SE455343B - Forfarande for att detektera forendringar i membranpotentialen hos individuella celler - Google Patents

Description

455 343 10 15 20 25 30 35 2 aktiva grupper. Sålunda blir liganden och receptorn icke- kovalent bundna i ett "nyckelhâl och nyckel"-förhållande.

Till följd av bindning äger en intracellulär biokemisk eller biofysikalisk ändring rum, som inducerar att cellen pâ- börjar eller avslutar någon metabolisk eller fysiologisk process. Ligander innefattar substanser, såsom exempelvis acetylkolin, epinefrin och norepinefrin (neurotransmittrar), insulin, tillväxthormoner och tyrotropin (hormoner), histamin, antigener, proteiner av finmunsystemet eller prote- iner därav, Vira, bakterier, vissa toxiner och sperma.

Yör många av dessa substanser finns det ingen naturlig eller syntetisk antagoniskt, dvs en substans, som kan reversera den fysiologiska effekten av sin motsvarande substans, eller bindas till receptorer, varvid bindning av den naturliga substansen utesluts. Naturliga eller syntetiska agonister är även kända. En agonist är en substans, som bindes till recepLorn för att initiera ett fysiologiskt cellsvar lik- nande det av den naturliga liganden. Många nu inom medicinen använda läkemedel är agonister eller antagonister av natur- liga ligander.

I många fall kan skeenden, som inträffar i celler efter bindning av ligander till specifika receptorer, dupli- ceras genom att man bringar cellerna att reagera med andra substanser, som bindes till receptorerna, t.ex. med vissa växtlektiner eller antikroppar inställda på vissa isolerade receptorer. Det är även möjligt att initiera cellsvar av detta slag genom tillsats av medel, som ändrar membranpoten- tialen i samma riktning som efter ligand-receptorväxel- verkan.

Ett snabbt och tillförlitligt sätt att detektera och mäta den intracellulära effekten av en ligand-receptor- växelverkan skulle ha betydande användbarhet vid biokemisk forskning och och diagnostisk undersökning. På grund av skillnaden i receptorspecificitet av i övrigt homogena cell- populationer och på grund av det enorma antalet olika kemotaktiska medel bör ett sådant test i idealfallet kunna leda till analys av enskilda celler. 10 15 20 25 30 35 3 Olika direkta och indirekta förfaranden för detek- tcring av ligand-receptorväxelverkan är förut kända. I en grupp av metoder använder man radioaktivt eller fluorescent märkta ligander. Dessa inkuberas med en cellsuspension och, efter tvättning för avlägsning av obundna ligander, cell- massans radioaktivítet och fluorescens analyseras. Ford- ringarna på märkta ligander begränsar kraftigt användningen av denna teknik. En annan grupp av kända detekteringsför- faranden utnyttjar observationen, att ligand-receptorväxel- verkningar ofta är åtföljda av ökning av intracellulär syn- tes av deoxiribonukleinsyra (DNA). I vissa system kan DNA- nivåer efter bindning av ligander till receptorer, till exempel efter det att lymfocyter har stimulerats med anti- gen eller mitogener t.ex. fytohemagglutinin, uppmätas och sedan jämföras med DNA-nivån av en jämförbar cellmassa, i vilken ingen ligand-receptorväxelverkan har ägt rum. Den relativa nivån av DNA är ett mätt på ligand-receptorväxel- verkníngen. Denna teknik är begränsad i praktiken, eftersom DNA-syntesen i allmänhet inte är detekterbar många timmar eller t.o.m. dygn efter ligandbindning.

Ytterligare en annan klass av metoder för,detektering av vissa typer av ligand-receptorväxelverkan är baserad på ändringar i "matrixens av cytoplasmastruktur" såsom bestämd genom mätning av polarísationen av íntracellulär fluoreceins fluorcscens. För att vara användbar för analys med dessa metoder måste celler ha förmåga att producera intracellulär fluorescein genom enzymatisk hydrolys av fluoresceindi- acetat eller en liknande förening. Dessa metoder är tekniskt svåra att genomföra och resulten är svära att tolka. Dess- utom fordrar metoderna metabolisk :modifiering av ett reagens av cellerna, som studeras.

Fastän det har varit känt under dekader, att exci- terbara celler, t.ex. neuroner eller muskelceller, undergàr en snabb ändring av membranpotentíal vid stimulering av en neurotransmitter, har man endast nyligen funnit, att de genom fysiologiska stimulantia inducerade membranpoten- tialändringarna inte är begränsade till dessa specialise- 455 343 10 15 20 25 35 L! rade celler. Genom insättning av mikroelektroder i icke- exciterbara celler har man funnit, att membranpotential- ändringar är förenade med ligand-receptorväxelverkningarna.

I själva verket har man observerat, att de fysiologiska skeenden, som inträffar i icke-exciterbara celler efter bindningen av en ligand till en receptor, ibland kan dupli- ceras genom tillsats till cellsuspensionen av ett medel, som ändrar membranpotentialenj_samma riktning som ligand- receptorbindning gör. Ytterligare forskning har utvecklat nya tekniker för observation av sådana ändringar. Exempel- vis har en fotometrisk mätmetod av ändringar i membran- potentíal i cellsuspensioner beskrivits av P.J. Sims et al. (Biochemistry, Vol. 13, nr 16, 197H, sid 3315).

Enligt detta förfarande inkuberas cellsuspensionen med ett cyaninfärgämne eller annat färgämne, som är positivt laddat och har förmåga att passera genom cellmembranens lipid- skikt. Förhållandet mellan koncentrationsändringar av intra- cellulärt och extracellulärt färgämne ändras med ändringar i cellmembranens potentialznär cellen blir hyperpolariserad, dvs när cellens inre blir mera negativt, kommer fler mole- kyler av färgämne att tränga in i cellerna. I förfarandet enligt Sims et al användes dessa färgämnen i sådana koncen- trationer, att molekyler av intracellulärt färgämne bildar icke-fluorescenta aggregat, och fluorescensen av det fria färgämnet i suspensionsmediet mätes mot en mörkare bakgrund av cellerna. Denna fluorescens avtar med cellernas hyper- polarisation. Om endast en liten fraktion av cellerna i suspensíonen är känsliga för en given ligand, är det endast denna fraktion, som visar en ändring i membranpotential.

I detta fall kommer koncentrationen av färgämnet i mediet inte att ändra sig avsevärt, och man har således ingen detek- terbar ändring i fluorescensen av extracellulärt färgämne. 1 varje fall kan man med denna metod inte identifiera en- skilda celler, som är känsliga för liganden.

W.N. Ross et al har i the Journal of Membrane 33, merocyanin-, oxonol- och cyaninfärgämnen för mätning av Biology, vol. sid. 1H1 (1977) beskrivit användningen av 10 15 20 25 35 5 snabba ändringar i membranpotential i exciterbara celler, t.ex. de stora axonerna av nervsystemet hos bläckfisk.

Linjära ändringar i absorption, fluorescens, dikronism och dubbelbrytning av färger har man funnit vara förenade med ändringar i membranpotential. För dessa mätningar mest lämpade färgämnen är merocyaniner, som är negativt laddade och sålunda inte lätt tränger genom cellväggarna. Vanligen färgar dessa färgämnen inte andra cellmembran än de av exci- terbara nerv- och muskelceller. Man har observerat, att merocyaniner färgar vissa icke-exciterbara cellmembran, t.ex. omogna eller leukemiska blodkroppar. Emellertid har denna färgning visats ske oberoende av ändringar i cellmembran- potential.

Det är ett syfte med föreliggande uppfinning att åstadkomma ett förfarande för bioanalys, baserat på icke- destruktiva mätningar av ändringar i membranpotential i enskilda celler. Ett annat syfte är att åstadkomma ett snabbt, känsligt och mångsidigt bioanalysförfarande, riktat mot detektering av förekomsten och förutsägning av cellsvar på ligand-reccptorväxelverkan. Ytterligare ett annat syfte är att detektera ligand-receptorväxelverkningar i enskilda, icke-exciterbara celler. Andra syften är att till- handahälla nya tekniker för att utskilja potentiellt aktiva läkemedel, för diagnostisering av fysiologisk missfunktion i vävnader, och för undersökning avallergi och histc-kompa- tabilitet.

Uppfinningen avser ett bioanalysförfarande, som kännetecknas av stegen (a) bestämning av ett av enskilda särdrag av en eller flera celler, som är representativt för membranpotentialen därav, med en icke-störande metod; och (b) jämförelse av cellsärdraget med en referens för att upp- täcka skillnader i de enskilda cellernas membranpotential.

Utföringsformer av uppfinningen ger ett snabbt och känsligt, icke-inträngande förfarande för dctektering av cellmembranpotentialändringar i icke-exciterbara celler och för förutsägning av det fysiologiska svaret av icke-exciter- bara celler på modifiering genom fysikaliska, farmakologiska 10 15 20 25 30 35 4554543 8 biologiska eller kemiska medel. I en utföringsform åstadkoms potentíaländríngar av ligand-receptorväxelvurkan. l en annan, utföringsform är ändringen icke-specifik, t.ex. efter skada på cellerna.

I det förra fallet tagelsen, att en ändring i är förfarandet baserat på iakt- jonflödet genom cellens membran och resulterande ändringar i membranpotential sker inom kort tid, typiskt under kortare tid än 1 timme, medan det fysio- logiska svaret av en given cell pâ bindning av en specifik ligand ofta är svårt eller omöjligt att detektera och sker ofta inte förrän timmar eller dygn efter växelverkningen.

Denna utföringsform av uppfinningen inbegriper bestämning av en karakteristisk egenskap hos enskilda celler, vilken är reprcsentativ för deras membranpotential, jämförelse av den karakteristiska egenskapen med en referens för att bestämma skillnader i membranpotential, och-användning av de obser- verade ändringarna som en på förekomsten av en ligand- receptorväxelverkan indikativ markering.

Med hänsyn till det stora antalet substanser, som visar aktivitet som kemiska budbärare, den iakttagna mång- falden av receptorplatser på enskilda celler av en given cellpopulation och mångfalden av fysiologiskt svar av en- skilda celler på specifika legander är det ett viktigt sär- drag; att individuella cellers svar (i motsats till hela suspensioner) på inverkan av ligander detekteras.

Sålunda åstadkommer man förfaranden: 1) för bestäm- ning av närvaron eller frånvaron av specifika receptorer för en given ligand på några eller alla celler i en cellpopula- tion; 2) för bestämning av närvaron eller frånvaron i en blandning av substanser av en specifik ligand, som man vet växelverkar med celler av en given population; 3) för studium av kumulativa effekter av ligandkombinationer på celler; U) för att jämföra effekterna av två eller flera ligander på en given cellpopulation och 5) för att bestämma en indi- kering pâ en cellpopulations eller cellsubpopulations fysio- logiska tillstånd efter kontakt med en förmodad toxín eller i n annan substans. Eftersom flera av metoderna, som anvandes 10 15 20 25 30 35 455 345 7 för detektering av ändringar i membranpotential, är icke- destruktiva, kan förfarandena användas i kombination med cellsortering för framställning av cellpopulationer, som är rika pà celler med önskade receptorsärdrag samtidigt som cellivskraften bibehålles.

I enlighet med en utföringsform av uppfinningen bringas icke-exciterbara celler, typiskt i suspension, i kontakt med en lösning, som innehåller eller misstänks inne- hålla en eller flera aktiva ligander. Blandningen inkuberas under betingelser, under vilka komplementära cellreceptorer och ligander bindes för índucering av en fysiologisk änd- ring i cellerna, på vilka bindning sker. Före, efter eller under inkuberingen detekteras ett karakteristiskt särdrag av individuella cellers cellmembranpotential. Detta detek- teradc karakteristiska särdraget jämföres med en referens för detektering av ändringar i membranpotentíaler och för att erhålla användbar information.

Närvaron eller frånvaron av en given ligand i en lösning kan bestämmas genom inkubering av lösningen med en cellpopulation, som innefattar minst en subpopulation, som man vet innehåller receptorer för liganden i fråga, detekte- ring av ändringar i cellmembranpotentialen i varje av cell- erna, som bildar populationen, och jämförelse av fördelningen av eventuella membranpotentialändringar bland cellerna med resultaten av exempelvis en referenskarakteristika, som innefattar resultaten av samma analysförsök parallellt med provet och innehållande ett autentiskt prov av liganden i fråga. En indikation på ligandkoncentrationen i det okända provet kan även framtagas med denna teknik.

Närvaron och frekvensen av celler, som är reaktiva med en känd ligand i en heterogcn cellpopulation kan be- stämmas på liknande sätt genom jämförelse av ändringar i membranpotential bland celler av populationen. Genom kombi- nation av denna teknik med kända förfaranden för cellgall- ring, kan forskaren erhålla cellpopulatíoner, vilka är relativt homogena med avseende på känslighet för en specifik ligand. 10 15 20 25 30 455 343 8 I en annan utföringsform kan det fysiologiska svaret på en icke-exciterbar cellpopulation på kontakten med tvâ eller flera kemiskt olika ligander förutsägas och jämföras genom inkubering av lösningar av respektive ligander i flercellsprov, avkänning av riktningen, storleken och/eller tidsförloppet av ändringar i membranpotential i enskilda celler i respektive cellprov, och sedan jämförelse av mät- ningar gjorda i respektive prov. Denna teknik kan exempel- vis användas för att utskilja syntetiska substanser, som misstänks vara agonistiska eller antagonistiska med avseende på den naturliga liganden och att detektera variation i cellsvar av liknande celler på funktionellt eller struktur- ellt besläktade ligander.

I en annan utföringsform kan den kumulativa effekten av kontakten av två eller flera kemiskt olika lígander med en population av icke-exciterbara celler snabbt undersökas genom inkubering av liganderna och cellpopulationen, detek- tering av ändringar i cellmembranpotentialen i enskilda celler och jämförelse av de detekterade potentíaländringarna med exempelvis resultaten från parallella försök med de enskilda liganderna eller en förteckning av det förbe- stämda cellsvaret på en eller flera av de enskilda ligand- erna. På detta sätt kan läkemedel, som uppför sig som agonister eller antagonister gentemot naturliga ligander, och en indikation på deras optimala dos upptäckas.

I ytterligare en annan utföringsform utvärderas de toxiska effekterna av olika medel på celler genom mätning av membranpotential efter kontakten med dessa medel. Mem- branpotentialen av en skadad cell måste nå noll i gränsen, vid vilken membranet är genombrutet. Mindre grad av skada är detekterbar genom en minskning av membranpotentialens storlek i förhållande till oskadade celler. Åtskilliga icke-inträngande metoder utnyttjas för användning vid detektering och mätning av membranpotentialen i enskilda icke-excíterbara celler. För närvarande före- dragna metoder inbegriper användning av antingen membran- genomträngliga eller membranbundna färger, som förenar sig 10 25 30 35 9 med enskilda celler och har detekterbara optiska egenskaper, som ändrar som svar på ändringar i membranpotential. Så- ledes ställer sig joniska cellmembrangenomträngliga färger, om inkuberade med cellerna, snabbt i jämvikt mellan motsatta sidor av cellmembran som funktion av membranpotentialen.

En mätning, som är indikativ för den intraeellulära färg- ämneskoncentrationen, görs sedan genom fotometrísk mätning av fluoreseens, absorption eller annan optisk egenskap hos färgen i den enskilda cellen och av sådana andra attribut av den enskilda cellen (exempelvis cellvolym), som måste vara kända för bestämning av den intracellulära färgämneshalten.

När cellerna, som jämföres, är homogena med avseende på volym, kommer mätningen, som är representativ för mängden intraeellulärt färgämne, vara proportionellt mot membran- potentialen. Den fotometriska mätningen kan átföljas av kon- ventionell mikrofotomctri eller flödescytometri. När den optiska egenskapen, som skall mätas, är fluorescens, väljes färgen företrädesvis bland de, som utmärkes av ökande fluoreseens-kvantum verkningsgrad i lösningsmedel med av- tagande polaritet, och koncentrationen av färgämnet i mediet väljes så, att man söker förhindra intracellulär fluoreseens- inaktivering genom bildning av komplex med lägre fluorescens. föredragna fluorescenta färgämnen är katjoniska cyaninfärg- ämnen, t.ex. 3,3'-dihexyl-2,2'-oxakarboeyanin (diO-C5~(3)).

Nu följer en beskrivning, som är avsedd att läsas med hänvisning till ritningarna av utföringsformen av upp- finningen. Beskrivningen är given endast som exempel och skall ej vara begränsande för uppfinningen.

På ritningarna visar: fig. 1 en graf av fördelningen av eellulär fluor- nscens intensitet av en första alikvot av en suspension av lymfoeytceller av människa, inkubcrad med 3,3'-dihexyl-2,2'- axakarbocyanfin (aio-cs-(an med en han av s x 10"” n.

I denna och de följande graferna anger den vertikala axeln antalet celler med en särskild intensitet och horísontal- axeln visar fluoreseensintensiteten; 10 20 25 30 35 455 343 ~.-. 10 fig. 2 en graf av fördelningen av cellulär fluorescensintensitet av en andra alikvot av cellsuspen- sionen, inkuberad samtidigt med en koncentration av -s 2 x 10 en koncentration av 5 x 10- N av depolariserande jonofor gramicidin och 8 M av dio-cs-<3); fig. 3 en graf av fördelningen av cellulär fluorescensintensitet av en tredje alikvot av cellsuspen- 6 M av sionen, inkuberad samtidigt med en halt av G x 10- hyperpolariserande jonofor valinomycin och en halt av 5 X 1o'8 M av dio-cs-(a>; fig. H en graf av fördelningen av cellulär fluorescensintensitet av en fjärde alikvot av cellsuspen- sionen, inkuberad samtidigt med en 10 pg/ml lösning av liganden concanavalin A och en halt av 5 x 10-8 M av diü-C6-(3); fig. 5 en graf av fördelningen av collulär fluorescensintensitet av en femte alikvot av cellsuspen- sionen, inkubcrad samtidigt med en 20 pg/ml lösning av liganden fytohemagglutinin och en halt av 5 x 10-8 M av díO-CS-(3); fig. 6 en graf av fördelningen av cellulär fluorescensintensitet av antalet celler med ett givet fluorescent svar mot fluorescent intensiLet, erhållen med 8 M av en alikvot av T-lymfocyter i jämvikt med 5 x 10_ diO-C6-(3); fig. 7 en graf av fördelningen av cellulär fluorescensintensitet av T-lymfocytsuspension av fig. 6 tjugo minuter efter tillsats av fytohemagglutinin till en halt av 20 ng/ml, och visar depolariseringseffekten av denna lektin på en subpopulation av T-cellerna. fig. 8 en graf av fördelningen av cellnlär fluorescensintensitet av en B-lymfocytcellsuspension, i x 1o"8 M aio-cs-(3); aan fig. 9 en graf, som ivsar hyperpolariseringseffekten jämvikt med 5 av fytohemaggluthrüipåB-cellsuspensionen i fig. 8 tjugofem minuter efter tillsats av fytohemagglutinin till en halt av 20 un/ml. 10 15 20 25 35 455 343 11 Alla de föregående graferna gjordes med en flödes- cytometer (Cytofluorograph,0rtho Instruments) ansluten till en pulshöjdsanalysator.

Förfarandet inbegriper användning av icke-exciterbara celler, dvs celler från annan vävnad än muskel- och nerv- vävnad. De i analysen enligt föreliggande uppfinning inbe- gripna cellerna isoleras med konventionell teknik och upp- slammas i ett medium med förmåga att underhålla normal cell- metabolism, dvs en balanserad, syresatt, isotonisk saltlös- ning, buffrad till pH 7,2 - 7,6, och innehållande glukos eller andra näringsämnen och approximativt fysiologiska halter av natrium-, kalium-, kalcium- och magnesiumjoner.

Företrädesvis bör cellerna vara fria fràn yttre protein (albumin, etc) och andra substanser med stark affinitet för färgämnen av den typ, som användes för att detektera membran- potentialändringar i den föredragna detekteringstekniken, som är beskriven i det följande.

Såsom erfordras av syftena av testet, som skall genomföras, kan cellerna innefatta en population, som är relativt homogen med avseende på fysiologisk funktion (t.ex. T-lymfocyter) eller med avseende på ligandspecificitet (t.ex. bröstceller, känsliga för IgE-allergenkomplex).

Om så erfordras, kan cellerna indelas i ett flertal ali- kvoter, så att flera bestämningar av membranpotential kan göras parallellt. Membranpotentialen av celler i varje ali- kvot bestämmes sedan efter kontakt, exempelvis med en lös- ning av olika ligander, och halter av en enda typ av ligand eller en ligandfri lösning, så att jämförelse kan göras.

Lösningen, med vilka cellerna bringas i kontakt, beroende på syftena av undersökningen kan innefatta en okänd, som man misstänker innehåller en ligand, specifik för cellerna i provet, ett autentiskt prov av en känd ligand i en känd eller okänd halt, ett ej rent ligandpreparat eller en lös- ning innehållande en substans, som man misstänker vara toxisk för cellerna eller en subpopulation därav.

Förutom detektering av förekomsten av ligand- receptorbindning kan tekniken säkerställa de följande kate- 10 20 25 30 35 455 343 12 gorierna av information: 1) närvaron av en subpopulatíon av celler i suspen- sionen med för en specifik ligand komplementära membranyt- receptorer; 2) närvaron i en lösning av en specifik typ av ligand med förmåga att binda till receptorer, som befinner sig på celler i uppslamningen eller en subpopulation därav; 3) den kumulativa effekten av multipelligander, som växelverkar med en given cellpopulation; H) en jämförelse av svaret av en cellpopulation el- ler subpopulation därav på olika typer av ligander; 5) effekten på cellivskraften för olika halter av toxiska substanser; eller 6) stimuleringen av cellmetabolismen av olika hal- ter av näringsämnen, t.ex. aminosyror eller sockerarter.

Hed avseende på system, som inbegriper ligand- receptorväxelvcrkningar, erhålles informationen genom inku- bering av cellerna med ligandlösningen under tillräckligt lång tid och vid en lämplig temperatur (t.ex. den normala temperaturen för cellerna i den naturliga omgivningen) för att tillåta förekomsten av ligand-receptorväxelverkan och en resulterande ändring i jonflöde genom cellmembranerna.

Ett karakteristiskt värde av membranpotentialen i varje cell i suspensionen eller varje cell i en representativ alikvot av uppslamningen erhålles sedan, eventuellt i intervall, så att en profil av potentialändring med tiden erhålles.

Det uppmätta karakteristiska värdet jämfüres sedan med eLt refcrensvärde för bestämning om en ligand-receptor- växelverkan har ägt rum, om riktningen, storleken eller tidsförloppct av ändringarna liknar eller antagoniscrar ändringarna, inducerade i cellerna vid kontakt med en känd ligand, eller om den kumulatíva effekten på membranpoten- tialen av dc tvâ eller flera ligander skiljer sig från den för en enda lígand eller en annan blandning av ligander.

Arten av det karakteristiska referensvärdet kommer med nödvändighet att variera beroende på den specifika in- 10 20 25 30 35 Ja.

Lfi LH CN .|>.

LN 13 formation som sökes. Såsom framgår av det föregående kan det innefatta resultaten av en eller flera försök parallellt med försöksprovet. Alternativt kan det ha formen av en uppteck- ning av en sådan analys, t.ex. en graf av antalet celler, som uppvisar en given potential, mot storleken av potentialen.

Ligander och deras antagonister ger i allmänhet upp- hov till motsatta effekter på cellmembranpotential. Följ- aktligen söker man inom forskningen att upptäcka substanser med förmåga att efterlikna, blockera eller hämma effekten av naturliga ligander på celler av en speciellt vävnad, var- vid riktningen, storleken och/eller tidsförloppet av mem- branpotentialförändringar i ett cellprov av vävnaden kan be- stämmas genom multipelmätningar efter kontakt av cellerna med den naturliga liganden. Därefter kan olika substanser tillsättas till alikvoter av samma cellsuspension. Genom att jämföra i respektive prov inducerade membranpotentialänd- ringar kan forskaren identifiera såsom värdiga kandidater för ytterligare forskning specifika material som sannolikt har den önskade fysiologiska effekten, och andra föreningar kan avfärdas från ytterligare betraktande. Hed användning av föreliggande förfarande kan man även bestämma sådana parametrar som koncentrationen av antagonist; som erfordras för att upphäva effekten på membranpotential av en given celltyp i en given koncentration av agonist. Sådana mät- ningar är värdefulla vid utvärderingen av ligander och deras antagonister som farmakologiska medel.

I vissa fall existerar det flera typer av specifika receptorer för en given ligand. Exempelvis kan bindningen av ligand till receptorer av en klass av celler leda till hyperpolarisation, medan bindning av samma ligand till recep- torer av en andra klass kan leda till depolarisation. Före- liggande förfarande kan skilja mellan dessa två typer av växelverkníngar. Kända celluppdelningstekniker, som användes i kombination med föreliggande förfarande, möjliggör isole- ring av cellstammar med en önskad receptors specificitet från heterogena populationer. Användning av förfarandet i detta sammanhang åstadkommer större selektivitet i förhål- 10 15 20 25 30 35 455 343 ' 1U lande till den vanliga metoden att uppdela celler, baserad på bindning av fluorescent märkt ligand, eftersom fysio- logisk effekt liksom ligandbindning kan inbegripas i ur- valskriterierna. Ytterligare specificitet kan erhållas ge- nom kombinationen av direkt mätning av bindning av optiskt märkt ligand med detektering av ändringen i membranpoten- tial efter ligandbindning.

När närvaron av en speciell typ av ligand i en lösning eller närvaron celler med en speciell ligandspeci- ficitet är informationen, som är intresse, kan membranpoten~ tialen avlägsas före och efter blandning av liganden och cellsuspensionen och resultaten jämföras. Respektive repre- sentativa alikvoter av en cellsuspension kan inkuberas med exmepelvis 1) en lösning innehållande en okänd halt av en given ligand, 2) en ligandfri lösning, och 3) en lösning innehållande en känd halt av liganden. Efter inkubering kan en indikation på halten av den okända liganden erhållas genom jämförelse av membranpotentialen av celler i respek- tive prov. Eftersom membranpotentialen av enskilda celler detekteras, är det möjligt att identifiera en subpopulation av celler i suspensionen med en vald ligandspecificitet. förfarandet kan användas för detektering och kvanti- fíering av cellulärt immunsvargenom mätning av potential- ändringar i lymfocyter, makrofager eller andra celler av Ümunsystemetefter kontakt med sådana substanser som anti- gener, antikroppar, haptener, allergener och komplement- komponenter. Eftersom lymfoeyter typiskt är en heterogen population med avseende pâ reaktiviteten med ett givet anti- gen ger fraktionen av celler, som svarar på ett givet anti- gen ett värdefullt mått på cellulärt immunsvar. Ändringen från det vanliga mönstret av potentialändringar i respon- siva celler kan indikera defekter i immunfunktionen.På lik- nande sätt kan införandet av olika allergener i flera prov av en persons serum och åtföljande inkubation av proven med celler, som är inbegripna i utsöndringen av histamin, an- vändas som ett icke-inträngande medel för detektering av en persons känslighet för olika allergeniska material. 10 15 20 25 30 35 455 343 15 Eftersom enligt föreliggande förfarande isolering och märkning av en specifik ligandart inte erfordras för de- tektering av substanser med förmåga till bindning till celler med givna receptorspecificiteter, är det möjligt att använda förfarandet för att analysera ligandaktivitet i orena bered- ningar av ligand och att följa och avkänna ligandaktivitet i olika fraktioner av sådana orena beredningar, erhållna från förfaranden för rening eller isolering av den önskade specifika liganden. I Förfarandet kan även användas som ett hjälpmedel vid definiering av den kemiska strukturen av ytreceptorer genom demonstration av konkurrensnællan olika ligander med känd specificitet till bindningspositioner på cellytor.

De toxiska effekterna av olika medel på celler kan utvärderas genom successiva mätningar av membranpotential- erna av celler efter kontakten med dessa medel. Det är känt, baserade på inträngandet av detek- ändamål, är det till reproduktion är skadad eller om graden av skada näst intill brott av cellmembranens helhet har inträffat. Potentialen att tester på cellivkraften, normalt ej inträngande färger, t.ex. propidiumjodid, Lerar endast de celler, som desintegreras. För många t.ex. för utvärdering av läkemedel för cancerterapi, värdefullt att bestämma om en cells framtida förmåga av en skadad cell måste nå noll i gränsen, vid vilken mem- branen är genombruten. Mindre grad av skada är detekterbar genom minskning av storleken av membranpotentialen i förhål- lande till oskadade celler. Minskningen eller upphörande av svar på ligander och andra substanser, som normalt ger kända ändringar i potentialen, kan även detekteras genom mätning av cellmembranpotentialer.

Eftersom fördelning av inträngande joniska för- eningar, t.ex. läkemedel, genom cellmembraner beror på mem- branpotentialen kan förfarandet användas för att förutsäga skillnader i läkemedelsupptagning av olika celltyper. För- farandet kan även användas för att.åstadkomma en korrektions- faktor, baserad på skillnader i färgupptagning, som är förut- sagd på basis_av uppmätta potentialskillnader, vilket till- 10 20 30 *,455 343 16 låter att ett antal inträngande joniska färger, t.ex. akri- diner, användes som vitalfärgning för kvantifiering av olika intracellulära beståndsdelar, t.ex. nukleinsyror och glukos- aminoglukaner.

Alla de'i det föregående angivna förfaranden er- fordrar en snabb, icke-inträngande och företrädesvis icke- destruktiv metod för detektering av membranpotentialen eller för erhållande av en mätning proportionellt mot membran- potentialen av de 103 till 106 enskilda cellerna i ett typiskt cellprov. Införandet av mikroelektroder i enskilda celler skadar med nödvändighet cellmembraner och kan inte realistiskt användas för detektering av membranpotential i var och en av det stora antalet celler i en cellsuspensíon.

Det föredragna detekteringsförfarandet inbegriper använd- ning av katjoniska cellmembran-permeabla fluurescenta färg- ämnen, som under inkubering fördelar sig mellan motsatta sidor av eellmembranerna som en funktion av membranpoten- tialen. Den intracellulära koncentrationen av färgämnen H eller en parameter, som är proportionell mot halten, mätes sedan optiskt i en mikrofotometer eller Ilödescytometer.

Vid hyperpolarisation ökar affiniteten för färgämnet i cel- lens inre; vid depolarisation minskar affiniteten för färg- ämnet i cellens inre.

En klass av färgämnen, som är lämplig för använd- ning vid denna teknik, är katjoniska färgämnen, t.ex. 3,3'-di-n-hutyl-9-metyl- och 3,3'-dietyltiakarbocyaniner, 3,3'-dietyl-2,2'-oxakarbocyaniner, 2,3,3,1',3',3'-hexametyl- indokarbocyanin och -dikarbocyanin, 3,3'-dietyltiadikarbo- cyanin och företrädesvis 3,3'-díhexyl-2,2'-oxakarboeyanin (diO-Cs-(3))L Dessa färgämnen är tillgänliga i handeln, exempelvis från Accurate Chemical Company eller Eastman Kodak.

Det är fördelaktigt om det valda färgämnet uppvisar större fluorescenskvantum-verkningsgrad med avtagande polaritet hos lösningsmedlct och om fluorescens- och absorp- tionsmaximet för färgämnet förskjuts med ändringar i lös- ningsmedlets polaritet. Dessa karakteristiska egenskaper 10 20 25 30 35 455 345 17 maximerar selektiviteten för detektering av membranbundet färgämne i cellen mot bakgrunden av fritt färgämne i lös- ning. Det är även fördelaktigt att använda tillräckligt låga halter av det valda fluorescenta färgämnet för att minimera släckning av fluorescens av intracellulärt färgämne på grund av bildning av aggregat. I fallet med det föredragna cyanin- färgämnct (diO-C6-(3)), är halter av eller under cirka 3 X 10_7M föredragna.

Di0-CB-(3) utmärkes av en ökning i kvantum-verk- _ ningsgrad av cirka H,5 i n-oktanol i förhållande till vat- tenlösningar. Dess absorptions- och emissionsmaxima i n-okta- nol ligger cirka 10 nm högre än i vattenlösningar. Mängden diO-Cs-(3) inom enskilda celler bestäms genom mätning av fluorescens i området av SUN nm efter exitation vid cirka H88 nm. Bland cyaninfärgämnen i allmänhet är de önskade lös- ningseffekterna på kvantum verkningsgraden mera utpräglade i karbocyaninfärger, som har den allmänna formeln R-(CH)3-R', än i di- och trikarbocyaniner med den allmänna formeln R-(CH)5-R' respektive R-(CH)7-R'.

En mikrofluorometer kan användas för att mäta fluorescens, men mätningen genomföres snabbast och exaktast med användning av en flödescytometer. Metodiken för flödes- cytomctri och cellsortering är beskriven av P.K. Horan och L.L. Wheeless, Jr. i. 198, 1U9 - 157 (1977). Tlödescytometrar, i vilka argonjonlaserljuskällor användes, är väl lämpade för föreliggande mätningar. Sådana Science, vol. sid. instrument säljes av flera tillverkare och är inrättade för automatisk sortering av celler på basis av flera kriterier, t.ex. fluorcscensintensitet, cellstorlck, våglängden för fluoresccnscn och våglängden eller intensiteten av absorp- tion.

Om cellpopulationen, som studeras, är relativt homo- gen med avseende på storlek och inre struktur och om koncen- trationen av tillsatt färgämne och antalet suspenderade celler i en given volym medium hàlles konstant, kommer den totala mängden färgämne i en given cell, mätt genom inten- siteten av fluorescensen från denna cell, vara direkt pro- 10 20 25 30 455 343 18 portionell mot koncentrationen och därför mot membranpoten- Lialcn. När emellertid blandade cellpopulationer eller vari- erande halter av celler och/eller färgämnen är inbegripna kan ytterligare mätningar vara erforderliga. Eftersom den intracellulära koncentrationen av färgämne är lika med den totala mängden färgämne i cellen divíderat med cellens volym, kan ett värde, proportionellt mot halten av färgämne i en given cell, erhållas genom mätning av den totala mängden färgämne, såsom beskrivet i det föregående, och division med en mot cellvolymen proportionell mängd. En mätning av ccllvolymen kan erhållas samtidigt med avläsningen av intraccllulär fluorescens i flödescytometrar genom elektro- nisk eller optisk mätning av cellstorlek, t.ex. cellens tvärsnittsarea upphöjt tiLL3/2, uppmätt genom ljusspridning vid vinklar nära helysningsaxeln. Flödescytometriteknik till- låter företrädesvis att denna information samlas.behand1as elektroniskt och visas automatiskt. Cytometern alstrar en för fluorescensintensiteten representativ signal, en för cellvolymen representativ andra signal och bestämmer sedan kvoten av signalerna. Denna kvot, som är proportionell mot membranpotentialen, kan sedan användas som ett cellsorte- ringskriterium och/eller visas.

När populationen av celler, som analyseras, är märk- bart heterogen med avseende på cellvolym eller mängd färg- bindande material, kan en mätning proportionellt mot mem- branpotentialcn genom användning av två färgämnen med olika affiniteter för íntracellulära komponenter. I detta fall kan den intracellulära fluorescensen för båda färgämnen mätas. Ökningen eller minskningen av kvoten av innehållet av intracellulärt färgämne är då proportioncllt mot änd- ringen i membranpotential och beror på cellvolym och varia- tioner i mängden färgbindande material bland celler. Även om etablerade principer inom kemin tillåter beräkning av effekter av variationer i cell- och färgämnes- koncentrationer i mediet på den intracellulära koncentra- tionen av färgämne, är det i praktiken enklare att inställa utspädningar så, att koncentrationen av celler och färgämne 10 15 20 25 30 19 är approximativt lika stora i alla prov, som jämföres.

Interferens vid fotometriska potentialmätningar kan vara förorsakad av icke-specifik färgning av döda eellers cytoplasma i vilka membranens helhet har gått förlorat. Om en liten mängd av ett vanligen ej inträngande färgämne, t.ex. etidiumbromid eller propidiumjodid sättes till mediet, kommer kärnan av de celler, som har skadade membran, att färgas, medan färgämnet inte tränger in i livskraftiga cel- ler. Om det för potentialmätningar använda inträngande färg- ämnet och det för detektering av membranskada använda ej in- trängande färgämnet har olika optiska egenskaper, är det möj- ligt att utföra korrelatíonsmätningar av en eller flera op- tiska egenskaper av varje färgämne i varje cell och att eli- mínera skadade celler, som sålunda har detekterats genom ytterligare analys. Om det använda inträngande färgämnet är det föredragna diO-C5-(3), och det ej inträngande färg- ämnet är propidiumjodid, kommer kärnorna av skadade celler att emittera rött fluorescent ljus i området av 610 nm efter exeitation av H88 nm. Denna fluorescens kan enkelt ur- skiljas av betraktaren eller genom fotometriska metoder från den gröna fluroreseensen av diO-Cs-(3).

Fotometriska mätningar av membranpotential kan kom- bineras med andra mätningar av samma celler för att öka för- farandets analyskraft. Exempelvis kan eellsvaret i olika. faser av eellcykeln på en given ligand bestämmas genom sam- tidig färgning med diO-C6-(3) och med en DNA fluorokrom, t.ex. Hoechst-förening nummer 333H2.

Det är möjligt att mäta andra optiska egenskaper en fluorescens, t.cx. absorption, för att erhålla en indikation på mängden färgämne i enskilda celler. I detta fall är det föredraget att man använder färgämnen, som bildar intracellu- lära aggregat med absorptionsmaxima vid våglängder, som skil- jer sig från de för det fria färgämnet, och att man använder dessa färgämnen i tillräckligt höga halter, så att en rela- tivt stor fraktion finns i cellerna i form av aggregat.

Detta maximerar detekteringsselektiviteten av intraeellulärt färgämne mot bakgrunden av fritt färgämne i lösning. 10 15 20 30 35 455 343 _ Ü _= 2 20 Tiakarbocyaninfärgämnen, t.ex. 3,3'-dietyl- och 3,3'-dipro- pyltiadikarbocyanin kan uppvisa denna egenskap under vissa betingelser. Vid bindning till röda blodkroppar bildas av det förra färgämnet en ny absorptionstopp vid cirka 590 nm, troligen på grund av komplexbildning av intracellulärt färg- ämne med hemoglobin. Absorptionen av celler vid denna våg- längd kan således mätas för bestämning av mängden färgämne i de enskilda cellerna. Även om fotometriska mätningar av upptagningen av katjoniska färgämnen är den föredragna metoden för mätning av ändringar i membranpotentíal, kan andra tekniker användas. Även om det ínrc av icke-exciterbara celler är negativt med avseende till utsidan, kan exempelvis anjoniska färgämnen, som har affinitet till lösningsmedel med avtagande polari- affinitet till tet, användas. I detta fall har färgämncna on intracellulära komponenter trots sin laddning och kommer att absorberas i cellen. Dess halt kommer att minska vid - cellhyperpolarisation och öka vid dcpolarisation. Uppfin- ningcn innefattar även att icke-fotometriska metoder för detekteríng av membranpotcntial kan användas. I detta av- seende kan ändringar i mcmbranpotential bestämmas på känt sätt med användning av en radioaktivt märkt katjon, t.ex. ett kol-1H- eller tritiummärkt kvaternärt ammonium- eller fosfoniumsalt. Detta förfarande är närmare beskrivet i Methods of Enzymology, H.R. Kaback, Academic Press, 1974 (sid. 698). Se även Changes in Membrane Potential of Human Granulocytes Antecide the Metabolic Response to Surface Stimulation, Proc. Natl. Acad. Sci, vol. 75 nr 8, uid. 3818-3827, augusti, 1978 (H.M. Korchak et al) och Biochcmístry 1H:25, 1975 (Schuldincr et al). UppLagningen av dessa katjoncr, liksom de av katjoniska färgämnen, är en funktion av cellulär membranpotential. Intracellulär radioaktivitet kan mätas efter tvättning av cellerna genom spridning av ett monocellulärt skikt av celler på en glas- skiva och genom att man bringar glasskivan i kontakt med en fotografisk emulsion. Jämförelse göres exempelvis ge- nom atL man underkastar ett kontrollprov för samma förfar- 10 ?Û 25 30 455 343 21 ande och jämför de erhållna autoradiogrammen. Fastän detta förfarande för mätning av cellmembranpotentialändringar är verksamt är det icke föredraget, eftersom relativt långa tider erfordras för att exponera den använda fotografiska emulsionen och cellivskraften inte bevaras.

Ett annat icke-fotometriskt förfarande för mätning av mcmbranpotcntial innefattar en modifiering av den vid konventionella elektroniska cellräknare använda tekniken. l dessa apparater bringas i saltlösning uppslammade enskilda celler att passera genom en öppning, anordnad mellan ett par elektroder, som upprätthåller en ström i lösningen.

Fasscringen av en cell genom öppningen ändrar lösningens konduktivitet och leder till en detekterbar spänningspuls.

Fulshöjden är utmärkande för cellvolymcn. Eftersom membraner av celler med olika membranpotential typiskt har olika joniska konduktiviteter kan signaler innehållande för varia- tioner i jonkonduktiviteten av membrancn av enskilda celler, som passerar genom öppningen, utmärkande information an- vändas med användning av växelström. Dessa kan användas för jämförelse av membranpotcntialerna av enskilda celler, t.ex. med hjälp av en pulshöjdsanalysator.

Perifcra blodlymfocyter erhålles från donerat blod och isoleras genom centrifugering över densitetsgradienter enligt Hypaquo-Ficoll. Grova uppskattningar av andelen eritrocyter, monocyter och granulocyter i lymfocytbered- ningarna erhålles genom cytografisk analys av cellernas röda och gröna fluorescenta signaler i alikvotcr, färgade med akridinorange. Antalet celler räknas och eellivskraften säkerställas genom trypanblått-uteslutníng.

Arbetslösningar av diO-C6-(3) kan framställas av 10' H eller s X 10"" Arbetslösningens halter bör inställas så, att man erhåller x 10-7 M vid tillsats av 10 ml färgämneslösning till 1,0 ml celler, ut- 3 M molära förrådslösningar i etanol.

H och 5 en slutlig färgëmneshalt mellan 10-8 spädda i medium 199 (Gibco). 10 20 25 30 35 455 343 * 22 Valinomycin (Sigma Chemical Company) en känd jonofor ägnad att hyperpolarisera lymfocyter, löses i etanol vid en halt av 0,66 mg/ml. Gramicidin (lCN) en känd jonofor ägnad att depolarisera lymfocyter, löses också i etanol (0,H mg/ml). Fytohemagglutinin (“PHA", Difco, 2 mg/ml) och Concanavalin A ("Con-A", Sigma, 1 mg/ml) löses i fosfatbuffrad der), som man saltlösning. PHA och Con-A är lektiner (ligan- vet kan bindas till periferiella human- lymfocyter. I Innan några andra försök utföres undersöks kinetiken för cellernas upptagning av färgämne. 20 ml färgämneslös- ning sättes till 2 ml av en utspädd eellsuspension innehål- lande 1-2 x 10-5 sedan i en flödescytometer. Fluorescensfördelníngens topp celler/ml. Cellernas fluorescens mätes lokaliseras och dess position antecknas i intervall av en minut tills den blir stabil. Detta sker typiskt inom 12 minuter när di0-Cs-(3) användes som indikatorfärgämne.

Följande försök är utformade för konstanthållning av intervallet mellan tillsats av färgämne och lektin eller jonofor och mätning av fluorescens, vilket intervall före- irädesvis är något längre än den observerade jämviktstiden.

En tid av 15 eller 20 minuter är lämplig för diO-CB-(3) i här använda koncentrationer, I ett försök jämfördes fluorescensfördelningen av 5 alikvoter av eellsuspension. Vid tiden för tillsats 10 ul arbetslösning av diO-CB-(3)/ml celler), tillsattes även: a ingenting (kontrollprov) b PHA (10 ml arbetslösning; slutlig halt 20 pg/ml) v Con A (10 ml arbetslösníng; slutlig halt 10 ug/ml) d Valjnomyuin (10 ml arbetslösníng; slutlig halt 6 x 10-6 M) och e Gramicidin (10 ml arbetslösning; slutlig halt 2 X 1o'5 M).

Prov framställdes 1 intervall av 3 till 6 minuter för att möjliggöra rening av flödessystemet av flödes- cytometern mellan proven. Pluorescensmätningar av alla prov 10 20 25 35 4455 343 23 utfördes med användning av samma lasereffekt och förstärk- ningsinställning. Approximativt lika många celler mättes i varje prov och flnorescensfördelningen från alla proven visades i samma skala av en pulshöjdsanalysator.

Resultaten från försöken är visade i fig. 1 - 5.

Dessa grafer erhölls när cellernas fluorescenssvar mättes 15 minuter efter tillsats av färgämnet och lektinerna eller jonoforerna. DiO-C5-(3) användes i en slutlig halt av 5 x 10-8 en fördelning av den intracellulära halten av cyaninfärgämnet H. Av fig. 1 (kontrollprov) framgår, att man har bland celler av populationen, såsom framgår av den visade intensitetsfürdelningen av fluorescent svar (X-axeln). Så- lunda varierar den observerade membranpotentialen av en- skilda celler i populationen före stimulering. Emellertid är membranpotentialer fördelade omkring en topp, utmärkt vid linjen A, som representerar en stor subpopulation av celler med något intcrmediärt värde för membranpotential.

I fin. 2 visas effekten av tillsats av de polariser- ande jonofor nramicidin. Det framgår, att antalet celler, som uppvisar en minskning i fluorescent intensitet (fram- kallad av den denolariserande av gramícidin) är betydligt större och att man har en förskjutning av toppen mot punkten, utmärkt vid H. Däremot uppvisar celler, till vilka den hyperpolariserande jonoforen valinomycin var tillsatt (fig. 3) en ökning av frekvensen av celler med högre flnorescent intensitet, utmärkt vid C.

F]uoroscensintensitetsfördelningarna för de med gramicidin och valiomycin behandlade proven ger vid jäm~ förelse med knnLrollprovet en indikation på variationen av de Flnureucontn signalerna, som är att vänta efter maximal depolarisatíwn och hyperpolarisation. Detta exempel visar, att det katjoniska cyaninfärgämnet ansamlas i den intra- cellulära volymen av enskilda celler som en funktion av mcmbranpotentialen.

Exempe]_2 Effekten av tillsats Con A till humanlymfocyter är visad i fig. M. Det framgår.att lymfocytsuspensionen 455 10 15 29 25 30 35 545 p 2U är heterogen med avseende på dess svar på lektin. Det inne- häller en subpopulation av celler, som efter bindning med Con. A hyperpolariseras, och en annan, som depolariseras.

Hyperpolariserade celler visar en ökning av fluorescens- intensiteten såsom visad vid D; dcpolariserade celler upp- visar en minskning av fluorescensintensiteten såsom visat av en svag men tydlig topp vid D'. Storleken av den hyperpolariserade populationen är betydligt större än den av den depolariserade populationen.

Tillsats av PHA till celler leder till en upplös- ning av två grupper av celler. Den breda, bimodala fördel- ningen, visad i fig, 5, indikerar, att en subpopulation av cellerna synes vid bindning med PHA depolarisera till en punkt, så att det fluorescenta svaret av enskilda celler minskar till en punkt, utmärkt vid E. En andra subpopula- tion av cellen visade en mera drastisk depolarisation, visad av ett ännu lägre fluorosccnt svar, visad vid E'.

Exempel 3 Förrüdslösning av PHA och diO-C6-(3) sättes till en lymfocytcellsuspension, framställd enligt exempel 1. Flödes- eytometern inställes sedan för separation av celler med en fluorescent intensitet motsvarande intensiteterna E och E' i fig. 3. Efter en inkubationstid av 15 minuter införes en uppmätt suspension i flödescytometern och uppdelas i tre cellsuspensioner, av vilka två är rika på celler, som är homogena med avseende på sitt fysiologiska svar vid bind- ning med PHA.

Exempel H B-anrikade och T-anrikade populationer av lymfo- cyter (cirka 85 %rena§erhâlles enligt rosett-teknik, analy- scrad för känsligheten för PHA. Yig. 6 visar fördelningen av fluoreseenssvar av T-celler i suspensíonen före tillsats av lektinet; fíg. 7 visar fördelningen av fluorescenssvaret av samma cellsuspensíon 20 minuter efter kontakt med PHA av förràdslösningen i exempel 1. Tillsatsen av detta lektin leder till en likformig depolarisation av T-lymfocyter. 1 motsats därtill, såsom är visat i fíg. 8 (kontroll) och 9 LI! 25 (25 minuter efter tillsats av PHA) undergär B-celler lik- formíg hyperpnlavisation till följd av PHA-receptovväxelver- kan. Dessa resultat visar, att uppfinningens förfarande kan användas för att jämföra det fysiologiska svaret av olika oelltyper på en given ligand. Det visar även att olika cell- typer kan skiljas på basis av ett fysiologiskt svar på en ligand.

Claims (28)

10 15 20 25 30 35 455 345 26 PATENTKRAV

1. Ett bioanalysförfarande, som utnyttjar en eller flera icke-excíterbara celler, k ä n n e t e c k n a t av stegen att man a) bestämmer ett karakteristiskt värde för en eller flera individuella celler av de icke-exciterbara cellerna med en icke-inträngande metod, varvid det karakteristiska värdet representerar membranpotentialen därav och b) värde för att detektera skillnader i de individuella cellernas jämför cellens karakteristiska värde med ett referens- membranpotential, varvid steget (a) innefattar att man (i) inkuberar cellerna antingen med ett färgämne, som förenar sig med de individuella cellerna, eller med ett genom cellmembranerna inträngande joniskt färgâmne, och (ii) detekterar en optisk egenskap antingen hos det med individuella celler förenade färgämnet, vilket uppvisar cellmembranpotentialen hos de individuella cellerna eller en egenskap hos cellerna, vilken är representativ för den intra- cellulära färgämneskoncentrationen, och bestämmer cellens karakteristiska värde ur den optiska egenskapen.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e t e c k- n a t av att cellerna modifieras före detektering av den optiska egenskapen, varvid en ändring i cellmembranpotentialen inträder före detekteringen av den optiska egenskapen.

3. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e L e c k- n a t av att cellmodifieringen är farmakologisk, kemisk eller biologisk.

4. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k- n a t av att modifieringen innefattar inkubering av cellerna i en lösning av ligander under sådana betingelser, att komple- mentära cellreceptorer och liganderna binder varandra.

5. n a t Förfarande enligt patentkravet 4, k ä n n e t e c k- av att liganderna utgöres av neurotransmilorer, hor- moner, farmakologiska medel och naturliga eller syntetiska agonister och antagonister därtill, antigener, antikroppar, haptener, allergener eller komplementkomponenter och kombina- tioner därav. 10 15 20 25 30 35 27 455 343

6. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k- n a t av att cellmodifieringen är fysikalisk.

7. Förfarande enligt något av patentkraven 2 - 6, k ä n n e t e c k n a t av att modifieringen föregår inku- beringen.

8. Förfarande enligt något av patentkraven 2 - 6, k ä n n e l e c k n a t av att modifieringen följer efter inkuberingen.

9. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 8, k ä n n e t e c k n a t av att referensvärdet är ett För en bestämd färgämneskoncentration representativt värde och att jämförelsen innebär en bestämning av skillnaden mellan den detekterade färgämneskoncentrationen och den Förbestämnda koncentrationen.

10. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - B, k ä n n e t e c k n a t av att referensvärdet är ett För en Förbestämd Färgämneskoncentration representativt värde och att jämförelsen innebär en bestämning av riktnings- ändringen För skillnaden mellan den detekterade färgämnes- koncentrationen och den Förbestämda koncentrationen.

11. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 8, k ä n n e t e c k n a t av att referensvärdet är en mängd av värden, vilken är representativ För ett förbestämt koncentrations-tidsförlopp, och att jämförelsen utgör skill- naderna mellan den detekterade koncentrationen och det förbestämda koncentrations-tidsförloppet.

12. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 11, k ä n n e t e c k n a t av att Färgämnet är ett fluorescent färgämne och att delekteringen av färgämnet innefattar detek- tering av fluorescens av en eller flera individuella celler.

13. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 11, k ä n n e t e c k n a t av att färgämnet är ett fluorescent färgämne och att detekteringen av färgämnet innefattar detektering av den spektrala fluorescensförskjutningen av en eller flera individuella celler.

14. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 11, k ä n n e t e c k n a t av att detekteringen av Färgämnet innefattar detektering av optisk absorption av en eller flera individuella celler. 10 15 20 25 30 35 455 543 28

15. k ä n n e t e c k n a t Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 11, av att detekteringen av Färgämnet innefattar detektering av spektralförskjutning av den optiska absorptionen av en eller Flera individuella celler efter hopklumpning av Färgämnet.

16. k ä Fluorescent färgämne med ökande Fluorescenskvantum-verknings- Förfarande enligt patentkravet 12 eller 13, n n e t e c k n a t av att ïärgämnet är ett katjoniskt grad i lösningsmedel med avtagande polaritet.

17. k ä n n e t e c k n a t Förfarande enligt patentkravet 12 eller 13, av att Färgämnet är ett fluorescent, katjoniskt cyaninfärgämne.

18. n a t 17, k ä n n e t e c k- av att Färgämnet är ett salt av §,T-dihexyl-2,2'-oxa- Förfarande enligt patentkravet karbocyanin.

19. k ä n n e t e'c k n a t 12 eller 14, av att halten färgämne i Förfarande enligt patentkravet den extracellulära lösningen är sådan, att intracellulär Fluorescenssläckning genom bildning av komplex med redu- cerad fluorescens undertryckes.

20. k ä n n e t e c k n a t 'Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 19, av att man för att detektera närvaro inkuberar en eller Flera icke- av en ligand i en lösning, exciterbara celler, som man vet innehåller en till liganden komplementär membranbunden receptor, med lösningen under sådana betingelser, att ligander och receptorer bindes till varandra, varvid närvaron av liganden i lösningen utvisas av en ändring i membranpotentialen i de receptorn innehål- lande cellerna.

21. Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 19, k ä_n n e t e c k n a t av att man För att detektera närvaro av celler med till en vald specifik ligand komplementära receptorer i ett flertal celler, som är heterogena med av- seende på ligandspecificitet, inkuberar cellerna med en lös- ning innehållande den specifika liganden under sådana be- tingelser, att komplementära cellreceptorer och ligander binds vid varandra, varvid närvaro av celler med till ligan- den komplementära receptorer utvisas av en ändring i cellernas membranpotential. 10 15 20 25 30 35 29 455 545 _-L

22. k ä n n e t e c k n a t förfarande enligt något av patentkraven 1 - 19, av att man för att detektera närvaro i en cellpopulation av celler med till en vald ligand komple- men med ett annat mentära receptorer, Fysiologiskt svar därpå, inkuberar cellpopulationen med en lösning innehållande den valda liganden för framkallning av cellmembranpotential- ändringar i cellerna av påtaglig storlek och riktning i cellerna.

23. t e c k n a t förfarande enligt patentkravet 21 eller 22, k ä n n e- av att celler med liknande membranpotential- ändringar avskiljes för erhållande av en cellpopulation, som är rik på celler känsliga för den valda liganden.

24. k ä n n e t Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 19, e c k n a t av att man för jämförelse av det kontakt med inkuberar prov av cellpopula- fysiologiska svaret av en cellpopulation i flera kemiskt skilda ligander tionen med respektive ligander under sådana betingelser, att receptorer och lígander binds vid varandra,och avkänner membranpotentialändringar i individuella celler av respek- tive cellprov.

25. k ä n n e t e c k n a t Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 19, av att man för bestämning av den kumulativa effekten av att en cellpopulation bringas i kon- takt med flera kemiskt skilda ligander, inkuberar ligan- derna och cellpopulationen under sådana betingelser, att komplementära cellreceptorer och ligander binds.

26. k ä n n e t e c k n a t Förfarande enligt något av patentkraven 1 - 19, av att man för bestämning av en cellpopulations livskraft efter kontakt med celltoxin in- kuberar cellpopulationen med toxinet.

27. k ä n n e t e c k n a t Förfarande enligt något av patentkraven 1 ~ 19, av att man för bestämning av effek- ten på en eellpopulatíon av kontakten med cellnäringsämne inkuberar cellpopulationen med näringsämnet.

28. k ä n n e L e c k n a t Förfarande enligt något av patentkraven 2 - 19, av att cellerna inkuberas med två 455 343 50 eller Flera sådana färgämnen och den optiska egenskapen är representativ för förhållandet mellan de intracellulâra koncentrationerna av Fârgämnena.