CH639776A5

CH639776A5 - Procede d'evaluation biologique.

Info

Publication number: CH639776A5
Application number: CH673180A
Authority: CH
Inventors: Howard Maurice Shapiro
Original assignee: Shapiro H M
Priority date: 1978-04-20
Filing date: 1979-04-12
Publication date: 1983-11-30
Also published as: GB2097530A; FR2467402A1; CA1132890A; SE8008648L; DE2953524C2; FR2467402B1; IT1148234B; NL7915051A; US4343782A; DE2953524A1; BE84T1; IT8086278A0; JPS54151895A; IE790802L; IE47975B1; EP0005032A2; GB2097530B; JPH0152699B2; EP0005032A3; SE455343B

Description

La présente invention concerne un procédé pour détecter et mesurer la réaction des cellules à certaines substances extracellulaires.

Il est connu depuis longtemps que l'intérieur des cellules animales et végétales est électriquement négatif par rapport à l'extérieur. La valeur de cette différence de potentiel se situe habituellement entre 5 et 90 mV, la plus grande partie du potentiel étant développée au travers de la membrane de la cellule.

Les potentiels de membrane des cellules changent de diverses façons l'état physiologique de la cellule. Etant donné que l'expédient de l'énergie métabolique est nécessaire pour maintenir les potentiels, le potentiel au travers de la membrane d'une cellule blessée ou morte diminue de valeur. Des changements spécifiques du potentiel de membrane se produisent en quelques minutes après l'interaction des cellules avec un grand nombre de substances ou coordinats qui se lient avec une affinité relativement élevée aux récepteurs transmembraneux.

Le brevet US N° 3971952 décrit un procédé pour déterminer les propriétés élastiques et diélectriques des diaphragmas de cellules mesurant la tension de claquage ou de rupture diélectrique des diaphragmas de cellules. Le brevet US N° 3971952 décrit que, mesurant la polarisation de la fluorescence de la radiation émise par la couche lipide des membranes des cellules marquées avec la partie fluorescente, on peut déterminer le degré de fluidité de membrane des cellules et qu'on peut en déduire une information sur le comportement de la cellule.

L'état de la technique se référant à cet object inclut aussi les brevets US N° 3883247, DE N° 1773809, DE N° 2451174, DE N" 2502174 et GB N° 1319710.

En rapport avec les ligands et les récepteurs, des recherches récentes en biologie cellulaire ont démontré qu'une forme de base de communication entre les cellules de systèmes vivants multicellulaires est réalisée par des ligands extra-cellulaires ou messagers chimiques. Ces messagers chimiques proviennent à la fois des tissus spécialisés de l'organisme et de sources externes. Leurs structures chimiques et sites d'action varient grandement. Ils peuvent avoir une zone d'influence aussi petite que quelques centaines d'angströms (par exemple à la jonction neuromusculaire) ou dans la totalité de l'organisme (des messagers portés par le sang tels que les hormones).

Du fait de récentes recherches biochimiques dans ce domaine, il a maintenant été établi que nombre de ces messagers chimiques se combinent avec la cellule recevant le message en s'accouplant sélectivement aux récepteurs disposés sur l'extérieur de la cellule. Apparemment, le récepteur reconnaît le messager chimique sur la base de sa stéréochimie et/ou la répartition spatiales de ses groupes chargés ou chimiquement actifs. Donc, le ligand et le récepteur sont liés de façon non convalente suivant une liaison de clé et serrure. Du fait de cette liaison, un changement intracellulaire biochimique ou biophysique se produit, qui induit la cellule à commencer ou à achever un certain procédé métabolique ou physiologique. Les ligands comprennent des substances telles que l'acétylcholine, l'épinéphrine, et la norépinéphrine (neurotransmetteur), l'insuline, l'hormone de croissance et la thyrotropine (hormones), l'histamine, les antigènes, les protéines du système immunologique ou des protéines de celles-ci, les virus, les bactéries, certaines toxines et le sperme. Pour beaucoup de ces substances, il existe un antagoniste naturel ou synthétique, c'est-à-dire une substance qui peut inverser l'essai physiologique de sa substance correspondante ou se lier aux récepteurs empêchant ainsi la liaison de la substance naturelle. On connaît également des agonistes naturels ou synthétiques. Un agoniste est une substance qui se lie au récepteur pour amorcer une réaction cellulaire physiologique similaire à celle du ligand naturel. De nombreuses drogues maintenant habituellement employées dans la pratique médicale sont des agonistes ou antagonistes de ligands naturels.

Dans de nombreux cas, les événements qui se produisent dans les cellules à la suite d'une liaison du ligand avec des récepteurs spécifiques peuvent être reproduits en faisant réagir les cellules avec d'autres substances qui se lient aux récepteurs, par exemple avec certaines lectines végétales ou avec un anticorps préparé contre les récepteurs isolés. Il est également possible d'amorcer les réactions cellulaires de ce type par addition d'agents qui changent le potentiel de membrane dans le même sens que celui obtenu après une interaction ligand-récepteur.

Une méthode rapide et fiable pour détecter et mesurer l'effet intracellulaire de l'interaction ligand-récepteur aurait une utilité significative en recherche biochimique et des essais pour diagnostics. A cause de la diversité des spécificités des récepteurs parmi les populations cellulaires autrement homogènes et à cause du nombre énorme d'agents chimiotactiques, un tel essai, idéalement, devrait être capable de s'appliquer aux cellules individuelles.

Divers procédés directs et indirects pour détecter l'interaction ligand-récepteur sont connus dans la technique. Dans un type de procédé, on utilise des ligands marqués par une substance radioactive ou fluorescente. Ils sont incubés avec une suspension de cellules et, après lavage pour éliminer les ligands non liés, on dose la radioactivité ou fluorescence de la masse cellulaire. La nécessité d'employer des ligands marqués impose des limitations sévères à l'utilisation de cette technique. Dans un autre type de procédés de détection connu dans la technique, on utilise l'observation que les interactions ligand-récepteur sont souvent accompagnées par des augmentations de synthèse intracellulaire d'acide désoxyribonucléique (ADN).

Dans certains systèmes, après la liaison des ligands au récepteur, par exemple après que les lymphocytes ont été stimulés par un antigène ou des mitogènes tels que la phytohémagglutinine, on peut mesurer les quantités d'ADN et ensuite les comparer avec la quantité d'ADN d'une masse cellulaire comparable où aucune interaction ligand-récepteur ne s'est produite. Le niveau relatif d'ADN donne une mesure de l'interaction ligand-récepteur. L'utilisation de cette technique est limitée parce que la synthèse de l'ADN n'est généralement pas détectable avant de nombreuses heures ou même jours après la liaison du ligand.

Encore un autre type de procédés pour détecter certains types d'interaction ligand-récepteur est fondé sur la structure de la matrice cytoplasmique déterminée par la mesure de la polarisation de fluorescence de la fluorescéine intracellulaire. Pour pouvoir être analysées par de tels procédés, les cellules doivent être capables de produire une fluorescéine intracellulaire par hydrolyse enzymatique du diacétate de fluorescéine ou d'un composé similaire. Ces procédés sont techniquement difficiles à mettre en œuvre et les résultats sont difficilement interprétés. En outre, le procédé exige une modification métabolique d'un réactif par les cellules à étudier.

Bien qu'il ait été connu depuis des décennies que des cellules excitables telles que les neurones et les cellules musculaires subissent un changement rapide du potentiel de membrane lorsqu'elles sont stimulées par un neurotransmetteur, il est seulement apparent depuis peu de temps que les changements du potentiel de membrane induits par des Stimuli physiologiques ne sont pas limités à ces cellules spécialisées. En insérant des microélectrodes dans des cellules non excitables, des chercheurs ont établi que les changements de potentiel de

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membrane sont associés à leurs interactions ligand-récepteur. En fait, on a observé que les événements physiologiques qui se produisent dans des cellules non excitables à la suite d'une liaison d'un ligand à un récepteur peuvent parfois être reproduits par addition à la suspension de cellules, d'agents qui changent le potentiel de membrane dans le même sens que celui qui se produit après une liaison ligand-récepteur. Une recherche supplémentaire a développé de nouvelles techniques pour observer ces changements. Par exemple, une méthode photométrique de mesure des changements du potentiel de membrane dans une masse de cellules en suspension a été décrite par P.J. Sims et coll. («Biochemistry», vol. 13, N° 16, 1974, p. 3315). Selon cette méthode, la suspension de cellules est incubée avec une cyanine ou un autre colorant qui est chargé positivement et est capable de traverser la couche de lipide des membranes cellulaires. Le rapport des concentrations de colorant intracellulaire à colorant extra-cellulaire change avec les changements du potentiel de membrane: lorsque les cellules deviennent hyperpolarisées, c'est-à-dire lorsque l'intérieur des cellules devient plus négatif, davantage de molécules de colorant pénètrent dans les cellules. Dans la méthode de Sims et coll., ces colorants sont utilisés en concentration telle que les molécules de colorant intracellulaire forment des agrégats non fluorescents et la fluorescence du colorant libre dans le milieu en suspension est mesurée contre le fond plus sombre des cellules. Cette fluorescence diminue avec l'hyperpolarisation des cellules. Si seulement une petite fraction des cellules dans une suspension est sensible à un ligand donné, c'est seulement cette fraction qui présente un changement du potentiel de membrane. Dans ce cas, la concentration de colorant dans le milieu ne changera pas d'une manière appréciable et il n'y aura donc pas de changement détectable de fluorescence du colorant extra-cellulaire. De toute façon, cette méthode ne permet pas d'identifier les cellules individuelles sensibles au ligand.

Dans la publication «Journal of Membrane Biology», vol. 33, p. 141 (1977), W.N. Ross et coll. ont décrit l'utilisation de la méro-cyanine, de l'oxonol et de la cyanine comme colorants pour mesurer les changements rapides du potentiel de membrane dans les cellules excitables telles que les axones géants du système nerveux du calmar. On a observé que les changements de l'absorption, de la fluorescence, du dichroïsme et de la biréfringence des colorants étaient associés aux changements du potentiel de membrane. Les colorants qui conviennent le mieux pour ces mesures sont les mérocyanines, qui sont chargées négativement et donc ne pénètrent pas facilement les parois cellulaires. Généralement, les colorants ne colorent pas les membranes cellulaires autres que celles des cellules nerveuses et musculaires excitables. On a observé que les mérocyanines colorent certaines membranes cellulaires non excitables, par exemple les cellules sanguines immatures ou leucémiques. Cependant, on a constaté que cette coloration se produisait indépendamment des changements du potentiel de membrane cellulaire.

Il est un but de l'invention de mettre en œuvre un procédé d'évaluation biologique fondé sur un processus non intrusif des changements du potentiel de membrane des cellules individuelles. Un autre but de l'invention est de fournir un procédé rapide, sensible et universel d'évaluation biologique servant à détecter et à prédire la réaction cellulaire aux interactions ligand-récepteur. Encore un autre but de l'invention est de détecter les interactions ligand-récepteur dans des cellules individuelles non excitables. D'autres buts sont de fournir de nouvelles techniques pour sélectionner des drogues potentiellement actives, pour diagnostiquer le mauvais fonctionnement physiologique des tissus et pour tester l'allergie et l'histo-compatibilité.

L'invention met en œuvre un procédé d'évaluation biologique se caractérisant par les étapes qui consistent à: a) déterminer une propriété caractéristique de cellules individuelles parmi une sous-population de cellules non excitables représentative du potentiel de membrane de celles-ci suivant un processus non intrusif, et b) comparer cette propriété caractéristique des cellules à une caractéristique de référence pour détecter les différences du potentiel de membrane de ces cellules individuelles.

Les modes de réalisation de l'invention constituent un procédé rapide et sensible non intrusif pour détecter le changement du potentiel de membrane des cellules pour les cellules non excitables et pour prédire la réaction physiologique des cellules non excitables à une modification par des agents physiques, pharmacologiques, biologiques ou chimiques. Selon un mode de réalisation, le changement du potentiel est provoqué par l'interaction ligand-récepteur. Dans un autre mode de réalisation, le changement est non spécifique, ainsi que cela se produit après un dommage causé aux cellules.

Dans le premier cas, le procédé est fondé sur l'observation que, bien que la réaction physiologique d'une cellule donnée à la liaison d'un ligand spécifique soit souvent difficile ou impossible à détecter et souvent ne se produise pas avant des heures ou des jours après l'interaction, un changement du flux ionique au travers de la membrane de la cellule et le changement résultant du potentiel de membrane se produisent après peu de temps, typiquement en moins de 1 h. Ce mode de réalisation consiste à déterminer une caractéristique des cellules individuelles qui est représentative du potentiel de membrane de celles-ci, à comparer cette caractéristique à une caractéristique de référence pour détecter les différences du potentiel de membrane et à utiliser les changements observés comme indicateur de l'interaction ligand-récepteur. Du fait du grand nombre de substances qui présentent une activité comme messager chimique, la diversité observée des sites récepteurs sur les cellules individuelles d'une population donnée de cellules et la diversité de la réaction physiologique des cellules individuelles à des ligands spécifiques, il est important que la réaction des cellules individuelles (par opposition aux suspensions de masse) à l'exposition des ligands soit détectée.

Donc, on met en œuvre des procédés: 1) pour déterminer la présence ou l'absence de récepteurs spécifiques pour un ligand donné sur certaines ou la totalité des cellules d'une population de cellules; 2) pour déterminer la présence ou l'absence dans un mélange de substances d'un ligand spécifique connu pour réagir avec les éléments d'une population de cellules donnée; 3) pour étudier les effets cumulatifs des combinaisons des ligands sur les cellules; 4) pour comparer les effets de deux ou plusieurs ligands sur une population de cellules donnée, et 5) pour déterminer une indication de l'état physiologique d'une population de cellules ou sous-population après exposition à une toxine suspectée ou à une autre substance. Etant donné que plusieurs des méthodes utilisées pour détecter les changements du potentiel de membrane ne sont pas destructives, les procédés peuvent être utilisés en combinaison avec une espèce de cellule pour produire des populations de cellules riches en cellules ayant les spécificités souhaitées des récepteurs tout en préservant la viabilité des cellules.

Suivant un mode de réalisation de l'invention, des cellules non excitables, typiquement en suspension, sont mises en contact avec une solution contenant ou suspectée de contenir un ou plusieurs ligands actifs. On incube le mélange sous les conditions où les récepteurs des cellules et ligands complémentaires se lient pour induire un changement physiologique dans les cellules où la liaison se produit, Avant, après ou pendant l'incubation, une caractéristique représentative du potentiel de membrane cellulaire des cellules individuelles est détectée. Cette caractéristique détectée est comparée à une caractéristique de référence pour détecter les changements des potentiels de membrane et pour obtenir une information utile.

La présence ou l'absence d'un ligand donné dans une solution peut être déterminée en incubant la solution avec une population de cellules comprenant au moins une sous-population connue pour contenir des récepteurs pour le ligand en question, en détectant les changements dans le potentiel de membrane cellulaire dans chacune des cellules formant la population et en comparant la répartition des changements du potentiel de membrane, s'il y en a, parmi les cellules aux résultats, par exemple, d'une caractéristique de référence comprenant les résultats du même essai réalisé en parallèle avec un échantillon à tester contenant un échantillon authentique du ligand en question. Une indication de la concentration du ligand dans l'inconnu peut également être déduite par cette technique.

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La présence et la fréquence des cellules qui réagissent avec un ligand donné dans une population hétérogène de cellules peuvent être déterminées d'une manière similaire en comparant les changements du potentiel de membrane parmi les éléments de la population. En combinant cette technique avec des méthodes connues de classification de cellules, le chercheur peut obtenir des populations de cellules relativement homogènes par rapport à la sensibilité d'un ligand spécifique.

Suivant un autre mode de réalisation, la réaction physiologique d'une population de cellules non excitables à l'exposition de deux ou plusieurs ligands chimiquement distincts peut être prédite et comparée en incubant des solutions des ligands respectifs dans une pluralité d'échantillons cellulaires, en observant le sens, la valeur et/ou le temps des changements du potentiel de membrane dans les cellules individuelles dans les échantillons cellulaires respectifs et en comparant ensuite les mesures faites dans les échantillons respectifs. Cette technique peut être utilisée, par exemple, pour détecter les substances synthétiques suspectées d'être des agonistes ou antagonistes envers le ligand naturel et pour détecter des variations de la réaction cellulaire de cellules similaires à des ligands fonctionnellement ou structurellement apparentés.

Dans un autre mode de réalisation, l'effet cumulatif de l'exposition de deux ou davantage de ligands chimiquement distincts à une population de cellules non excitables peut être rapidement essayé en incubant les ligands et la population de cellules, en détectant les changements du potentiel de membrane cellulaire des cellules individuelles et en comparant les changements du potentiel détectés aux résultats obtenus en parallèle avec les ligands individuels ou un enregistrement de la réaction cellulaire prédéterminée à un ou plusieurs des ligands individuels. De cette façon, des drogues qui se comportent comme agonistes ou antagonistes envers le ligand naturel et une indication de leur dose optimale peuvent être découvertes.

Dans un autre mode de réalisation encore, les effets toxiques de divers agents sur les cellules sont évalués par la mesure du potentiel de membrane après exposition à ces agents. Le potentiel de membrane d'une cellule endommagée doit atteindre zéro dans la zone où la membrane est rompue. Des degrés moindres d'endommagement sont détectables par une diminution de la valeur du potentiel de membrane par comparaison aux cellules non endommagées.

Diverses méthodes non intrusives sont envisagées pour être utilisées pour détecter et mesurer le potentiel de membrane dans des cellules individuelles non excitables. La méthode actuellement préférée consiste à utiliser soit des colorants perméables aux membranes, soit des colorants liés aux membranes qui s'associent aux cellules individuelles et ont des caractéristiques optiques détectables qui changent en réponse à des changements de potentiels de membrane. Donc, des colorants ioniques perméables aux membranes cellulaires, s'ils sont incubés avec les cellules, s'équilibrent rapidement entre les côtés opposés des membranes cellulaires en fonction du potentiel de membrane. Une mesure indicative de la concentration intracellulaire du colorant est alors faite par mesure photométrique de la fluorescence, de l'absorption ou autres propriétés optiques du colorant dans la cellule individuelle et d'autres attributs de la cellule individuelle (par exemple le volume de la cellule) qui doivent être connus dans le but de déterminer la concentration intracellulaire du colorant. Lorsque les cellules comparées sont homogènes en ce qui concerne leur volume, la mesure représentative de la quantité de colorant intracellulaire sera proportionnelle au potentiel de membrane. La mesure photométrique peut être mise en œuvre par microphotométrie habituelle ou cytométrie à débit. Lorsque la propriété optique à mesurer est la fluorescence, le colorant est de préférence choisi parmi ceux caractérisés par une augmentation du rendement quantique de fluorescence dans des solvants où la polarité diminue et la concentration du colorant dans le milieu est choisie de façon à décourager l'inacti-vation intracellulaire de la fluorescence par formation de complexes de fluorescence réduite. Des colorants fluorescents préférés sont les cyanines cationiques telles que dihexyl-3,3'-oxa-2,2'-carbocyanine [diO—C6—(3)].

Pour que l'invention puisse être mieux comprise, référence est faite aux figures suivantes de modes de réalisation de l'invention. La description a seulement un but illustratif et ne doit pas être considérée comme limitant l'invention.

Dans les dessins:

la fig. 1 est un graphique de la répartition de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une première aliquote d'une suspension de cellules humaines de lymphocytes incubés avec une concentration de 5 x 10~8 M de dihexyl-3,3'-oxa-2,2'-carbocyanine [diO —C6—(3)]; dans ce graphique et dans les graphiques suivants l'axe vertical représente le nombre de cellules ayant une intensité particulière et l'axe horizontal représente l'intensité de la fluorescence;

la fig. 2 est un graphique de la répartition de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une seconde aliquote d'une suspension de cellules incubées simultanément avec une concentration de 2 x 10~5 M de gramicidine ionophore dêpolarisante et une concentration de 5 x 10~8 M de diO—C6—(3);

la fig. 3 est un graphique représentant la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une troisième aliquote d'une suspension de cellules incubées simultanément avec une concentration de 6 x 10~6 M de valinomycine ionophore hyperpolarisante et une concentration de 5 x 10~8 M de diO—C6 — (3);

la fig. 4 est un graphique donnant la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une quatrième aliquote d'une suspension de cellules incubées simultanément avec une solution de 10 ng/ml de ligand concanavaline A et une concentration de 5 x 10-8 M de diO—C6—(3);

la fig. 5 est un graphique représentant la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une cinquième aliquote d'une suspension cellulaire incubée simultanément avec une solution de 20 |Jg/ml de ligand phytohémagglutinine et une concentration de 5 x 10-8 M de diO —C6 —(3);

la fig. 6 est un graphique de la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire du nombre de cellules avec une réaction de fluorescence donnée en fonction de l'intensité de la fluorescence fait avec une aliquote de lymphocytes T équilibrée par une concentration de 5x 10~8 M de diO—C6—(3);

la fig. 7 est un graphique représentant la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une suspension de lymphocytes T de la fig. 6, 20 min après l'addition de phytohémagglutinine pour obtenir une concentration de 20 ng/ml, montrant l'effet dépolarisant de cette lectine sur une sous-population de cellules T ;

la fig. 8 est un graphique donnant la distribution de l'intensité de la fluorescence cellulaire d'une suspension de cellules de lymphocites B équilibrée par une concentration de 5 x 10-8 M de diO—C6 —(3);

la fig. 9 est un graphique représentant l'effet hyperpolarisant de la phytohémagglutinine sur la suspension de cellules B de la fig. 8, 25 min après l'addition de phytohémagglutinine à une concentration de 20 ng/ml.

Tous ces graphiques ont été réalisés avec un cytomètre du type Cytofluorograph, de Ortho Instruments, raccordé à un analyseur d'altitude des impulsions.

Le procédé consiste à utiliser des cellules non excitables, c'est-à-dire des cellules autres que celles provenant du tissu musculaire et nerveux. Les cellules concernées dans l'analyse selon la présente invention sont isolées par des techniques habituelles et mises en suspension dans un milieu capable de supporter un métabolisme cellulaire normal, par exemple une solution saline équilibrée, oxygénée, isotonique tamponnée à pH 7,2-7,6 et contenant du glucose ou autres produits nutritifs et approximativement des concentrations physiologiques d'ions sodium, potassium, calcium et magnésium. De préférence, les cellules ne contiennent ni protéines étrangères (albumine, etc.), ni autres substances ayant une forte affinité pour les colorants du type utilisé pour détecter les changements des potentiels de membrane dans la technique de détection préférée décrite ci-dessous.

Ainsi qu'il est exigé pour les buts du test à mettre en œuvre, les cellules peuvent comprendre une population relativement homogène s

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en ce qui concerne leur fonction physiologique (par exemple, des lymphocytes T), ou en ce qui concerne la spécificité du ligand (par exemple, des cellules mères sensibles au complexe allergène IgE). Si nécessaire, les cellules peuvent être divisées en un certain nombre de parties aliquotes de sorte que plusieurs déterminations du potentiel de membrane peuvent être faites en parallèle. Le potentiel de membrane des cellules dans chaque partie aliquote est alors déterminé après exposition, par exemple, à une solution de différents ligands, de différentes concentrations d'un seul type de ligand, ou d'une solution sans ligand, de sorte qu'une comparaison puisse être faite. La solution à laquelle les cellules sont exposées, en fonction des buts du test, peut comprendre un inconnu suspecté de contenir un ligand spécifique pour les cellules de l'échantillon, un échantillon authentique d'un ligand connu de concentration connue ou inconnue, une préparation impure de ligand ou une solution contenant une substance suspectée d'être toxique envers les cellules ou une sous-population de celles-ci.

Outre qu'elle détecte la liaison ligand-récepteur, la technique permet de vérifier les catégories suivantes d'informations:

1) la présence d'une sous-population de cellules dans la suspension ayant des récepteurs de surface de la membrane complémentaires à un ligand spécifique;

2) la présence, dans une solution, d'un type spécifique de ligand capable de se lier avec les récepteurs disposés sur les cellules dans la suspension ou une sous-population de ces cellules;

3) l'effet cumulatif de ligands multiples qui réagissent avec une population donnée de cellules;

4) une comparaison de la réaction d'une population de cellules ou sous-population de celles-ci à différents types de ligands;

5) l'effet sur la viabilité des cellules des diverses concentrations de substances toxiques, ou

6) la stimulation du métabolisme cellulaire par diverses concentrations de produits nutritifs tels que les acides aminés ou des sucres.

En ce qui concerne les systèmes impliquant des interactions ligand-récepteur, l'information est obtenue en incubant les cellules avec une solution de ligand pendant une période de temps suffisante et à une température convenable (par exemple la température normale des cellules dans leur milieu naturel) pour permettre aux interactions ligand-récepteur de se produire et un changement résultant du flux ionique au travers des membranes cellulaires. Une caractéristique représentative du potentiel de membrane de chaque cellule dans la suspension où de chaque cellule dans une partie aliquote de la suspension est alors obtenue, éventuellement après des intervalles, de sorte qu'un profil de changement de potentiel en fonction du temps soit obtenu.

La caractéristique mesurée est alors comparée à une caractéristique de référence pour déterminer si l'interaction ligand-récepteur a eu lieu, si le sens, la valeur ou le temps des changements imite — ou y est opposé — le changement induit dans les cellules après exposition à un ligand connu, soit que l'effet cumulatif sur le potentiel de membrane de deux ou plusieurs ligands diffère de celui d'un seul ligand ou d'un mélange différent de ligands.

La nature de la caractéristique de référencé variera nécessairement en fonction de l'information spécifique recherchée. Comme on l'a noté ci-dessus, elle peut comprendre les résultats d'un ou de plusieurs essais réalisés en parallèle avec l'échantillon à tester. Selon une autre possibilité, elle peut prendre la forme d'un enregistrement d'un tel essai, par exemple sous la forme d'un graphique du nombre des cellules présentant un potentiel donné en fonction de la valeur du potentiel.

Les ligands et leurs antagonistes généralement produisent des effets opposés sur le potentiel de membrane cellulaire. Par conséquent, au cours de la recherche des efforts dirigés vers la découverte d'une substance capable d'imiter, de bloquer ou d'annuler l'effet de ligands naturels sur les cellules d'un tissu particulier, le sens, la valeur et/ou le temps des changements de potentiel de membrane dans un échantillon de cellules d'un tissu peuvent être déterminés par des mesures multiples après exposition des cellules à un ligand naturel. Ensuite, diverses substances peuvent être ajoutées aux aliquotes de la même suspension de cellules. En comparant les changements de potentiel de membrane induits dans les échantillons respectifs, le chercheur peut identifier, comme candidat valable pour une recherche supplémentaire, des matières spécifiques ayant vraisemblablement l'effet physiologique souhaité, et d'autres composés peuvent être éliminés de la recherche. En utilisant la présente méthode, on peut également déterminer des paramètres tels que la concentration de l'antagoniste nécessaire pour abolir l'effet sur le potentiel de membrane d'un type donné de cellules, d'une concentration donnée d'agoniste. De telles mesures sont utiles pour l'évaluation des ligands et de leurs antagonistes comme agents pharmacologiques.

Dans certains cas, il existe divers types de récepteurs spécifiques pour un ligand donné. Par exemple, la liaison d'un ligand à des récepteurs d'une classe de cellules peut résulter en une hyperpolarisa-tion, alors que la liaison du même ligand à des récepteurs d'une seconde classe de cellules peut résulter en une dépolarisation. La méthode actuelle permet de distinguer entre ces deux types d'interaction. Des techniques connues de classification de cellules, utilisées en combinaison avec le procédé selon l'invention, permettent l'isolation de lignes de cellules ayant une spécificité de récepteur souhaitée parmi des populations hétérogènes. L'utilisation de la méthode dans ce contexte fournit une sélectivité accrue par comparaison aux méthodes habituelles de classification de cellules fondée sur la liaison d'un ligand marqué par fluorescence parce que l'effet physiologique aussi bien que la liaison du ligand peuvent être incorporés dans le critère de sélection. Une spécificité supplémentaire peut être obtenue par la combinaison d'une mesure directe de la liaison du ligand marqué optiquement avec détection du changement du potentiel de membrane après la liaison du ligand.

Lorsque la présence d'un type particulier de ligand dans une solution ou celle de cellules ayant une spécificité particulière envers le ligand est l'information intéressante, on peut lire le potentiel de membrane avant et après le mélange de ce ligand avec la suspension de cellules, et les résultats sont comparés. Les parties aliquotes représentatives respectives d'une suspension de cellules peuvent être incubées avec, par exemple: 1) une solution contenant une concentration inconnue d'un ligand donné, 2) une solution sans ligand, et 3) une solution contenant une concentration connue de ligand.

Après incubation, une indication dans la concentration de ligand de l'inconnu peut être obtenue par comparaison des potentiels de membrane des cellules dans les échantillons respectifs. Etant donné que le potentiel de membrane de cellules individuelles est mesuré, il est possible d'identifier une sous-population de cellules dans la suspension avec une spécificité choisie de ligand.

La méthode peut être utilisée pour la détection et la quantification des réactions immunes des cellules par mesure des changements de potentiel chez les lymphocytes, macrophages ou autres cellules du système immunologique après exposition à des substances telles que les antigènes, anticorps, haptènes, allergènes et composants de complément. Etant donné que les lymphocytes sont typiquement une population hétérogène en ce qui concerne la réactivité envers un antigène donné, la fraction de cellules répondant à l'antigène donné fournit une mesure utile de la réaction immunologique cellulaire. Des altérations du modèle habituel des changements de potentiel sur les cellules en réaction peuvent indiquer des défauts de la fonction immunologique. Similairement, l'introduction de divers allergènes dans plusieurs échantillons d'un sérum individuel, suivie par l'incubation des échantillons avec des cellules impliquées dans l'excrétion de l'histamine, peut être utilisée comme moyen non intrusif pour détecter la sensibilité d'un individu à diverses matières allergènes.

Etant donné que, avec les procédés selon l'invention, l'isolation et le marquage d'espèces spécifiques de ligand ne sont pas nécessaires pour la détection de substances capables de se lier aux cellules avec les spécificités des récepteurs données, il est possible d'utiliser la méthode pour tester l'activité du ligand d'une préparation impure de ligand, et suivre et observer l'activité du ligand dans diverses frac-

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tions de telles préparations impures résultant de procédés conçus pour purifier ou isoler le ligand spécifique souhaité.

La méthode peut également être utilisée pour aider à définir la structure chimique des récepteurs de surface par démonstration de la compétition entre divers ligands de spécificité connue envers des sites de liaison sur les surfaces des cellules. Les effets toxiques de divers agents sur les cellules peuvent être évalués par des mesures successives des potentiels de membrane des cellules après exposition à de tels agents. Il est connu que les essais pour la viabilité des cellules fondés sur la pénétration de colorants normalement perméables tels que l'iodure de propidium détectent seulement les cellules qui sont désintégrées. Pour divers buts, par exemple l'évaluation de l'effet des drogues sur la thérapeutique du cancer, il est utile de déterminer si la capacité future de reproduction de la cellule est détruite, ou si un dommage insuffisant pour la rupture de l'intégrité de la membrane cellulaire s'est produit. Le potentiel d'une cellule endommagée doit atteindre zéro dans la zone où la membrane s'est rompue. Les degrés moindres de dommages sont détectables par une diminution de la valeur du potentiel de membrane par comparaison aux cellules non endommagées. La diminution ou suppression de la réaction contre les ligands et autres substances qui normalement produisent des changements connus du potentiel peut également être détectée par une mesure des potentiels des membranes cellulaires.

Etant donné que la distribution de composés ioniques perméables, par exemple des drogues au travers des membranes cellulaires, dépend du potentiel de membrane, la méthode peut être utilisée pour produire des différences d'absorption de drogue parmi les différents types de cellules. Le procédé peut également être utilisé pour fournir un facteur de correction fondé sur les différences d'absorption de colorants prédites sur la base des différences de potentiels mesurées, ce qui permet d'utiliser une variété de colorants ioniques perméables, par exemple les acridines, comme colorants vitaux pour la quantification de divers constituants intracellulaires, par exemple les acides nucléiques et les glycosaminoglycanes.

La totalité des procédés précédents exige une méthode rapide, non intrusive et de préférence non destructive pour détecter le potentiel de membrane ou obtenir une mesure proportionnelle au potentiel de membrane de 103 à 106 cellules individuelles dans un échantillon typique de cellules. L'intrusion de microélectrodes dans les cellules individuelles endommage nécessairement les membranes cellulaires et ne peut être utilisée efficacement pour détecter le potentiel de membrane de chacune du grand nombre de cellules d'une suspension de cellules. La méthode de détection préférée consiste à utiliser des colorants de fluorescence cationiques perméables à la membrane cellulaire qui, pendant l'incubation, se partagent entre les deux côtés opposés des membranes cellulaires en fonction du potentiel de membrane. La concentration intracellulaire du colorant ou un paramètre proportionnel à la concentration est alors mesurée par des techniques optiques au moyen d'un microphotomètre où d'un cytomètre à débit. Pendant l'hyperpolarisation, l'affinité de l'intérieur de la cellule envers le colorant est accrue; au cours d'une dépolarisation, l'affinité de l'intérieur de la cellule pour le colorant diminue.

Des colorants convenant pour cette technique sont les colorants cationiques de la cyanine tels que les di-n-butyl-3,3'-méthyl-9- et diéthyl-3,3'-thiacarbocyanines, diêthyl-3,3'-oxa-2,2'-carbocyanine, hexaméthyl-2,3,3,l',3',3'-indocarbocyanine et -dicarbocyanine, diéthyl-3,3'-thiadicarbocyanine et, de préférence, dihexyl-3,3'-oxa-2,2'-carbocyanine [diO—Cfl—(3)]. Ces colorants sont disponibles dans le commerce, par exemple, chez Accurate Chemical Company ou Eastman Kodak.

Il est avantageux que le colorant choisi présente un rendement quantique de fluorescence augmenté lorsque la polarité du solvant diminue et que le maximum de la fluorescence et de l'absorption du colorant se déplace avec les changements de la polarité dans le solvant. Ces caractéristiques portent au maximum la sélectivité de la détection du colorant associé à la membrane dans les cellules contre un fond de colorant libre en solution. Il est également avantageux d'utiliser des concentrations suffisamment faibles du colorant fluorescent choisi pour réduire au minimum l'extinction de la fluorescence du colorant intracellulaire due à la formation d'agrégats. Dans le cas du colorant préféré de cyanine [diO—C6—(3)], des concentrations égales ou inférieures à 3 x 10~7 M sont préférées.

Le diO—C6—(3) se caractérise par une augmentation du rendement quantique d'environ 4,5 dans du n-octanol sur des solutions aqueuses. Son maximum d'absorption et d'émission dans le n-octanol est d'environ 10 nm supérieur à celui en solution aqueuse. La quantité de diO—C6 —(3) dans les cellules individuelles est déterminée par la mesure de la fluorescence dans la région de 504 nm, après excitation à environ 488 nm. Les effets souhaités du solvant sur le rendement quantique sont plus prononcés dans les colorants de carbocyanine, qui a la formule générale Rr-(CH)3—R', que dans le cas des di- et tricarbocyanines ayant la formule générale R—(CH) 5 — R' et R—(CH)7—R' respectivement.

Un microfluoromètre doit être utilisé pour mesurer la fluorescence mais la mesure est accomplie le plus rapidement et avec le plus de précision en utilisant un cytomètre à débit. La méthodologie du cytomètre à débit et la classification des cellules sont décrites par P.K. Horan et L.L. Wheeless, jun., dans «Science», vol. 198, pp. 149-157 (1977). Les cytomètres à débit utilisant des sources lumineuses au laser à ions argon conviennent parfaitement pour les mesures de la présente invention. De tels instruments sont vendus par différents fabricants et sont capables de classer automatiquement les cellules en fonction de divers critères, par exemple intensité de fluorescence, dimension des cellules, longueur d'onde de la fluorescence et longueur d'onde ou intensité d'absorption.

Si la population de cellules étudiées est relativement homogène en ce qui concerne la dimension de la structure interne et si la concentration de colorant ajouté et le nombre de cellules en suspension dans un volume donné de milieu sont maintenus relativement constants, la quantité totale de colorant dans une cellule donnée,

mesurée par l'intensité de la fluorescence provenant de cette cellule, sera directement proportionnelle à la concentration et, par conséquent, au potentiel de membrane. Cependant, lorsque des populations de cellules mélangées ou diverses concentrations de cellules et/ou de colorant sont impliquées, des mesures supplémentaires peuvent être nécessaires. Etant donné que la concentration intracellulaire de colorant est égale à une quantité totale de colorant dans la cellule divisée par le volume de la cellule, une valeur proportionnelle à la concentration de colorant dans une cellule donnée peut être obtenue en mesurant la quantité totale de colorant comme il a été décrit ci-dessus, et en divisant par une quantité proportionnelle au volume des cellules. Une mesure du volume des cellules peut être obtenue simultanément avec une lecture de la fluorescence intracellulaire dans des cytomètres à débit par des mesures électroniques ou optiques de la dimension des cellules, par exemple 3/2 de l'énergie de la section transversale de la cellule, mesurée par dispersion de la lumière à des angles proches de l'axe d'illumination. De manière avantageuse, les techniques cytométriques à débit permettent d'assembler cette information, de la manipuler électroniquement et de la montrer automatiquement. Le cytomètre crée un signal représentatif de l'intensité de la fluorescence, un second signal représentatif du volume des cellules et ensuite détermine le rapport des signaux. Ce rapport, qui est proportionnel au potentiel de membrane, peut alors être utilisé comme critère de classification des cellules et/ou montré.

Lorsque la population des cellules à tester est notablement hétérogène en ce qui concerne le volume cellulaire ou la quantité de colorant liant, une mesure proportionnelle du potentiel de membrane peut être obtenue en utilisant deux colorants avec des affinités différentes pour les constituants intracellulaires. Dans ce cas, la fluorescence intracellulaire des deux colorants peut être mesurée. L'augmentation ou diminution du rapport des teneurs en colorants intracellulaires est alors proportionnelle au changement du potentiel de membrane et est indépendante du volume des cellules et des variations de la teneur en matière colorante liante dans les cellules.

Bien que les principes établis en chimie permettent le calcul des effets des variations dans les cellules et des concentrations de colo5

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rant dans le milieu sur la concentration intracellulaire de colorant, il est plus simple, en pratique, d'ajuster les dilutions de sorte que les concentrations des cellules et de colorant soient approximativement les mêmes dans tous les échantillons comparés.

Une interférence avec les mesures photométriques du potentiel peut être provoquée par une coloration non spécifique du cytoplasme des cellules mortes où l'intégrité de la membrane a été perdue. Si une petite quantité de colorant normalement imperméable, tel que le bromure d'éthidium ou l'iodure de propidium, est ajoutée au milieu, le noyau de ces cellules à membrane endommagée sera coloré alors que le colorant ne pénétrera pas dans les cellules viables. Si le colorant perméable utilisé pour les mesures du potentiel et le colorant imperméable utilisé pour détecter les dommages à la membrane ont des propriétés optiques différentes, il est possible de faire des mesures corrélatives d'une ou plusieurs propriétés optiques de chaque colorant dans chaque cellule et d'éliminer les cellules endommagées ainsi détectées des analyses ultérieures. Si le colorant perméable utilisé est le diO—C6—(3) préféré, et si le colorant imperméable est l'iodure de propidium, les noyaux des cellules endommagées émettront une fluorescence rouge dans la région 610 nm après excitation à 488 nm. Cette fluorescence peut aisément être distinguée par l'observateur où par des méthodes photométriques de la fluorescence verte du diO—C6—(3).

Des mesures photométriques du potentiel de membrane peuvent être combinées avec d'autres mesures des mêmes cellules pour augmenter le pouvoir analytique de la méthode. Par exemple, la réaction des cellules au cours des différentes phases du cycle de la cellule avec un ligand donné peut être déterminée par une coloration simultanée avec du diO—C6—(3) et avec du fluorochrome d'ADN tel que le composé N° 33342 de Hoechst.

Il est possible de mesurer ces propriétés optiques autres que la fluorescence, par exemple l'absorption, pour obtenir une indication de la quantité de colorant dans les cellules individuelles. Dans ce cas, on préfère utiliser des colorants sous forme d'agrégats intracellulaires avec un maximum d'adsorption à des longueurs d'onde différentes de celles du colorant libre et d'utiliser ces colorants en concentrations suffisamment élevées pour qu'une fraction relativement importante existe dans les cellules sous forme d'agrégats. Cela augmente au maximum la sélectivité de la détection de colorant intracellulaire contre un fond de colorant libre en solution. Les colorants de thiacarbocyanine tel que diéthyl-3,3'- et dipropyl-3,3'-thiadicarbocyanine peuvent présenter cette propriété sous certaines conditions. Lié à des cellules sanguines rouges, le premier colorant est connu comme présentant un nouveau pic d'absorption à environ 590 nm, probablement dû à une complexation du colorant intracellulaire avec l'hémoglobine. L'absorption des cellules à cette longueur d'onde peut être mesurée pour déterminer la quantité de colorant dans les cellules individuelles.

Bien qu'une mesure photométrique de l'absorption des colorants cationiques soit la méthode préférée de mesure des changements du potentiel de membrane, d'autres techniques peuvent être mises en œuvre. Par exemple, même si l'intérieur des cellules non excitables est négatif par rapport à l'intérieur, des colorants anioniques qui ont une affinité pour les solvants à polarité décroissante peuvent être utilisés. Dans ce cas, le colorant aura une affinité pour les constituants intracellulaires malgré sa charge et sera absorbé par la cellule. Sa concentration diminuera lors de l'hyperpolarisation de la cellule et augmentera avec la dépolarisation.

Il est également envisagé que les méthodes non photométriques de détection du potentiel de membrane puissent être employées. De ce point de vue, des changements du potentiel de membrane peuvent être déterminés de manière connue en utilisant un cation marqué à la radioactivité tel que le carbone 14 ou des sels d'ammonium quaternaire ou de phosphonium marqué au tritium. Des détails de ce procédé sont décrits dans «Methods of Enzymology», H.R.

Kaback, Academic Press, 1974 (p. 698). Voir également «Changes in Membrane Potential of Human Granulocytes Antecede the Metabolie Response to Surface Stimulation», in «Proc. Nati., Acad. Sei.»,

vol. 75, No 8, pp. 3818-3822, août 1978 (H.M. Korchak et coli.) et «Biochemistry», 14:25, 1975 (Schuldiner et coll.). L'absorption de ces cations, comme celle des colorants cationiques, est une fonction du potentiel de membrane cellulaire. La radioactivité intracellulaire peut être testée après lavage des cellules en étalant une couche monocellulaire de cellules sur une lame et en exposant la lame à une émulsion photographique. Des comparaisons sont faites, par exemple, en soumettant un échantillon de contrôle au même procédé et en comparant les autoradiographies résultantes. Bien que cette méthode de mesure du changement de potentiel de membrane soit opérationnelle, elle n'est pas préférée, étant donné que des périodes de temps relativement longues sont nécessaires pour exposer l'émul-sion photographique utilisée et la viabilité des cellules n'est pas préservée.

Une autre méthode non photométrique de mesure du potentiel de membrane implique une modification de techniques utilisées dans les compteurs électroniques habituels des cellules. Dans ces appareils, on fait passer les cellules individuelles en suspension en milieu salin au travers d'un orifice intercalé entre une paire d'électrodes qui maintiennent un courant dans la solution en suspension. Le passage d'une cellule au travers de l'orifice fait varier la conductivité de la solution, ce qui résulte en une impulsion de tension détectable. La hauteur de l'impulsion est une indication du volume de la cellule. Etant donné que les membranes des cellules avec des potentiels de membrane différents ont typiquement des conductivités ioniques différentes, des signaux contenant une information indicative des variations de la conductivité ionique des membranes des cellules individuelles passant au travers de l'orifice peuvent être obtenus en utilisant le courant alternatif. Ils peuvent être utilisés pour comparer les potentiels de membrane des cellules individuelles, par exemple à l'aide d'un analyseur d'altitude des impulsions.

Exemple l :

Des lymphocytes de sang périphérique sont obtenus d'un sang de donneur et isolés par centrifugation sur des gradients de densités de Hypaque-Ficoll. Des estimations grossières du pourcentage d'éry-throcytes, monocytes et granulocytes dans les préparations de lymphocytes sont obtenues par analyse cytographique des signaux fluorescents rouge et vert des cellules dans des parties aliquotes colorées à l'acridine orange. Les dénombrements des cellules sont obtenus et la viabilité des cellules est établie par exclusion du trypane bleu.

Des solutions de travail de diO—C6 —(3) peuvent être préparées à partir de solutions stocks de 10-3 M ou 5 x 10-4 M dans de l'éthanol. Les concentrations des solutions de travail doivent être ajustées pour obtenir une concentration finale en colorant entre 10~8Met5xl0_7M pour que 10 ml d'une solution de colorant soient ajoutés à 1,0 ml de cellules diluées dans du milieu 199 (Gibco).

On dissout de la valinomycine (Sigma Chemical Company), un ionophore connu capable d'hyperpolariser les lymphocytes, dans de l'éthanol à une concentration de 0,66 mg/ml. De la gramicidine (ICN), un ionophore connu capable de dépolariser les lymphocytes, est également dissous dans de l'éthanol (0,4 mg/ml). On dissout de la phytohémagglutinine (PHA, Difco, 2 mg/ml) et de la concanavaline A (Con-A, Sigma, 1 mg/ml) dans une solution saline tamponnée au phosphate. PHA et Con-A sont des lectines (ligands) connues comme étant capables de se lier aux lymphocytes périphériques de l'homme.

Avant que toute autre expérience ne soit réalisée, on contrôle les cinétiques de l'absorption des colorants par les cellules. On ajoute 20 ml d'une solution de colorant à 2 ml d'une suspension diluée de cellules contenant 1-2 x 10~5 cellules/ml. La fluorescence des cellules est alors mesurée au moyen d'un cytomètre à débit. Le pic de la distribution de la fluorescence est localisé et sa position est notée à des intervalles de 1 min jusqu'à ce qu'il devienne stable. Cela se produit typiquement dans les 12 min lorsque diO—C6—(3) est utilisé comme indicateur de colorant.

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Des expériences ultérieures sont alors conçues pour maintenir constant l'intervalle entre l'addition de colorant et de lectine ou ionophore et la mesure de la fluorescence, intervalle qui est, de préférence, légèrement plus long que celui observé au moment de l'équilibre. Une période de 15 ou 20 min est convenable pour diO—C6(3) aux concentrations utilisées ici.

Dans une expérience, les distributions de la fluorescence de 5 parties aliquotes de suspension de cellules ont été comparées. Au moment de l'addition du colorant (10 (il de solution de travail de diO—C6—(3)/ml de cellules), on ajoute également respectivement:

a. rien (échantillon de contrôle),

b. PHA (10 ml de solution de travail; concentration finale 20 ng/ml),

c. Con-A (10 ml de solution de travail; concentration finale 10 (ig/ml),

d. valinomycine (10 ml de solution de travail; concentration finale 6 x 10-6 M), et e. gramicidine (10 ml de solution de travail, concentration finale 2xl0-5 M).

Des échantillons sont préparés à des intervalles de 3 à 6 min pour permettre le temps de nettoyage du système de circulation du cytomètre à débit entre les échantillons. Des mesures de la fluorescence de tous les échantillons sont réalisées en utilisant la même puissance du laser et le même facteur d'amplification. Des nombres approximativement égaux de cellules sont mesurés dans chaque échantillon et la distribution de la fluorescence de tous les échantillons est donnée sur la même échelle d'un analyseur d'altitude d'impulsions.

Les résultats de l'expérience sont illustrés dans les fig. 1 à 5. Ces graphiques sont obtenus lorsque la réponse fluorescente des cellules est mesurée 15 min après l'addition du colorant et des lectines ou ionophores. On a utilisé le diO —C6—(3) à une concentration finale de 5 x 10~s M. Dans la fig. 1 (échantillon de contrôle), on peut voir qu'il y a une distribution de la concentration intracellulaire du colorant de cyanine parmi les cellules de la population, indiquée par la distribution de l'intensité de la réponse fluorescente (axe des x). Donc, le potentiel de membrane observé des éléments individuels de la population de cellules varie avant la stimulation. Cependant, les potentiels de membrane sont distribués autour d'un pic indiqué par la ligne A, représentant une sous-population importante de cellules ayant une valeur intermédiaire de potentiels de membrane.

Dans la fig. 2, l'effet de l'addition de l'ionophore dépolarisant gramicidine est montré. Comme on peut le voir, le nombre de cellules présentant une réduction de l'intensité de la fluorescence (induite par l'effet dépolarisant de la gramicidine) est significativement accru et il s'est produit un décalage du pic vers le point indiqué en B. Par opposition, les cellules auxquelles on a ajouté l'ionophore hyperpo-larisant valinomycine (fig. 3) présentent une augmentation de la fréquence des cellules d'intensité de fluorescence supérieure, indiquée en C.

Les distributions de l'intensité de la fluorescence des échantillons traités à la gramicidine et à la valinomycine, par comparaison à l'échantillon de contrôle, donnent une indication de la variation des signaux fluorescents espérés après une dépolarisation et une hyper-

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polarisation maximales. Cet exemple montre que le colorant cationique de cyanine est collecté dans le volume intracellulaire des cellules individuelles comme une fonction du potentiel de membrane.

Exemple 2:

L'effet de l'addition de Con-A aux lymphocytes humains est représenté dans la fig. 4. Comme on peut le voir, la suspension de lymphocytes est hétérogène en ce qui concerne sa réponse à cette lectine. Elle contient une sous-population de cellules qui, par liaison avec Con-A est hyperpolarisée, et une autre qui est dépolarisée. Les cellules hyperpolarisées présentent une augmentation de l'intensité de la fluorescence, comme il est montré en D; les cellules dépolarisées présentent une diminution de l'intensité de la fluorescence montrée par un pic faible mais distinct en D'. La dimension de la population hyperpolarisée est significativement plus importante que celle de la population dépolarisée.

L'addition de PHA aux cellules résulte en une résolution de deux groupes de cellules. La distribution large, bimodale, illustrée dans la fig. 5 indique qu'une sous-population de cellules semble se dépolariser par liaison avec PHA jusqu'à un point tel qu'une réponse fluorescente des cellules individuelles diminue jusqu'à un point indiqué en E. Une seconde sous-population de cellules présente une dépolarisation plus sévère indiquée par une réponse fluorescente également plus basse indiquée en E'.

Exemple 3:

Une solution stock de PHA et diO—C6—(3) est ajoutée à une suspension de cellules lymphocytaires préparée selon l'exemple 1. Un cytomètre à débit est alors réglé pour séparer les cellules ayant une intensité de fluorescence correspondant aux intensités indiquées en E et E' dans la fig. 3. Après une incubation de 15 min, on mesure la suspension dans le cytomètre à débit et on la sépare en trois suspensions cellulaires, dont deux sont riches en cellules homogènes par rapport à leur réponse physiologique lors de la liaison avec PHA.

Exemple 4:

Les populations de lymphocytes enrichies en cellules B et enrichies en cellules T (de pureté environ 85%) sont obtenues en refaisant les essais pour leur sensibilité à PHA. La fig. 6 montre la distribution de la réponse de fluorescence des cellules T dans la suspension avant l'addition de la lectine; la fig. 7 montre la distribution de la réponse fluorescente de la même suspension de cellules 20 min après l'exposition à PHA dans la solution stock de l'exemple 1.

Comme il est montré, l'addition de cette lectine résulte en une dépolarisation uniforme de lymphocytes T. Par opposition, comme il est montré dans la fig. 8 (contrôle) et dans la fig. 9 (25 min après addition de PHA), les cellules B subissent une hyperpolarisation uniforme résultant des interactions PHA-récepteurs. Ces résultats démontrent que le procédé selon l'invention peut être utilisé pour comparer la réponse physiologique de différents types de cellules envers un ligand donné. Il démontre également que différents types de cellules peuvent être distingués en fonction de leur réponse physiologique à un ligand.

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REVENDICATIONS

1. Procédé d'évaluation biologique, caractérisé par les étapes qui consistent à:

a) déterminer une propriété caractéristique de cellules individuelles parmi une sous-population de cellules non excitables représentative du potentiel de membrane de celles-ci suivant un processus non intrusif et b) comparer cette propriété caractéristique des cellules à une propriété caractéristique de référence pour mesurer les différences dans le potentiel de membrane de ces cellules individuelles.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape a) consiste à:

A) incuber les cellules avec un colorant qui s'associe aux cellules individuelles, et

B) mesurer une propriété optique du colorant associé aux cellules individuelles, cette propriété optique mesurée étant indicative du potentiel de membrane de cellule des cellules individuelles.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape a) consiste à:

A) incuber ces cellules avec un colorant ionique perméable à la membrane cellulaire, et

B) mesurer une propriété optique de ces cellules, cette propriété optique étant représentative de la concentration intracellulaire du colorant, et déterminer cette caractéristique cellulaire à partir de cette propriété optique.
4. Procédé selon l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que ces cellules sont modifiées avant de mesurer cette propriété optique de sorte qu'un changement du potentiel de membrane cellulaire se produit avant de mesurer cette propriété optique.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que cette modification est d'ordre pharmacologique, chimique ou biologique.
6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que cette étape de modification consiste à incuber ces cellules dans une solution de ligands sous des conditions où les récepteurs cellulaires et les ligands se lient l'un à l'autre.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que ces ligands sont choisis parmi les neurotransmetteurs, les hormones, les agents pharmacologiques, les agonistes et antagonistes naturels ou synthétiques de ceux-ci, les antigènes, les anticorps, les haptènes, les allergènes, les composants de complément et des combinaisons de ceux-ci.
8. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que cette modification cellulaire est d'ordre physique.
9. Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que cette étape de modification précède l'incubation.
10. Procédé selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que cette étape de modification succède à cette incubation.
11. Procédé selon l'une des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que cette caractéristique de référence est une valeur représentative d'une concentration prédéterminée de colorant et cette étape de comparaison détermine la différence de la valeur de cette concentration de colorant mesurée et de cette concentration prédéterminée.
12. Procédé selon l'une des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que cette caractéristique de référence est une valeur représentative d'une concentration prédéterminée de colorant, et cette étape de comparaison détermine le sens du changement de la différence de valeur de cette concentration de colorant mesurée et cette concentration prédéterminée.
13. Procédé selon l'une des revendications 2 à 10, caractérisé en ce que cette caractéristique de référence est une série de valeurs représentatives de cette concentration prédéterminée en fonction du temps, et cette étape de comparaison détermine les différences des valeurs de cette concentration mesurée et cette concentration prédéterminée en fonction du temps.
14. Procédé selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que ce colorant est un colorant fluorescent et en ce que cette étape de mesure du colorant comprend la mesure de la fluorescence pour une ou plusieurs cellules individuelles.
15. Procédé selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que ce colorant est un colorant fluorescent et en ce que cette étape de mesure du colorant consiste à mesurer le décalage spectral de la fluorescence pour une ou plusieurs cellules individuelles.
16. Procédé selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que cette étape de mesure du colorant comprend la mesure de l'absorption optique pour une ou plusieurs cellules individuelles.
17. Procédé selon l'une des revendications 2 à 13, caractérisé en ce que cette étape de mesure du colorant comprend la mesure du décalage spectral de l'absorption optique d'une ou plusieurs cellules après agrégation de ce colorant.
18. Procédé selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que ce colorant est un colorant fluorescent cationique ayant un rendement quantique de fluorescence augmentant dans les solvants ayant une polarité décroissante.
19. Procédé selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que le colorant est un colorant fluorescent cationique de cyanine.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le colorant est un sel de dihexyl-3,3'-oxa-2,2'-carbocyanine.
21. Procédé selon l'une des revendications 14 ou 15, caractérisé en ce que la concentration du colorant dans la solution intracellulaire est telle qu'on minimise l'extinction de la fluorescence intracellulaire par formation de complexes de fluorescence réduite.
22. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21, pour détecter la présence de cellules ayant des récepteurs complémentaires à un ligand spécifique choisi dans une pluralité de cellules hétérogènes par rapport à la spécificité du ligand, caractérisé en ce qu'elle consiste à incuber cette pluralité de cellules avec une solution contenant ce ligand spécifique sous des conditions où les récepteurs cellulaires complémentaires et le ligand se lient l'un à l'autre, la présence de ces cellules ayant des récepteurs complémentaires à ce ligand étant indiquée par un changement du potentiel de membrane de ces cellules.
23. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 pour détecter la présence dans une population de cellules ayant des sites de récepteurs complémentaires à un ligand choisi mais une réponse physiologique différente à celui-ci, caractérisé en ce qu'il consiste à incuber cette population de cellules avec une solution contenant ce ligand choisi pour induire des changements de potentiel de membrane dans cette cellule de valeur distincte ou de sens distinct dans ces cellules.
24. Procédé selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que des cellules présentant des changements de potentiel de membrane similaires sont séparées pour produire une population de cellules riches en cellules sensibles à ce ligand choisi.
25. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 pour la comparaison de la réaction physiologique d'une population de cellules exposée à une pluralité de ligands chimiquement distincts, caractérisé en ce qu'il consiste à incuber des échantillons de cette population de cellules avec les ligands respectifs sous des conditions où les récepteurs et les ligands se lient l'un à l'autre, et observer les changements du potentiel de membrane dans les cellules individuelles des échantillons de cellules respectifs.
26. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 pour la détermination des effets cumulatifs en exposant une pluralité de ligands chimiquement distincts à une population de cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à incuber les ligands et la population de cellules sous les conditions où les récepteurs cellulaires complémentaires et le ligand se lient l'un à l'autre.
27. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 pour la détermination de la viabilité d'une population de cellules après exposition à une toxine de cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à incuber la population de cellules avec cette toxine.
28. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21 pour détermination de l'effet sur une population de cellules de l'exposition à un nutritif pour des cellules, caractérisé en ce qu'il consiste à incuber cette population de cellules avec cet agent nutritif.

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29. Procédé selon l'une des revendications 2 à 21, caractérisé en ce que les cellules sont incubées avec deux ou plusieurs de ces colorants et la propriété optique est représentative de ce rapport de concentrations intracellulaires de ces colorants.
30. Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 21 pour détecter la présence d'un ligand dans une solution, caractérisée en ce qu'elle comprend l'incubation d'une ou plusieurs cellules non excitables connues pour contenir un récepteur lié à la membrane complémentaire au ligand, cette solution étant sous des conditions où le ligand et le récepteur se lient l'un à l'autre, la présence de ce ligand dans cette solution étant indiquée par un changement du potentiel de membrane dans les cellules contenant ce récepteur.