DE4421891A1 - Verfahren zum Nachweis von komplementaktivierenden IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene - Google Patents
Verfahren zum Nachweis von komplementaktivierenden IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-AntigeneInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum fluo
reszenzspektroskopischen Nachweis von komplementaktivie
renden IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene.
Neben den gutuntersuchten zellulären Immunmechanismen bei
dem komplexen Vorgang der Transplantatabstoßung bei Trans
plantatempfängern spielen die humoralen Faktoren eine wei
tere wichtige Rolle. Bei der Bestimmung dieser Faktoren ist
der Nachweis der Fähigkeit zur Aktivierung der klassischen
Komplementkaskade gegebenenfalls vorhandener Immuno
globulin G (IgG)-Antikörper gegen HLA-DR-Antigene von
Bedeutung.
Das vorhandene immunologische Risiko potentieller Trans
plantatempfänger wird derzeit aufgrund bereits abgestoßener
Transplantate und durch das Vorhandensein
lymphocytotoxischer Antikörper abgeschätzt. Das dabei
angewendete Verfahren ("panel-reactivity", Terasaki et al.
Nature 204, 998 (1964)) beruht auf einer
komplementabhängigen Lyse von Lymphocyten. Die lysierten
Zellen werden über ein Farbstoffsubstrat sichtbar gemacht.
Aufgrund der Verwendung peripherer Lymphocyten als
Zielzellen ist die "panel-reactivity" für die sichere
Erkennung von Antikörpern gegen B-Lymphocyten und somit den
darauf exprimierten MHC-Klasse II Antigenen, zu denen auch
die HLA-DR-Antigene gehören, nicht geeignet.
In der Transplantationsmedizin werden unmittelbar vor einer
Transplantation spenderspezifische Antikörper im Empfänger
serum mittels des "Crossmatch Tests" detektiert. Dabei
werden Spenderlymphocyten mit Empfängerserum inkubiert und
im positiven Fall eine komplementabhängige Lyse beobachtet.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein
einfaches und schnelles Verfahren zur Verfügung zu stellen,
mit dem komplementaktivierende IgG-Antikörper gegen
HLA-DR-Antigene nachgewiesen werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfah
ren zum Nachweis von komplementaktivierenden IgG-Antikör
pern gegen HLA-DR-Antigene, das dadurch gekennzeichnet ist,
daß man HLA-DR-Antigene mit Patientenserum, einer Kom
plementquelle und mit einem gegen eine Komplementkomponente
gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper inkubiert und
fluoreszenzspektroskopisch untersucht.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten HLA-DR-Anti
gene können in reiner, isolierter Form eingesetzt werden.
Bevorzugt werden die HLA-DR-Antigene auf definierten Ziel
zellen exprimiert, wobei sich insbesondere
EBV-transformierte lymphoblastoide Zellinien eignen. Die
HLA-DR-Spezifität kann dabei beispielsweise durch
DNA-Typisierung ermittelt werden.
Als Komplementquelle eignet sich jedes Material, das die
notwendigen Substrate für die klassische Komplementkaskade
enthält und dabei nicht mit HLA-DR-Antigenen reagiert. Bei
spielsweise kann Humanserum eingesetzt werden, welches zu
vor auf Alloantikörper gegen HLA-DR-Antigene oder, bei der
Verwendung EBV-transformierter lymphoblastoider Zellinien,
auf Alloantikörper gegen diese Zellinien untersucht wurde.
Gemäß dem vorliegenden Verfahren wird mit fluoreszenzmar
kierten Antikörpern inkubiert, die gegen eine Komplement
komponente gerichtet sind. Als Komplementkomponente kann
jedes stabile Spaltprodukt aus der klassischen Komplement
kaskade gewählt werden. Insbesondere eignet sich beispiels
weise das C4c-Fragment. Erfindungsgemäß können alle be
kannten Fluoreszenzmarkierungen für Antikörper verwendet
werden. Beispielsweise eignen sich Phycoerythrin(PE)-markierte
oder Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierte
Antikörper. Bevorzugt werden FITC-markierte antihuman
C4c-Antikörper.
Die fluoreszenzspektroskopische Untersuchung der vorberei
teten Probe kann neben herkömmlichen fluoreszenzspektro
skopischen Methoden beispielsweise mittels der Durchfluß
zytometrie erfolgen. Hierzu eignet sich insbesondere das
FACScan-Fließzytometer der Fa. Becton Dickinson.
In einer bevorzugten Form kann das erfindungsgemäße Ver
fahren zur gleichzeitigen Bestimmung und Differenzierung
von komplementaktivierenden und nicht-komplementaktivieren
den IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene eingesetzt wer
den. Hierzu wird die Probe zusätzlich mit einem weiteren
gegen IgG-Antikörper gerichteten fluoreszenzmarkierten
Antikörper inkubiert. Hierbei können ebenfalls alle für
Antikörper bekannten Fluoreszenzmarkierungen verwendet
werden, allerdings muß diese Fluoreszenzmarkierung Licht
einer anderen Wellenlänge emittieren, als der gegen die
Komplementkomponente gerichtete Antikörper. Bevorzugt
werden Mischungen aus PE-markierten und FITC-markierten
Antikörpern eingesetzt. Besonders bevorzugt wird eine
Mischung aus FITC-markierten antihuman C4c-Antikörpern und
PE-markierten F(ab′)₂-antihuman IgG-Antikörpern.
Zur Differenzierung von komplementaktivierenden und nicht-
komplementaktivierenden Antikörpern erfolgt die fluores
zenzspektroskopische Untersuchung gleichzeitig oder nach
einander bei den beiden Wellenlängen, bei denen die fluo
reszenzmarkierten Antikörper Licht emittieren. Wird auf
beiden Wellenlängen ein Signal erfaßt, so liegen im Serum
des Patienten komplementaktivierende IgG-Antikörper gegen
HLA-DR-Antigene vor. Wird nur auf der Wellenlänge des
Lichts, das der gegen IgG gerichtete Antikörper emittiert,
ein Signal erfaßt, so liegen im Serum des Patienten nicht-
komplementaktivierende IgG-Antikörper gegen HLA-DR-Antigene
vor. Wird nur auf der Wellenlänge des Lichts, das der gegen
die Komplementkomponente gerichtete Antikörper emittiert,
ein Signal erfaßt, so besitzt das Serum eine komplement
aktivierende Kapazität in Abwesenheit von IgG-Antikörpern.
In diesem Fall müssen andere Antikörperklassen in Betracht
gezogen werden.
Bevorzugt werden beide Wellenlängen gleichzeitig mittels
einer zweifarben-zytometrischen Analyse detektiert. Dieses
Verfahren bietet die Möglichkeit, Proben des Patienten in
kurzer Zeit auf das Vorhandensein gegebenenfalls komple
mentaktivierender IgG-Antikörper gegen HLA-DR-Antigene zu
untersuchen.
Die einzelnen Substrate können erfindungsgemäß gleichzeitig
als Mischung, als Mischungen bestimmter Substrate oder ge
trennt nacheinander inkubiert werden. Bevorzugt werden
dabei zunächst die HLA-DR-Antigene mit Patientenserum und
anschließend mit der Komplementquelle inkubiert und ab
schließend mit dem fluoreszenzmarkierten Antikörper oder
einer Mischung aus den beiden fluoreszenzmarkierten Anti
körpern inkubiert.
Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zur Bestimmung der humoralen Risikofaktoren bei Trans
plantatempfängern, insbesondere Nierentransplantatempfän
gern. Hierzu wird das oben beschriebene Verfahren vor der
Transplantation mit dem Serum des potentiellen Transplan
tatempfängers ausgeführt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ebenfalls ein Testkit zur
Bestimmung von humoralen Risikofaktoren bei Transplantat
empfängern, insbesondere Nierentransplantatempfängern. Die
ses Testkit enthält die oben beschriebenen HLA-DR-Antigene,
eine Komplementquelle und einen gegen eine Komplementkompo
nente gerichteten fluoreszenzmarkierten Antikörper. Gegebe
nenfalls kann ein weiterer gegen IgG gerichteter Antikör
per, der eine Fluoreszenzmarkierung trägt, die Licht einer
anderen Wellenlänge emittiert, als der gegen die Komple
mentkomponente gerichtete Antikörper, enthalten sein.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfin
dung näher illustrieren.
Zellen von elf verschiedenen EBV-transformierten lympho
blastoiden Zellinien (siehe Tabelle 1), deren HLA-DR-Spezi
fitäten durch DNA-Typisierung ermittelt worden waren, wur
den auf 2×10⁶ Zellen/ml in einem Nährmedium suspendiert.
Das Nährmedium bestand aus RPMI 1640 (Biochrom), das mit
100 × nicht-essentieller Aminosäuren, 100 mM Natrium
pyruvat, 200 mM L-Glutamin, 20 U/ml Penicillin/Streptomycin
und 10% fetalem Rinderserum versetzt worden war.
Jeweils 2×10⁵ Zellen wurden in jede Vertiefung einer
Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen eingebracht. Die Zel
len wurde zweimal mit einer Pufferlösung aus 1% Rinder
serum Albumin (Paesel und Lorey) und 0,1% Natriumazid in
PBS durch wiederholtes kaltes Zentrifugieren von 200 µl
Zellsuspension bei 800 Upm (Umdrehungen pro min) für je 1 min
gewaschen. Der Puffer wurde nach jedem
Zentrifugationsschritt abgegossen und erneut aufgefüllt.
Zur Anlagerung der Alloantikörper an die Zielzellen wurden
anschließend 40 l unverdünntes Patientenserum zugegeben
und 45 min bei 4°C inkubiert. Während dieser und aller
nachfolgenden Inkubationsperioden wurden die Mikrotiter
platten in einem Schüttler bewegt. Anschließend wurden
nicht-bindende Immunglobuline durch mindestens vier Wasch
schritte entfernt. Als Komplementquelle wurde frisches
Humanserum, das nicht gegen lymphoblastoide Zellinien
reagiert, zu jeder Probe zugegeben. Um eine optimale
Aktivierung der klassischen Komplementkaskade zu erreichen,
wurden 50 µl eines Serums verwendet, das 1 : 6 in einer Ca2+
und Mg2+ Ionen enthaltenden 1,5 M Tris/aqua dest. Lösung,
pH 7,4, (Biomol) verdünnt worden war. Es wurde 20 min bei
Raumtemperatur inkubiert und viermal gewaschen.
Anschließend wurde mit 40 µl einer Mischung aus gleichen
Volumenteilen PE-markierter F(ab′)₂-antihuman IgG-Antikör
per (1 : 100 verdünnt) und FITC-markierter antihuman
C4c-Antikörper (1 : 50 verdünnt) inkubiert. Nach 45 min bei 4°C
wurden die Zellen dreimal gewaschen, in 200 µl Puffer
resuspendiert und bis zur fließzytometrischen Analyse im
Dunkeln bei 4°C aufbewahrt.
Die fluoreszenzspektroskopischen Untersuchungen wurden mit
einem FACScan-Fließcytometer der Fa. Becton Dickinson, das
mit einem luftgekühlten Argonlaser (488 nm) ausgerüstet
war, durchgeführt. Die rote (PE)-Fluoreszenz wurde über
einen 585/42 nm Filter und die grüne Fluoreszenz (FITC)
über einen 530/30 nm Filter gemessen. Die spektrale
Überlappung der FITC- und PE-Signale wurde kompensiert. Von
jeder Probe wurden 10⁴ Zellen untersucht. Für jede verwen
dete DR-spezifische, EBV-transformierte Zellinie wurde die
Signalintensität und der Untergrund für beide Signale mit
tels einer Palette von 50 Normalkontrollsera bestimmt.
Damit kann jedes Serum eines Patienten, das ein positives
Fluoreszenzsignal liefert, eindeutig identifiziert werden.
Zur spezifischen Inhibierung der klassischen Komplementak
tivierung wurden ausgewählte Proben der Komplementquelle
sowie Testseren durch Hitzebehandlung bei 56°C (30 min) vor
der Inkubation mit den HLA-DR-Antigenen inaktiviert. Bei
der anschließend fluoreszenzspektroskopischen Untersuchung
konnte kein Signal des gegen die Komplementkomponente
gerichteten Antikörpers detektiert werden. Das Signal des
gegen IgG gerichteten Antikörpers blieb unverändert.
In einem zweiten Experiment wurde in ausgewählten Fällen
gleichzeitig mit den PE-markierten F(ab′)₂-antihuman
IgG-Antikörpern 20 µl einer Humanimmunoglobulin-Lösung
(PolyglobinTR, 50 mg/ml) zugegeben. Dieses führte zu einer
signifikanten Verringerung des durch den gegen IgG
gerichteten Antikörper hervorgerufenen Signals. Das Signal
durch den gegen eine Komplementkomponente gerichteten Anti
körper blieb unverändert. Dieses Experiment zeigt, daß die
drei möglichen, oben beschriebenen Fälle (Vorliegen komple
mentaktivierender IgG-Antikörper, nicht-komplementaktivie
render IgG-Antikörper und Komplementaktivierung ohne Vor
liegen von IgG-Antikörpern) durch das erfindungsgemäße
Verfahren in seiner bevorzugten Ausführungsform eindeutig
unterschieden werden können.
Um zu zeigen, daß die gemessenen Signale nicht auf
anti-Klasse I reaktive Antikörper zurückzuführen sind, wurden
diese in 27 Sera mit bekannter Reaktivität gegen DR4
(BOLETH) durch Absorption an Platelets entfernt. Dazu
wurden 6 mg lyophilisierter Platelets von verschiedenen
Spendern in 250 µl Patientenserum suspendiert. Nach 15 min
Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen
bei 2000 Upm (10 min) zentrifugiert. Diese Proben wurden
dann wie unter 1. beschrieben weiter untersucht. Bei 26
Proben wurde die Reaktivität gegenüber DR4-Antigenen nicht
vermindert. Nur bei einer Probe trat eine Signalschwächung
auf, was auf das Vorhandensein möglicher anti-MHC-Klasse I
Antikörper hinweist. Diese Probe zeigte gleichzeitig eine
Aktivität im Mikrocytotoxizitätstest (Panel-Reaktivität).
Um den Einfluß natürlich vorkommender anti-Maus-Antikörper
zu reduzieren, wurden ausgewählte Sera mit einer Reaktivi
tät gegen LCL 9022, was auf das Vorhandensein von Alloanti
körpern gegen DR3 hinweist, zunächst gegen
nicht-transfektierte Mausfibroblasten absorbiert. Als
HLA-DR-Antigenquelle wurden dann mit human DR3 transfektierte
Mausfibroblasten verwendet. 5×10⁵ nicht transfizierte
Mausfibroblasten wurden zweimal mit PBS gewaschen und mit
500 µl Humantestserum in 1,5 ml Mikrotubes (Eppendorf)
resuspendiert und im ersten Schritt 60 min bei 37°C und im
zweiten Schritt 120 min bei 4°C inkubiert. Die erhaltenen
Überstände wurden 20 min bei 10⁴ Upm zentrifugiert und nach
Zusatz von FITC-markierten F(ab′)₂-rabbit-antihuman
IgG-Antikörpern (Dianova) fluoreszenzspektroskopisch unter
sucht. Die Signalintensität normaler Kontrollseren nahm da
bei stark ab, wohingegen die Signalintensität von Seren mit
spezifischer Reaktivität gegen DR3 erhalten blieb. Dieses
Ergebnis zeigt, daß die Meßergebnisse tatsächlich auf dem
Vorhandensein von Antikörpern gegen HLA-DR Antigene
beruhen.
Zum Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens mit dem
Mikrocytotoxizitätstest, der von der Eurotransplant Orga
nisation vorgeschrieben wird, wurden die Seren von 20 zu
fällig ausgewählten Patienten nach beiden Methoden unter
sucht. Die "Panel-Reaktivität" wurde mit 50 verschiedenen
Lymphocytproben bestimmt. Tabelle 2 gibt das Ergebnis der
Tests nach beiden Methoden wieder. Es zeigt sich, daß bei
insgesamt acht Patienten nach dem erfindungsgemäßen Ver
fahren ein positives Ergebnis erzielt wurde, wogegen der
Mikrocytotoxizitätstest mit peripheren Lymphocyten nur bei
zwei Patienten das Vorhandensein lymphocytotoxischer Anti
körper anzeigt. Nur ein Patient reagierte in beiden Tests.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert damit bei der Be
stimmung humoraler Risikofaktoren bei Transplantatempfän
gern ein zuverlässigeres und differenzierteres Ergebnis als
das bislang verwendete Verfahren.
Claims (6)
1. Verfahren zum Nachweis von komplementaktivierenden
IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene, dadurch gekennzeich
net, daß man HLA-DR-Antigene mit Patientenserum und
einer Komplementquelle und mit einem gegen eine
Komplementkomponente gerichteten fluoreszenzmarkierten
Antikörper inkubiert und fluoreszenzspektroskopisch
untersucht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, angewandt zur Differenzierung
von komplementaktivierenden und nicht-komplementaktivie
renden IgG-Antikörpern gegen HLA-DR-Antigene, dadurch
gekennzeichnet, daß ein weiterer gegen IgG gerichteter
Antikörper zugesetzt wird, der eine Fluoreszenzmarkie
rung trägt, die Licht einer anderen Wellenlänge emit
tiert, als der gegen die Komplementkomponente gerichtete
Antikörper.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch ge
kennzeichnet, daß Zellinien, vorzugsweise EBV-transfor
mierte lymphoblastoide Zellinien, als Träger der
HLA-DR-Antigene eingesetzt werden.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß die Komplementkomponente das Spalt
produkt C4c der Komplementkaskade ist.
5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche zur Be
stimmung von humoralen Risikofaktoren bei Transplantat
empfängern, insbesondere Nierentransplantatempfängern.
6. Testkit zur Bestimmung von humoralen Risikofaktoren bei
Transplantatempfängern, insbesondere Nierentransplantat
empfängern, enthaltend HLA-DR-Antigene, eine Komplement
quelle, einen fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen
eine Komplementkomponente und gegebenenfalls einen wei
teren gegen IgG gerichteten Antikörper, der eine
Fluoreszenzmarkierung trägt, die Licht einer anderen
Wellenlänge emittiert als der gegen die Komplement
komponente gerichtete Antikörper.
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