DE2953524C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein nicht-intrusives Verfahren zur
Bestimmung von Zellmembranpotentialen, wobei nicht
erregbare Zellen mit einem membran-durchlässigen
ionischen Farbstoff inkubiert werden und durch Messen
einer optischen Eigenschaft der gefärbten Zellen deren
Membranpotential bestimmt wird.
Es ist bekannt, daß der Zellinhalt von tierischen und
pflanzlichen Zellen in bezug auf die Umgebung elektrisch
negativ geladen ist. Die Größe dieser Potentialdifferenz
liegt im allgemeinen zwischen 5 und 90 mV, wobei der
größte Teil des Potentials über die Zellmembran
entwickelt wird.
Die Zellmembranpotentiale ändern sich in unterschied
licher Weise mit dem physiologischen Zustand der
Zelle. Da metabolische Energie
verbraucht wird, um die Potentiale aufrechtzuerhal
ten, verringert sich die Höhe des Potentials über die
Membran bei einer verletzten oder einer toten Zelle.
Zu größeren Änderungen im Membranpotential
kommt es innerhalb von Minuten bei der Wechselwirkung
der Zellen mit sehr vielen unterschiedlichen Substanzen
oder Liganden, die mit relativ hoher Affinität eine
Bindung mit spezifischen Transmembranrezeptoren ein
gehen.
In der Zellbiologie hat sich vor kurzem gezeigt, daß
hinsichtlich der Liganden und Rezeptoren eine Basis
form des Austausches zwischen den Zellen von leben
den Vielzellersystemen ausgelöst wird durch extra
zelluläre Liganden oder chemische Überträger bzw.
Wirkstoffe. Diese chemischen Überträger können so
wohl aus speziellen Geweben innerhalb des Organismus
oder auch von externen Quellen stammen. Ihre chemischen
Strukturen und die Orte der Wirkung variieren stark.
Sie können eine Beeinflussungszone über einen schmalen
Bereich von wenigen 100 Angström (z. B. bei neuromusku
lären Verbindungen) oder über den gesamten Organismus
(z. B. Blutwirkstoffe, wie Hormone) aufweisen.
Bei neuen biochemischen Untersuchungen ist nun gefun
den worden, daß viele dieser chemischen Überträger
eine Zwischenfläche zwischen der Zelle, die den
Reiz bzw. den Impuls über die selektive Kupplung
erhält und den Rezeptoren, die sich an der Außen
fläche der Zelle befinden, bilden. Es wird angenommen,
daß der Rezeptor den chemischen Überträger aufgrund
dessen stereochemischen Aufbaus und/oder der räumlichen
Verteilung seiner geladenen oder chemisch aktiven Gruppen
erkennt. Auf diese Weise wird der Ligand und der
Rezeptor über eine Schloß-Schlüssel-Beziehung nicht
kovalent gebunden. Als Ergebnis des Bindungsvorganges
kommt es zu einer intrazellulären biochemischen oder
biophysikalischen Änderung, so daß in der Zelle ein
metabolischer oder physiologischer Prozeß ausge
löst oder beendet wird. Als Liganden sind z. B. Substan
zen, wie Acetylcholin, Epinephrin und Norepine
phrin (Neurotransmitter), Insulin, Wachstumshormon und
Thyrotropin (Hormone), Histamin, Antigene, Proteine
des Immunsystems oder Proteine davon, Viren, Bakterien,
einige Zellgifte und Sperma geeignet. Für viele dieser Substanzen
gibt es natürliche oder synthetische Antagonisten, d. h.
eine Substanz, die die physiologische Wirkung der
korrespondierenden Substanz aufhebt oder an die Rezep
toren gebunden wird, wodurch die Bindung der natürli
chen Substanz ausgeschlossen wird. Natürliche oder
synthetische Agonisten sind bekannt. Ein Agonist ist eine
Substanz, die gebunden an den Rezeptor eine physiologi
sche Zellreaktion ähnlich der des natürlichen Liganden
auslöst. Viele Drogen, die üblicherweise in der medi
zinischen Praxis verwendet werden, sind Agonisten oder
Antagonisten der natürlichen Liganden.
In vielen Fällen kann die Reaktion, die in Zellen nach
dem Bindungsvorgang des Liganden an die spezifischen
Rezeptoren ausgelöst wird, durch eine Reaktion der
Zellen mit anderen Substanzen, die mit den Rezeptoren
verbindbar sind, z. B. mit einigen Pflanzenlectinen oder
mit Antikörpern, hergestellt gegen isolierte Rezeptoren,
verdoppelt werden. Es ist auch möglich, eine derartige
Zellreaktion durch Addition von Mitteln auszulösen,
die das Membranpotential in der gleichen Richtung
ändern, wie bei der folgenden Ligand-Rezeptor-Wechsel
beziehung.
Es wird daher ein schnelles und zuverlässiges Verfah
ren zur Ermittlung und Messung des intrazellulären
Effekts einer Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung ge
wünscht, da dieses Verfahren außerordentlich nützlich
für die biochemische Forschung und für diagnostische
Untersuchungen ist. Aufgrund der Unterschiedlichkeit
der Rezeptorspezifität bei ansonsten homogenen
Zellkulturen und wegen der sehr großen Zahl unter
schiedlicher chemotaktischer Mittel wäre ein solches
Meßverfahren ideal für die Prüfung individu
eller Zellen.
Es sind verschiedene direkte und indirekte Verfahren
für die Bestimmung der Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehun
gen bekannt. Bei einer Klasse von bekannten Verfahren
werden radioaktiv markierte oder fluoreszierende Ligan
den verwendet. Diese Liganden werden in eine Zell
suspension inkubiert und nach dem Herauswaschen der
nicht gebundenen Liganden wird die Radioaktivität
oder die Fluoreszenz der Zellmasse geprüft. Da bei
diesen Verfahren markierte Liganden eingesetzt werden,
ist dieses Verfahren in seiner Einsatzmöglichkeit er
heblich begrenzt. Bei einer anderen Klasse von Meß
verfahren wird der Umstand zur Beobachtung genutzt,
daß die Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehungen oft von
einem Ansteigen der intrazellulären Bildung von Des
oxyribonucleinsäure (DNA) begleitet ist. Bei einigen
Systemen kann man nach der Bindung der Liganden an den
Rezeptor, z. B. wenn man Lymphocyten mit einem Antigen
oder Mitogenen wie z. B. Phythohemagglutinin stimuliert,
das DNA-Niveau messen und dann mit dem DNA-Niveau
einer Vergleichszellmasse, in der keine Ligand-Rezeptor-
Wechselbeziehung stattgefunden hat, vergleichen. Das
relative Niveau der Desoxyribonucleinsäure ist ein Maß
für die Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung. Dieses be
kannte Verfahren ist in seiner Anwendung ebenfalls
begrenzt, da die Bildung der DNA im allgemeinen nicht
für einige Stunden oder noch nach Tagen nach der Ligan
denbindung bzw. -kupplung meßbar ist.
Eine andere bekannte Klasse von Verfahren für die
Bestimmung einiger Arten von Ligand-Rezeptor-Wechsel
beziehungen basiert auf Änderungen in der Struktur
der Cytoplasmamatrix, die bestimmt wird durch die
Messung der Polarisation der Fluoreszenz des intra
zellulären Fluoresceins. Um eine Analyse nach diesen
Methoden durchzuführen, müssen die Zellen in der Lage
sein, intrazelluläres Fluorescein durch enzymatische
Hydrolyse von Fluoresceindiacetat oder einer ähnlichen
Verbindung zu bilden. Diese Verfahren sind technisch
schwierig durchzuführen und die Ergebnisse sind sehr
schwierig zu interpretieren. Außerdem erfordert dieses
Verfahren eine metabolische Modifikation eines Mittels
durch die Zellen, das noch nicht vollständig erforscht
ist.
Es ist seit langem bekannt, daß erregbare Zellen, z. B.
Nervenzellen und Muskelzellen, eine sehr schnelle
Änderung des Membranpotentials anzeigen, wenn sie mit
einem Neurotransmitter stimuliert werden. Seit kurzem
ist jedoch auch bekannt, daß die Membranpotential
änderungen, die durch eine physiologische Stimulation
induziert werden, nicht auf diese speziellen Zellen
begrenzt sind. Es ist festgestellt worden, durch
Einführung einer Mikroelektrode in nicht erregbare
Zellen, daß Membranpotentialänderungen verbunden
sind mit einer Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung. Es
ist beobachtet worden, daß die physiologische Reaktion,
die bei nicht erregbaren Zellen nach dem Bindungsvor
gang eines Liganden an einen Rezeptor eintritt, manchmal
verdoppelt werden kann durch die Zugabe von Mitteln zu
der Zellsuspension, die das Membranpotential in der
gleichen Richtung verändern wie die nachfolgende
Ligand-Rezeptor-Kupplung. Es sind auch neue Methoden
zur Beobachtung dieser Änderungen entwickelt worden.
In Biochemistry, Vol. 13, Nr. 16, 1974, Seite 3315 ist
z. B. ein photometrisches Verfahren zur Messung der
Änderungen im Membranpotential von Zellsuspensions
ansätzen beschrieben. Nach diesem Verfahren wird die
Zellsuspension mit einem Cyanin oder einem anderen
Farbstoff, der positiv geladen ist, und der geeignet
ist, die Lipidschicht der Zellmembran zu durchqueren,
inkubiert. Die Verhältnisse der intrazellulären zu
den extrazellulären Farbstoffkonzentrationen ändern
sich mit den Änderungen der Zellmembranpotentiale.
Wenn die Zellen hyperpolarisiert werden, d. h. je
negativer das Zellinnere wird, desto mehr Farbstoff-
Moleküle treten in die Zellen ein. Bei diesem bekannten
Verfahren werden die Farbstoffe in Konzentrationen
verwendet, daß die intrazellulären Farbstoffmoleküle
nicht-fluoreszierende Aggregate bilden und die Fluores
zenz der freien Farbstoffmoleküle im Suspensionsmedium
gegen den dunkleren Hintergrund der Zellen gemessen wird.
Die Fluoreszenz fällt mit der Hyperpolarisation der
Zellen ab. Wenn nur ein kleiner Teil der Zellen in
der Suspension gegenüber einem gegebenen Liganden
sensibilisiert ist, dann zeigt nur dieser Teil der
Zellen eine Änderung im Membranpotential. In diesem
Fall ändert sich die Farbstoffkonzentration in dem
Medium nicht merkbar, so daß die Änderung in der
Fluoreszenz des extrazellulären Farbstoffs nicht
meßbar ist. Darüber hinaus ist dieses Verfahren nicht
geeignet für die Identifizierung von hinsichtlich eines
Liganden sensibilisierten individuellen Zellen.
Aus Journal of Membrane Biology, Vol. 33, Seite 141
(1977) ist die Verwendung von Merocyaninen, Oxonol und
Cyaninfarbstoffen zur Messung schneller Änderungen von
Membranpotentialen in erregbaren Zellen, z. B.
Riesenaxonen des Squid-Nervensystems, bekannt. Es wurde
beobachtet, daß lineare Änderungen in der Absorption,
Fluoreszenz, Dichroismus und der Doppelbrechung der
Farbstoffe zusammen mit den Änderungen im
Membranpotential vorkommen. Die geeignetsten Farbstoffe
für diese Messungen sind die Merocyanine, die negativ
geladen sind und daher nicht zu leicht durch die
Zellwände hindurchtreten. Im allgemeinen färben diese
Farbstoffe außer den erregbaren Nervenzellen und
Muskelzellen keine anderen Zellmembranen. Merocyanine
färben jedoch auch einige nicht erregbare Zellmembranen,
z. B. Immatur- und Leukämieblutzellen, wobei die Anfärbung
unabhängig von einer Änderung des Zellmembranpotentials
ist.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein
biologisches Meßverfahren auf der Basis einer nicht
intrusiven Messung der Änderungen des Membranpotentials
von individuellen nicht erregbaren Zellen zur Verfügung
zu stellen.
Die Erfindung löst die Aufgabe gemäß dem kennzeichnenden
Teil von Patentanspruch 1.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind
in den Unteransprüchen angeführt.
Das erfindungsgemäße Meßverfahren hat gegenüber bekannten
Verfahren den Vorteil, schneller, empfindlicher und
vielseitiger anwendbar zu sein. Ein weiterer Vorteil liegt
darin, daß es auf einzelne, nicht erregbare Zellen
angewandt werden kann. Bisher bekannte Verfahren konnten
Meßcharakteristika nur in Zellsuspensionsansätzen
bestimmen. Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es
auch möglich, potentielle aktive Drogen aufzuzeigen,
unterstützend bei der Diagnose physiologischer
Fehlfunktionen von Geweben einzugreifen sowie Allergie-
und Gewebeverträglichkeits-Tests durchzuführen.
Das erfindungsgemäße Verfahren
bietet die Möglichkeit, nicht nur pharmakologisch,
biologisch oder chemisch modifizierte Zellen auf ihre
physiologischen Reaktionen zu untersuchen, sondern auch
physikalisch modifizierte Zellen mit Hilfe von
Zellmembranpotentialänderungen zu charakterisieren.
Die Erfindung findet Anwendung
- 1) für die Bestimmung der Anwesenheit oder der Ab wesenheit von spezifischen Rezeptoren für einen bestimmten Liganden in einer Zelle oder allen Zellen einer Zellkultur,
- 2) für die Bestimmung der Anwesenheit oder der Abwesen heit einer Mischung von Substanzen eines spezifischen Liganden von dem bekannt ist, daß er mit Teilen einer gegebenen Zellkultur in Wechselwirkung tritt,
- 3) für das Studium der kumulativen Effekte von Kombi nationen von Liganden auf Zellen,
- 4) für den Vergleich der Effekte von zwei oder mehreren Liganden auf eine vorgegebene Zellkultur und
- 5) zur Bestimmung der Anzeige des physiologischen Zu stands einer Zellkultur oder Zellsubkultur nach der Behandlung mit einem vermutlichen Gift oder einer anderen Substanz.
Da viele der Verfahren zur Bestimmung der Änderungen
des Membranpotentials nicht zerstörend sind, können
die Verfahren in Kombination mit einer Zellsortierung
verwendet werden zur Herstellung von Zellkulturen, die
reich sind an Zellen mit den gewünschten Rezeptor
spezifitäten, um so das Zellwachstum zu garantieren.
Man kann das erfindungsgemäße Verfahren durchführen, indem man nicht erregbare Zellen, wie
sie typischerweise in Suspensionen vorliegen, mit
einer Lösung in Kontakt bringt, die einen oder
mehrere aktive Liganden enthält oder von der man annimmt,
daß sie diese Liganden enthält. Die Mischung
wird unter Bedingungen, bei denen sich Komplement-
Zellrezeptoren und Liganden miteinander verbinden,
inkubiert, um eine physiologische Änderung in den
Zellen, in denen es zur Kupplung kommt, zu induzieren.
Vor, nach oder während der Inkubation wird eine
Charakteristik, dargestellt durch das Zellmembran
potential der individuellen Zellen, aufgenommen.
Die ermittelte Charakteristik wird verglichen mit
einer Standardprobe, um die Veränderungen
in den Membranpotentialen zu bestimmen und so die
gewünschte Information zu erhalten.
Die Gegenwart oder Abwesenheit eines Liganden in einer
Lösung kann bestimmt werden durch die Inkubation der
Lösung mit einer Zellkultur einschließlich wenigstens
einer Zellsubkultur, von der bekannt ist, daß sie
Rezeptoren für die fraglichen Liganden enthält. Es folgen weiterhin die Auf
zeichnung der Änderungen des Zellmembranpotentials in
jeder Zelle der Zellkultur und ein Vergleich der Verteilung
der Membranpotentialänderungen, sofern welche auftre
ten, dieser Zellen mit den Ergebnissen einer parallelen
Standardprobe, die
eine authentische Probe des fraglichen Liganden enthält.
Mit der erfindungsgemäßen Methode kann auch
die Ligandenkonzentration in der zu unter
suchenden Probe bestimmt werden.
Die Gegenwart und die Zahl der Zellen, die mit einem
bekannten Liganden in einer heterogenen Zellkultur rea
gieren, kann in ähnlicher Weise dadurch bestimmt wer
den, daß man die Änderungen des Membranpotentials zwi
schen den Zahlen der Kultur vergleicht. Durch
die Kombination dieses erfindungsgemäßen Verfahrens
mit bekannten Verfahren zur Zellsortierung ist dem
Forscher eine Möglichkeit an die Hand gegeben, Zell
kulturen herzustellen, die relativ homogen hinsicht
lich der Sensibilisierung gegenüber einem spezifischen
Liganden sind.
Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann die physiolo
gische Reaktion einer Zellkultur mit nicht erregbaren Zellen auf
die Behandlung mit zwei oder mehreren chemisch be
stimmten Liganden vorhergesagt werden und verglichen
werden durch die Inkubation von Lösungen entsprechender
Liganden in mehrzelligen Proben, Aufzeichnung der
Richtung der Höhe und/oder der Zeit des Ablaufs der
Änderungen im Membranpotential in den individuellen
Zellen hinsichtlich der Zellproben und Vergleich der
Messungen der Proben. Diese Technik kann z.B. verwendet
werden zur Auslese von synthetischen Substanzen, bei
denen man erwartet, daß sie Agonisten oder Antagonisten
zu den natürlichen Liganden sind und um die Veränderung
in der Zellreaktion von ähnlichen Zellen gegenüber
funktionell oder strukturell ähnlichen Liganden zu
bestimmen.
Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann
der kumulative Effekt der Behandlung von zwei oder
mehreren bestimmten chemischen Liganden zu einer
Kultur von nicht erregbaren Zellen sehr schnell ge
prüft werden durch die Inkubation der Liganden und
der Zellkultur, der Aufnahme der Änderungen im Zell
membranpotential der individuellen Zellen und Ver
gleich der aufgenommenen Potentialänderungen z.B.
mit den Ergebnissen von Parallelversuchen mit
individuellen Liganden oder der Aufzeichnung der
vorherbestimmten Zellreaktion gegenüber einem oder
mehreren der individuellen Liganden. Dieses Ver
fahren dient zur Entdeckung von Drogen, die als
Agonisten oder Antagonisten zu natürlichen Liganden
wirken sowie zur Ermittlung ihrer optimalen Dosen.
Nach einer Ausgestaltung der Erfindung kann die
Giftwirkung verschiedener Mittel auf Zellen abge
schätzt werden durch die Messung des Membranpotentials
nach der Behandlung der Zellen mit diesen Mitteln. Das
Membranpotential einer verletzten Zelle muß innerhalb
der Zeit auf Null abfallen, in der die Membran zer
stört ist. Geringere Verletzungen sind durch einen
Abfall der Höhe des Membranpotentials im Vergleich
zu unverletzten Zellen feststellbar.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verteilen sich ionische, membranpermeable Farb
stoffe, wenn sie in Zellen inkubiert sind, sehr schnell
gleichmäßig auf den gegenüberliegenden Seiten der
Zellmembranen in Abhängigkeit vom Membranpotential.
Dann wird eine Messung der intrazellulären Farbstoff
konzentration vorgenommen über eine photometrische
Messung der Fluoreszenz, der Absorption oder anderer
optischer Eigenschaften des Farbstoffs innerhalb der
individuellen Zelle und es werden andere Daten der individuellen
Zelle, die ebenfalls bekannt
sein müssen, wie z. B. das Zellvolumen,
über die intrazelluläre Farbstoffkonzentration
bestimmt. Dort wo die verglichenen Zellen
hinsichtlich des Volumens homogen sind, ist die Messung
der Menge des intrazellulären Farbstoffs proportional
dem Membranpotential. Die photometrische Messung kann
durchgeführt werden durch übliche Mikrophotometrie
oder durch Fließcytometrie. Wenn es sich bei der zu
bestimmenden optischen Eigenschaft um die Fluoreszenz
handelt, dann wird vorzugsweise ein Farbstoff verwen
det, der ein an
steigendes Fluoreszenzquantum in
Lösungsmitteln mit abfallender Polarität aufweist
und die Konzentration des Farbstoffs in dem Medium
wird so eingestellt, daß die intrazelluläre Fluores
zenz-Inaktivierung durch die Bildung von Komplexen
mit verringerter Fluoreszenz verhindert wird. Geeigne
te fluoreszierende Farbstoffe sind die kationischen
Cyaninfarbstoffe, z. B. das 3,3′-Dihexyl-2,2′-oxacarbo
cyanin (diO-C₆-(3)).
Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgen
den Zeichnungen näher erläutert
Fig. 1 zeigt die graphische Darstellung der Ver
teilung der Zellfluoreszenzintensität eines
ersten Anteils einer menschlichen Lymphocyten-
Zellsuspension, inkubiert mit 5 · 10-8M 3,3′-
Dihexyl-2,2′oxacarbocyanin (diO-C₆-(3)).
In dieser graphischen Darstellung und in
den folgenden Darstellungen zeigt die
Ordinate die Zahl der Zellen mit einer be
stimmten Intensität an und auf der Abszisse
ist die Fluoreszenzintensität aufgetragen;
Fig. 2 ist eine graphische Darstellung der Ver
teilung der Zellfluoreszenzintensität eines
zweiten Anteils der Zellsuspension, inkubiert
gleichzeitig mit 2 · 10-5M depolarisierendem
ionophoren Gramicidin und 5 · 10-8M diO-C₆-(3);
Fig. 3 zeigt eine graphische Darstellung der Ver
teilung der zellulären Fluoreszenzintensität
eines dritten Teils der Zellsuspension, in
kubiert gleichzeitig mit 6 · 10-6M hyperpolari
sierendem ionophoren Valinomycin und 5 · 10-8M
diO-C₆-(3);
Fig. 4 zeigt die graphische Darstellung der Ver
teilung der zellulären Fluoreszenzintensität
eines vierten Anteils der Zellsuspension, in
kubiert gleichzeitig mit 10 µg/ml einer Lösung des
Liganden Concanavalin A und 5 · 10-8M diO-C₆-(3);
Fig. zeigt die graphische Darstellung der Verteilung
der zellulären Fluoreszenzintensität eines
fünften Anteils der Zellsuspension, inkubiert
gleichzeitig mit 20 µg/ml einer Lösung des
Liganden Phytohemagglutinin und 5 · 10-8M
diO-C₆-(3);
Fig. 6 zeigt die graphische Darstellung der Vertei
lung der zellulären Fluoreszenzintensität
einer Anzahl von Zellen mit einem gegebenen
Fluoreszenzsignal gegenüber der Fluoreszenz
intensität, gemessen an einem Anteil von
T-Lymphocyten, im Gleichgewicht stehend mit
5 · 1-8M diO-C₆-(3);
Fig. 7 zeigt die graphische Darstellung der Ver
teilung einer zellulären Fluoreszenzintensi
tät nach der Zugabe von Phytohemagglutinin
in einer Konzentration von 20 µg/ml,
wobei der Depolarisierungseffekt dieses Lectins
an einer Subkultur der T-Zellen gezeigt ist;
Fig. 8 zeigt die graphische Darstellung der Verteilung
der zellulären Fluoreszenzintensität einer
B-Lymphocytenzellsuspension mit 5 · 10-8M
diO-C₆-(3) und
Fig. 9 zeigt die graphische Darstellung des hyper
polarisierenden Effekts von Phytohemagglutinin
an der B-Zellsuspension gemäß Fig. 8, 20 min
nach der Zugabe von Phytohemagglutinin in
einer Konzentration von 20 µg/ml.
Die graphischen Darstellungen wurden aufgezeichnet mit
einem Fließcytometer (Cytofluorograph der Firma Ortho
Instruments), das mit einem Impulshöhenanalysator
verbunden war.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auf nicht erregbare
Zellen anwendbar, d. h. also nicht nur auf
Zellen aus Muskelgewebe und Nervengewebe.
Die Zellen, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
analysiert bzw. geprüft werden sollen, werden nach
üblichen Verfahren isoliert und in einem Medium suspen
diert, das geeignet ist einen normalen Zellstoffwechsel
zu fördern, z.B. eine ausgewogene, sauerstoffhaltige
isotonische gepufferte Salzlösung mit einem pH-
Wert von 7,2 bis 7,6, enthaltend Glucose oder andere
Nährstoffe und etwa physiologische Konzentrationen
an Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumionen.
Die Zellen sollten vorzugsweise frei von externen
Proteinen; z.B. Albumin usw. und anderen Substanzen
sein, die eine starke Affinität zu den Farbstoffen aufwei
sen, die verwendet werden, um die Membranpotential
änderungen gemäß dem vorliegenden Verfahren zu be
stimmen.
Dem Ziel des Tests entsprechend können die Zellen eine
Zellkultur enthalten, die relativ homogen hinsicht
lich der physiologischen Funktion (z. B. T-Lymphocyten)
oder hinsichtlich der Ligandenspezifität (z. B. Mast
zellen sensibilisiert gegenüber IgE Allergenkomplexen)
sind. Falls gewünscht, können die Zellen eingeteilt
werden in viele Aliquote, so daß mehrere Bestimmungen
des Membranpotentials parallel nebeneinander durchge
führt werden können. Das Membranpotential der Zellen
in jedem Teil wird dann nach der Behandlung, z. B. mit
einer Lösung von verschiedenen Liganden, verschiedenen
Konzentrationen von einzelnen Ligandenarten oder einer
ligandenfreien Lösung, bestimmt, so daß ein Vergleich
durchgeführt werden kann. In Abhängigkeit von der Ziel
richtung der Untersuchung kann die Lösung, die für die
Behandlung der Zellen eingesetzt wird, eine unbekannte
Lösung sein, bei der man vermutet, daß sie einen Ligan
den enthält, der für die Zellen in der Probe spezifisch
ist, eine authentische Probe eines bekannten Liganden
einer bekannten oder unbekannten Konzentration sein,
ein unreines Ligandenpräparat sein oder eine Lösung
sein, die eine Substanz enthält, bei der man vermutet,
daß sie ein Gift für die Zellen oder für eine Subkultur
davon darstellt.
Zusätzlich zu der Feststellung bzw. Bestimmung des
Ablaufs einer Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung bzw.
Bindung ist das erfindungsgemäße Verfahren geeignet
für die Ermittlung der folgenden Kategorien von Infor
mationen:
- 1) Die Anwesenheit einer Subkultur von Zellen in der Suspension, enthaltend Membranoberflächenrezeptoren als Komplement zu einem spezifischen Liganden,
- 2) die Anwesenheit einer spezifischen Ligandenart in einer Lösung, die geeignet ist, eine Bindung ein zugehen mit Rezeptoren, die sich an den Zellen in der Suspension oder einer Subkultur davon befinden,
- 3) zur Bestimmung des kumulativen Effekts von multiplen Liganden, die in Wechselwirkung treten mit einer ge gebenen Zellkultur,
- 4) ein Vergleich der Reaktion einer Zellkultur oder einer Subkultur davon zur Differenzierung der Arten der Liganden,
- 5) des Effekts der Zellebensfähigkeit verschiedener Konzentrationen von toxischen Substanzen oder
- 6) der Simulation von Zellmetabolismen durch verschie dene Konzentrationen von Nährstoffen, z.B. Aminosäuren oder Zucker.
Hinsichtlich der Systeme, bei denen sich eine Liganden-
Rezeptor-Wechselwirkung abspielt, wird die Information
erhalten durch die Inkubation der Zellen mit der Ligan
denlösung für eine ausreichende Zeit und bei einer
geeigneten Temperatur (z. B. Normaltemperatur der Zellen
in ihrer natürlichen Umgebung), damit die Liganden-
Rezeptor-Wechselwirkung eintreten kann und es zu einer
entsprechenden Änderung im Ionenstrom über die Zell
membranen kommt.
Dann wird eine Charakteristik jeder Zelle in der
Suspension oder jeder Zelle in einem repräsentativen
Teil der Suspension, dargestellt durch das Membran
potential, erhalten, ggf. in Intervallen, so daß ein
Profil von Potentialänderungen über die Zeit erhalten
wird.
Die gemessene Charakteristik wird dann mit einer
Standardprobe verglichen, um festzustellen,
ob eine Ligand-Rezeptor-Wechselbeziehung bzw. -Kupplung
stattgefunden hat und ob die Richtung, die Höhe oder
der zeitliche Verlauf der Änderungen nach
geahmt oder antagoniert wurden bei den Änderungen, die
in den Zellen bei der Behandlung mit einem bekannten
Liganden induziert wurden, oder ob der kumulative
Effekt am Membranpotential von zwei oder mehreren
Liganden sich unterscheidet von dem eines einzelnen
Liganden oder einer unterschiedlichen Mischung von
Liganden.
Die Art der Standardprobe muß notwendiger
weise variiert werden in Abhängigkeit von der gewünsch
ten spezifischen Information. Die Standardprobe
kann aus den Ergebnissen von einer oder mehreren Parallel
versuchen mit der Testprobe bestehen. Alternativ dazu
kann die Standardprobe die Auf
zeichnung eines solchen Meßverfahrens sein, z. B. einer
graphischen Darstellung einer Zahl von Zellen, die
ein bestimmtes Potential gegenüber der Höhe des
Potentials aufweisen.
Die Liganden und ihre Antagonisten verursachen im all
gemeinen entgegengesetzte Wirkungen bei den Zellmembran
potentialen. Es werden daher Substanzen gesucht, die
geeignet sind den Effekt der natürlichen Liganden an
Zellen eines besonderen Gewebes zu kopieren, blockieren
oder zu negativieren. Die Richtung, Höhe und/oder der
zeitliche Verlauf der Membranpotentialänderungen in
einer Zellprobe eines Gewebes können bestimmt werden
durch mehrere Messungen nach der Behandlung der Zellen
mit dem natürlichen Liganden. Danach werden verschie
dene Substanzen zu Aliquoten der gleichen Zellsuspension
hinzugefügt. Durch den Vergleich der Membranpotential
änderungen, die in den entsprechenden Proben induziert
werden, kann der Forscher die Proben identifizieren,
die für weitere spezifische Untersuchungen geeignet
sind, z.B. die gewünschte physiologische Wirkung
aufweisen, und kann die anderen Proben eliminieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch geeignet zur
Bestimmung der Parameter, wie der Konzentration des
Antagonisten, die benötigt wird, um den Effekt des
Membranpotentials einer bestimmten Zellart auf eine
gegebene Konzentration des Agonisten zu beseitigen.
Diese Messungen sind nützlich für die Entwicklung
der Liganden und ihrer Antagonisten als Pharmazeutika.
In einigen Fällen existieren verschiedene Arten von
spezifischen Rezeptoren für einen bestimmten Liganden.
So kann z. B. die Kupplung eines Liganden an Rezeptoren
einer Zellart zu einer Hyperpolarisation
führen, während die Kupplung bzw. Bindung des gleichen
Liganden an Rezeptoren einer zweiten
Zellart zu einer Depolarisation führen kann. Das er
findungsgemäße Verfahren ist geeignet zwischen diesen
beiden Arten von Wechselwirkungen zu unterscheiden.
Bekannte Zellsortiermethoden in Kombination mit dem
erfindungsgemäßen Verfahren ermöglichen die Isolierung
von Zellinien mit der gewünschten Rezeptorspezifität
aus heterogenen Zellkulturen. Die Verwendung des er
findungsgemäßen Verfahrens führt in diesem Zusammen
hang zu einer erhöhten Selektivität im Vergleich
zu üblichen Verfahren für die Sortierung von Zellen
auf Basis der Kupplung von fluoreszierend gemachten
Liganden, weil sowohl der physiologische Effekt als auch
die Ligandenkupplung eingearbeitet sind in die Selektions
kriterien. Eine zusätzliche Spezifität kann dadurch
erhalten werden, daß man die direkte Messung der
Kupplung mit optisch markierten Liganden mit der
Bestimmung der Änderung im Membranpotential nach
der Ligandenkupplung kombiniert.
Wenn die Gegenwart einer besonderen Ligandenart in
einer Lösung oder die Gegenwart von Zellen mit einer
besonderen Ligandenspezifität von Interesse ist, kann
das Membranpotential vor und nach dem Mischen des
Liganden mit der Zellsuspension abgelesen und die
Resultate verglichen werden. Entsprechende Anteile
der Zellsuspension können inkubiert werden mit z. B.
- 1) einer Lösung, enthaltend eine unbekannte Konzentration eines bestimmten Liganden,
- 2) einer ligandenfreien Lösung und
- 3) einer Lösung, enthaltend eine bekannte Konzentration des Liganden.
Nach der Inkubaktion kann ein Wert für die Liganden
konzentration in der unbekannten Lösung erhalten werden
durch den Vergleich der Membranpotentiale der Zellen
in den entsprechenden Proben. Wenn das Membranpotential
der individuellen Zellen bestimmt ist, ist es möglich
eine Subkultur von Zellen in der Suspension mit einer
ausgewählten Ligandenspezifität zu identifizieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann für die qualitative
und quantitative Bestimmung der zellulären Immunreaktion
verwendet werden, durch das Messen der Potentialänderun
gen in Lymphocyten, Macrophagen oder anderen Zellen
des Immunsystems, nachdem die Zellen Substanzen wie
Antigenen, Antikörpern, Haptenen, Allergenen und Komple
mentverbindungen ausgesetzt worden sind. Da die
Lymphocyten üblicherweise eine heterogene Zellkultur
hinsichtlich ihrer Reaktivität gegenüber einem bestimm
ten Antigen darstellen, liefert die Fraktion der Zellen, die auf
ein bestimmtes Antigen reagieren, ein nützliches Maß für
die zelluläre Immunreaktion bzw. -antwort. Abweichungen
vom üblichen Muster der Potentialänderungen in leicht
reagierenden Zellen können Defekte in der Immunfunktion
anzeigen. In ähnlicher Weise kann die Einführung von
verschiedenen Allergenen in eine Vielzahl von Proben
eines individuellen Serums und die nachfolgende
Inkubation der Proben mit Zellen, die an der Exkretion
des Histamins beteiligt sind, als
nicht-intrusives Verfahren für die Bestimmung der
Sensibilität eines Individuums gegenüber verschiedenen
Allergenen verwendet werden.
Da beim erfindungsgemäßen Verfahren die Isolierung
und Markierung einer speziellen Ligandenspezies für
die Bestimmung der Substanzen für die Bindungs
reaktion in den Zellen mit bestimmter Rezeptorspezifi
tät nicht notwendig ist, ist es möglich, das erfin
dungsgemäße Verfahren für die Bestimmung der Ligandenaktivität in
unreinen Ligandenpräparaten zu verwenden und die
Ligandenaktivität in verschiedenen Fraktionen solcher
unreinen Präparate, die zur Reinigung oder Isolierung
des gewünschten spezifischen Liganden erhalten wer
den, zu verfolgen und aufzuzeigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch als Hilfsmittel
zur Definierung der chemischen Struktur der Oberfläche
der Rezeptoren verwendet werden, etwa durch die Demonstration der Konkurrenz
zwischen den verschiedenen Liganden bekannter Spezifi
tät für die Bindungsplätze an den Zelloberflächen.
Die toxischen Wirkungen verschiedener Substanzen auf
die Zellen kann abgeschätzt werden durch eine
Messung der Membranpotentiale der Zellen
nach der Behandlung der Zellen mit diesen Mitteln.
Es ist bekannt, daß die Tests für die Lebensfähigkeit
der Zellen, basierend auf den Zutritt normalerweise
impermeabler Farbstoffe, wie Propidiumjodid, nur jene
Zellen ermitteln, die zerstört sind. Für viele Fälle,
z. B. für die Entwicklung von Pharmazeutika für die
Krebsbehandlung, ist es sinnvoll zu bestimmen, ob die
zukünftige reproduktive Kapazität der Zelle beeinträch
tigt ist oder ob eine teilweise Beschädigung durch
einen Riß in der Zellmembran stattgefunden hat.
Das Potential einer verletzten Zelle muß
auf Null abfallen, sobald die Membran zerstört ist.
Geringere Verletzungen sind bestimmbar durch ein
Abfallen des Membranpotentials im Vergleich
zu den unverletzten Zellen. Die Verringerung oder die
Verhinderung der Zellantwort bzw. Zellreaktion auf
Liganden und andere Substanzen, die normalerweise
bekannte Änderungen des Potentials verursachen, kann
auch durch die Messung der Zellmembranpotentiale er
mittelt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Voraussage
von Unterschieden bei der Aufnahme von Pharmazeutika
in unterschiedlichen Zellarten verwendet werden, da die Aufnahme
der Permeablen bzw. durchringenden ionischen
Verbindungen (z. B. der Pharmazeutika) durch die Zellmembran
abhängig ist von dem Membranpotential. Das erfindungs
gemäße Verfahren kann auch als Korrekturfaktor verwen
det werden aufgrund der unterschiedlichen Farbstoff
aufnahme, die durch die
gemessenen Potentialunterschiede vorherbestimmt, ist wodurch verschiedene
durchdringende ionische Farbstoffe, z. B. Acridine für lebende Anfärbungen
verwendet werden können, sowie für die
quantitiative Bestimmung verschiedener intrazellulärer
Bestandteile, z. B. der Nucleinsäuren und der Glycosamino
glycane.
Alle oben genannten Verfahren erfordern eine schnelle,
nichtintrusive und vorzugsweise nicht zerstörende
Methode zur Bestimmung des Membranpotentials oder
eine Messung, die proportional ist dem
Membranpotential von 10³ bis 10⁶ individuellen Zellen
in einer üblichen Zellprobe. Die Einführung einer
Mikroelektrode in die individuellen Zellen beschädigt
notwendigerweise die Zellmembranen und kann daher nicht
verwendet werden um das Membranpotential in jeder der
vielen Zellen in der Zellsuspension zu bestimmen. Bei
einer bevorzugten Bestimmungsmethode werden kationische
zellmembranpermeable fluoreszierende Farbstoffe ver
wendet, die sich während der Inkubation zwi
schen den Innen- und den Außenseiten der Zellmembranen
als Funktion des Membranpotentials aufteilen. Dann wird die
intrazelluläre Konzentration des Farbstoffs oder
ein Parameter, der der Konzentration proportional ist,
mittels eines optischen Verfahrens mit einem Mikro
photometer oder einem Fließcytometer gemessen. Bei
einer Hyperpolarisation wird die Affinität des Zell
inneren für den Farbstoff erhöht, während bei einer
Depolarisation die Affinität des Zellinneren für den
Farbstoff herabgesetzt wird.
Geeignete Farbstoffe für diese Methode sind z. B.
kationische Cyaninfarbstoffe, wie 3,3′-Di-n-butyl-
9-methyl- und 3,3′-Diethyl-thiacarbocyanine,
3,3′-Diethyl-2,2′-oxacarbocyanin, 2,3,3,1′,3′,3′-
Hexamethylindocarbocyanin und Dicarbocyanin, 3,3′-Di
ethylthiadicarbocyanin und vorzugsweise 3,3′-Dihexyl-
2,2′-oxacarbocyanin (diO-C₆-(3)). Bei diesen Farb
stoffen handelt es sich um handelsübliche Farbstoffe
(Fa. Eastman Kodak).
Es ist von Vorteil, wenn die ausgewählten Farbstoffe
ein erhöhtes Fluoreszenz
quantum in Lösungsmitteln mit abfallender Polarität
aufweisen und daß die Fluoreszenz und die Absorptions
maxima des Farbstoffes sich mit den Änderungen
der Polarität des Lösungsmittels verschieben. Diese
Eigenschaften erhöhen die Selektivität der Bestimmung
der membranassoziierten Farbstoffe innerhalb der
Zellen gegenüber dem Hintergrund der farbstofffreien
Zellen in der Lösung. Es ist auch von Vorteil, die
ausgewählten fluoreszierenden Farbstoffe in einer aus
reichend geringen Konzentration zu verwenden, um die
Auslöschung der Fluoreszenz der intrazellulären Farb
stoffe aufgrund der Bildung von Aggregaten zu ver
ringern. Bei der Verwendung des bevorzugt eingesetzten
Cyaninfarbstoffs (DiO-C₆-(3)) liegt die Konzentration
bei oder unterhalb etwa 3 × 10-7M.
Der Farbstoff diO-C₆-(3) ist charakterisiert durch
einen Anstieg des Quantums auf etwa
4,5 in n-Octanol gegenüber wäßrigen Lösungen. Die
Absorptions- und Emissionsmaxima in n-Octanol sind
um etwa 10 nm höher als in einer wäßrigen Lösung.
Die Menge des diO-C₆-(3) in individuellen Zellen wird
bestimmt durch das Fluoreszenzquantum im Bereich
von 504 nm nach der Anregung bei etwa 488 nm.
Bei den Cyaninfarbstoffen tritt der gewünschte Ein
fluß des Lösungsmittels auf das Quan
tums im allgemeinen mehr bei den Carbocyaninfarbstoffen
in Erscheinung, die die allgemeine Formel R-(CH)₃-R′
aufweisen und weniger bei den Di- und Tricarbocya
ninen mit der allgemeinen Formel R-(CH)₅-R′ und
R-(CH)₇-R′.
Für die Messung der Fluoreszenz kann ein Mikrofluoro
meter verwendet werden; besonders schnell und besonders
präzise arbeitet jedoch das Fließcytometer. Die Arbeits
weise der Fließcytometrie und der Zellsortierung ist
z. B. in Science, Vol. 198, Seiten 149-157 (1977)
beschrieben. Die Fließcytometer, die Argonionenlaser
lichtquellen verwenden, sind für die obigen Messungen
besonders geeignet. Diese Instrumente werden von ver
schiedenen Firmen hergestellt. Diese Geräte sind für
das automatische Sortieren von Zellen auf der Basis der
verschiedenen Kriterien wie der Fluoreszenzintensität,
der Zellgröße, der Wellenlänge der Fluoreszenz und
der Wellenlänge oder der Intensität der Absorption
geeignet.
Wenn die zu untersuchende Zellkultur relativ homogen
hinsichtlich der Größe und der inneren Struktur ist
und wenn die Konzentration des zugegebenen Farbstoffs
und die Zahl der suspendierten Zellen in dem vorge
gebenen Volumen des Mediums relativ konstant gehalten
werden, ist die Gesamtmenge des Farbstoffs in einer
bestimmten Zelle, gemessen durch die Intensität der
Fluoreszenz dieser Zelle, direkt proportional der
Konzentration und damit des Membranpotentials. Wenn
jedoch gemischte Zellkulturen oder unterschiedliche
Zellkonzentrationen und/oder Farbstoffkonzentrationen
vorliegen, sind zusätzllche Messungen notwendig. Da
die intrazelluläre Konzentration des Farbstoffs gleich
ist der Gesamtmenge des Farbstoffs in der Zelle ge
teilt durch das Zellvolumen, wird ein Wert
der proportional zur Konzentration des Farbstoffs
in einer bestimmten Zelle ist, dadurch erhalten, indem die
Gesamtmenge des Farbstoffs wie oben beschrieben
durch eine Größe die proportional dem Zell
volumen ist, geteilt wird. Die Messung des Zellvolumens kann gleich
zeitig mit der Ablesung der intrazellulären Fluores
zenz im Fließcytometer durch eine elektronische oder
optische Messung der Zellgröße vorgenommen werden,
in den z. B. 3/2 der Stärke des Zellquerschnitts, gemessen
durch die Streuung des Lichts in einem Winkel nahe
der Achse der Illumination, bestimmt werden. Es ist von Vorteil, daß
bei der Fließcytometrie die Informationen gesammelt,
elektronisch manipuliert und automatisch aufgezeigt
werden können. Das Cytometergerät bildet ein Signal,
das der Fluoreszenzintensität entspricht, ein zweites
Signal für das Zellvolumen und berechnet dann das
Verhältnis der Signale. Dieses Verhältnis, das dem
Membranpotential proportional ist, kann dann als
Zellsortierungskriterium verwendet und/oder
aufgezeichnet werden.
Bei den zu untersuchenden Zellkulturen, die hinsichtlich
des Zellvolumens oder der Menge des farbstoffbindenden
Materials sehr heterogen sind, kann die Messung, die
dem Membranpotential entspricht, dadurch erhalten wer
den, daß man zwei Farbstoffe mit unterschiedlichen
Affinitäten zu den intrazellulären Komponenten ver
wendet. In diesem Fall kann die intrazelluläre Fluores
zenz von beiden Farbstoffen gemessen werden. Der An
stieg oder der Abfall im Verhältnis der intrazellulären
Farbstoffgehalte ist dann proportional zur Änderung
des Membranpotentials und ist unabhängig vom Zell
volumen und Veränderungen hinsichtlich des Gehalts
des farbstoffbindenden Materials in den Zellen.
Auch wenn es nach den Prinzipien der Chemie möglich ist,
die Effekte und die Änderungen in der Zelle und in den
Farbstoffkonzentrationen in den Medien und die intra
zelluläre Konzentration der Farbstoffe zu berechnen,
so ist es doch einfacher für die Praxis, die Verdünnungen
so einzustellen, daß die Zellkonzentrationen und die
Konzentration des Farbstoffs in allen Proben, die mit
einander verglichen werden, etwa gleich sind.
Es kann zu einer Interferenz mit photometrischen Poten
tialmessungen kommen, die verursacht werden durch die
nicht spezifische Anfärbung des Cytoplasmas von toten
Zellen, bei denen die Zellmembranen zerstört sind. Wenn
eine kleine Menge eines normalerweise nicht durchlässigen
Farbstoffs, z. B. Ethidiumbromid oder Propidiumjodid
zu dem Medium hinzugegeben wird, wird der Zellkern
der Zellen mit den zerstörten Membranen angefärbt,
während der Farbstoff nicht in die lebenden
Zellen eindringt. Da der durchdringende bzw. perme
able Farbstoff, der für die Messung des Potentials
verwendet wird und der nicht durchdringende Farbstoff,
der für die Entdeckung geschädigter Membranen ver
wendet wird, unterschiedliche optische Eigenschaften
aufweisen, ist es möglich, Korrelationsmessungen
von einer oder mehreren optischen Eigenschaften
jedes Farbstoffs in jeder Zelle vorzunehmen und so
die geschädigten Zellen, die auf diese Weise er
mittelt werden, zu eliminieren und von der weiteren
Analyse auszuschließen. Wenn als durchdringender Farb
stoff vorzugsweise diO-C₆-(3) und als nicht durch
dringender Farbstoff Propidiumjodid verwendet waren,
dann emitiert der Zellkern der geschädigten Zellen eine
rote Fluoreszenz im Bereich von 610 nm nach An
regung bei 488 nm. Diese Fluores
zenz ist von einem Beobachter oder von einem Photo
meter leicht von der grünen Fluoreszenz des diO-C₆-(3)
zu unterscheiden.
Die photometrischen Messungen des Membranpotentials
können kombiniert werden mit anderen Messungen der
gleichen Zellen, um die analytische Aussage des Ver
fahrens zu erhöhen. So kann z. B. die Antwort bzw. die
Reaktion der Zellen in verschiedenen Phasen des Zell
zykluses gegenüber einem bestimmten Liganden bestimmt
werden durch das gleichzeitige Anfärben mit diO-C₆-(3)
und mit einem DNA-Fluorochrom (z. B. Nr. 33342 der Fa.
Hoechst AG).
Es ist auch möglich, andere optische Eigenschaften
als die Fluoreszenz zu messen, z. B. die Absorption,
um so ein Anzeichen für die Menge des Farbstoffs in
den individuellen Zellen zu erhalten. In diesem Fall
ist es von Vorteil, Farbstoffe zu verwenden, die intra
zelluläre Aggregate mit Absorptionsmaxima bei Wellen
längen bilden, die sich von denen des
freien Farbstoffs unterscheiden und wobei diese Farbstoffe
in ausreichend hoher Konzentration verwendet werden,
so daß eine relativ hohe Fraktion in den
Zellen in Form der Aggregate besteht. Auf diese Weise
wird die Selektivität der Bestimmung des intrazellulären
Farbstoffs gegenüber dem Hintergrund des freien Farb
stoffs in der Lösung verstärkt. Diese Eigenschaften
weisen unter bestimmten Bedingungen z. B. die Thia
carbocyaninfarbstoffe auf, z. B. das 3,3′-Diethyl- und
3,3′-Dipropylthiadicarbocyanin. An rote Blutkörper
chen gebunden, weisen die obigen Farbstoffe eine neue
Absorptionsbande von 590 nm auf, die wahrscheinlich
durch einen Komplex des intrazellulären Farbstoffs
mit Hämoglobin bewirkt wird. Die Absorption der Zellen
bei dieser Wellenlänge kann daher zur Bestimmung der
Menge des Farbstoffs innerhalb der individuellen
Zellen verwendet werden.
Auch wenn die photometrische Bestimmung der Aufnahme der
kationischen Farbstoffe die bevorzugte Methode für
die Messung der Änderungen des Membranpotentials ist,
können aber auch andere Verfahren verwendet werden.
So können z. B. dann, wenn das Zellinnere von nicht
erregbaren Zellen negativ gegenüber der Umgebung ist,
anionische Farbstoffe, die eine Affinität für Lösungs
mittel mit steigender Polarität aufweisen, verwendet
werden. In diesem Fall weist der Farbstoff eine
Affinität zu intrazellulären Verbindungen unabhängig
von ihrer Ladung auf und wird in der Zelle absorbiert.
Die Konzentration dieses Farbstoffs wird herabgesetzt
bei einer Zell-Hyperpolarisation und erhöht sich bei
einer Zell-Depolarisation.
Die Erfindung wird anhand der Beispiele näher erläutert.
Peripherische Blutlymphocyten wurden aus Spenderblut
erhalten und durch Zentrifugieren über Hypaque-Ficoll-
Dichtegradienten isoliert. Mittels cytographischer Ana
lyse der roten und grünen Fluoreszenzsignale der Zel
len in Anteilen, die mit Acridinorange angefärbt waren,
wurden die Prozentzahlen an Erythrocyten, Monocyten
und Granulocyten in dem Lymphocytenpräparat grob
bestimmt. Die Zellzahlen wurden ermittelt und die
Zell-Lebensfähigkeit durch einen Trypanblau-Ausschluß
bestimmt.
Es wurden Versuchslösungen mit diO-C₆-(3) aus den ent
sprechenden Arbeitslösungen in Ethanol mit Konzentrationen
von 10-3M oder 5 · 10-4M hergestellt. Die Konzentrati
onen der Versuchslösungen bzw. Arbeitslösungen wurden
so eingestellt, daß die Farbstoffkonzentration zwi
schen 10-8M und 5 · 10-7M liegen, wenn 10 ml der Farbstoff
lösung zu 1,0 ml der Zellen, verdünnt mit dem Medium
199 (Gibco), gegeben wurden.
Dann wurde Valinomycin (Sigma Chemical Company), ein
bekanntes Ionophor für die Hyperpolarisierung von
Lymphocyten, in Ethanol in einer Konzentration
von 0,66 mg/ml gelöst. Dann wurde Gramicidin (ICN), ein be
kanntes Ionophor für die Depolarisierung von Lympho
cyten, ebenfalls in Ethanol mit einer Konzen
tration von 0,4 mg/ml gelöst. In einer Phosphat gepufferten
Salzlösung wurden Phytohemagglutinin (PHA, Difco,
2 mg/ml) und Concanavalin A (Con-A, Sigma, 1 mg/ml)
gelöst. PHA und Con-A sind bekannte Lectine (Liganden),
die geeignet sind menschliche peripherische Lympho
cyten zu binden.
Bevor weitere Experimente durchgeführt wurden, wurde
die Kinetik der Farbstoffaufnahme der Zellen unter
sucht. 20 ml einer Farbstofflösung wurden zu 20 ml einer
verdünnten Zellsuspension, enthaltend 1 bis 2 · 10⁵
Zellen/ml gegeben. Die Fluoreszenz der Zellen wird
dann mit einem Fließcytometer gemessen. Die Bande der
Fluoreszenzverteilung wird bestimmt und ihre Position
in 1-Minutenintervallen aufgezeichnet, bis sie stabil
ist. Dieser Vorgang dauert etwa 12 min, wenn diO-C₆-(3)
als Indikatorfarbstoff verwendet wird.
Die nachfolgenden Versuche dienen dazu, das Inter
vall zwischen der Zugabe des Farbstoffs und des Lectins
oder des Ionophors und der Messung der Fluoreszenz
konstant zu halten, wobei das Intervall vorzugsweise
etwas länger sein sollte als die beobachtete Gleichge
wichtszeit. Bei den hier verwendeten Konzentrationen
ist für das diO-C₆-(3) eine Periode von 15 bis 20 min
ausreichend.
In einem weiteren Experiment wurden die Fluoreszenzverteilungen
von 5 Aliquoten der Zellsuspension verglichen. Während der
Zeit der Farbstoffzugabe (10 µl Versuchslösung diO-C₆-(3)/
ml Zellen) wurden außerdem die folgenden Substanzen
hinzugegeben:
- a) Keine Zugabe (Kontrollprobe)
- b) PHA (10 ml Arbeitslösung; Endkonzentration 20 µg/ml)
- c) Con-A (10 ml Arbeitslösung bzw. Versuchslösung; Endkonzentration 10 µg/ml)
- d) Valinomycin (10 ml Arbeitslösung; Endkonzentration 6 · 10-6M) und
- e) Gramicidin (10 ml Arbeitslösung; Endkonzentration 2 · 10-5M).
Die Proben wurden in Abständen von 3 bis 6 min herge
stellt, damit genügend Zeit zur Reinigung des Fließ
systems des Fließcytometers zwischen den einzelnen Proben ver
bleibt. Die Fluoreszenzmessungen aller Proben wurden
unter Verwendung der gleichen Laserapparatur mit den
gleichen Verstärkereinrichtungen vorgenommen. Es wurde
etwa die gleiche Zahl von Zellen in jeder Probe ge
messen und die Fluoreszenzverteilung von allen Proben
auf der gleichen Skala des Impulshöhenanalysators auf
gezeichnet.
Die Ergebnisse der Experimente sind in den Fig. 1 bis
5 wiedergegeben. Die Flecken bzw. Pünktchen wurden
erhalten, wenn die Fluoreszenzeigenschaften der Zelle
15 min nach der Zugabe des Farbstoffs
und der Lectine oder der Ionophoren gemessen wurden. Das diO-C₆-(3)
wurde in einer Endkonzentration von 5 · 10-8M verwendet.
Die Fig. 1 (Kontrollprobe) zeigt eine Verteilung der
intrazellulären Konzentration des Cyaninfarbstoffs
zwischen den Zellen der Kultur, dargestellt durch die
Verteilung der Intensität der Fluoreszenz (siehe x-Achse).
Das beobachtete Membranpotential der individuellen
Zellen in der Kultur variiert je nach der Stimula
tion. Die Membranpotentiale sind jedoch verteilt über
einen Peak, angezeigt durch die Linie A; dieser Peak
stellt eine große Subkultur der Zellen mit einem
Zwischenwert des Membranpotentials dar.
Fig. 2 zeigt den Effekt der Zugabe des depolarisieren
den Ionophorsgramicidin, wie Fig. 2 zeigt,
ist die Zahl der Zellen, die eine Verringerung der
Fluoreszenzintensität aufweisen, die
durch die depolarisierende Wirkung des Gramicidins induziert wird, er
heblich erhöht und außerdem ist eine Verschiebung
des Peaks in Richtung des Punkts zu erkennen, der mit
B gekennzeichnet ist. Im Gegensatz dazu weisen die
Zellen, die mit dem hyperpolarisierenden Ionophor
Valinomycin versetzt worden sind (siehe Fig. 3), eine
Erhöhung der Zahl der Zellen mit einer höheren
Fluoreszenzintensität auf (vgl. C).
Wenn man die Fluoreszenzintensitätsverteilung der
mit Gramicidin und Valinomycin behandelten Proben
mit der Kontrollprobe vergleicht, erhält man einen
Wert für die Veränderung der Fluoreszenzsignale,
die man nach der maximalen Depolarisation und
Hyperpolarisation erhält. Dieses Beispiel zeigt, daß die
kationischen Cyaninfarbstoffe in den intrazellulären
Volumina der individuellen Zellen in Abhängigkeit des
Membranpotentials gesammelt werden.
In Fig. 4 ist der Effekt der Zugabe von Con-A zu
menschlichen Lymphocyten wiedergegeben. Die Lympho
cytensuspension ist heterogen hinsichtlich ihrer
Antwort bzw. Reaktion auf dieses Lectin. Sie enthält
eine Zellsubkultur, die bei der Bindung an Con-A
hyperpolarisiert wird und eine andere, die depolari
siert wird. Die hyperpolarisierten Zellen weisen einen
Anstieg in der Fluoreszenzintensität auf (vgl. C), die
depolarisierten Zellen weisen einen Abfall in der
Fluoreszenzintensität auf, wie der schwache aber
deutlich erkennbare Peak D′ zeigt. Die Größe der
hyperpolarisierten Zellsubkultur ist erheblich größer
als die der depolarisierten Zellsubkultur.
Die Zugabe von PHA zu den Zellen führt zu einer Auf
teilung in zwei Gruppen von Zellen. Die Breite bimodale
Verteilung in Fig. 5 zeigt an, daß eine Subkultur der
Zellen depolarisiert wurde durch die Bindung an PHA
und zwar in einem Ausmaß, daß das Fluoreszenzsignal
der individuellen Zellen herabgesetzt wurde
bis zu einem Punkt, der mit E bezeichnet ist. Eine zweite
Subkultur der Zellen weist eine noch stärkere Depolari
sierung auf, dargestellt durch ein niedrigeres
Fluoreszenzsignal bei Punkt E′.
Es wurde eine Vorratslösung von PHA und diO-C₆-(3)
zu einer Lymphocytenzellsuspension, hergestellt
gemäß Beispiel 1, hinzugegeben. Mittels eines Fließ
cytometers wurden dann die Zellen abgetrennt, die
eine Fluoreszenzintensität aufweisen, die den Intensi
täten von Punkt E und Punkt E′ in Fig. 3 entspricht.
Nach einer etwa 15minütigen Inkubation wurde die
Suspension in einem Fließcytometer gemessen und er
neut zu 3 Zellsuspensionen gelöst. Zwei der Zell
suspensionen sind reich an homogenen Zellen hinsicht
lich ihrer physiologischen Reaktion bezüglich der
Bindung an PHA.
Es wurden B-Zellen-angereicherte und T-Zellen-ange
reicherte Lymphocytenkulturen (Reinheit etwa 85%)
durch Rosetting (Rosettendifferenzierung), geprüft
hinsichtlich ihrer Sensibilisierung gegenüber PHA,
hergestellt. Fig. 6 zeigt die Fluoreszenzverteilung
der T-Zellen in der Suspension vor der Zugabe von
Lectin. Fig. 7 zeigt die Fluoreszenzverteilung der
gleichen Zellsuspension 20 min nach der Behand
lung mit PHA der Stammlösung von Beispiel 1.
Wie der Fig. 7 zu entnehmen ist, führt die Zugabe des
Lectins zu einer gleichförmigen Depolarisation der
T-Lymphocyten. Im Gegensatz dazu führt, gezeigt in den
Fig. 8 (Vergleichsprobe) und 9 (25 min nach
der Zugabe von PHA), die PHA-Rezeptor-Wechselwirkung
bei den B-Zellen zu einer gleichförmigen Hyperpolari
sation.
Diese Ergebnisse zeigen, daß das Verfahren der Er
findung verwendet werden kann, um die physiologischen
Reaktionen von unterschiedlichen Zellarten gegenüber
einem bestimmten Liganden vergleichen zu können. Die Ergeb
nisse zeigen weiterhin, daß unterschiedliche Zell
arten aufgrund dieser physiologischen Reaktionen
gegenüber einem bestimmten Liganden voneinander unter
schieden werden können.
Claims (28)
1. Nicht-intrusives Verfahren zur Bestimmung von
Zellmembranpotentialen, wobei nicht erregbare Zellen mit
einem membrandurchlässigen ionischen Farbstoff inkubiert
werden und durch Messen einer optischen Eigenschaft der
gefärbten Zellen deren Membranpotential bestimmt wird,
dadurch gekennzeichnet, daß zum
Nachweis einer Änderung des Zellmembranpotentials von
Einzelzellen deren intrazelluläre Farbstoffkonzentration
optisch gemessen und mit der einer Standardprobe
verglichen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen vor der Messung derart modifiziert werden,
daß ein Wechsel im Zellmembranpotential stattfindet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Zellmodifikation pharmakologisch, chemisch
oder biologisch vornimmt.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Zellen modifiziert, indem man sie in eine
Lösung von Liganden unter Bedingungen inkubiert, bei
denen sich die Komplement-Zellrezeptoren und die Liganden
verbinden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Liganden Neurotransmitter, Hormone,
pharmakologische Mittel, natürliche oder synthetische
Agonisten und Antagonisten davon, Antigene, Antikörper,
Haptene, Allergene und/oder Faktoren des
Komplementsystems verwendet.
6. Verfahrem nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Zellen auf physikalischem Wege modifiziert
werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß das Inkubieren der Zellen vor der
Modifikation erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß das Inkubieren der Zellen nach dem
Modifizieren derselben erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß als Standardprobe eine
vorgegebene Farbstoffkonzentration dient und durch einen
Vergleich des Meßwerts mit der Standardprobe die
Differenz der beiden bestimmt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß als Standardprobe eine
vorgegebene Farbstoffkonzentration dient und durch einen
Vergleich der bestimmten bzw. ermittelten
Farbstoffkonzentration mit der vorgegebenen
Farbstoffkonzentration die Richtung und die Höhe der
Differenz ermittelt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß als Standardprobe ein Satz
von Werten für einen vorgegebenen Konzentrations-Zeit-
Verlauf dient und durch einen Vergleich die Unterschiede
in der Höhe der ermittelten Konzentration und des
vorgegebenen Konzentrations-Zeit-Verlaufs ermittelt
werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff einen
fluoreszierenden Farbstoff verwendet, wobei die
Farbstoffkonzentration über die Fluoreszenz einer oder
mehrerer individueller Zellen bestimmt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff einen
fluoreszierenden Farbstoff verwendet und die
Spektralverschiebung der Fluoreszenz einer oder mehrerer
individueller Zellen mißt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß durch die Bestimmung der
Farbstoffkonzentration die optische Absorption einer oder
mehrerer individueller Zellen ermittelt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11,
dadurch gekennzeichnet, daß als Meßcharakteristik die
Spektralverschiebung der optischen Absorption einer oder
mehrerer individueller Zellen nach der Aggregation des
Farbstoffs verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13,
dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein
kationischer fluoreszierender Farbstoff mit einem
ansteigenden Fluoreszenzquantum in Lösungsmitteln mit
abfallender Polarität ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13,
dadurch gekennzeichnet, daß man als Farbstoff einen
fluoreszierenden kationischen Cyaninfarbstoff verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch
gekennzeichnet, daß der Farbstoff ein Salz des 3,3′-
Dihexyl-2,2′-oxacarbocyanins ist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13,
dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration des
Farbstoffs in der extrazellulären Lösung so groß gehalten
wird, daß die intrazelluläre Fluoreszenzauslöschung
durch die Bildung von Komplexen mit verringerter
Fluoreszenz möglichst klein ist.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennnzeichnet, daß man zur Ermittlung der
Anwesenheit eines Liganden in der Lösung eine oder
mehrere nicht erregbare Zellen, die ein membrangebundenes
Rezeptorkomplement zu dem Ligand enthalten mit der Lösung
inkubiert unter Bedingungen, bei denen sich die Liganden
und die Rezeptoren verbinden, wobei die Anwesenheit eines
solchen Liganden in der Lösung angezeigt wird durch einen
Wechsel des Membranpotentials in den Zellen, die den
Rezeptor enthalten.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Anwesenheit von
Zellen mit Rezeptorkomplement für einen ausgewählten
spezifischen Liganden in einer Vielzahl von Zellen, die
heterogen hinsichtlich der Ligandenspezifität sind,
ermittelt, und eine Vielzahl von Zellen in eine Lösung
inkubiert, die den spezifischen Liganden enthält und zwar
unter Bedingungen, bei denen sich die Komplement-
Zellrezeptoren und die Liganden binden, wobei die
Anwesenheit der Zellen mit den Rezeptorkomplementen zu
diesem Liganden durch eine Änderung des Membranpotentials
der Zellen angezeigt wird.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Anwesenheit von
Zellen mit Rezeptorlagekomplement zu einem ausgewählten
Ligand, aber mit einer unterschiedlichen physiologischen
Reaktion dazu in einer Zellkultur bestimmt, und daß man
die Zellkultur in eine Lösung inkubiert, die den
ausgewählten Ligand enthält, um in den Zellen
Membranpotentialänderungen mit deutlicher Höhe oder
Richtung zu induzieren.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 oder 22,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen, die ähnliche
Membranpotentialänderungen aufweisen, abtrennt, um eine
Zellkultur herzustellen, die reich an sensitiven Zellen
hinsichtlich des ausgewählten Ligands ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet, daß man die physiologische
Reaktion einer Zellkultur, die einer Vielzahl von
verschiedenen chemischen Liganden ausgesetzt ist,
vergleicht und daß man Zellkulturproben mit den
entsprechenden Liganden unter Bedingungen inkubiert, bei
denen sich die Rezeptoren und Liganden binden und man die
Änderungen des Membranpotentials in den individuellen
Zellen der entsprechenden Zellkulturen aufzeichnet.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Behandlung von
Zellkulturen mit einer Vielzahl von chemisch bestimmten
Liganden den kumulativen Effekt bestimmt, und daß man die
Liganden und die Zellkultur unter Bedingungen inkubiert,
bei denen sich die Komplement-Zellrezeptoren und die
Liganden miteinander verbinden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Lebensfähigkeit einer
Zellkultur dadurch bestimmt, daß man in die Zellkultur
ein Zellgift inkubiert.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Wirkung eines
Nährstoffs auf die Zellkultur dadurch bestimmt, daß man
in die Zellkultur einen Nährstoff inkubiert.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen mit zwei oder
mehreren der Farbstoffe inkubiert, wobei das optische
Aussehen bzw. die optische Eigenschaft das Verhältnis der
intrazellulären Konzentrationen der Farbstoffe anzeigt.
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