KR20060104704A - 아세틸콜린에스터라제 또는 그 변이체와 감광물질이부착되어 있는 잔류 농약 검출용 스트립 - Google Patents

아세틸콜린에스터라제 또는 그 변이체와 감광물질이부착되어 있는 잔류 농약 검출용 스트립 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아세틸콜린에스터라제(AChE) 또는 그 변이체와 감광가교화물질 이 Im-P 막에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 잔류농약 검출용 스트립 및 상기 스트립을 이용하는 것을 특징으로 하는 농작물 및 토양 잔류농약의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 잔류농약 검출용 스트립은 냉장보관시 활성이 안정하여 장기간 보관하며 사용하는 것이 가능하고, 기존 검출방법보다 간편하고 민감하게 농약의 잔류여부를 확인할 수 있다. 특히, 유기인계와 카바메이트계 농약에 대한 민감성이 매우 높고, 잔류농도까지 측정할 수 있다는 장점을 가진다.
바이오센서, 잔류농약 검출, 아세틸콜린에스터라제(AChE), 스트립

Description

아세틸콜린에스터라제 또는 그 변이체와 감광물질이 부착되어 있는 잔류 농약 검출용 스트립{Strip for Detecting a Remained Pesticide, Attached Acetylcholinesterase or Its Mutant and Photosensitive Material}
도 1은 막의 종류에 따른 효소시료의 고정상태를 나타낸 사진이다. a)의 1은 셀룰로오즈 막을 나타내고, 2는 DEAE막을 나타내며, 3은 필름막을 나타낸다. b)는 Im-P막 상에 효소를 고정시켜 발색시킨 상태를 나타낸 사진이다.
도 2는 추출시약으로 사용하는 메탄올과 버퍼의 비율에 따른 발색 정도를 효소량과 기질농도를 변화시키면서 알아본 사진이다. 1은 버퍼만을 사용한 경우를 나타낸 것이고, 2, 3, 4, 5 및 6은 각각 메탄올:버퍼의 비율을 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 및 1:5로 사용한 경우를 나타낸 것이다. a, b 및 c는 각각 기질 농도 1mM, 2mM 및 4mM에서 Karnovsky법으로 발색한 경우이고, d는 기질농도 1mM에서 Ellman 발색법을 사용하여 발색시킨 경우이다.
도 3은 본 발명의 따른 잔류 농약 검출용 스트립의 사용 전 사진이다.
도 4는 완충용액의 pH에 따른 효소활성 정도를 나타낸 것이다. a)는 pH6.0과 pH7.4의 버퍼에서 시간에 따른 효소활성의 변화를 나타낸 것이며, b) pH변화에 따른 발색정도를 나타내는 효소 스트립의 사진으로, 1 및 2는 각각 pH6.0 및 pH7.4를 나타낸다.
도 5는 본 발명에 따른 잔류 농약 검출용 스트립의 기질농도에 따른 발색정도의 차이를 나타낸 사진이다. a, b 및 c는 각각 7mM, 3mM 및 1mM의 기질농도를 나타낸다.
도 6a 내지 도 6e는 strip과 기존법에 의한 각종 유기인계 및 카바메이트 농약의 저해율을 나타낸 것이다. 각 그래프에서, kinetic은 시중에 사용되는 용액상의 간이검사법을 이용한 결과이고, 스트립은 본 발명에 따른 스트립을 이용한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 스트립에 유기인계(A) 및 카바메이트계(B) 농약을 처리하여 AChE 저해정도를 살펴본 사진이다. 도7(A)에서 a는 control, b는 아진포스메칠, c는 카보페노치온, d는 클로르페빈포스, e는 클로르피리포스, f는 디메토에이트, g는 이피엔, h는 에치온, I는 페니트로치온, j는 말라치온, k는 펜토에이트, l은 파라치온, m은 펜토에이트, n은: 포살론, o는 포스머트, p는 프리미포스메칠, q는 펜치온, r은 오메토에이트이고, 도(B)에서 a는 control, b는 프로복서, c는 벤디오카브, d는 카바릴, e는 카보후란, f는 옥사밀, g는 이소프로카브이다.
도 8은 저장기간에 따른 스트립의 저장 안정성을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 아세틸콜린에스터라제(AChE) 또는 그 변이체와 감광가교화물질이 Im-P 막에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 잔류농약 검출용 스트립 및 상기 스트립을 이용하는 것을 특징으로 하는 농작물 및 토양 잔류농약의 검출방법에 관한 것이다.
농산물 또는 식품 중의 농약의 잔류가 커다란 문제가 되고 있어 농산물 및 토양의 잔류농약의 검출방법에 대한 관심이 높아지고 있다. 잔류농약 속성검사법은 현재 사용되는 농약 중 유기인계와 카바메이트계 살충제를 검사하는 방법으로써 이들 농약성분에 의한 곤충의 신경전달계 효소인 AchE에 대한 저해 특성을 이용한다. 즉, 유기인계와 카바메이트계 살충제는 신경전달을 마비시켜 곤충의 이상흥분을 유발시킴으로서 그 살충작용을 나타내기 때문에 이러한 원리를 이용하여 곤충으로부터 AchE를 분리하여 채소류 등으로부터 추출한 농약추출액과 반응시켜 이 효소의 활성이 저해되는 정도를 측정하여 이들 농약의 잔류여부를 알아낼 수 있다.
이러한 잔류농약 속성검사법은 검사할 수 있는 농약이 유기인계와 카바메이트계 살충제로 한정되어 있다는 점과 이들 농약의 잔류량을 알 수가 없다는 단점이 있으나, 실제로 국내에서 농산물에 잔류하여 기준치를 초과하는 농약성분의 대부분(70-80%)이 유기인계 및 카바메이트계 살충제로 나타나고 있으며, 독성학적인 측면에서 인체에 가장 해로운 농약들이 유기인계, 카바메이트계 살충제이므로 농산물의 안정성 측면에서 충분히 그 효과를 볼 수 있을 것으로 사료된다.
유기인계 살충제는 천연 기질인 아세틸콜린과 구조적으로 유사한 에스테르 화합물이다. 살충제의 인산기는 AchE의 에스테르부위에 끌리고, 나머지 부위는 비록 양하전기가 없을 지라도, AchE의 여러 아미노산 잔기와 상호작용에 의해 효소표면에 배열된다. 유기인계 살충제는 아세틸콜린과 마찬가지의 과정을 거쳐 분해되고 효소를 인산화시킨다. 그러나 효소와 인산기 간의 에스테르 결합은 아세틸화된 에스테르 결합에 비하여 가수분해에 매우 안정하다. 인산기가 dimethylphosphate인 경우에 효소의 반이 회복하는 데 걸리는 시간은 약 80분이 소요되고, diethylphosphate인 경우에는 전자에 비해 6배나 더 오래 걸린다고 알려져 있다. 이러한 시간은 자연적으로 아세틸화한 효소가 회복하는 데에 걸리는 시간에 비해 약 100만 배 이상 더 오래 걸리는 시간이다.
유기인계 살충제에 의해 인산화된 AChE 즉 저해된 AChE는 간극에 방출된 아세틸콜린을 분해할 수 없게 되고, 축적된 아세틸콜린은 지속적으로 수용기와 결합하게 되고, 활성화된 수용기는 지속적으로 신경충격(nerve impulse)을 만들어 전파하고, 축색돌기에 자리잡은 이온통로와 이온펌프는 지속적으로 개폐되어 작동하고, 이로 인해 신경전달에 교란이 야기되고 에너지는 고갈되어 결국에는 곤충은 마비되어 죽게 된다.
카바메이트계 살충제는 유기인계 살충제와 마찬가지로 일종의 에스테르화합물이다. 카바메이트계 살충제의 작용기작은 본질적으로 유기인계 살충제와 유사하다. 즉, AChE의 세린 수산기를 카바밀화(carbamylation)하여 효소를 저해한다. 수산기를 가진 이탈기(leaving group)가 생성되고, 주된 작용점이 중추신경계이라는 점도 유사하며, 중독증상도 유사하다. 다만 카바밀화된 효소는 인산화된 효소에 비 하여 상대적으로 덜 안정적이다. 대개 카바밀화된 효소는 수십 분 내에 가수분해되어 회복된다. 그러므로 AchE의 저해정도를 측정함으로서 유기인계 및 카바메이트 계통의 농약의 존재유무를 알 수 있게 되는 것이다.
바이오센서(biosensor)는 여러 가지 효소, 미생물, 항체와 항원, 수용체 그리고 동식물의 조직 등을 이용하여 생체관련물질을 감지하고, 정량하는 소자로서 기초과학, 환경오염물질의 측정, 식품공학 등에 광범위하게 사용되고 있다. 바이오센서를 이용하는 방법은 정량분석이 가능하며, 농약의 종류와는 무관하게 포함된 농약의 전체량을 결정할 수 있으며, 단시간 내에 정량이 가능하다는 점이다. 특히 저렴한 가격으로 실험실이 아닌 포장이나 집에서도 측정이 가능하다는 장점을 가지고 있다. 한편 농약의 종류를 판별해 낼 수 없다는 단점도 가지고 있다. 그러나 단가가 싸고 시간이 적게 걸리며 손쉬운 조작에 의하여 잔류 농약을 분석할 수 있어 채소류와 같이 유통기간이 짧은 농산품의 잔류농약 검정용으로 최적이라 하겠다.
효소를 이용한 바이오센서인 효소센서는 효소의 기질특이성, 작용특이성 및 저농도 반응특이성 등의 특징을 이용하여 고도의 정확성을 요구하는 센서로서 적당하다. 특히 기질 및 작용특이성은 여러 가지 측정대상물질이 혼합되어 있는 시료에서도 동시에 각각의 측정대상물질의 농도를 정량화할 수 있으므로 효소센서는 매우 유용한 측정방법이다.
효소센서의 개념은 Clark와 Lyon에 의해 제시되었고, Updlike와 Hicks는 Aspergillus niger에서 추출한 글루코오스산화효소를 고정화하여 효소센서를 제조하였다. 바이오센서에 있어서 감지막의 형성은 감도, 감지시간에 직접적인 영향을 줄 뿐 만아니라 센서의 저장 및 안정성에도 관계가 있어 감지막 물질로는 효소에 대한 독성이 적고 효소를 균일하게 분산시킬 수 있는 수용성 고분자를 사용하는게 좋다. Hanazato 등은 감광성 수용성으로서 polyvinyl alcohol(PVA)를 기질 고분자로 하고 여기에 stilbazolium(SbQ) 감광성기를 도입하여 글루코오스 산화효소를 고정화한 포도당 센서에 대하여 보고하였다 (Shiono, S. et al., Methods Biochem Anal, 36:151-78, 1992).
AchE를 고정화시킨 최초의 효소전극으로는 Durand 등이 아세틸콜린의 농도를 측정하기 위한 목적으로 효소를 포함하는 젤라틴 용액을 전극표면에 흡착시킨 것으로서 시도된 바 있다 (Durand et al., Biochim Biophys Acta. 527:277-81, 1978). 그 후 보다 안정한 효소로서 알려진 butylcholinesterase를 고정화 시킨 효소전극이 보고된 바 있으며, quartz-fiber에 형광 표지된 AchE를 고정화시킨 바이오센서가 보고된 바 있다 (Rogers, K.R. et al., Fundam Appl Toxicol, 16:810-20, 1991).
또한, AChE와 tyrosinase의 두 효소의 공동작용에 의한 유기인계를 측정할 수 있는 바이오센서(Andreescu et al., Anal Bioanal Chem. 374:39-45, 2002), AChE 유전자를 바큘로바이러스(baculovirus)를 이용하여 sf9 cell에 감염시킨 후 단백질을 최대한 발현시켜 바이오센서의 재료로 사용한다거나(Chaabihi, H., Biochem Biophys Res Commun. 203:734-42, 1994), AChE의 Y408F 및 F368L 변이체를 제조하여 유기인계와 카바메이트계 농약에 대한 감수성을 높인 다음 감광성 물질인 PVA-SbQ를 이용하여 바늘 타입의 백금과 구리 전극에 고정시킨 바이오센서 (Turdean, G.L., J. Enzyme. Inhib. Med. Chem., 17:107, 2002)와, 초파리의 AChE의 Y408F, F368L 및 F368H 변이체들을 멀티전극에 고정하여 바이오센서를 제작한 보고도 있었다 (Bachmann, T.T. et al., Biosens. Bioelectron., 15:193, 2002). 그러나, 상기 바이오센서는 전극에 AChE 및 그 변이체들을 전극에 고정시킴으로서 결과 검출시에 포텐티오스탓(potentiostat) 또는 폴라올가노픽(polar organographic) 분석기 등의 고가의 장비를 사용하여야 하며, 잔류농약에 대한 민감성과 효소 안정성이 낮다는 단점을 가지고 있다.
한편, AChE를 이용하여 유기인계 및 카바메이트계 살충제의 잔류 유무를 측정하는 간이법은 사용되고 있으나, 이러한 잔류농약 속성검사법은 검사할 수 있는 농약이 유기인계와 카바메이트계 살충제로 한정되어 있다는 점과 이들 농약의 잔류농도로 알 수 없다는 문제점을 갖고 있다.
이에, 본 발명자들은 곤충세포의 AchE 또는 그 변이체를 감광물질에 용해한 다음, 광 가교반응(photo cross-linking reaction)에 의하여 Im-P 막 위에 고정화시켜 스트립 형태로 제작한 결과, 편의성 및 안정성이 뛰어날 뿐만 아니라, 유기인계와 카바메이트계 농약에 대한 민감성이 매우 높고, 잔류농도까지 측정할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 편의성 및 안정성이 뛰어나고, 유기인계와 카바메이트계 농약에 대한 민감성이 매우 높은 잔류농약 검출용 스트립 및 그 제조방법을 제공하 는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 잔류농약 검출용 스트립을 이용하는 것을 특징으로 하는 잔류농약의 검출방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) AChE 또는 그 변이체를 고분자 감광물질인 PVA-SbQ과 혼합하는 단계; (b) 상기 AChE 또는 그 변이체와 PVA-SbQ의 혼합액을 약 4℃에서 약 3시간 보관하여 기포를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 기포가 제거된 AChE 또는 그 변이체와 PVA-SbQ의 혼합액을 Im-P막에 침적하고, UV조건하에서 반응시켜 고정시키는 단계를 포함하는 잔류농약 검출용 스트립의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 AChE는 서열번호 1의 아미노산 서열과 80%이상의 상동성을 가지고, 상기 변이체는 107Y, F368L 및 Y408F인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 효소의 농도는 OD412nm 0.5~2인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, AChE 또는 그 변이체와 PVA-SbQ가 Im-P막에 고정되어 있는 잔류농약 검출용 스트립 및 상기 잔류농약 검출용 스트립을 이용하는 것을 특징으로 하는 잔류농약의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 잔류농약 검출방법은 (a) 검출할 시료에서 잔류농약을 메탄올로 추출하는 단계; (b) 상기 메탄올 추출물을 효소 버퍼와 혼합하는 단계; (c) 상기 혼합액에 상기 잔류농약 검출용 스트립을 침적시키는 단계; (d) 상기 침적된 스트립을 AchE 기질용액에 재 침적시키는 단계; 및 (e) 상기 재 침적된 스트립을 발색시켜 발색정도를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 잔류농약 검출방법에 있어서, AchE 기질용액의 농도는 0.5~4mM인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 농약은 유기인계 및/또는 카바메이트계인 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 스트립의 제작
잔류농약 검출용 스트립에 부착할 효소시료는 본 발명자들에 의한 선행논문의 방법에 의해 제조하였다 (Kim, Y.M. et al., J. Korean Soc. Agric. Chem. Biotechnol., 46:353, 2003). 상기 방법에 의해 제조된 효소 원시료를 약 10배 희석하여, 412nm에서의 흡광도가=1.2가 되게 한 다음, 효소시료 400㎕에 고분자 감광물질인 PVA-SbQ(Toyo Gosei., Co.Ltd) 100㎕를 잘 섞은 다음, 4℃에서 3시간 정도 보관하여 기포를 없앤 후 막에 부착시켜, UV에서 1시간 동안 반응시켜 고정시켰다.
상기 감광물질인 PVA-SbQ는 효소에 대한 독성이 적고 효소를 균일하게 분산 시킬 수 있는 수용성 고분자인 polyvinyl alcohol에 감광성기를 가진 stilbazolium(SbQ)을 결합시킨 물질로 그 구조는 아래와 같다.
Figure 112005017124701-PAT00001
< PVA-SbQ의 구조>
효소시료를 고정할 막을 선택하기 위하여 셀룰로오스 막과, DEAE막, 및 Im-P막에 본 발명의 효소시료를 고정하여 발색시켜 보았다. 셀룰로오스 막은 막 위에 효소와 PVA-SbQ를 섞은 후, 막 위에 고정하였지만 효소가 고정된 막 주변으로 효소가 번져 결과의 판독이 어려웠으며, DEAE 막에 효소를 고정하였을 때는 막이 찌그러져 적당하지 않았다. 필름막은 효소를 고정하는데 까지는 성공하였지만 버퍼에서 발색 시에 고정된 효소들이 막에서 떨어져 나와 결과 판독이 불가능 하였다. 그러나, Im-P 막을 사용한 경우에는 효소를 막 위에 깨끗하게 고정시킬 수 있고, 발색시 효소가 번지지도 않아, Im-P막을 사용하여 스트립을 제작하였다 (도 1).
스트립의 막에 고정시킬 효소의 적량을 확인하기 위하여 효소의 원시료액을 희석하여, 412nm에서의 OD값이 2.0, 1.5 및 0.5인 효소시료를 제조한 다음, PVA-sbQ를 섞어 Im-P막에 고정하여 스트립을 제조하였다.
상기 제조된 스트립을 표준농약시료를 사용할 때 50% 저해되는 농도에서 농 약추출액과 반응시킨 후 발색하여 저해율을 구해본 결과, OD값 2.0일 때가 저해율이 가장 낮았으며, OD 1.0에서 좋은 편차를 나타내어 OD 1.0의 효소시료를 스트립 제조에 사용하였다 (도 2). 본 발명에 따른 잔류농약 검출용 스트립의 외양은 도 3과 같다.
실시예 2. 스트립을 이용한 농약 검출
잔류농약의 최적 검출조건을 찾기 위하여, AchE의 기질용액(7.5mL 1mM acetylthiocoline iodide)에, 122mM sodium citrate, 26mM copper sulfate 및 5mM ferricyanide를 각각 섞은 용액에 실시예 1에서 제조한 스트립을 10분간 담가 반응시킨 다음, 발색정도를 densitometer(GS 710 Calibrated imaging Densitimeter, Bio-Rad)로 측정하였다.
(1) 효소 고정막 발색시 발색시약의 비율
1mM AchE 기질 (acethylthiocoline iodide), 30mM copper sulfate, 5mM potassium ferricyanide 및 122mM sodium citrate를 7.5:1:1:0.5의 비율로 섞어 발색 버퍼로 사용하였다. 상기 발색 버퍼는 각각의 성분의 stock solution을 만들어 보관하면서 발색직전에 위의 비율로 섞은 후 실온에서 10분간 방치한 후 발색시켰으며, 각각의 성분 용액들을 따로 만들지 않고 섞어서 보관했을 때는 빨간색의 침전물들이 발생하여 효소발색시, 막 위에 달라붙어 효소의 활성을 측정할 때 오차가 발생하였다. 그리고 또한 위의 버퍼들을 섞은 후 바로 사용하게 되면 효소가 빨갛 게 발색된 후 시간이 지나야 원래의 발색 형태로 돌아오게 되어 오히려 효소발색 시간이 지체될 뿐만 아니라 효소의 발색률 오차가 커졌다.
(2) 발색시 완충액의 pH에 따른 영향
본 발명의 스트립 발색 시 버퍼의 pH를 달리하여 시간별로 발색 시켜본 결과, pH 7.4에서보다는 6.0에서 발색률이 좋았으며, 증류수에서 가장 높았다. 그러나 증류수는 스트립의 발색시 버퍼에 비해 효소의 안정성이 낮기 때문에 발색시 사용할 버퍼의 pH는 6.0으로 하였다 (도 4). 또한 효소 고정막을 발색시켜본 결과도 pH 6.0일 때가 pH 7.4일 때보다 발색의 정도가 훨씬 선명하게 나왔다(도 4b). 이로써 스트립 발색 기질 버퍼의 최적 pH를 6.0으로 정하였다.
(3) 최적 기질농도
효소발색시 최적의 기질농도를 알아보기 위해 기질 농도를 7mM, 3mM 및 1mM로 만들어 발색 정도를 알아보았다. 1mM과 3mM에서는 발색 정도의 차이가 거의 없었으나, 7mM일 때는 1mM과 3mM에 비해 확연히 구분될 정도로 진하게 발색되었다. 그러나 효소량에 따른 발색정도의 구분과 기질농도의 가격에 대한 소비량을 고려하여 1mM과 3mM과의 차이점이 거의 생기지 않았으므로, 최적의 기질농도를 1mM로 정하는 것이 바람직하다고 사료되어 발색시의 기질농도를 1mM로 정하였다 (도 5).
(4) 농약에 의한AChE 활성의 저해율
농약에 의한 AChE 활성의 저해율은 하기의 식으로 계산하였다.
저해율(%)=[(Control의 효소활성도 - 양성시료의 효소활성도)/(Control의 효소활성도)] ×100
상기 식에서, control의 효소 활성도는 농약이 첨가되지 않아 정상적으로 남아있는 효소량(값)을 의미하고, 양성시료의 효소활성도는 농약이 첨가되어 효소가 불활성 된 후 남아있는 효소량(값)을 의미한다.
(5) 농약추출액과 완충액의 비율
본 발명의 스트립과 표준 농약을 반응시키기 위하여, 메탄올 1ml, bromic water 20㎕ 및 농약 20㎕를 섞어, 5분 반응 후 다시 반응 버퍼와 섞었다. 버퍼와 섞은 반응액에 실시예 3에서 제조된 스트립을 넣고 10분간 반응시킨 다음 발색용액에 넣고 발색시킨 후, 발색정도를 측정하였다.
농약추출 시 사용하게 될 메탄올이 효소발색에 영향을 주기 때문에 최적의 효소발색을 위한 농약추출액과 완충액의 적당한 비율을 찾기 위해서 농약추출액과 버퍼의 양의 비율을 달리하면서 실험한 결과, 동량으로 섞은 후, 효소 고정막을 10분동안 발색액에 담근 후 효소를 활성화 시켰을 때는 효소발색이 전혀 일어나지 않았으며, 농약추출액과 완충액을 1:3의 비율로 섞어 효소 고정막을 발색시켰을 때부터 효소가 활성화 되었다. 따라서 본 발명에서는 농약 추출액과 완충액의 비율을 1:3으로 하여 반응시켰다 (도 6).
(6) 발색방법
AChE의 발색법을 찾기 위해 2가지 방법으로 실험한 결과 Ellman방법은 발색이 너무 빨리 되어 효소가 포화상태에 이르는 시간이 짧아, 각각의 스트립의 효소저해율에 큰 차이가 나지 않아 결과 판독이 어려웠다. 다른 방법인 Karnovsky의 방법으로 효소를 발색시켰을 때는 효소의 양에 따른 차이가 확연하게 구분되어 본 발명의 스트립을 발색시키는 방법으로는 Karnovsky의 방법을 사용하였다 (도 6).
상기 최적화된 조건에서, 본 발명의 잔류농약검출용 스트립을 이용하여 클로르피리포스, 카보후란, 디메토에이트, EPN 등의 유기인계 및 카바메이트계 농약을 발색·검출한 결과, 높은 감도의 저해율을 나타내었다 (도 7). 이 결과로부터 본 발명의 잔류농약검출용 스트립은 잔류농약의 검출에 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 스트립의 안정성 실험
실시예 1에서 제작된 스트립의 저장기간 및 조건에 따른 안정성을 알아보기 위하여, 실온과 4℃에 각각 보관하면서 15일 단위로 스트립을 발색시킨 후 활성도를 측정하였다. 4℃에서는 105일이 지나도 여전히 발색정도가 변하지 않았지만, 25℃에서는 90일째부터 활성이 떨어짐을 알 수 있었다. 그러므로 스트립을 냉장보관 하면 활성을 저하시키지 않고 오랫동안 보관할 수 있음을 알 수 있었다 (도 8).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통 상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 AchE 또는 그 변이체와 감광물질이 Im-P 막에 부착되어 있는 것을 특징으로 하는 잔류농약 검출용 스트립 및 상기 잔류농약 검출용 스트립을 이용하는 것을 특징으로 하는 잔류농약의 검출방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 잔류농약 검출용 스트립은 냉장보관시 활성이 안정하여 장기간 보관하며 사용하는 것이 가능하고, 기존 검출방법보다 간편하고 민감하게 농약의 잔류여부를 확인할 수 있다. 특히, 유기인계와 카바메이트계 농약에 대한 민감성이 매우 높고, 잔류농도까지 측정할 수 있다는 장점을 가진다.
<110> Soiltek Co.Ltd. <120> Strip for Detecting a Remained Pesticide, Attached Acetylcholinesterase or Its Mutant and Photosensitive Material <130> P04-059 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 649 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 1 Met Ala Ile Ser Cys Arg Gln Ser Arg Val Leu Pro Met Ser Leu Pro 1 5 10 15 Leu Pro Leu Thr Ile Pro Leu Pro Leu Val Leu Val Leu Ser Leu His 20 25 30 Leu Ser Gly Val Cys Gly Val Ile Asp Arg Leu Val Val Gln Thr Ser 35 40 45 Ser Gly Pro Val Arg Gly Arg Ser Val Thr Val Gln Gly Arg Glu Val 50 55 60 His Val Tyr Thr Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro Pro Val Glu Asp Leu 65 70 75 80 Arg Phe Arg Lys Pro Val Pro Ala Glu Pro Trp His Gly Val Leu Asp 85 90 95 Ala Thr Gly Leu Ser Ala Thr Cys Val Gln Glu Arg Tyr Glu Tyr Phe 100 105 110 Pro Gly Phe Ser Gly Glu Glu Ile Trp Asn Pro Asn Thr Asn Val Ser 115 120 125 Glu Asp Cys Leu Tyr Ile Asn Val Trp Ala Pro Ala Lys Ala Arg Leu 130 135 140 Arg His Gly Arg Gly Ala Asn Gly Gly Glu His Pro Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Ala Asp Thr Asp His Leu Ile His Asn Gly Asn Pro Gln Asn Thr Thr 165 170 175 Asn Gly Leu Pro Ile Leu Ile Trp Ile Tyr Gly Gly Gly Phe Met Thr 180 185 190 Gly Ser Ala Thr Leu Asp Ile Tyr Asn Ala Asp Ile Met Ala Ala Val 195 200 205 Gly Asn Val Ile Val Ala Ser Phe Gln Tyr Arg Val Gly Ala Phe Gly 210 215 220 Phe Leu His Leu Ala Pro Glu Met Pro Ser Glu Phe Ala Glu Glu Ala 225 230 235 240 Pro Gly Asn Val Gly Leu Trp Asp Gln Ala Leu Ala Ile Arg Trp Leu 245 250 255 Lys Asp Asn Ala His Ala Phe Gly Gly Asn Pro Glu Trp Met Thr Leu 260 265 270 Phe Gly Glu Ser Ala Gly Ser Ser Ser Val Asn Ala Gln Leu Met Ser 275 280 285 Pro Val Thr Arg Gly Leu Val Lys Arg Gly Met Met Gln Ser Gly Thr 290 295 300 Met Asn Ala Pro Trp Ser His Met Thr Ser Glu Lys Ala Val Glu Ile 305 310 315 320 Gly Lys Ala Leu Ile Asn Asp Cys Asn Cys Asn Ala Ser Met Leu Lys 325 330 335 Thr Asn Pro Ala His Val Met Ser Cys Met Arg Ser Val Asp Ala Lys 340 345 350 Thr Ile Ser Val Gln Gln Trp Asn Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Ser Phe 355 360 365 Pro Ser Ala Pro Thr Ile Asp Gly Ala Phe Leu Pro Ala Asp Pro Met 370 375 380 Thr Leu Met Lys Thr Ala Asp Leu Lys Asp Tyr Asp Ile Leu Met Gly 385 390 395 400 Asn Val Arg Asp Glu Gly Thr Tyr Phe Leu Leu Tyr Asp Phe Ile Asp 405 410 415 Tyr Phe Asp Lys Asp Asp Ala Thr Ala Leu Pro Arg Asp Lys Tyr Leu 420 425 430 Glu Ile Met Asn Asn Ile Phe Gly Lys Ala Thr Gln Ala Glu Arg Glu 435 440 445 Ala Ile Ile Phe Gln Tyr Thr Ser Trp Glu Gly Asn Pro Gly Tyr Gln 450 455 460 Asn Gln Gln Gln Ile Gly Arg Ala Val Gly Asp His Phe Phe Thr Cys 465 470 475 480 Pro Thr Asn Glu Tyr Ala Gln Ala Leu Ala Glu Arg Gly Ala Ser Val 485 490 495 His Tyr Tyr Tyr Phe Thr His Arg Thr Ser Thr Ser Leu Trp Gly Glu 500 505 510 Trp Met Gly Val Leu His Gly Asp Glu Ile Glu Tyr Phe Phe Gly Gln 515 520 525 Pro Leu Asn Asn Ser Leu Gln Tyr Arg Pro Val Glu Arg Glu Leu Gly 530 535 540 Lys Arg Met Leu Ser Ala Val Ile Glu Phe Ala Lys Thr Gly Asn Pro 545 550 555 560 Ala Gln Asp Gly Glu Glu Trp Pro Asn Phe Ser Lys Glu Asp Pro Val 565 570 575 Tyr Tyr Ile Phe Ser Thr Asp Asp Lys Ile Glu Lys Leu Ala Arg Gly 580 585 590 Pro Leu Ala Ala Arg Cys Ser Phe Trp Asn Asp Tyr Leu Pro Lys Val 595 600 605 Arg Ser Trp Ala Gly Thr Cys Asp Gly Asp Ser Gly Ser Ala Ser Ile 610 615 620 Ser Pro Arg Leu Gln Leu Leu Gly Ile Ala Ala Leu Ile Tyr Ile Cys 625 630 635 640 Ala Ala Leu Arg Thr Lys Arg Val Phe 645

Claims (9)

  1. 다음의 단계를 포함하는 잔류농약 검출용 스트립의 제조방법:
    (a) AChE 또는 그 변이체를 고분자 감광물질인 PVA-SbQ과 혼합하는 단계;
    (b) 상기 AChE 또는 그 변이체와 PVA-SbQ의 혼합액을 약 4℃에서 약 3시간 보관하여 기포를 제거하는 단계; 및
    (c) 상기 기포가 제거된 AChE 또는 그 변이체와 PVA-SbQ의 혼합액을 Im-P막에 침적하고, UV조건하에서 반응시켜 고정시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AchE는 서열번호 1의 아미노산 서열과 80%이상의 상동성을 가지고, 상기 변이체는 107Y, F368L 및 Y408F인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 효소의 농도는 OD412nm 0.5~2인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 농약은 유기인계 및/또는 카바메이트계인 것을 특징으로 하 는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, AChE 또는 그 변이체와 PVA-SbQ가 Im-P막에 고정되어 있는 잔류농약 검출용 스트립.
  6. 제5의 잔류농약 검출용 스트립을 이용하는 것을 특징으로 하는 잔류농약의 검출방법.
  7. 제6항에 있어서, 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 잔류농약의 검출방법:
    (a) 검출할 시료에서 잔류농약을 메탄올로 추출하는 단계;
    (b) 상기 메탄올 추출물을 효소 버퍼와 혼합하는 단계;
    (c) 상기 혼합액에 제5항의 스트립을 침적시키는 단계;
    (d) 상기 침적된 스트립을 AchE 기질용액에 재 침적시키는 단계; 및
    (e) 상기 재 침적된 스트립을 발색시켜 발색정도를 측정하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, AchE 기질용액의 농도는 0.5~4mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 농약은 유기인계 및/또는 카바메이트계인 것을 특징으로 하는 방법.
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