입하여 사용하였다.
Ⅱ. 실 험 방 법
1. 혈액의 채취 및 분리
혈액은 채취하기전 12시간 절식시킨 상태에서 마취제(benzocaine)를 에탄올에 용해하여 마취시킨 다음, 넙치의 꼬리부분(尾部)에서 5cm지점의 등뼈밑 동맥에서 일회용 주사기로 채혈하였다. 채혈한 혈액은 실온에 일정시간 방치한 후 700×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 항응고제(sodium heparin, 100,000units)를 혈액 1.0ml당 0.05ml 처리한 CBC병(complete blood cell count, 녹십자사)에 넣어 -70℃에 동결 보존하면서 분석에 사용하였다.
2. 신경 조직세포의 분획
뇌조직 일정량을 분취하여 완충용액(1.15% KCl/10mM phosphate buffer + 5mM EDTA, pH 7.4)에 넣어 -70℃에 동결·보존하였다. 조직 획분은 조직 1.0g씩을 분취한 다음, 인산완충용액(0.1M TRIS buffer, pH 8.0)에 2배량의 완충용액으로 1분간 균질화한 다음, 10,000×g에서 20분간 원심분리하여 상층액을 사용하였다.
3. 단백질 함량의 측정
혈청 및 뇌조직획분의 단백질 함량은 Lowry 등 (1951)의 방법에 따라 표준 단백질로서 BSA(bovine serum albumin)를 사용하여 분광광도계를 사용하여 525nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량선에 의하여 단백질의 함량을 정량하였다.
4. 젖산탈수소효소의 활성 측정
혈청중의 젖산탈수소효소(LDH)의 활성측정은 킷트시약(Sigma Co., 1340-UV)을 사용하여 측정하였다. LDH A 효소시약 2.5ml에 혈청 100ul를 첨가하여 잘 혼합한 후 1분간 방치한 다음, LDH B 효소시약 0.1ml를 넣고 물을 대조로 하여 340nm에서 흡광도를 1, 2 및 3분씩 측정하여 다음 식에 따라 LDH의 활성을 정량하였다.
LDH activity(U/L)＝(OD/min)×Total volume(ml×1000*/6.22**×Sample(ml)
*1000=unit/ml를 Unit/L로 전환;**6.22=340 nm에서 NADH n mol의 흡수력
5. 아세틸콜린에스테라아제의 활성 측정
뇌조직중의 아세틸콜린에스테라아제(AChE)의 활성 측정은 Galgani 등(1992)의 방법에 따라 측정한다. 마이크로플레이트에 0.1M Tris buffer, pH 8.0(Trizma HCl+Trizma base)을 300ul, 0.01M 디치오니트로벤조산(DTNB) 20ul, 뇌획분 10ul을 첨가한다. 흡광도를 측정하기 직전에 기질시약인 0.1M 아세틸콜린클로라이드(acetylthiocholine chloride) 10ul을 첨가한다. 마이크로플렛 리더(ELISA reader)를 이용하여 405nm에서 흡광도의 변화를 3분동안 측정하여 다음 식에 따라 아세틸콜린에스테라아제(AChE)의 활성을 정량하였다.
AChE activity(unit/min/mg protein)＝(Final Abs-Initial Abs)×2*×1000**/min/mg protein
*Enzyme suspension의 희석배수;**1unit=0.001 Abs
6. 부티릴콜린에스테라아제의 활성 측정
뇌조직 중의 부틸릴콜린에스테라아제(BChE)의 활성 측정은 최 등(1997)에 따라 상기의 아세틸콜린에스테라아제(AChE)와 꼭같은 방법으로 부티릴콜린에스테라아제(BChE)의 활성을 측정한다.
BChE activity(unit/min/mg protein)＝(Final Abs-Initial Abs)×2*×1000**/min/mg protein
*Enzyme suspension의 희석배수;**1unit=0.001 Abs
Ⅲ. 실험결과의 평가
1. LDH, AChE 및 BChE의 활성 평가
오염이 비교적 낮은 동해안의 자연산 넙치를 대조군으로 하여 오염이 급격히 증가하고 있는 남해안 양식산 넙치의 오염에 미치는 LDH, AChE 및 BChE의 활성에 미치는 영향을 비교하여 보면 표 1에서 보는 바와 같다.
표 1에서 보는 바와 같이 해양오염의 정도에 따라 혈청중의 LDH의 활성이 증가하였고, AChE 및 BChE의 활성도 해양오염의 정도에 따라 유의적으로 감소함을 알 수 있었다. 이들의 함량이 남해안의 조사지역에 따라 다소간의 차이는 인정되지만, 현격한 차이가 없어서 해양오염의 정도를 명확하게 평가할 수 없다. 따라서 이들 효소의 단편적 평가로서는 해양오염의 정도를 평가하기에는 상당한 무리가 따른다.
2. LDH/AChE 및 LDH/BChE 비의 평가
이들 효소의 단편적 평가가 해양오염의 정도를 평가하기에는 적합치 않기 때문에 이들 효소의 비(LDH/AChE 및 LDH/ BChE)로써 해양오염의 정도를 평가하고자 한다. 표 1에서는 보는 바와 같이 LDH/AChE의 비는 남해안 양식산 넙치가 1.63∼2.08×10-5로서 포항의 자연산 넙치(1.17×10-5) 대비 약 40∼80%까지 현저한 증가가 인정되어 남해안의 오염이 심각함을 알 수 있다. 남해안 중에서도 마산연안의 오염이 80%나 증가하여 심각함을 알 수 있다. 또한 LDH/BChE의 비는 남해안 양식산 넙치가 60∼90×10-5로서 포항의 자연산 넙치(40.0×10-5) 대비 약 50∼125%까지 현저한 증가가 인정되어 남해안의 오염이 심각함을 알 수 있다.
LDH/AChE의 평가와 마찬가지로 남해안 중에서도 마산연안의 오염이 125%나 가장 현저히 증가하여 심각함을 알 수 있다. 이들 중에서 한산도의 오염이 비교적 오염도가 높은 것은 내만(內灣)으로서 환류가 잘되지 않기 때문인 반면 통영이 오히려 오염도가 낮다는 사실은 육상 오염원이 비교적 적을 뿐만 아니라 외해(外海)와 연결되어 있는 청적해역이기 때문이다.
아세틸콜린에스테라아제(AChE) 및 부틸릴콜린에스테라아제(BCHE)에 대한 젖산탈수소효소(LDH)의 비의 비교
조 사 지 역 LDH활성 AChE활성 BChE활성 LDH/AChE 비a LDH/BChE 비a
대동조해군안 포 항(자연산) 0.093±0.030 7,936±472 246±40 1.17(100%) 40.0(100%)
실남험해군안 고 성(양식산) 0.110±0.030 6,743±393 162±23 1.63(139%) 70.0(175%)
삼천포(양식산) 0.109±0.030 6,244±326 160±30 1.75(150%) 70.0(175%)
한산도(양식산) 0.141±0.020 7,245±310 185±20 1.95(167%) 80.0(200%)
통 영(양식산) 0.101±0.030 6,348±308 163±20 1.59(136%) 60.0(150%)
마 산(양식산) 0.145±0.020 6,973±321 169±25 2.08(178%) 2.08(178%)
LDH활성: unit/ml 혈청; AChE 및 BChE 활성: unit/min/mg 단백질;aLDH/AChE 및LDH/BChE의 비: x105
본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다.
실시예 1
넙치의 체성분의 효소분석법의 간소화 및 재현성이 높여야 한다. 혈청중의 젖산탈수소효소(LDH)의 활성측정은 LDH A 효소시약 2.5ml에 혈청 100ul를 첨가한 다음, LDH B 효소시약 0.1ml를 넣고 물을 대조로 하여 340nm에서 흡광도를 1, 2 및 3분씩 측정하여 LDH의 활성을 정량한다. LDH의 활성 측정은 킷트화하여 간소화 한다.
실시예 2
뇌조직중의 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 및 부티릴콜린에스테라아제(BChE)의 활성은 마이크로플레이트에 0.1M Tris buffer 300ul, 0.01M DTNB 20ul, 뇌세포획분 10ul을 첨가하고, 측정하기 직전에 기질시약인 0.1M 아세틸치오콜린클로라이드 10ul을 첨가하여 ELISA reader를 이용하여 405nm에서 흡광도의 변화를 3분동안 측정하여 측정한다. AChE 및 BChE의 활성 측정은 킷트화하여 간소화한다.
본 발명은 넙치의 효소분석에 의하여 젖산탈수소효소(LDH)와 콜린(Ch)계의 아세틸콜린에스테라아제(AChE) 및 부티릴콜린에스테라아제(BChE)의 활성을 측정하여 그 비(LDH/AChE, LDH/BChE)로써 해양오염 진단용 생화학지표를 삼았기 때문에 보다 신속하게 해양오염정도를 파악하여 양식어장의 피해를 유효하게 방지할 수 있는 등의 효과가 있다.

Claims (1)

  1. 해양오염의 진단용 생화학 지표에 있어서, 넙치의 혈액 및 뇌조직의 절취후, 혈청과 뇌조직에 함유된 이들중의 LDH, AChE 및 BChE의 활성을 측정하여 그 비(LDH/AChE 및 LDH/BChE)로서 해양오염 진단용 생화학지표(biomarkers)로 삼는 것을 특징으로 하는 넙치의 효소분석에 의한 해양오염 진단용 생화학지표의 개발.
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