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Diese
Erfindung behandelt hauptsächlich, obwohl
nicht ausschließlich,
ein Verfahren für
die schnelle, kosteneffektive, empfindliche und spezifische Durchflusszytometrieanalyse
des Zellzyklus von in heterogenen Zellproben vorhandenen Tumor- und
Normalzell-Subpopulationen,
um das Wissen über
die Zellbiologie für
diagnostische, prognostische und therapeutische Zwecke und die Forschung
zu erweitern.
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Der
Zellzyklus bezieht sich auf die Phasen, welche eine Zelle zu durchlaufen
hat, um sich selbst zu vervielfachen und zwei theoretisch identische Tochterzellen
zu ergeben. Während
dieses Zeitabschnitts und in einer aufeinanderfolgenden Art und Weise
beginnen die ruhenden Zellen (G0-Phase) unter bestimmten Umständen oder
nach Erhalt spezifischer Stimuli die Synthese von RNA und Proteinen (G1-Phase),
welche notwendig sind, um effektiv die Vervielfachung ihrer DNA
und die Teilung der Zelle in zwei Tochterzellen durchzuführen. Nachfolgend
beginnt die DNA-Synthese (S-Phase); wenn die Zelle ihre DNA einmal
dupliziert hat, beginnt ein zweiter Spätprotein-Synthesezeitabschnitt (G2-Phase), welcher
die Zelle für
die Teilung vorbereitet (M-Phase). Die Zellzyklusanalyse, hauptsächlich durch
die Untersuchung der Verteilung von Zellen auf die G0/G1-, S- und
G2-M-Zellzyklusphasen, wurde als nützlich für die Analyse von Tumorproben
und im Studium der proliferativen Antwort auf verschiedene Stimuli
als auch in anderen Bereichen nachgewiesen. Im Allgemeinen ist das
Verfahren von außerordentlichem Wert,
nicht nur um Einblicke in den Bereich der Zellbiologie zu erhalten,
sondern ebenfalls für
diagnostische, prognostische und therapeutische Zwecke. Von den
verschiedenen, heutzutage verwendeten Methoden, basiert die am meisten
eingesetzte auf der Färbung
der Zellen mit DNA-spezifischen Fluorochromen. Aus der erhaltenen
Menge von Fluoreszenz/DNA und unter Verwendung mathematischer Modelle
wird der Anteil der Zellen aus einer bestimmten Probe berechnet,
welche in den G0/G1-, S- und G2/M-Zellzyklusphasen sind. Einer der größten Fallstricke
für die
Analyse des Zellzyklus von in vivo erhaltenen Proben ist die häufige Abwesenheit
von reinen Zellpopulationen. Häufig
(d. h. in Tumorproben oder anderen biologischen Proben) ist eine
Mischung verschiedener Zelltypen in schwankenden Anteilen vorhanden,
welche eine verschiedene Verteilung über die distinkten Zellzyklusphasen
aufweist. Daher ergibt die allgemeine Analyse des Zellzyklus keine
direkte Information über
die Proliferation jeder der verschiedenen in der Probe vorhandenen
Subpopulationen. Vor kurzem durchgeführte Untersuchungen haben die
Möglichkeit
der Durchführung
der Färbung mit
monoklonalen Antikörpern
und einem DNA-Fluorochrom gezeigt, um spezifisch die Verteilung
von Tumorzellen über
die verschiedenen Zellzyklusphasen zu analysieren (DOLBEARE FRANK
A ET AL; CELL TISSUE KINET 22(3)). Jedoch machen es verschiedene
Faktoren schwieriger, die Zellen für die spezifische Identifikation
von den verbleibenden Zellen zu unterscheiden, um ihre Zellzyklusverteilung
zu analysieren. Diese Faktoren enthalten: die Heterogenität der Tumorzellen
in Bezug auf die Expression eines individuellen Markers (entweder
innerhalb der Tumorprobe oder zwischen verschiedenen Tumorproben
von verschiedenen Patienten mit der gleichen Diagnose), die Verwendung
von Fluorochromen, die spezifisch an die DNA binden, welche einen
Teil der mit den verwendeten monoklonalen assoziierten Fluoreszenz
absorbieren, und die Notwendigkeit von permeabilisierenden Substanzen
in den meisten dieser Verfahren, welche zu einem bestimmten Ausmaß die Zellmembran
und die Bindung des monoklonalen Antikörpers verändern (BECTON DICKINSON CO).
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Demgemäß wurde
bisher über
kein Verfahren berichtet, in welchem innerhalb einer Probe, in der
die Zellzyklusverteilung unter Verwendung der Färbung mit für Nukleinsäuren spezifischen Fluorochromen
zu analysieren ist, wobei das gleiche Fluorochrom für einen
Pool verschiedener monoklonaler Antikörpern verwendet wird, um eine
Zellpopulation zu identifizieren.
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Daher
ist es eine Absicht dieser Erfindung, eine Lösung für die spezifische Untersuchung
des Zellzyklus einer in einer Probe vorhandenen Population von Zellen
zur Verfügung
zu stellen, in welchem eine optimale Unterscheidung zwischen den
interessierenden Zellen und den restlichen Zellelementen der Probe
erhalten werden kann.
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Zusätzlich ist
es eine weitere Absicht der Erfindung, die Verteilung der restlichen
Zellen (Zellen, welche negativ für
den Pool der verwendeten monoklonalen Antikörper sind) über die verschiedenen Zellzyklusphasen
zu bestimmen.
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Das
Verfahren dieser Erfindung besteht in der Verwendung eines Pools
von monoklonalen Antikörpern,
konjugiert mit dem gleichen Fluorochrom (FL1), wie etwa Fluoresceinisothiocyanat
(FITC), um alle in der Probe vorhandenen Zellen zu identifizieren,
um sie spezifisch zu identifizieren, und ein für Nukleinsäuren spezifisches Fluorochrom
(FL2), wie etwa Propidiumiodid oder Ethidiumbromid.
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Sowohl
die Probenvorbereitung, die Zellfärbung mit monoklonalen Antikörpern und
mit für
Nukleinsäure
spezifischen Fluorochromen, die Auswahl der zu untersuchenden Zellen
als auch die Kalibrierung und die Einstellung des Durchflusszytometers werden
den vorbeschriebenen und empfohlenen Verfahren folgend durchgeführt (BECTON
DICKINSON CO).
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Für die Analyse
der Ergebnisse als auch für die
exakte Quantifizierung der Verteilung jeder untersuchten Zellpopulation über die
Zellzyklusphasen, können
kommerziell erhältliche
Software-Programme verwendet werden. Während der Analyse muss, neben
der Auswahl der Untergruppe der interessierenden Zellen für die Untersuchung
aus der Probe, jedes Ereignis, das Zell-Multipletts als auch Zelltrümmern entspricht,
ausgeschlossen werden.
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Die
Erfindung kann sowohl in normalen als auch in pathologischen Proben
aus humanen oder tierexperimentellen Modellen, aus Pflanzen, Bakterien
und anderen Mikroorganismen und für alle Zwecke verwendet werden,
bei denen eine Analyse der Verteilung einer in einer Probe vorhandenen
Untergruppe von Zellen über
die G0/G1-, S- und G2/M-Zellzyklusphasen für die Forschung und für diagnostische,
prognostische und therapeutische Untersuchungen erforderlich ist.
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Wie
aus dem vorher beschriebenen abgeleitet werden kann, können die
verwendeten monoklonalen Antikörper,
im Wesentlichen abhängig
von dem zu identifizierenden Zelltyp variieren. Überdies sollte erkannt werden,
dass in dieser Erfindung Variationen, in welchen eine andere Art
von Fluorochrom verwendet wird, oder in welchen die Anzahl der monoklonalen
Antikörper
mehr als 2 ist, eingeschlossen sind. Schließlich sind ebenso alle Variationen
eingeschlossen, in welchen mehr als ein Pool von monoklonalen Antikörpern verwendet
werden, in welchen sie mit verschiedenen Fluorochromen für die spezifische
und simultane Identifikation in der gleichen Probe von zwei oder
von mehreren unterschiedlichen Zellpopulationen gefärbt werden.
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Mit
dieser Erfindung optimieren wir auf eine signifikante Art und Weise
die Untersuchung des Zellzyklus in biologischen Proben, und wir
verbessern die Auswahl der interessierenden Zellen als auch die
Geschwindigkeit ihrer Untersuchung.
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Es
sollte ebenfalls herausgestellt werden, dass die Möglichkeit
der Verwendung eines Pools von mit dem gleichen Fluorochrom gefärbten monoklonalen
Antikörpern
für die
Untersuchung des Zellzyklus ausführliche
Informationen über
die Proliferation der untersuchten Zellen zur Verfügung stellt,
welche helfen würde,
systematisch ihre Lokalisierung und ihre Rolle in verschiedenen
normalen und pathologischen Zuständen
zu identifizieren.
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Ohne
eine Grenze für
das Potential der Erfindung zu ziehen, werden im Folgenden zwei
Beispiele beschrieben, welche ihre Verwendung veranschaulichen.
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BEISPIEL 1
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1. Material und Methoden
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Peripheres
Blut (PB) wurde durch Venenpunktion von 10 Patienten erhalten, bei
denen diagnostiziert wurde, dass sie an chronischen B-Zell-lymphoproliferativen
Störungen
litten, in flüssiges
EDTA (K3) gegeben und bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis die Probenvorbereitung
begonnen wurde. Die Zellzyklusanalyse wurde innerhalb der nächsten 5 Stunden
unter Verwendung einer direkten Immunfluoreszenztechnik und Färben mit
Propidiumiodid gemessen durch Durchflusszytometrie durchgeführt.
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2. Probenvorbereitung
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Ein
Röhrchen
mit 100 μL
PB mit 0,5 bis 1 × 106 weißen
Blutzellen wurde für
jede der Proben vorbereitet. Die Probe wurde mit vier, mit FITC
konjugierten monoklonalen Antikörpern
inkubiert.
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Die
Spezifität
der Kombinationen der verwendeten monoklonalen Antikörper und
ihre Herkunft waren wie folgt:
- 1) FMC63-FITC(CD19);
pan-B Marker (Serotec, UK)
- 2) Leu14-FITC(CD22); pan-B Marker (Becton/Dickinson, USA)
- 3) Leu16-FITC(CD20); pan-B Marker (Becton/Dickinson, USA)
- 4) WR17-FITC(CD37); pan-B Marker (Serotec, UK).
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Die
Röhrchen
wurden behutsam gevortext und in der Dunkelheit für 10–15 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Unmittelbar nach diesem Inkubationszeitabschnitt
wurden 2 mL einer Ammoniumchlorid-Lysierungslösung hinzugegeben, gefolgt durch
4–5 Sekunden
Vortex. Danach wurden die Zellen für weitere 10 Minuten in der
Dunkelheit inkubiert (Raumtemperatur). Danach wurden die Proben
bei 300 g für
5 Minuten (4°C)
zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen und das von roten Blutzellen freie Zellpellet wurde durch
kräftiges
Vortexen (1–2
Sekunden) resuspendiert. In jedem Röhrchen wurden 1 mL einer Phosphatpuffersalinelösung (PBS),
die 1 g/L bovines Serumalbumin (Sigma Chemicals, St. Louis, MO,
USA) enthält,
zugegeben. Eine weitere Zentrifugation (300 g, 5 Minuten) wurde
durchgeführt und
die Zellen wurden schließlich
in 1 mL PBS-Lösung
mit 0,5% Tween-20 (Sigma), 100 mg/mL de RNAse (Sigma Chemicals)
und 5 μg/mL
Propidiumiodid (Sigma Chemicals) resuspendiert. Die Zellen wurden
für 15
Minuten bei Raumtemperatur in dieser Lösung inkubiert und bei 4°C in der
Dunkelheit gelagert, bis sie in dem Durchflusszytometer analysiert
wurden.
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3. Datenerhebung
und Analyse
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Die
Messungen erfolgten mit einem FACSort-Durchflusszytometer (Becton/Dickinson),
ausgestattet mit einem Argonionenlaser, eingestellt auf 488 nm und
15 m Watt. Das Instrument wurde unter Verwendung des DNA-QC Reagenz
(Becton/Dickinson) kalibriert. Die Fluoreszenzkompensation zwischen
FITC und Propidiumiodid wurde unter Verwendung von CALIBRITE beads
(Becton/Dickinson) und von roten Zellen vom Huhn, gefärbt mit
Propidiumiodid, durchgeführt.
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Die
Datenanalyse erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wählten wir die interessierenden
Zellen aus (FITC positiv), die neoplastischen B-Zellen entsprechen,
und schlossen nicht nur die Nicht-B-Zellen, sondern auch Zelltrümmer und
Zellaggregate aus. Für
diesen Zweck wurde das PAINT-A-GATE PLUS-(Becton/Dickinson), Softwareprogramm
verwendet. Danach wurde das RFIT mathematische Modell, enthalten
in dem CELLFIT-Softwareprogramm
(Becton/Dickinson) für
die Analyse der DNA-Histogramme verwendet, um den Anteil der Zellen
aus der ausgewählten
Zellpopulation zu berechnen, die in den G0/G1-, S- und G2/M-Zellzyklusphasen
sind.
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BEISPIEL 2
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1. Material
und Methoden
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Peripheres
Blut (PB) wurde durch Venenpunktion von 15 Patienten erhalten, bei
denen diagnostiziert wurde, dass sie an multiplen Myelomen leiden,
in flüssiges
EDTA (K3) gegeben und bei Raumtemperatur aufbewahrt, bis die Probenvorbereitung begonnen
wurde. Die Zellzyklusanalyse wurde innerhalb der nächsten 5
Stunden unter Verwendung einer indirekten Immunfluoreszenztechnik
und Färbung
mit Propidiumiodid, gemessen durch Durchflusszytometrie, durchgeführt.
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2. Probenvorbereitung
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Ein
Röhrchen
mit 100 μL
PB mit 0,5 bis 1 × 106 weißen
Blutzellen wurde für
jede der Proben vorbereitet. Die Probe wurde mit zwei monoklonalen
Antikörpern
inkubiert.
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Die
Spezifität
der Kombinationen der verwendeten monoklonalen Antikörper und
ihre Herkunft war wie folgt:
- 1) BB4; Plasmazellmarker
(Serotec, UK)
- 2) GR7A4(CD38); stark und charakteristisch durch Plasmazellen
exprimierter Marker (Universidad de Granada, Spanien)
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Die
Röhrchen
wurden behutsam gevortext und in der Dunkelheit für 10–15 Minuten
bei Raumtemperatur inkubiert. Unmittelbar nach diesem Inkubationszeitabschnitt
wurden 2 mL PBS-Lösung
hinzugegeben, gefolgt durch 4–5
Sekunden Vortex. Danach wurden die Zellen zentrifugiert, der Überstand wurde
verworfen und das Zellpellet in 200 μL der gleichen Lösung resuspendiert.
Zu der Zellsuspension wurde ein gegen Maus-Immunglobulin gerichteter, monoklonaler
Antikörper
vom Kaninchen in einer Endverdünnung
von 1/100 gegeben und eine zweite Inkubation bei Raumtemperatur
in der Dunkelheit für 10–15 Minuten
durchgeführt.
Nachdem diese Inkubation beendet war, wurden 2 mL einer Ammoniumchlorid-Lysierungslösung zugegeben,
gefolgt durch vier bis fünf
Sekunden Vortex. Danach wurden die Zellen für weitere 10 Minuten in der
Dunkelheit inkubiert (Raumtemperatur). Danach wurden die Proben
bei 300 g für
5 Minuten (4°C)
zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen und das von roten Blutzellen freie Zellpellet wurde durch
kraftvolles Vortexen (1–2
Sekunden) resuspendiert. In jedes Röhrchen wurden 1 mL einer Phosphatpuffer-Salinelösung (PBS)
mit 1 g/L bovines Serumalbumin (Sigma Chemicals, St. Louis, MO,
USA) zugegeben. Eine weitere Zentrifugation (300 g, 5 Minuten) wurde
durchgeführt
und die Zellen wurden schließlich
in 1 mL einer PBS-Lösung mit
0,5% Tween-20 (Sigma) resuspendiert, 100 mg/mL de RNAse (Signal
Chemicals) und 5 μg/mL Propidiumiodid
(Sigma Chemicals) resuspendiert. Die Zellen wurden für 15 Minuten
bei Raumtemperatur in dieser Lösung
inkubiert und wurden bei 4°C
in der Dunkelheit gelagert, bis sie in dem Durchflusszytometer analysiert
wurden.
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3. Datenerhebung und Analyse
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Die
Messungen erfolgten mit einem FACSort-Durchflusszytometer (Becton/Dickinson),
ausgestattet mit einem Argonionenlaser, eingestellt auf 488 nm und
15 m Watt. Das Instrument wurde unter Verwendung des DNA-QC Reagents
(Becton/Dickinson) kalibriert. Die Fluoreszenzkompensation zwischen
FITC und Propidiumiodid wurde unter Verwendung von CALIBRITE beads
(Becton/Dickinson) und von roten Zellen vom Huhn, gefärbt mit
Propidiumiodid, durchgeführt.
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Die
Datenanalyse erfolgt in zwei Schritten. Zunächst wählten wir die Plasma-Zellen
entsprechenden, interessierenden Zellen aus (FITC positiv) und schlossen
nicht nur die übrigen
Zellen, sondern auch Zelltrümmer
und Zellaggregate aus. Für
diesen Zweck wurde das PAINT-A-GATE
PLUS-(Becton/Dickinson)Softwareprogramm verwendet. Danach wurde
das RFIT mathematische Modell, enthalten in dem CELLFIT-Softwareprogramm
(Becton/Dickinson) für die
Analyse der DNA-Histogramme verwendet, um den Anteil der Zellen
aus der ausgewählten
Zellpopulation zu berechnen, die in den G0/G1, S und G2/M-Zellzyklusphasen
sind.