KR100681410B1 - 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트 및 이를 이용한 오염진단방법 - Google Patents

해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트 및 이를 이용한 오염진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트 및 이를 이용한 오염 진단방법에 관한 것으로, 특히 신경 독성물질에 의하여 활성이 저해되는 고순도의 콜린계 효소 추출물, 기질, 표준시약, 발색시약 및 상기 효소 추출물을 고정화하는 마이크로 플레이트를 포함하는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트에 관한 것이다. 이러한 본 발명에 의하는 경우, 해수나 해양퇴적물에 신경 독성 물질과 수질 오염 물질이 존재하는지 여부를 조기진단할 수 있으며, 생물체를 직접 채집하여 분석하지 않고도, 해수를 이용하여 직접 수질의 오염 여부를 간단하게 진단할 수 있다.
해양퇴적물 및 수질 오염, 아세틸콜린에스터라제, 부티릴콜린에스터라제

Description

해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트 및 이를 이용한 오염 진단방법{Diagnostic kit for ocean sediment and water pollution and Diagnostic method using the same}
도 1은 어류의 뇌에서 추출한 상층액에 알칼로이드 에세린을 첨가한 뒤, 아세틸콜린에스터라제 및 부티릴콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 2는 어류의 근육에서 추출한 상층액에 알칼로이드 에세린을 첨가한 뒤, 아세틸콜린에스터라제 및 부티릴콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 어류의 뇌에서 추출한 상층액에 BW284C51을 첨가한 뒤, 아세틸콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 4는 어류의 근육에서 추출한 상층액에 BW284C51을 첨가한 뒤, 아세틸콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 5는 어류의 뇌에서 추출한 상층액에 이소-OMPA을 첨가한 뒤, 부티릴콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 6은 어류의 근육에서 추출한 상층액에 이소-OMPA을 첨가한 뒤, 부티릴콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과 그래프이다.
도 7은 M1에서부터 M9까지의 다양한 지역에서 수집한 수질을 본 키트를 이용 하여 오염 여부를 측정한 결과 그래프이다.
도 8은 오염지역으로부터 수집한 시료를 알코올로 각각 희석율을 달리하여 희석한 후 본 키트를 이용하여 수질오염 여부를 진단한 결과 그래프이다.
본 발명은 해양퇴적물 및 수질의 오염 여부를 진단하는 키트 및 이를 이용한 오염 진단방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신경 독성물질에 의하여 활성이 저해되는 고순도의 콜린계 효소 추출물, 기질, 표준시약, 발색시약 및 상기 효소 추출물을 고정화하기 위한 마이크로 플레이트를 포함하는 수질 오염 진단키트 및 수질 오염 여부를 간단하게 진단하는 방법에 관한 것이다.
현재 전 세계적으로 인구가 증가함에 따라 식량의 소요량이 증대되고 있는바, 농업의 생산성을 증가시키기 위해 농약의 사용량이 급증하고 있으며, 공업단지 조성에 따라서 육상의 오폐수가 수상에 과다 유입되고 있는 실정이다. 이는 급속한 공업화에 따른 필연적인 것으로 해양오염은 연안어장의 오염을 유발함으로써 수산물 공급에도 문제가 되고 있다.
이들 오염물질은 중금속 등의 유기인계 농약 및 방사능 물질 등으로서 수산 생물에 영향을 미칠 뿐만 아니라 체내에 농축될 가능성도 있어 국민의 건강까지 위협을 끼칠 수 있는 실정이다.
이렇게 날로 심각해지는 해수 등의 수질 오염을 평가하고 진단하기 위해서 여러 가지 방법이 사용되고 있다. 일반적으로는 해수에서 현재 존재하는 오염물질의 농도를 화학적으로 분석하는 방법과 해양에 서식하는 생물의 생화학적 지표를 통한 진단방법이 이루어지고 있다.
그러나, 종래의 화학적 분석법은 방법이 상당히 복잡한 과정을 거처야 할 뿐 아니라, 고가의 분석비용과 분석을 위한 긴 시간이 투자되어야 하는 단점이 있었다. 또한, 농약류는 그 화학적 특성으로 인하여 수중 내에서의 분해가 빨라 분석이 까다로운 단점이 있어, 오염지역의 서식 생물의 오염물질로 인한 실제적인 위해성을 펑가하기에 매우 까다로운 실정이다.
또 다른 오염진단 방법인 해양에 서식하는 생물을 생화학적 지표로서 활용하는 종래의 방법은, 생물이 신경 독성물질 등에 의해 오염되었는지 여부를 시험하기 위하여 어류 자체의 혈액이나 조직 등을 분획해 내어 정상상태인지를 판별하는 방식으로 이루어졌기 때문에, 진단하고자 하는 지역마다 생물체는 직접 채집해야하는 번거로움이 있었으며, 이로 인해 간단하고 단순화된 빠른 진단이 힘들었다. 이로써, 수질의 오염 여부를 생물체가 신경 독성물질에 대한 위해성을 가지기 전에 조 기에 쉽게 진단하는 것을 기대하기 어려웠다.
또한 이러한 종래의 오염진단 방법을 통해서는, 실제 어류가 서식하지 않는 특수한 지역이나 오폐수 처리장의 배출수 등이 연안 현장에 유입되었을 때, 새로 개발된 농약류나 살충제 등으로 인한 생물의 오염물질로 인한 위해성을 실험실에서 신속하고 정확히 진단하는 것을 기대하기가 어렵다. 보다 중요한 문제는, 실제 해양 환경은 많은 복잡한 요인들이 존재하고 있으므로 서식생물의 신경독성물질로 인한 위해성이 검출되더라도, 오염 현장의 생물체에서 측정된 결과와 비교해서 판별할 만한 청정해역의 시료를 동시에 채집하여 측정하지 않는다면, 생물의 오염물질에 대한 위해성 판별의 신뢰도는 떨어질 수 밖에 없다는 데에 있다. 즉 매번 오염되지 않은 지역의 생물을 함께 채집하여 그 혈액이나 조직 등을 분획하여 같은 조건에서 위해성 평가를 비교하는 실험을 반복해야 한다는 것이다.
또한, 생체 외 방법은 민감하기 때문에 유리하고, 짧은 시간에 많은 시험 샘플의 분석에 사용될 수 있다. 그러나, 국내에는 이를 개선하고자 하는 많은 노력에도 불구하고 해양생물의 신경 독성물질에 대한 영향을 정확하고 간편하게 실험실에서 평가할 수 있는 키트가 발명되거나 보급된 바는 없다. 최근, 환경에 대한 관심과 수요가 급증하고 있으나, 아직은 일부 매우 제한적인 연구실에서 생물체를 직접 분석하여 측정하는 종전의 방법만을 그대로 답습하고 있을 뿐이다. 이에, 본 발명자는 생물체를 직접 분석하여 측정하는 방법을 변형하여 다양한 환경 매질에서 신경 독성물질이 생물체에 미칠 수 있는 영향을 생물체를 직접 이용하지 않고 조기에 스크리닝할 수 있는 키트를 발명하였다.
본 발명은 상기한 문제점을 해소하기 위한 것으로, 신경 독성물질에 의하여 활성이 저해되는 고순도의 콜린계 효소 추출물, 기질, 표준시약, 발색시약 및 상기 효소 추출물을 고정화하기 위한 마이크로 플레이트를 포함하는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트를 제공하고, 수질오염 여부를 간단하게 진단하는 방법을 제공함에 목적이 있는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 고순도로 추출한 콜린계 효소를 통하여, 해수에 신경 독성물질이 포함되어 있는지 여부를 실험실에서 조기진단할 수 있도록 하여, 여러 지역의 해양퇴적물 및 수질에 대하여 생물체에 신경 독성물질로 인한 위해성을 가지는지를 조기에 간편하게 진단할 수 있는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트를 제공함에 목적이 있는 것이다.
본 발명은 신경 독성물질에 의하여 활성이 저해되는 콜린계 효소 추출물, 상기 콜린계 효소 추출물과 반응하여 반응 생성물을 만들기 위한 기질, 상기 콜린계 효소 추출물과 기질의 반응 생성물과 색 반응을 일으키도록 하는 발색시약 및 상기 효소 추출물을 고정화하기 위한 마이크로 플레이트를 포함하는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트에 관한 것이다.
그리고, 본 발명은, 상기 발색시약과 색 반응을 일으키는 물질로서, 상기 콜린계 효소 추출물과 기질의 반응 생성물이 발색시약에 의해 일으키는 색 반응의 기준이 되는 표준시약을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 수질 오염 진단키트도 가능하다. 또한, 상기 콜린계 효소 추출물은 청정해역에 서식하는 어패류의 근육이나 뇌 조직에서 추출한 아세틸콜린에스터라제(Acetylcholinesterase, AChE) 또는 부티릴콜린에스터라제(Butyrylcholinesterase, BChE)일 수 있다.
그리고, 본 발명에 따른 상기 기질은 아세틸티오콜린(Acetylthiocholine) 또는 부티릴티오콜린(Butyrylthiocholine)이 바람직하고, 발색시약은 DTNB이 바람직하며, 표준시약은 티오콜린인 것이 가장 바람직하다.
또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 바람직한 실시형태는 마이크로 플레이트에 콜린계 효소 추출물을 결합시키는 단계; 완충용액을 마이크로 플레이트에 분주하는 단계; 상기 콜린계 효소 추출물이 결합한 마이크로 플레이트에 검사하고자 하는 해수를 분주하는 단계; 기질, 촉매제를 마이크로 플레이트에 첨가하는 단계; 상기 해수를 분주한 플레이트에 발색시약을 첨가하는 단계; 효소의 활성에 따라 색 반응이 일어나는 단계; 및 상기 발색시약에 의한 발색 반응을 흡광도를 이 용하여 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 해수의 오염 진단방법에 관한 것이다.
이하 상세하게 설명한다.
본 발명의 상기 콜린계 효소 추출물은 청정해역에 서식하는 어패류의 근육이나 뇌 조직에서 추출한 아세틸콜린에스터라제(AChE) 또는 부티릴콜린에스터라제(BChE)으로 오염진단의 표준물질이다.
대표적인 수질 오염물질인 유기인계 농약이나 방사능 물질은, 사람 및 동물 체내의 콜린계 효소와 결합하여 이 효소의 작용을 비가역적으로 억제함으로써 신경전달 물질인 아세틸콜린을 축적시켜 신경장애를 일으킨다. 본 발명은 유기인계 농약과 같은 신경 독성물질로부터의 위해성 여부를 판별하는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트이다.
콜린계 효소는 생체 내 중요한 신경전달물질로서 근육이나 혈액, 뇌 등 생체 거의 모든 조직에 분포하고 있다고 알려져 있다. 발명에 사용한 콜린계 효소인 콜린에스터라제는 두 그룹의 효소로 나눌 수 있고 아세틸콜린에스터라제(Acetylcholinesterase)와 부티릴콜린에스터라제(Butyrylcholinesterase)가 바람직하다. 두 계열의 효소는 모두 알칼로이드 에세린(alkaloid eserine)에 의해 그 활 성이 저해되는 것이 특징이다. 또한, 아세틸콜린에스터라제는 BW284C51에 의해, 부티릴콜린에스터라제는 이소-OMPA에 의해 각각 저해될 수 있다. 이러한 콜린계 효소 활성 억제제를 통하여 근육이나 뇌 등으로부터 추출해낸 콜린계 효소의 순도를 평가할 수 있으며, 고순도로 추출된 콜린에스터라제는 해양퇴적물 및 수질의 오염 여부를 진단하는 표준물질로서, 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트에 포함된다.
본 발명은 신경독 성물질의 생물학적 지표인 콜린계 효소 추출물을 플레이트에 먼저 분주하여 배양시킨 후 해수로부터 측정하고자 하는 매질을 추출하고 에탄올 또는 메탈올에 치환시킨 용액을 첨가하여 일정한 시간 간격으로 활성을 측정하는 것이다.
본 발명의 다른 특징에 따른 콜린계 효소 추출물은 청정해역의 어류의 근육 및 뇌 조직에서 추출한 것으로, 먼저 청정해역에서 수집한 오염되지 않은 어류의 근육과 뇌를 마쇄한 뒤, 여기에 완충용액을 첨가하여 원심분리하고, 그 상층액을 분리한 것을 콜린계 효소의 저해시약들로 처리하고 배양하여, 저해도가 높은 것만을 분획한 것이다.
고순도의 콜린계 효소인 콜린에스터라제를 추출하기 위해서는 분획한 상층액에 알칼로이드 에세린, BW284C51, 이소-OMPA와 같이 콜린계 효소의 활성을 저해하는 억제제를 사용한다. 그러나, BW284C51, 이소-OMPA는 두 그룹의 효소를 선택적 으로 저해하는 것으로, 아세틸콜린에스터라제는 BW284C51(1,5-Bis(4-allyldimethylammoniumphenyl)pentan-3-one dibromide)에 의해, 부티릴콜린에스터라제는 이소-OMPA(tetraisopropylphosphoramide)에 의해 각각 저해된다.
이를 이용하여 어류의 뇌 또는 근육에서 분획한 상층액에 상기 억제제들을 첨가시켜 아세틸콜린에스터라제 및 부티릴콜린에스터라제의 활성을 측정하여 고순도의 효소를 추출하게 된다. 콜린계 효소 추출물은 기질과 반응하여 티오콜린(thiocholine)을 생성시키므로, 효소의 활성은 단백질의 1㎕ 당 생성되는 티오콜린의 몰(mole)로 계산된다.
[도 1]은 어류의 뇌에서 분획한 조직을 원심분리하여 얻은 상층액에 알칼로이드 에세린을 첨가시켜 아세틸콜린에스터라제 및 부티릴콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과를 표로 나타낸 것이다. 이에 따르면, 알칼로이드 에세린이 첨가되지 않은 경우에는 시간이 지날수록 티오콜린 생성이 현저히 많아지므로, 아세틸콜린에스터라제 및 부티릴콜린에스터라제의 활성이 높지만, 알칼로이드 에세린이 첨가된 경우에는 티오콜린의 생성이 없어 완벽하게 콜린계 효소의 활성이 저해되는 것을 알 수 있다. 즉, 아세틸콜린에스터라제 및 부티릴콜린에스터라제가 어류의 뇌로부터 고순도로 추출된 것을 확인할 수 있다.
또한, [도 2]는 어류의 근육에서 분획한 조직을 원심분리하여 얻은 상층액에 알칼로이드 에세린을 첨가시켜 아세틸콜린에스터라제 및 부티릴콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과를 표로 나타낸 것이다. 이에 따르면, 알칼로이드 에세린이 첨가되지 않은 경우에는 시간이 지날수록 티오콜린 생성이 많아지므로, 아세틸콜린에스터라제 및 부티릴콜린에스터라제의 활성이 높지만, 알칼로이드 에세린이 첨가된 경우에는 콜린계 효소의 활성의 높은 저해를 확인할 수 있다. 즉, 아세틸콜린에스터라제 및 부티릴콜린에스터라제가 어류의 근육으로부터 고순도로 추출된 것을 알 수 있다.
[도 3]은 어류의 뇌에서 분획한 조직을 원심분리하여 얻은 상층액에 아세틸콜린에스터라제만을 선택적으로 저해하는 BW284C51을 첨가시켜 아세틸콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과를 표로 나타낸 것이며, [도 4]는 어류의 근육에서 분획한 상층액에 아세틸콜린에스터라제만을 선택적으로 저해하는 BW284C51을 첨가시켜 아세틸콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과를 표로 나타낸 것이다. 이에 따르면 BW284C51이 첨가되었을 경우 아세티콜린에스터라제의 활성이 완벽하게 저해됨을 알 수 있으며, 뇌와 근육에서 아세틸콜린에스터라제가 고순도로 추출된 것임을 알 수 있다.
[도 5]는 어류의 뇌에서 분획한 조직을 원심분리하여 얻은 상층액에 부티릴콜린에스터라제만을 선택적으로 저해하는 이소-OMPA를 첨가시켜 부티릴콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과를 표로 나타낸 것이며, [도 6]은 어류의 근육에서 분 획한 상층액에 이소-OMPA를 첨가시켜 부티릴콜린에스터라제의 활성을 측정한 결과를 표로 나타낸 것이다. [도 5]에 따르면, 이소-OMPA를 첨가하지 않아도 부티릴콜린에스터라제의 활성이 낮으므로, 어류의 뇌에는 적은 양의 부티릴콜린에스터라제가 존재하여 고순도의 효소가 추출되지 않았음을 알 수 있다. 다만, [도 6]에 따르면, 부티릴콜린에스터라제의 활성이 높은 것을 확인할 수 있으며, 어류의 근육으로부터 부티릴콜린에스터라제가 고순도로 추출되었음을 알 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기질은 콜린계 효소 추출물과 반응하여 반응 생성물을 생성하는 물질로서, 아세틸티오콜린 또는 부티릴티오콜린이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 발색시약은 상기 콜린계 효소 추출물과 기질의 반응 생성물과 색 반응을 일으키도록 하는 물질로서, DTNB이 바람직하다.
본 발명의 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트는 표준시약을 추가로 포함할 수 있다. 상기 표준시약은 발색시약과 색 반응을 일으키는 물질로서, 콜린계 효소 추출물과 기질의 반응 생성물이 발색시약에 의해 일으키는 색 반응의 기준이 된다. 바람직한 표준시약은 티오콜린이다.
기질은 콜린계 효소와 반응하면 아세트산(acetic acid)과 티오콜린으로 가수분해되며, 생성된 티오콜린은 발색시약과 반응하여 노란 음이온을 증가시킨다. 그 러므로, 본 발명의 키트를 이용한 요염 여부 진단은 콜린계 효소 추출물을 마이크로 플레이트에 각각 일정량을 분주하고, 완충용액을 분주한 다음, 측정하고자 하는 해수로부터 수집한 매질 추출물을 일정량 분주하고 반응시킨 다음, 기질과 촉매제를 첨가하고 발색시약을 첨가하여 일정한 시간간격으로 노란색 반응이 일어나는지의 여부를 흡광도 405nm에서 측정하여 이루어진다.
이때, 표준시약으로서 일정량의 티오콜린을 발색시약과 반응시켜 색 반응의 기준을 정할 수 있으며, 상기 기질과 콜린계 효소의 반응 생성물인 티오콜린의 양에 따른 색 반응은 표준시약으로 인한 색 반응 기준과 비교할 수 있다. 색 반응이 기준과 유사한 흡광도를 보일수록 기질과 콜린계 효소의 반응 생성물인 티오콜린의 생성량이 많다는 것을 의미하며 이는 콜린계 효소의 활성이 저해되지 않았음을 의미한다. 그러나, 색 반응이 기준과 유사한 흡광도를 보이지 않고 그보다 낮은 흡광도를 보일수록 기질과 콜린계 효소의 반응 생성물인 티오콜린의 생성량은 적다는 것을 의미하며, 이로써 콜린계 효소의 활성이 매질 추출물에 의하여 저해되었음을 알 수 있게 된다.
본 발명의 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트는 해양의 환경매체인 방류수, 폐수, 저질 등을 추출하여 그 추출액에 의하여 효소의 활성 여부를 측정하므로, 어류를 채집하기 어려운 오염지역의 오염 여부를 진단할 수 있으며, 담수나 공장폐수만 확보하면 시료나 공간에 제한 없이 위해성 여부를 정확하게 진단해 낼 수 있는 진단용 키트이다.
본 발명에 의하면 신경독 성물질의 생물학적 지표인 콜린계 효소를 사용하는 측정법이 가지고 있는 특이성과 반응성을 활용하여 실질적으로 생물체 뿐만 아니라 해양저질 또는 방류수 등의 환경 매개체에서도 본 키트를 이용하여 오염 여부를 진단할 수 있는 것이다.
그러므로, 본 발명은 50개 이상의 대량의 시료를 50분 이내의 짧은 시간 동안 동시에 측정할 수 있고, 조작과정이 매우 간편한 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 이들만으로 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1: 콜린계 효소 추출물의 분획]
우리나라의 청정해역으로 알려진 지역에서 오염되지 않은 어류를 포획하여 그 근육과 뇌조직의 일정량을 분취하여 마쇄한다. 이에 5~10배의 완충용액(0.1몰 인산 버퍼, pH 7.5)을 첨가한 다음, 10,000×g에서 원심분리한다. 이 후 상층액만을 분리하여, 마이크로 플레이트에 나누어 놓은 다음, 콜린계 효소의 억제제인 알칼로이드 에세린, BW284C51, 이소-OMPA를 각각 첨가하여 일정한 시간 동안 반응시 킨다. 콜린계 효소는 기질과 반응하여 티오콜린(thiocholine)을 생성시키므로 효소의 활성은 단백질의 1㎕ 당 생성되는 티오콜린의 몰(mole)로 계산된다. 억제제에 의하여 효소활성의 저해도가 98% 이상인 분획만을 분리해 낸다.
[실시예 2: 아세틸콜린에스터라제를 이용한 해양 저질의 신경 독성물질 진단]
오염 여부를 진단하고자 하는 해수 또는 해양퇴적물에서 농약류 등이 용출될 수 있는 용액인 디클로로메탄(Dichloromethan)으로 오염 여부를 진단하고자 하는 해수 또는 해양퇴적물을 추출한 후 알코올로 추출액을 치환시킨다. 키트에서 제공하는 콜린계 효소 추출물을 98 웰 마이크로 플레이트에 50㎕씩 분주하고, 완충용액을 98 웰 마이크로 플레이트에 100㎕씩 분주한다. 그 후, 상기 마련한 오염 여부를 측정하고자 하는 매질 추출물을 1㎕씩 콜린계 효소 추출물이 담겨있는 웰에 분주하고 25℃에서 30분간 반응시킨다. 기질을 50㎕ 첨가한 다음, 발색시약인 DTNB를 첨가하면 노란색 반응이 시작되므로 흡광도 405nm에서 5분 간격으로 결과를 측정한다. 표준시약인 티오콜린 용액 50㎕를 발색시약인 DTNB와 반응시킨다. 흡광도 405nm에서 5분 간격으로 결과를 측정하여 상기의 콜린계 효소에 매질 추출물을 반응시켜 기질과 발색시약을 첨가하여 이루어진 노란색 반응의 결과와 비교한다.
이러한 방법으로 해수 등의 수질이 신경 독성오염물질에 의하여 오염되었는지의 여부를 스크리닝한 결과는 도 7에서 확인할 수 있다. 도 7은 M1에서부터 M9까 지의 다양한 지역에서 수집한 수질을 본 키트를 이용하여 오염 여부를 측정한 결과를 그래프이다. 오염 여부의 측정 결과는 기질과 콜린계 효소의 반응 생성물인 티오콜린의 발생률로 나타내었으며, 티오콜린의 발생률이 높을수록 콜린계 효소는 저해되지 않은 것이므로, 수질이 오염되지 않았음을 확인할 수 있는 것이며, 티오콜린의 발생률이 낮을수록 콜린계 효소는 저해된 것이므로, 수질이 오염되었다는 것을 확인할 수 있는 것이다. M1에서부터 M9까지의 다양한 지역에서 수집한 수질을 매질로 하여 본 키트의 아세틸콜린에스터라제 추출물 및 기질과 반응시키고 발색시약을 첨가하여 티오콜린의 발생률을 노란색 반응을 통하여 측정하여 본 결과 M2, M4 및 M6의 시료의 경우에 티오콜린 발생이 현저히 낮은 것으로 보아 콜린계 효소가 오염물질에 의하여 그 활성이 저해되었음을 확인할 수 있다. 즉, M2, M4 및 M6의 시료들을 수집한 지역이 신경독 성물질의 위해성에 노출된 오염지역임을 알 수 있다. 그래프에서 EH의 경우는 해수에서 수집한 매질 대신 100% 알코올을 첨가하여 반응하였으므로, 콜린계 효소의 활성이 전혀 저해되지 않아 티오콜린의 발생률이 최고치임을 확인할 수 있다. 그래프에서 HA는 대조군으로서 청정해역의 수질을 수집하여 매질로서 반응시킨 것으로 티오콜린의 발생률이 EH의 경우에 약간 못 미치나 거의 흡사한 것으로 보아 콜린계 효소의 활성이 거의 저해되지 않았음을 알 수 있다.
도 8은 오염지역으로부터 수집한 시료를 알코올로 각각 희석율을 달리하여 희석한 후 본 키트를 이용하여 수질오염 여부를 진단한 결과 그래프이다. 그래프 의 ET의 경우에는 오염된 해수로부터의 매질 대신에 알코올만을 시료로써 첨가한 경우므로 효소의 활성이 전혀 저해되지 않았음을 확인할 수 있으며, 알코올을 100%에서 400%로 희석할 수록 티오콜린의 발생률이 높아지는 것을 통해, 효소의 활성이 점차로 저해되지 않음을 확인할 수 있다. 결과에 따르면, 알코올로 시료의 희석을 증가할수록 콜린계 효소와 기질의 반응물인 티오콜린의 발생률이 증가함을 알 수 있으며, 이로써 오염된 매질이 희석됨에 따라, 콜린계 효소의 활성이 덜 억제되는 것을 알 수 있다.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명의 청정해역에 서식하는 어류의 근육이나 뇌 조직에서 추출한 오염진단용 콜린계 효소의 추출물을 포함한 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트를 통해 해양퇴적물 및 수질의 신경 독성물질에의 오염 여부를 진단함에 있어서 종래방법의 단점을 극복하여 손쉽게 오염 여부를 조기에 진단할 수 있는 키트를 제공할 수 있다.
이로써 본 발명은 오염지역의 생물체를 직접 수집하지 않고서도 해양퇴적물 및 수질 오염 여부를 실험실에서 조기진단할 수 있도록 한다. 어느 지역이든지 매질로써 해양퇴적물이나 수질을 얻을 수 있는 곳이라면 손쉽게 신경독 성물질의 위해성을 평가할 수 있으며, 손쉽고 정확한 방법으로 조기진단을 가능하도록 한다.

Claims (8)

  1. 신경 독성물질에 의하여 활성이 저해되는 콜린계 효소 추출물, 상기 콜린계 효소 추출물과 반응하여 반응 생성물을 만들기 위한 기질, 상기 콜린계 효소 추출물과 기질의 반응 생성물과 색 반응을 일으키도록 하는 발색시약 및 상기 효소 추출물을 고정화하기 위한 마이크로 플레이트를 포함하는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트에 있어서,
    상기 콜린계 효소 추출물은 청정해역에 서식하는 어패류의 근육에서 추출한 부티릴콜린에스터라제(Butyrylcholinesterase, BChE)인 것을 특징으로 하는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발색시약과 색 반응을 일으키는 물질로서, 상기 콜린계 효소 추출물과 기질의 반응 생성물이 발색시약에 의해 일으키는 색 반응의 기준이 되는 표준시약을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트.
  3. (삭제)
  4. (삭제)
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 기질은 아세틸티오콜린(Acetylthiocholine) 또는 부티릴티오콜린(Butyrylthiocholine)인 것을 특징으로 하는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 발색시약은 DTNB인 것을 특징으로 하는 해양퇴적물 및 수질 오염 진단키트.
  7. 제2항에 있어서, 상기 표준시약은 티오콜린(thiocholine)인 것을 특징으로 하는 수질 오염 진단키트.
  8. 마이크로 플레이트에 콜린계 효소 추출물을 결합시키는 단계;
    완충용액을 마이크로 플레이트에 분주하는 단계;
    상기 콜린계 효소 추출물이 결합한 마이크로 플레이트에 검사하고자 하는 해수를 분주하는 단계;
    기질, 촉매제를 마이크로 플레이트에 첨가하는 단계;
    상기 해수를 분주한 플레이트에 발색시약을 첨가하는 단계;
    효소의 활성에 따라 색 반응이 일어나는 단계; 및
    상기 발색시약에 의한 발색 반응을 흡광도를 이용하여 측정하는 단계를 포함하여 이루어지는 해수의 오염 진단방법에 있어서,
    상기 콜린계 효소 추출물은 청정해역에 서식하는 어패류의 근육에서 추출한 부티릴콜린에스터라제(Butyrylcholinesterase, BChE)인 것을 특징으로 하는 해수의 오염 진단방법.
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