DE60024923T2

DE60024923T2 - Verfahren zur Analyse der funktionellen Aktivierung von Leukocyten, Plättchen und anderen Zellen

Info

Publication number: DE60024923T2
Application number: DE60024923T
Authority: DE
Inventors: Alberto 37194 Santa Maria de Tormes Orfao; Atanasio Pandiella
Original assignee: Universidad de Salamanca
Current assignee: Universidad de Salamanca
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2020-05-04
Also published as: US6667149B1; EP1063526A3; DE60024923D1; EP1063526B1; ES2255482T3; ES2178517B1; ES2178517A1; EP1063526A2; ATE313800T1

Description

Die Erfindung bezieht sich hauptsächlich, allerdings nicht ausschließlich, auf ein Verfahren zur schnellen, kostengünstigen, empfindlichen und besonderen Quantifizierung der akkumulierenden Expression von Proteinen, die gewöhnlich transient in der zytoplasmischen Membran exprimiert werden und einen spezifischen, funktionell aktivierten Zustand Wiederspiegeln als Antwort auf eine Aktivierung, die in vivo tätig war und ex vivo messbar ist, oder in vitro verabreicht worden sind, über die Verwendung von Verbindungen, die im Stande sind, selektiv die Spaltung und Sekretion von zytoplasmischen Membranproteinen an extrazelluläre Medien zu inhibieren, ohne die Funktionsweise der Zelle zu beeinflussen. Die Erfindung kann sowohl bei normalen, als auch bei pathologischen Zellen verwendet werden, die in homogenen oder heterogenen Zellproben vorhanden sind, für jeden Zweck, der die Analyse der Expression der Membranproteine, die mit der funktionellen Aktivierung der Zelle oder der Stabilisierung von Membranproteinen assoziiert sind, erfordert, insbesondere für diagnostische, prognostische bzw. voraussagende und behandlungsüberwachende Zwecke.
Zur Zeit ist bekannt, dass jeder funktionelle Prozess, der im einzelligen Stadium stattfindet, sich neben anderen Erscheinungsformen wiederspiegelt im Vorhandensein von Veränderungen in der Expression von verschiedenen Zellproteinen. Unter diesen Modifizierungen sind besonders diejenigen Veränderungen in der Expression von Membranproteinen relevant, wenn sie als Rezeptoren und Liganden bei der Übermittlung von Signalen, Zelle-zu-Zelle und Zelle-extrazelluläre Protein, wirken. Wenn einmal ein Protein in der Zellmembran eine Rolle gespielt hat, oder, manchmal unmittelbar nachdem ein Protein die zytoplasmische Membran der Zellen, die es produziert haben, erreicht hat, werden diese Proteine abgespalten und verlassen die Zellmembran in die extrazellulären Medien über die Aktivität von Proteasen und insbesondere Membranproteasen, die besonders bei den Zellen wirken, wo sie exprimiert worden sind. Somit ereignet sich die Expression dieser Membranproteine häufig in einer transienten Weise für eine veränderliche Zeitdauer, wobei deren Expression abhängt nicht nur von deren Produktionsgeschwindigkeit, sondern auch von der Geschwindigkeit, in der sie von der Zellmembran abgespalten und in die extrazellulären Medien abgegeben wurden.
Seit langem ist bekannt, dass die potentielle Bedeutsamkeit der Messung dieser Membranproteine als funktionelle Aktivierungsmarker in verschiedenen Zell-Typen hoch ist. Da jedoch deren Expression an der Zelloberfläche transient ist, wurde die Analyse von deren Höhe an der zytoplasmischen Membran nicht routinemäßig verwendet. In alternativer Weise wurden Messungen dieser Proteine bei drei verschiedenen Stufen gemacht: 1) Quantifizierung des Proteins, das an die extrazellulären Medien abgegeben wurde (lösliches Protein), 2) qualitative Bewertung (Vorhandensein/Abwesenheit) der Expression des Proteins an der zytoplasmischen Membran, und 3) die kombinierte Bewertung beider Formen des Proteins. Allerdings gewährleisten solche Bestimmungen keine spezifische und/oder empfindliche Information über die Erzeugung dieser Proteine in individuellen Zellen. Daher wurden kürzlich Verfahren entwickelt, die die Quantifizierung der gesamten Erzeugung spezieller Proteine über eine besondere Zeitdauer in einem einzelligen Stadium ermöglichen. Für diesen Zweck wurden chemische Verbindungen verwendet, die eine Blockade des intrazellulären Transports von Sekretionsvesikeln induzieren wie Brefeldin A oder Monensin, um die intrazelluläre Akkumulierung von Proteinen zu induzieren, die erzeugt wurden als Antwort auf eine spezielle Aktivierung, die sich in vivo ereignen kann oder in vitro verabreicht werden können. In dieser späteren Gruppe von Techniken hat die Verwendung von Mitteln, die den Transport und die extrazelluläre Aussonderung von Proteinen in einer nicht-spezifischen Weise an der zytoplasmischen Ebene blockieren drei hauptsächliche Nachteile: 1) deren Verwendung kann mit unerwünschten Veränderungen von anderen Zellfunktionen verbunden sein, 2) die Verwendung dieser Methodik würde nicht die Freisetzung solcher Moleküle des Proteins ausserhalb der Zelle blockieren, das die Zellmembran vor der Verabreichung des blockierenden Mittels erreicht hat, und 3) für die Detektion des interessierenden Proteins im einzelligen Stadium ist die Verwendung von Fixierungs- und Permeabilitäts-Lösungen erforderlich, die die Empfindlichkeit der Methode für die Detektion des Proteins herabsetzen, und stellen eine Einschränkung für deren objektive quantitative Analyse dar.
Bis jetzt wurde noch keine Prozedur beschrieben, die mit einer minimalen Manipulation der Probe die funktionelle Analyse der Aktivierung individueller Zellen ermöglicht, basierend auf der Stabilisierung, und sowohl die quantitative, als auch die akkumulierende Analyse der Pegel der Membranproteine, deren Expression bei der Zelloberfläche gewöhnlich vorübergehend ist.
Remold – O'Donnell et al. (J Immunol 152, 3595–3605, 1994) haben die Durchführbarkeit der mit der inhibierenden Aktivierung verbundenen Herabsetzung der konstitutionellen CD43 Expression bei aus peripheren Blutproben isolierten Neutrophilen gezeigt. Diese Autoren zeigen, dass eine solche Herabsetzung auf die Inhibierung einer Protease, die sie cd43'ase nennen, zurückgeht, es gelang ihnen allerdings nicht, diese zu identifizieren. In jüngerer Zeit zeigten Remold – O'Donnell et al. (Blood 85, 337–342, 1995), dass die Substanzen, die zur Vermeidung der Herabsetzung der CD43-Expression verwendet wurden, wichtige funktionelle Veränderungen in Neutrophil-Funktionen induzieren, wie Phagocytose und Neutrophil-Gestalt, was zeigt, dass eine nicht-spezifische inhibitorische Wirkung hervorgerufen wurde.
Daher besteht eine Aufgabe dieser Erfindung aus dem Vorschlagen einer Lösung für die Untersuchung der funktionellen Aktivierung von Leukozyten, Blutplättchen und anderen Zellen, die in vivo erzeugt wurden und dafür empfänglich sind, ex vivo analysiert zu werden, oder in vitro induziert werden kann, basierend auf der Stabilisierung der Proteine aus der zytoplasmischen Membran, und deren Detektion in unmanipulierten Proben unter Verwendung quantitativer zytometrischer Techniken.
Auf ähnliche Weise besteht eine weitere Aufgabe dieser Erfindung aus dem Erlernen der Kinetik der Aktivität von Proteasen, die teilnehmen an Prozessierung, Schneiden und Freigabe von Proteinen außerhalb der Zellmembran, die verbunden sind mit funktionellen Aktivierungsprozessen von Leukozyten, Blutplättchen und anderen Zellen, die messbar ist ex vivo oder nach Induzieren in vitro.
Weiter im Besonderen und in Übereinstimmung mit dem, was obenstehend beschrieben worden ist, basiert die in vitro Prozedur dieser Erfindung für die Untersuchung der funktionellen Aktivierung von Leukozyten und anderen Zellen, deren in vivo erzeugte Aktivierung ex vivo messbar ist oder in vitro induziert werden kann, auf der Stabilisierung der zytoplasmischen Membranproteine, die eine transiente Expression an der Zelloberfläche besitzen, und deren Detektion unter Verwendung von quantitativen zytometrischen Techniken in der Abwesenheit von zusätzlicher Probenmanipulation die Schritte umfasst:

a) sequentielles Inkubieren einer nicht-manipulierten Probe mit einem Inhibitor oder einer Mischung von Inhibitoren mit Spezifität für eine Protease und einer Mischung von direkt mit Fluorochromen konjugierten monoklonalen Antikörpern;
b) Messen der Fluoreszenzemission der durch die Antikörper an die Zellen gebundenen Fluorochrome unter Verwendung von quantitativer Zytometrie;
c) Analysieren der erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung eines multiparametrischen analytischen Ansatzes für die Identifikation der interessierenden Zellsubpopulationen und darin Identifizierung derjenigen Zellen, die die stabilisierten Membranproteine exprimieren, wobei ihre Expression in einer objektiven Weise auf der Grundlage der nachgewiesenen Fluoreszenzintensität quantifiziert wird.

Nach Erhalten der Probe in der Anwesenheit der Protease-Inhibitoren, die oben erwähnt wurden, werden die Verwendung von Prozeduren für die in vitro Stimulierung der funktionellen Aktivierung der Zellen, dem Färben mit Antikörpern, der Einstellung und Kalibrierung des Zytometers durchgeführt gemäß häufig beschriebenen Methoden, die für die quantitative Analyse der Proteinexpression an der Zellmembran empfohlen werden. Für die Auswahl der spezifischen Zellsubpopulationen, die in der Probe vorhanden sind, in der das Durchführen der Bestimmung erwünscht ist, werden Antikörper verwendet, die in spezifischer Weise diejenigen Zellen identifizieren, und die deren Unterscheidung von anderen Subtypen an Zellen, die in der Probe vorhanden sind, zulassen, um auf diese Weise eine zusätzliche Probenmanipulation zu vermeiden.
Für die Analyse der Ergebnisse sowie für die akkurate und genaue Quantifizierung der Expression jedes interessierenden Proteins können verschiedene Softwareprogramme verwendet werden, von denen die PAINT-A-GATE PRO TM Software besonders geeignet ist. Während der Analyse, abgesehen von der Negativheit/Positivheit für jedes Antikörper-Anfärben einer oder mehrerer spezifischer Zell-Subpopulationen, werden die Fluoreszenzintensität, ausgedrückt in objektiven Einheiten einschließlich Median-Mittelwert und Dispersionswerte, verwendet.
Die Erfindung kann verwendet werden sowohl bei normalen, als auch bei pathologischen Proben von Menschen oder Tieren, Pflanzen, Bakterien und anderen Mikroorganismen, gemessen ex vivo, gelagert oder behandelt in vitro, für alle Zwecke, in denen die Analyse entweder des Zustands oder der Fähigkeiten der funktionellen Aktivierung von Leukozyten, Blutplättchen oder anderen Zellen erforderlich ist.
Wie aus dem, was oben beschrieben wurde, abgeleitet werden kann, können die stabilisierenden Verbindungen (Protease-Inhibitoren), die Antikörper und/oder die Fluochrome hauptsächlich in Abhängigkeit von der Art der Proteine, den Funktionen und/oder den Typen der zu untersuchenden Zellen schwanken, oder in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Probe. Ein derartiger Protease-Inhibitor ist ein monoklonaler Antikörper, eine Aminosäure oder ein von einer Aminosäure abgeleitetes Produkt oder ein Peptid.
Zusätzlich sollte verstanden werden, dass in dieser Erfindung Abweichungen, in denen die Anzahl der Antikörper, verwendet in Kombination mit einem Fluorochrom, höher ist als eins, und solche Modifizierungen der Technik, in denen monoklonale Antikörper, konjugiert mit mehr als einem Fluorochrom, verwendet werden, eingeschlossen sind. Ein Pool oder mehr als ein Pool monoklonaler Antikörper, konjugiert mit dem gleichen Fluorochrom und gerichtet auf eine oder mehrere verschiedene Zellsubpopulationen, kann verwendet werden, wobei jeder verwendete Pool von Antikörpern mit unterschiedlichen Fluorochromen konjugiert ist.
Die verwendeten Fluorochrome sind jede Kombination technisch kompatibler Fluochrome.
Schließlich sollte verstanden werden, dass in dieser Erfindung solche Abweichungen eingeschlossen sind, in denen, nach Inkubieren der Probe mit Antikörpern in Anwesenheit von stabilisierenden Substanzen, diese entfernt werden können, um die Kinetik der Wirkung dieser Proteasen zu studieren, die teilnehmen an Prozessierung, Schneiden und Freigabe der Membranproteine außerhalb der Zelle, die verbunden sind mit den Prozessen der funktionellen Aktivierung von Leukozyten, Blutplättchen und anderer Zellen, die ex vivo direkt nachdem sie erhalten wurden messbar sind, oder nachdem sie in vitro induziert wurden.
Darüber hinaus kann in dieser Erfindung, abgesehen von dem Anfärben der Subpopulationen der Zellen und der stabilisierten zu untersuchenden Proteine, auch die Messung anderer Oberflächenmarker einschließlich Oncoproteine und Proteine, die verbunden sind mit Zellzyklus, Apoptose oder Zellaktivierung und -differenzierung, durchgeführt werden.
Um die Kinetik der Wirkung der Proteasen, die beteiligt sind an Prozessierung, Schneiden und Freigabe derjenigen Membranproteine außerhalb der Zelle, die verbunden sind mit den Prozessen der funktionellen Aktivierung, hervorgerufen in vivo, die ex vivo messbar ist oder in vitro induziert werden kann, von Leukozyten, Blutplättchen und anderer Zellen, nach Durchführen der Inkubierung der Probe mit den Antikörpern in Anwesenheit von stabilisierenden Substanzen, können diese später entweder entfernt werden, oder deren Wirkungen umgekehrt werden.
Durch diese Erfindung optimieren wir in beträchtlicher Weise die Untersuchung der funktionalen Aktivierung von Leukozyten, Blutplättchen und anderer Zellen in biologischen Proben, deren in vivo Aktivierung ex vivo messbar sein kann, oder nach in vitro Stimulierung, was auch die Analyse der Kinetik der Wirkung von Membranproteasen ermöglicht.
Es ist zu beachten, dass die Möglichkeit des Stabilisierens von Membranproteinen, deren Expression in der Zelloberfläche transient ist oder selbst für sehr kurze Zeit andauert, eine detaillierte Information gewährleistet bezüglich des Zustandes der funktionellen Aktivierung der analysierten Zellen, die von hohem Interesse ist, auf eine systematische Weise, deren Lokalisierung und Verwendbarkeit in verschiedenen Situationen, sowohl bei normalen, als auch bei pathologischen Bedingungen.
Die Erfindung kann verwendet werden für die Identifizierung von Zellen, basierend auf dem Vorhandensein oder der Abwesenheit von Anfärben für einen oder mehrere Antikörper oder Kombinationen von Antikörpern, verwendet oder basierend auf der Fluoreszenzintensität, die für diese erhalten wurde.
Beispiel 1
1. Material und Methoden
Peripheres Blut (PB) wurde in zwei verschiedenen Schläuchen von 10 gesunden Freiwilligen erhalten. Ein Schlauch enthielt Heparin und der zweite Schlauch enthielt Heparin und einen Inhibitor der TACE Metalloprotease, verantwortlich für das Prozessierung und Freigabe von Tumornekrosefaktor (TNF) Alpha aus der zytoplasmischen Membran außerhalb der Zelle an die extrazellulären Medien. Die Analyse der TNF-α Expression an der zytoplasmischen Membran wurde durchgeführt nach Induzieren von deren Produktion durch T-Zellen und natürlichen Killer(NK)-Zellen mit Phorbolestern (PMA) und Ionomycin, unter Verwendung einer direkten Immunofluoreszenz-Technik, analysiert durch Fluss-Zytometrie.
2. Probenvorbereitung
20 μl PB wurden aus jedem der beiden Schläuche entnommen und in separate Röhren gegeben, die vorher deutlich beschriftet worden sind. Zu jeder der beiden Röhren wurden 80 μl RPMI 1640 Zellkulturmedien, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Glutamin, hinzugefügt. Anschließend wurden 25 μl einer Lösung, die PMA plus Ionomycin (endgültige Konzentration jeweils 25 ng/ml und 1 μg/ml) enthielt, hinzugefügt; nach Vortexen der Röhren wurden diese inkubiert für 2 Stunden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt. Nach diesem Inkubieren wurde die Probe aufgeteilt in zwei identische Teile, die in zwei verschiedene Röhren gegeben wurden (50 μl/Röhre). Zu einer dieser Röhren wurden 20 μl jedes der folgenden monoklonalen Antikörper, konjugiert mit Fluorochromen (Fluorescein Isothiocyanat-FITC, Phycoerythrin-PE, PE/Cyanin 5 PE/Cy5 und Allophycianin APC) hinzugefügt: CD3 (leu 4)-FITC/anti-TNFα-PE/CD56-PECy5/Cd45-APC. Die Spezifität und Quelle der monoklonalen Antikörper war wie folgt:

1) Leu-4-FITC (CD3): pan-T Zellmarker (Becton Dickinson, San-Jose, CA, USA).
2) 6401.1111-PE (anti-TNFα): identifiziert Tumornekrosefaktor (Becton Dickinson).
3) NKI-nb1-1-PECy5 (CD56): Marker, der NK-Zellen und eine Subpopulation von T-Zellen identifiziert (Caltag Laboratories, San Francisco, CA, USA).
4) HI30-RPC (CD45): pan-Leukozyt-Marker (Caltag Laboratories).

Zu der anderen Röhre, die als Isotyp-Kontrolle verwendet wurde, wurden die gleichen monoklonalen Antikörper hinzugefügt, mit Ausnahme des Antikörpers gegen TNF-α, der ersetzt wurde durch einen Maus-monoklonalen Antikörper des gleichen Isotyps wie das Anti-TNF-α Reagens (auch konjugiert mit PE) und gerichtet gegen ein Protein, das nicht bei Zellen aus menschlichem PB exprimiert wird. Beide Röhren wurden leicht gevortext und inkubiert für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur, in der Dunkelheit. Unmittelbar nach dieser Inkubierungsperiode wurden 2 ml QUICKLYSIS (Cytognos, Salamanca, Spanien) Lysis-Lösung zu jeder Röhre hinzugefügt, gefolgt von 4–5 Sekunden Vortexen. Danach wurden Zellen für eine zusätzliche Dauer von 10 Minuten in der Dunkelheit (Raumtemperatur) inkubiert. Nach dieser Periode wurden die fluoreszenten Färbungen in einem Fluss-Zytometer gemessen.
3. Datenerfassung und Analyse
Alle Messungen wurden durchgeführt in einem FRCS-Calibur Fluss-Zytometer (Becton Dickinson), versehen mit zwei Lasern, die jeweils bei 488nm und 650nm abgestimmt waren. Instrument-Einrichtung und -Kalibrierung wurde durchgeführt unter Verwendung des AUTOCOMP (Becton Dickinson) Software-Programms und CALIBRITE Microbeads (Becton Dickinson). Zur Datenerfassung wurde das CellQuest Software-Programm (Becton Dickinson) verwendet, wobei die Information ausschließlich bezüglich CD45 positiver Zellen gespeichert wurde. Nach Speichern der Information bezüglich der Fluoreszenz-Färbungen, durchgeführt bei PB Proben, wurde bezüglich der Fluoreszenz einer Mischung von 6 verschiedenen Subpopulationen von Microbeads Information erfasst, jede gefärbt mit einer unterschiedlichen bekannten Menge von PE Molekülen (QUANTIBRITE Microbeads, Becton Dickinson). Für deren Messung wurden die Subpopulationen von Microbeads verdünnt in 2ml QUICKLYSIS-Lösung.
Datenanalyse wurde durchgeführt unter Verwendung des PAINT-A-GATE PRO (Becton Dickinson) Software-Programmes unter Verwendung der Möglichkeit des Erhaltens einer logarithmischen Transformation des Parameters der seitlichen Lichtstreuung (SSC), um eine bessere Trennung zwischen den verschiedenen Typen von CD45-positiven Zellen, vorhanden in den PB Proben, zu erhalten.
TNFα Expression an der zytoplasmischen Membran jeder Zelle wurde in spezifischer Weise analysiert für T-Zellen (CDE45⁺⁺/CD3⁺) und NK-Zellen (CD45⁺⁺/CD3^–/CD56⁺), wobei die numerische Information aufgezeichnet wurde hinsichtlich des Prozentteils der Oberflächen TNFα-positiven Zellen und der Intensität der TNFα Expression unter den Subpopulationen von positiven Zellen (Mittelwert, Median und Koeffizient der Schwankung) in relativen Fluroeszenz-Kanälen (willkürliche Einheiten, skaliert von 0 bis 10000). Um im Stande zu sein, die Ergebnisse der Experimente, durchgeführt an verschiedenen Tagen oder in verschiedenen Laboratorien, zu vergleichen, wurden QUANTIBRITE Microbeads als Standard verwendet, um die Fluoreszenz-Intensität, ausgedrückt in willkürlichen Einheiten (Fluoreszenz-Kanäle) in die Anzahl von Molekülen, die löslichem Phycoerythrin (MESF) äquivalent ist, zu überführen.
Beispiel 2
1. Material und Methoden
PB-Probe wurde durch venösen Einstich von 10 gesunden Freiwilligen erhalten, und jede Probe wurde in zwei Schläuche gegeben. Ein Schlauch enthielt Heparin und der zweite Schlauch enthielt Heparin und einen Inhibitor der TACE Metalloprotease, verantwortlich für Prozessierung und Freigabe von L-Selectin (CD62L) aus der zytoplasmischen Membran von Leukozyten an die extrazellulären Medien. Die Analyse der CD62L-Expression an der zytoplasmischen Membran wurde durchgeführt unter Verwendung einer direkten Immunofluoreszen-Technik, analysiert durch Fluss-Zytometrie.
2. Probenvorbereitung
100 μl PB wurden aus jedem der Schläuche entnommen und in zwei separate Polypropylen-Röhren gegeben, die vorher deutlich beschriftet worden sind. Zu jeder der beiden Röhren wurden 80 μl RPMI 1640 Zellkulturmedien, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Glutamin, hinzugefügt. Anschließend wurden 25 μl einer Lösung, die PMA plus Ionomycin (endgültige Konzentration jeweils 25 ng/ml und 1 μg/ml) enthielt, hinzugefügt; nach Vortexen der Röhren wurden diese inkubiert für 2 Stunden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt. Nach diesem Inkubieren wurde die Probe aufgeteilt in zwei identische Teile, die in zwei verschiedene Röhren gegeben wurden (50 μl/Röhre). Zu einer dieser Röhren wurden 20 μl jedes der folgenden monoklonalen Antikörper, konjugiert mit Fluorochromen (Fluorescein Isothiocyanat-FITC, Phycoerythrin-PE, PE/Cyanin 5 PE/Cy5) hinzugefügt: CD14-FITC/CD62L-PE/CD45-PECy5. Die Spezifität und Quelle der monoklonalen Antikörper war wie folgt:

1) LeuM3-FITC (CD14): monozytischer Marker (Becton Dickinson).
2) Leu-8-PE-(CD62L): Adhäsionsmolekül (L-Selectin), exprimiert durch Leukozyten (Becton Dickinson).
3) HI30-PECy5 (CD45): pan-Leukozyt-Marker (Caltag Laboratories).

Zu der anderen Röhre, die als Isotyp-Kontrolle verwendet wurde, wurden die gleichen monoklonalen Antikörper hinzugefügt, mit Ausnahme des Antikörpers gegen CD62L, der ersetzt wurde durch einen Maus-monoklonalen Antikörper des gleichen Isotyps wie das CD62L Reagens (auch konjugiert mit PE) und gerichtet gegen ein Protein, das nicht bei Zellen aus menschlichem PB exprimiert wird. Beide Röhren wurden leicht gevortext und inkubiert für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur, in der Dunkelheit. Unmittelbar nach dieser Inkubierungsperiode wurden 2 ml QUICKLYSIS (Cytognos, Salamanca, Spanien) Lysis-Lösung zu jeder Röhre hinzugefügt, gefolgt von 4–5 Sekunden Vortexen. Danach wurden Zellen für eine zusätzliche Dauer von 10 Minuten in der Dunkelheit (Raumtemperatur) inkubiert. Nach dieser Periode wurden die fluoreszenten Färbungen in einem Fluss-Zytometer gemessen.
3. Datenerfassung und Analyse
Alle Messungen wurden durchgeführt in einem FACS-Calibur Fluss-Zytometer (Becton Dickinson), versehen mit zwei Lasern, die jeweils bei 488nm und 650nm abgestimmt waren. Instrument-Einrichtung und -Kalibrierung wurde durchgeführt unter Verwendung des AUTOCOMP (Becton Dickinson) Software-Programms und CALIBRITE Microbeads (Becton Dickinson). Zur Datenerfassung wurde das CellQuest Software-Programm (Becton Dickinson) verwendet, wobei die Information ausschließlich bezüglich CD45 positiver Zellen gespeichert wurde. Nach Speichern der Information bezüglich der Fluoreszenz-Färbungen, durchgeführt bei PB Proben, wurde bezüglich der Fluoreszenz einer Mischung von 6 verschiedenen Subpopulationen von Microbeads Information erfasst, jede gefärbt mit einer unterschiedlichen bekannten Menge von PE Molekülen (QUANTIBRITE Microbeads, Becton Dickinson). Für deren Messung wurden die Subpopulationen von Microbeads verdünnt in 2ml QUICKLYSIS-Lösung.
Datenanalyse wurde durchgeführt unter Verwendung des PAINT-A-GATE PRO (Becton Dickinson) Software-Programmes unter Verwendung der Möglichkeit des Erhaltens einer logarithmischen Transformation des Parameters der seitlichen Lichtstreuung (SSC), um eine bessere Trennung zwischen den verschiedenen Typen von CD45-positiven Zellen, vorhanden in den PB Proben, zu erhalten.
CD62L Expression an der zytoplasmischen Membran jeder Zelle wurde in spezifischer Weise analysiert für Neutrophile (CD45⁺ mit hohem SSC), Basophile (CD45⁺ mit geringem SSC), Monozyten (CD45⁺⁺, CD14⁺ mit mittlerem SSC) und Lymphozyten (CD45⁺⁺ mit geringem SSC), wobei die numerische Information aufgezeichnet wurde hinsichtlich des Prozentteils der Oberflächen CD62L-positiven Zellen und der Intensität der CD62L Expression unter den Subpopulationen von positiven Zellen (Mittelwert, Median und Koeffizient der Schwankung) in relativen Fluroeszenz-Kanälen (willkürliche Einheiten, skaliert von 0 bis 10000). Um im Stande zu sein, die Ergebnisse der Experimente, durchgeführt an verschiedenen Tagen oder in verschiedenen Laboratorien, zu vergleichen, wurden QUANTIBRITE Microbeads als Standard verwendet, um die Fluoreszenz-Intensität, ausgedrückt in willkürlichen Einheiten (Fluoreszenz-Kanäle) in die Anzahl von Molekülen, die löslichem Phycoerythrin (MESF) äquivalent ist, zu überführen.
Beispiel 3
1. Material und Methoden
Peripheres Blut (PB) wurde in zwei verschiedenen Schläuchen von 6 gesunden Freiwilligen erhalten. Ein Schlauch enthielt Heparin und der zweite Schlauch enthielt Heparin und einen Inhibitor der TACE Metalloprotease, verantwortlich für Prozessierung und Freigabe von Tumornekrosefaktor (TNF) Alpha aus der zytoplasmischen Membran außerhalb der Zelle an die extrazellulären Medien. Die Analyse der TNF-α Expression an der zytoplasmischen Membran wurde durchgeführt nach Induzieren von deren Produktion durch Monozyten und dentritischen Zellen mit Lipopolysaccharid (LPS) und γ-Interferon (γ-IFN) unter Verwendung einer direkten Immunofluoreszenz-Technik, analysiert durch Fluss-Zytometrie.
2. Probenvorbereitung
20 μl PB wurden aus jedem der beiden Schläuche entnommen und in separate Röhren gegeben, die vorher deutlich beschriftet worden sind. Zu jeder der beiden Röhren wurden 80 μl RPMI 1640 Zellkulturmedien, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Glutamin, hinzugefügt. Anschließend wurden 10 μl einer Lösung, die LPS (endgültige Konzentration 10 ng/ml) enthielt, hinzugefügt; nach leichtem Vortexen der Röhren wurden diese inkubiert für 4 Stunden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt. Nach diesem Inkubieren wurde die Probe aufgeteilt in zwei identische Teile, die in zwei verschiedene Röhren gegeben wurden (50 μl/Röhre). Zu einer dieser Röhren wurden 20 μl jedes der folgenden monoklonalen Antikörper, konjugiert mit Fluorochromen (Fluorescein Isothiocyanat-FITC, Phycoerythrin-PE, Peridin Chlorophyll Protein-PerCP und APC) hinzugefügt: CD3-CD19-CD56-CD14-FITC/anti-TNFα-PE/HLADR-PerCP/ CD45-APC. Die Spezifität und Quelle der monoklonalen Antikörper war wie folgt:

1) Leu-4-FITC (CD3): pan-T Zellmarker (Becton Dickinson).
2) C5.9-FITC (CD56): Neural-Adhäsionsmolekül, vorhanden in NK-Zellen und eine Subpopulation von T-Zellen (Imico, Madrid, Spanien).
3) Leu 12-FITC (CD19): pan-B-Zellmarker (Becton Dickinson)
4) Leu M3-FITC (CD14): Marker, vorhanden bei reifen Monozyten (Becton Dickinson)
5) 6401.1111-PE (anti-TNFα): identifiziert Tumornekrosefaktor α (Becton Dickinson)
6) L243-PerCP (HLADR): Marker, vorhanden bei Antigen darstellenden Zellen; Subtyp von HLA Klasse II Molekül (Becton Dickinson)
7) HI30-APC (CD4): pan-Leukozyt Marker (Caltag Laboratories)

Zu der anderen Röhre, die als Isotyp-Kontrolle verwendet wurde, wurden die gleichen monoklonalen Antikörper hinzugefügt, mit Ausnahme des Antikörpers gegen TNF-α, der ersetzt wurde durch einen Maus-monoklonalen Antikörper des gleichen Isotyps wie das Anti-TNF-α Reagens (auch konjugiert mit PE) und gerichtet gegen ein Protein, das nicht bei Zellen aus menschlichem PB exprimiert wird. Beide Röhren wurden leicht gevortext und inkubiert für 10–15 Minuten bei Raumtemperatur, in der Dunkelheit. Unmittelbar nach dieser Inkubierungsperiode wurden 2 ml QUICKLYSIS Lysis-Lösung zu jeder Röhre hinzugefügt, 0,5 ml mit Phosphatpuffer gepufferte Salzlösung (PBS) wurden zu jeder Röhre hinzugefügt, und die Röhren wurden 4–5 Sekunden gevortext. Danach wurde eine Messung der fluoreszenten Färbungen in einem Fluss-Zytometer durchgeführt.
3. Datenerfassung und Analyse
Alle Messungen wurden durchgeführt in einem FACS-Calibur Fluss-Zytometer (Becton Dickinson), versehen mit zwei Lasern, die jeweils bei 488nm und 650nm abgestimmt waren. Instrument-Einrichtung und -Kalibrierung wurde durchgeführt unter Verwendung des AUTOCOMP (Becton Dickinson) Software-Programms und CALIBRITE Microbeads (Becton Dickinson). Zur Datenerfassung wurde das CellQuest Software-Programm (Becton Dickinson) verwendet, wobei die Information ausschließlich bezüglich CD45 positiver Zellen gespeichert wurde. Nach Speichern der Information bezüglich der Fluoreszenz-Färbungen, durchgeführt bei PB Proben, wurde Information erfasst bezüglich der Fluoreszenz einer Mischung von 6 verschiedenen Subpopulationen von Microbeads, jede gefärbt mit einer unterschiedlichen bekannten Menge von PE-Molekülen (QUICKCAL Microbeads, Flow Cytometry Standards Corporation, San Juan, Puerto Rico). Für deren Messung wurden die Subpopulationen von Microbeads in 0.5 ml PBS Lösung verdünnt.
Datenanalyse wurde durchgeführt unter Verwendung des PAINT-A-GATE PRO (Becton Dickinson) Software-Programmes unter Verwendung der Möglichkeit des Erhaltens einer logarithmischen Transformation des Parameters der seitlichen Lichtstreuung (SSC), um eine bessere Trennung zwischen den verschiedenen Typen von CD45-positiven Zellen, vorhanden in den PB Proben, zu erhalten.
TNFα Expression an der zytoplasmischen Membran jeder Zelle wurde in spezifischer Weise analysiert für dendritische Zellen (CDE45⁺/CD3^–/CD19^–/CD14^–/CD56^–/HLADR⁺) und Monozyten (CD45⁺/CD14⁺), wobei die numerische Information aufgezeichnet wurde hinsichtlich des Prozentteils der Oberflächen TNFα-positiven Zellen und der Intensität der TNFα Expression unter den Subpopulationen von positiven Zellen (Mittelwert, Median und Koeffizient der Schwankung) in relativen Fluroeszenz-Kanälen (willkürliche Einheiten, skaliert von 0 bis 10000). Um im Stande zu sein, die Ergebnisse der Experimente, durchgeführt an verschiedenen Tagen oder in verschiedenen Laboratorien, zu vergleichen, wurden die QUICKCAL Microbeads (Flow Cytometry Standards Corporation) als Standard verwendet, um die Fluoreszenz-Intensität, ausgedrückt in willkürlichen Einheiten (Fluoreszenz-Kanäle) in die Anzahl von Molekülen, die löslichem Phycoerythrin (MESF) äquivalent ist, zu überführen.

Claims

In vitro-Verfahren für die Untersuchung der funktionellen Aktivierung von Leukozyten und anderer Zellen, deren in vivo erzeugte Aktivierung ex vivo messbar ist oder in vitro induziert werden kann, auf der Grundlage der Stabilisierung der zytoplasmatischen Membranproteine und ihres Nachweises unter Verwendung von quantitativen zytometrischen Techniken in der Abwesenheit einer zusätzlichen Probenmanipulationen, welches die Schritte umfasst von: a) sequenzielles Inkubieren einer nicht-manipulierten Probe mit einem Inhibitor oder einer Mischung von Inhibitoren mit Spezifität für eine Protease und einer Mischung von direkt mit Fluorochromen konjugierten monoklonalen Antikörpern; b) Messung der Fluoreszenzemission der durch die Antikörper an die Zellen gebundenen Fluorochrome unter Verwendung von quantitativer Zytometrie; c) Analyse der erhaltenen Ergebnisse unter Verwendung eines multiparametrischen analytischen Ansatzes für die Identifikation der interessierenden Zellsubpopulationen und darin Identifizierung derjenigen Zellen, welche die stabilisierten Membranproteine exprimieren, wobei ihre Expression in einer objektiven Weise auf der Grundlage der nachgewiesenen Fluoreszenzintensität quantifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Schritt (a) in vivo erhaltene normale oder pathologische Proben verwendet werden, die ex vivo gelagert oder behandelt wurden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Proteaseinhibitoren, die Antikörper oder die Fluorochrome und ihre Anzahl in Abhängigkeit von den zu untersuchenden Proteinen, Funktionen und/oder Zelltypen oder der Probenart variieren können.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteaseinhibitor ein monoklonaler Antikörper, eine Aminosäure, ein von Aminosäuren abgeleitetes Produkt oder ein Peptid ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass jede Kombination von technisch kompatiblen Fluorochromen verwendet werden kann.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass ein Pool oder mehr als ein Pool von mit dem gleichen Fluorochrom konjugierten monoklonalen Antikörpern, gerichtet gegen eine oder mehrere unterschiedliche Zellsubpopulationen, verwendet werden kann, wenn jeder verwendete Pool von Antikörpern mit einem unterschiedlichen Fluorochrom konjugiert ist.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5, in welchem zusätzlich zu der Färbung der untersuchten Subpopulationen von Zellen und der stabilisierten Proteine, andere Membranmarker, einschließlich Onkoproteine und Proteine verbunden mit dem Zellzyklus, der Apoptose oder der Zellaktivierung und -differenzierung, ebenfalls identifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, in welchem nach Inkubation der Probe mit Antikörpern in der Anwesenheit von stabilisierenden Substanzen diese entfernt werden können, um die Reaktionskinetiken der Proteasen zu untersuchen, die an Prozessierung, Schneiden und Freigabe in das extrazelluläre Medium der Membranproteine beteiligt sind, die mit der funktionellen Aktivierung von Leukozyten, Blutplättchen und anderen Zellen verbunden sind, deren in vivo-Aktivierung ex vivo oder nach in vitro-Stimulierung messbar ist.
Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 7, in welchem die Identifikation der Zellen auf der Anwesenheit oder Abwesenheit der Färbung von einem oder mehreren der verwendeten Antikörper als auch auf der Intensität oder Positivität dieser Antikörper beruht.