NL7915051A - Een biologische analyse-methode. - Google Patents

Description

79 1 5 0 5 1 -ΖΓ Ν.Ο. 29.292

Een biologische analyse-methode

De onderhavige uitvinding betreft een biologische analyse-methode en meer in het bijzonder een werkwijze voor het bepalen en meten van cellulaire reactie op bepaalde extra-cellulaire produkten.

5 Het is reeds lang bekend, dat het inwendige van dier en plantencellen elektrisch negatief is met betrekking tot het uitwendige. De grootte van dit potentiaalverschil is in het algemeen tussen 5 en 90 mV, waarbij het grootste deel van de potentiaal ontwikkeld is door het celmembraan.

10 Celmembraanpotentialen veranderen op verschillende wij zen met de fysiologische toestand van de cel. Aangezien het verbruik van metabolische energie vereist is om de potentialen te handhaven, wordt de potentiaal door het membraan van een gekwetste of stervende cel in grootte verminderd.

15 Meer specifieke veranderingen in de membraanpotentiaal vinden plaats binnen minuten volgende op de wisselwerking van cellen met een grote verscheidenheid produkten of liganden, die met relatief grote affiniteit binden aan specifieke transmembraanreceptoren.

20 In relatie tot liganden en receptoren hebben recente vooruitgangen in de cellulaire biologie aangetoond, dat een basisvorm van communicatie tussen de cellen van multi-cel-lulaire levende systemen wordt teweeg gebracht door extra-cellulaire liganden of chemische boodschappers. Deze chemi-25 sche boodschappers komen zowel voort uit gespecialiseerde weefsels binnen het organisme als uit uitwendige bronnen.

Hun chemische structuren en actie-plaatsen variëren ruim.

Zij kunnen een invloedszone hebben zo klein als enkele honderden angstrom (bijvoorbeeld de neuromusculaire ver-50 binding) of door het hele organisme (door bloed aangevoerde boodschappers zoals hormonen).

Als resultaat van recent biochemisch onderzoek op dit gebied, is nu vastgesteld, dat vele van deze chemische boodschappers een scheidingsvlak hebben met de cel, die de 35 boodschap ontvangt door selectieve koppeling aan receptoren, die op het uitwendige van de cel gelegen zijn. Klaarblijkelijk herkent de receptor de chemische boodschapper 7915051 2 op basis van de stereochemie ervan en/of de ruimtelijke verdeling van zijn geladen of chemisch actieve groepen.

Het ligand en de receptor worden dus non-covalent gebonden volgens een "slot-en-sleutel" verband. Als gevolg van de 5 binding heeft een intracellulaire biochemische of biofysi-sche verandering plaats, die de cel er toe beweegt een of ander metabolisch of fysiologisch proces te beginnen of te beëindigen. Tot liganden behoren produkten zoals acetylcholine, epinefrine en norepinefrine (neurotransmittoren), 10 insuline, groei hormoon en thyrotropine (hormonen), histamine, antigenen, proteïnen van het immuun systeem of proteïnen daarvan, vira, bacteria, bepaalde toxinen en sperma. Voor vele van deze produkten bestaat er een natuurlijke of synthetische antagonist, dat wil zeggen een produkt, dat 15 het fysiologische effect van het overeenkomstige produkt ervan kan omkeren, of aan receptoren bindt, waardoor binding van het natuurlijke produkt uitgesloten wordt. Natuurlijke of synthetische agonisten zijn eveneens bekend. Een agonist is een produkt, dat aan de receptor bindt, om een 20 fysiologisch cellulaire reactie te initiëren, soortgelijk aan die van het natuurlijke ligand. Vele geneesmiddelen, die thans op gebruikelijke wijze worden toegepast in de praktijk van de geneeskunde zijn agonisten of antagonisten van natuurlijke liganden.

25 In vele gevallen kunnen de gebeurtenissen, die plaats hebben in cellen volgend op de binding van ligand aan specifieke receptoren, gedupliceerd worden door reactie van de cellen met andere produkten, die aan de receptoren binden, bijvoorbeeld met bepaalde planten lectinen of met 30 antilichaam bereid tegen geïsoleerde receptoren. Het is eveneens mogelijk celreacties van dit type te initiëren door de toevoeging van middelen, die de membraanpotentiaal in dezelfde richting veranderen als plaats heeft na ligand-receptor-wisselwerking.

35 Een snelle en betrouwbare methode voor het bepalen en meten van het intracellulaire effect van een ligand-receptor wisselwerking zou een betekenisvol nut hebben bij biochemisch onderzoek en diagnostische beproeving. Vanwege de verscheidenheid van specifieke hoedanig-40 heden van de receptor onder overigens homogene celpopula- 7915051 3 ties en vanwege het enorme aantal verschillende chemotac-tische middelen, zou een dergelijke proef op ideale wijze in staat zijn afzonderlijke cellen te analyseren.

Verschillende directe en indirecte methoden voor het 5 bepalen van ligand-receptor-wisselwerkingen zijn in de techniek bekend. Bij een groep methoden worden radioactief of fluorescerend gemerkte liganden toegepast. Deze worden geïncubeerd met een celsuspensie en na wassen ter verwijdering van niet-gebonden liganden wordt de radio-10 activiteit of fluorescentie van de celmassa geanalyseerd,

De eis van ge^merkte liganden stelt ernstige beperkingen aan het gebruik van deze techniek. Bij een andere klasse _ bepalingsmethoden van de stand der techniek wordt gebruik gemaakt van de waarneming, dat ligand-recep-15 torwisselwerkingen vaak vergezeld gaan door toenamen in de intracellulaire desoxyribonucleïnezuur (DNA) synthese.

In bepaalde systemen kunnen, na het binden van liganden aan receptor, dat wil zeggen nadat lymfocyten zijn gestimuleerd met antigeen of mitogenen, zoals fytohemagglutini-20 ne, DNA niveaus gemeten worden en vervolgens vergeleken met het het DNA niveau van een vergelijkbare celmassa, waarin geen ligand-receptor wisselwerking heeft plaats gevonden. Het relatieve niveau van DNA verschaft een maatstaf voor de ligand-receptor wisselwerking. Deze techniek is in ge-25 bruiksmogelijkheden beperkt omdat DNA synthese in het algemeen niet vele uren of zelfs dagen na de ligand-binding bepaalbaar is.

Nog een andere groep methoden voor het bepalen van bepaalde typen ligand-receptor-wisselwerking 30 is gebaseerd op veranderingen in de "gestructureerdheid van de cytoplasma-achtige matrix" zoals bepaald door meting van de polarisatie van fluorescentie van intracellulair fluoresceïne. Om volgens dergelijke methoden geanalyseerd te worden dienen cellen het vermogen te hebben intracellu-35 lair fluoresceïne te produceren door enzymatische hydrolyse van fluoresceïne-diacetaat of een soortgelijke verbinding. Deze methoden zijn technisch moeilijk uit te voeren en de resultaten zijn moeilijk te interpreteren. Voorts vereist de methode metabolische modificatie van een reagens 40 door de cellen, die onder onderzoek zijn.

7915051 -------- 4

Terwijl het reeds decaden bekend is, dat prikkelbare cellen, zoals neuronen en spiercellen, een snelle verandering in membraanpotentiaal ondergaan, indien gestimuleerd met een neurotransmitter, werd pas onlangs duidelijk, dat 5 de membraanpotentiaalveranderingen, teweeg gebracht door fysiologische stimuli, niet beperkt zijn tot deze gespecialiseerde cellen. Door microelektroden in niet-prikkel-bare cellen op te nemen, hebben onderzoekers vastgesteld, dat membraanpotentiaalveranderingen verbonden zijn met hun 10 ligand-receptor wisselwerkingen. In feite werd waargenomen, dat de fysiologische gebeurtenissen, die plaats hebben in niet-prikkelbare cellen volgend op de binding van een ligand aan een receptor, soms gedupliceerd kunnen worden door de toevoeging aan de celsuspensie van middelen, die 15 de membraanpotentiaal in dezelfde richting wijzigen, als plaats heeft na ligand-receptor-binding. Verder onderzoek heeft nieuwe technieken ontwikkeld voor het waarnemen van dergelijke veranderingen. Bijvoorbeeld is een fotometrische methode voor de meting van veranderingen in membraan-20 potentiaal in massa-cel-suspensies beschreven door P.J. Sims c.s. (Biochemistry, 1.2., No. 16, (1974), blz. 3315)· Volgens deze methode wordt de celsuspensie geïncu-beerd met een cyanine of andere kleurstof, die positief geladen is en in staat is door de lipide-laag van celmem-25 branen te gaan. De verhouding van intracellulaire tot extracellulaire kleurstofconcentratie verandert met veranderingen in celmembraanpotentiaal: wanneer de cellen hyper gepolariseerd worden, dat wil zeggen als de binnenkant van de cellen negatiever worden, treden meer kleurstofmoleculen 30 de cellen binnen. Volgens de Sims c.s. methode worden deze kleurstoffen in zodanige concentraties gebruikt, dat intracellulaire kleurstofmoleculen niet fluorescerende aggregaten vormen en de fluorescentie van de vrije kleurstof in het suspenderingsmilieu wordt gemeten tegen de meer donkere 35 achtergrond van de cellen. Deze fluorescentie vermindert met ftyperpolarisatie van de cellen. Wanneer slechts een kleine fractie van de cellen in een suspensie gevoelig is voor een gegeven ligand, is het slechts deze fractie, die een verandering in membraanpotentiaal vertoont. In dit ge-40 val zal de kleurstofconcentratie in het milieu niet merk- 7915051 5 baar veranderen en er zal dus geen "bepaalbare verandering in de fluorescentie van extra cellulaire kleurstof zijn. In elk geval kan deze methode niet afzonderlijke cellen, die gevoelig zijn voor het ligand, iden-5 tificeren.

W.N. Ross c.s. hebben in Journal of Membrane Biology, 55« (1977)» 141 het gebruik van merocyanine ., oxonol en cyanine-kleurstoffen beschreven voor het meten van snelle veranderingen van de membraanpotentiaal in prikkelbare cel-10 len, zoals de reuze axonen van het pijl-inktvis-zenuwsy-steem. Lineaire veranderingen in absorptie, fluorescentie, dichroisme en dubbelbreking van de kleurstoffen bleken gebonden te zijn aan veranderingen in de membraanpotentiaal. De kleurstoffen, die voor deze metingen het meest geschikt 15 zijn, zijn merocyaninen, die negatief geladen zijn en dus niet gemakkelijk door celwanden dringen. In het algemeen kleuren deze kleurstoffen geen celmembranen anders dan die van prikkelbare zenuw- en spiercellen. Van merocyaninen is waargenomen, dat zij bepaalde niet prikkelbare celmembra-20 nen kleuren, bijvoorbeeld onvolwassen of leukemische bloedcellen. Gebleken is echter, dat een dergelijke verkleuring onafhankelijk van veranderingen in de celmembraanpotentiaal plaats heeft.

Het is een oogmerk van de uitvinding een biologische 25 analyse-methode te verschaffen op basis van niet-storende meting van veranderingen in de membraanpotentiaal in afzonderlijke cellen. Een ander oogmerk is het verschaffen van een snelle, gevoelige en veelzijdige methode van biologische analyse gericht op het bepalen van het voorko- 50 men van en voorspellen van de cellulaire reactie op,ligand-receptor-wisselwerkingen. Nog een ander oogmerk is het bepalen van ligand-receptor-wisselwerkingen in afzonderlijke, niet-prikkelbare cellen. Andere oogmerken zijn het verschaffen van nieuwe technieken voor het uitze-55 ven van potentieel actieve geneesmiddelen, voor het diagnostisch vaststellen van het fysiologisch verkeerd functioneren van weefsels en voor het onderzoeken van allergie en weef s elverenigbaarheid.

De uitvinding verschaft een biologische analyse-metho-40 de gekenmerkt door de trappen van: (a) bepaling van een 7 9 1 5 0 5 t 6 kenmerk van afzonderlijke cellen van een of meer niet-prikkelbare cellen, die representatief zijn voor de membraanpotentiaal ervan volgens een niet-storende methode; en (b) vergelijking van een dergelijk celkenmerk met een 5 referentiekenmerk voor het bepalen van ver schillen in de membraanpotentiaal van dergelijke afzonderlijke cellen.

Uitvoeringsvormen van de uitvinding verschaffen een snelle en gevoelige, niet storende methode voor het 10 bepalen van celmembraanpotentiaalveranderingen in niet-prikkelbare cellen en voor het voorspellen van de fysiologische reactie van niet-prikkelbare cellen op modi-catie door fysische, farmacologische, biologische of chemische middelen. Bij één uitvoeringsvorm wordt de poten-15 tiaalverandering veroorzaakt door ligand-receptor-wissel-werking. Bij een andere uitvoeringsvorm is de verandering niet specifiek, zoals plaats heeft na beschadiging aan de cellen.

In de eerstgenoemde situatie is de methode gebaseerd 20 op de waarneming, dat terwijl de fysiologische reactie van een gegeven cel op de binding van een specifiek ligand vaak moeilijk of onmogelijk is te bepalen en vaak niet tot uren of dagen na de wisselwerking plaats heeft, een verandering in de ionvloeiing door het membraan van de cel en 25 resulterende verandering in de membraanpotentiaal plaats heeft in korte tijd, gewoonlijk minder dan een uur. De benadering van deze uitvoeringsvorm van de uitvinding houdt de bepaling in van een kenmerk van afzonderlijke cellen, dat representatief is voor de membraanpotentiaal ervan, 30 vergelijking van het kenmerk met een referentiekenmerk voor het bepalen van verschillen in membraanpoten tiaal en het gebruik van de waargenomen veranderingen als een markeringsmiddel, dat indicatief is voor het voorkomen van een ligand-receptor-wisselwerking. Met het oog op het 35 grote aantal produkten, dat activiteit vertoont als chemische boodschappers, de waargenomen verscheidenheid van re-ceptorplaatsen op afzonderlijke cellen van een gegeven cel-populatie en de verscheidenheid van fysLoHogisde reactie van afzonderlijke cellen op specifieke liganden, is het een 40 belangrijk kenmerk, dat de reactie van afzonderlijke cellen 7915051 7 (in tegenstelling tot massa-suspensies) aan de blootstelling van liganden kwalitatief bepaald wordt.

Er worden derhalve processen verschaft: 1) voor het bepalen van de aanwezigheid of afwezigheid van specifieke 5 receptoren voor een gegeven ligand op sommige of alle cellen in een celpopulatie; 2) voor het bepalen van de aanwezigheid of afwezigheid in een mengsel van produkten van een specifiek ligand, waarvan de wisselwerking met leden van een gegeven celpopulatie bekend is; 3) voor het bestuderen van 10 de cumulatieve effecten van combinaties van liganden op cellen; 4) voor het vergelijken van de effecten van twee of meer liganden op een gegeven celpopulatie en 5) voor het vaststellen van een indicatie van de fysiologische toestand van een celpopulatie of subpopulatie na blootstelling aan 13 een verdacht toxine of ander produkt. Aangezien verschillende van de methoden, gebruikt voor het . bepalen van veranderingen in de membraanpotentiaal non-destructief zijn, kunnen de methoden gebruikt worden in combinatie met celrangschikking voor het voortbrengen van celpopulaties, 20 die rijk zijn aan cellen met gewenste specifieke receptor-hoedanigheden, terwijl de levensvatbaarheid van de cel bewaard blijft.

Volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding worden niet prikkelbare cellen, gewoonlijk in suspensie, in aan-25 raking gebracht met een oplossing, die een of meer actieve liganden bevat of vermoedelijk bevat. Het mengsel wordt ge-incubeerd onder omstandigheden, waaronder celreceptoren en liganden complementair binden voor het teweeg brengen van een fysiologische verandering in de cellen, waarop binding 30 plaats heeft. Voor, na of tijdens de incubatie wordt een kenmerk representatief voor de celmembraanpotentiaal van afzonderlijke cellen bepaald. Dit bepaalde kenmerk wordt vergeleken met een referentiekenmerk voor het bepalen van veranderingen in de mem- 35 braanpotentialen en voor het verkrijgen van bruikbare informatie.

De aanwezigheid of afwezigheid van een gegeven ligand in een oplossing kan bepaald worden door incubatie van de oplossing met een celpopulatie, die ten minste een subpo-40 pulatie bevat, waarvan bekend is dat receptoren aanwezig 7915051 8 zijn voor het ligand in kwestie, het bepalen van veranderingen in de celmembraanpotentiaal in elk van de cellen, die de populatie uitmaken en vergelijking van de verdeling van eventuele membraanpotentiaalveranderingen on-5 der de cellen met de resultaten bijvoorbeeld van een referent iekenmerk, dat de resultaten bevat van dezelfde analyse-proef in parallel met het proefmonster, dat een authentiek monster van het betreffende ligand bevat. Een indicatie van de ligandconcentratie in het onbekende kan ook aan deze 10 techniek ontleend worden.

De aanwezigheid en frequentie van cellen, die reactief zijn met een bekend ligand in een heterogene celpopulatie kunnen op een soortgelijke wijze bepaald worden door vergelijking van veranderingen in de membraanpotentiaal onder 15 leden van de populatie. Door combinatie van deze techniek met bekende methoden van celrangschikking, kan de onderzoeker celpopulaties verkrijgen, die relatief homogeen zijn met betrekking tot de gevoeligheid tot een specifiek ligand.

Bij een andere uitvoeringsvorm kan de fysiologische 20 reactie van een niet prikkelbare celpopulatie aan de blootstelling van twee of meer chemisch verschillende liganden voorspeld en vergeleken worden door incubatie-oplossingen van respectievelijke liganden in meervoudige celmonsters, het registreren van richting, grootte en/of tijdsverloop 25 van veranderingen in membraanpotentiaal in afzonderlijke cellen in respectievelijke celmonsters en vervolgens het vergelijken van metingen, die in de respectievelijke monsters zijn gedaan. Deze techniek kan bijvoorbeeld gebruikt worden om synthetische produkten uit te zeven, waarvan ver-30 moed wordt dat zij agonistisch of antagonistisch zijn met betrekking tot het natuurlijke ligand en voor het bepalen van variatie in cellulaire reactie van soortgelijke cellen op functioneel of structureel verwante liganden.

In een andere uitvoeringsvorm kan het cumulatieve ef-35 feet van blootstelling van twee of meer chemisch verschillende liganden aan een populatie van niet prikkelbare cellen snel geanalyseerd worden door de liganden en celpopulatie te incuberen, veranderingen in de cel- membraanpotentiaal in afzonderlijke cellen te bepalen en 40 de bepaalde potentiaalveranderingen bijvoor- 7915051 9 beeld te vergelijken, met parallel verkregen resultaten met de afzonderlijke liganden, of een registratie van de vooraf bepaalde cellulaire reactie op een of meer van de afzonderlijke liganden. Op deze wijze kunnen geneesmiddelen, die 5 zich ten opzichte van natuurlijke liganden gedragen als agonisten of antagonisten en een indicatie van hun optimum dosering ontdekt worden.

In nog een andere uitvoeringsvorm worden de toxische effecten van verschillende middelen op cellen geëvalueerd 10 door meting van de membraanpotentiaal na blootstelling aan dergelijke middelen. De membraanpotentiaal van een beschadigde cel dient nul te bereiken binnen de limiet, waarbij het membraan wordt doorbroken. Mindere maten van beschadiging zijn bepaalbaar door een afname in de 15 grootte van de membraanpotentiaal in vergelijking tot onbeschadigde cellen.

Verschillende niet-storende methoden worden beoogd voor gebruik in het ' bepalen en meten van de membraanpotentiaal in afzonderlijke niet prikkelbare cellen. 20 De methode, die thans de voorkeur verdient, houdt het gebruik in van hetzij membraan doordringende of membraan gebonden kleurstoffen, die zich verenigen met afzonderlijke cellen en bepaalbare kenmerken hebben, die ver ander si in reactie op veranderingen in de membraanpotentiaal. 25 Zo zijn ionogene, celmembraan doordringende kleurstoffen, indien geïncubeerd met de cellen, snel in evenwicht tussen tegengestelde zijden van celmembranen als een functie van de membraanpotentiaal. Een meting, die indicatief is voor de intracellulaire kleurstofconcentratie wordt vervolgens 30 uitgevoerd door fotometrische meting van de fluorescentie, absorptie of andere optische eigenschap >van de kleurstof binnen de afzonderlijke cel en van zulke andere kenmerken van de afzonderlijke cel (bijvoorbeeld celvolume), die bekend moeten zijn om de intracellulaire kleurstofconcentra-35 tie te bepalen. Wanneer de te vergelijken cellen homogeen zijn met betrekking tot het volume, zal de meting representatief voor de hoeveelheid van de intracellulaire kleurstof evenredig zijn met de membraanpotentiaal. De fotometrische meting kan tot stand worden gebracht volgens gebruikelijke 40 microfotometrie of door stromingscytometrie. Wanneer de te 7915 o 51 10 meten optische eigenschap fluorescentie is, wordt de kleurstof hij voorkeur gekozen uit die kleurstoffen, die gekenmerkt worden door toenemende fluorescentie kwantum efficiency in oplosmiddelen van afnemende polariteit, en de concen-5 tratie van kleurstof in het milieu wordt zodanig geselecteerd, dat intracellulaire fluorescentie inactivering door de vorming van complexen van verminderde fluorescentie tegengegaan wordt. Fluorescerende kleurstoffen, die de voorkeur verdienen, zijn kationogene cyanine-kleurstoffen, zo-10 als 3-3'-dihexy1-2.2'-oxacarbocyanine (di0-Cg-(3)).

Er volgt nu een beschrijving, die gelezen dient te worden onder verwijzing naar de bijgevoegde tekeningen van uitvoeringsvormen van de uitvinding. Deze beschrijving wordt alleen gegeven bij wijze van voorbeeld en niet bij 15 wijze van beperking van de uitvinding.

In de bijgevoegde tekeningen: is Fig. 1 een grafische voorstelling van de verdeling van cellulaire fluorescentie-intensiteit van een eerste evenmatig deel van een menselijke lymfocytcelsuspensie geïncu-20 beerd met een 5 x 10-¾ concentratie van 3*3'-dihexyl-2.21-oxacarbocyanine (diO-Cg-(3)). In deze en de volgende grafische voorstellingen, stelt de vertikale as het aantal cellen met een bijzondere intensiteit en de horizontale as de fluorescentie-intensiteit voor; 25 is Fig. 2 een grafische voorstelling van de verdeling van cellulaire fluorescentie-intensiteit van een tweede evenmatig deel van de celsuspensie gelijktijdig geïncubeerd met 2 x 10-¾ concentratie depolariserend ionöfore gramici-dine en 5 x 10-% concentratie diO-Cg-(3); 30 is Fig. 3 een grafische voorstelling van de verdeling van de cellulaire fluorescentie-intensiteit in een derde evenmatig deel van de celsuspensie gelijktijdig geïncubeerd met 6 x 10-¾ concentratie van het hyperpolariserend iono-fore valinomycine en 5 x 10-¾ concentratie di0-0^-(3); 35 is fig. 4· een grafische voorstelling van de verdeling van de cellulaire fluorescentie-intensiteit van een vierde evenmatig deel van de celsuspensie gelijktijdig geïncubeerd met een 10pg/ml oplossing van het ligand concanavaline A en 5 x 10-¾ concentratie diO-Cg-(3); 4-0 is Fig. 3 een grafische voorstelling van de verdeling 7915051 11 van de cellulaire fluorescentie-intensiteit van een vijfde evenmatig deel van de celsuspensie gelijktijdig geïncubeerd met een 20 μg/ml oplossing van het ligand fytohemagglutine en 5 x 10-¾ concentratie di0-Cg-(3); 5 is Pig. 6 een grafische voorstelling van de verdeling van de cellulaire fluorescentie-intensiteit van een aantal cellen met een gegeven fluorescentie-reactie versus fluorescentie-intensiteit uitgevoerd met een evenmatig deel

O

T lymfocyten in evenwicht zijnde met 5 x 10 M concentra-10 tie di0-Cg(3); is Pig. 7 een grafische voorstelling van de verdeling van de cellulaire fluorescentie-intensiteit van de T lymfocyten-suspensie van fig. 6 twintig minuten na toevoeging van fytohemagglutinine voor het verschaffen van een 15 concentratie van 20 jug/ml, die het depolariserende effect laat zien van dit lectine op een subpopulatie van de T cellen; is Pig. 8 een grafische voorstelling van de verdeling van de cellulaire fluorescentie-intensiteit van een 20 B lymfocyt-celsuspensie in evenwicht zijnde met 5 x 10-¾ concentratie diO-Cg(3); en is Pig. 9 een grafische voorstelling, die het hyper-polariserende effect laat zien van fytohemagglutinine op de 25 B cellensuspensie van fig. 8 vijfentwintig minuten na toevoeging van fytohemagglutinine tot een concentratie van 20 μ-g/ml.

Alle voorafgaande grafische voorstellingen werden uitgevoerd met een stromingscytometer (cytofluorograaf, Ortho 30 Instruments) verbonden met een pulshoogte-analysator.

De werkwijze houdt het gebruik in van niet prikkelbare cellen, dat wil zeggen, cellen anders dan van spier- en zenuwweefsel. De cellen, die betrokken zijn bij de analyse volgens de onderhavige methode worden geïsoleerd volgens 35 gebruikelijke technieken en gesuspendeerd in een milieu, dat in staat is normaal cellulair metabolisme te verdragen, bijvoorbeeld een uitgebalanceerde, met zuurstof behandelde, isotone zoutoplossing gebufferd tot een pH van 7»2 - 7»6 en glucose of andere voedingsmiddelen en ongeveer fysiolo- 4-0 gische concentraties van natrium-, kalium- calcium- en mag- 7915051 12 nesiumion bevat. Bij voorkeur dienen de cellen vrij te zijn van vreemd proteïne (albumine, enz.) en andere produkten met een sterke affiniteit voor kleurstoffen van het type, dat gebruikt wordt om membraanpotentiaalveranderingen kwa-5 litatief te bepalen volgens de hierna beschreven bepalings-techniek, die de voorkeur verdient.

Zoals vereist door de oogmerken van de uit te voeren proef, kunnen de cellen een populatie bevatten, die relatief homogeen is met betrekking tot de fysiologische func-10 tie (bijvoorbeeld T lymfocyten) of met betrekking tot de ligand specificiteit (bijvoorbeeld mastcellen, die gevoelig zijn voor IgE allergeen complexen). Indien vereist kunnen de cellen verdeeld worden in meervoudige evenmatige hoeveelheden, zodat verschillende bepalingen van de membraan-15 potentiaal naast elkaar kunnen worden uitgevoerd. De mem-braanpotentiaal van cellen in elk evenmatig deel wordt vervolgens bepaald na blootstelling bijvoorbeeld aan een oplossing van verschillende liganden, verschillende concentraties van een enkel type ligandeof een ligand-rvrije op-20 lossing, zodat een vergelijking kan worden gemaakt. De oplossing, waaraan de cellen worden blootgesteld, kan, afhankelijk van de oogmerken van de proef, een onbekende, waarvan vermoed wordt dat deze een ligand bevat, dat specifiek is voor cellen in het monster, een authentiek monster van 25 een bekend ligand van een bekende of onbekende concentratie, een onzuiver ligandpreparaat of een oplossing, die een produkt bevat, waarvan vermoed wordt dat het toxisch is ten opzichte van de cellen of een subpopulatie daarvan, bevatten.

30 Naast de bepaling van het voorkomen van ligand-receptor-binding, is de techniek in staat de volgende categorieën informatie vast te stellen: 1) de aanwezigheid van een subpopulatie van cellen in de suspensie met membraanoppervlakreceptoren, die complemen- 35 tair zijn ten opzichte van een specifiek ligand; 2) de aanwezigheid in een oplossing van een specifiek type ligand, dat in staat is met receptoren te binden, die aanwezig zijn op cellen in de suspensie of een subpopulatie daarvan; 40 3) het cumulatieve effect van multipele liganden, die in 7915051 15 wisselwerking treden met een gegeven celpopulatie; 4) een vergelijking van de reactie van een celpopulatie of subpopulatie daarvan op verschillende typen liganden; 5) het effect van cel levensvatbaarheid van verschillen-5 de concentraties van toxische produkten, of 6) de stimulering van cel metabolisme door verschillende concentraties voedingsmiddelen, zoals aminozuren of suikers.

Met betrekking tot systemen, die ligand-receptor-wis-selwerkingen inhouden, wordt de informatie verkregen door 10 incubatie van de cellen met de ligand-op los sing gedurende een voldoende tijdsperiode en bij een geschikte temperatuur (bijvoorbeeld de normale temperatuur van de cellen in hun natuurlijke omgeving) om het voorkomen van ligand-receptor-wisselwerkingen en een resulterende verandering in ion-15 stroming door de celmembranen mogelijk te maken. Een kenmerk, representatief voor de membraanpotentiaal van elke cel in de suspensie of elke cel in een representatief evenmatig deel van de suspensie wordt vervolgens verkregen, desgewenst met intervallen, zodat een profiel van de potentiaal-20 verandering met de tijd verkregen wordt.

Het gemeten kenmerk wordt vervolgens vergeleken met een referentie-kenmerk om vast te stellen of een ligand-receptor-wisselwerking heeft plaats gevonden, of de richting, grootte of tijdsverloop van de veranderingen de ver-25 anderingen opgewekt in de cellen bij blootstelling aan een bekend ligand nabootsen of antagoneren of het cumulatieve effect op de membraanpotentiaal van de twee of meer liganden verschillen van die van een enkelvoudig ligand of een verschillend mengsel van liganden.

50 De aard van het referentiekenmerk zal noodzakelijker wijze variëren afhankelijk van de specifiek gezochte informatie. Zoals hiervoor vermeld kan het de resultaten van een of meer parallel uitgevoerde analyses met het proefmonster bevatten. Ook kan het de vorm hebben van een re-35 gistratie van een dergelijke analyse, zoals een grafische voorstelling van een aantal cellen, die een gegeven potentiaal toont ten opzichte van de grootte van de potentiaal.

Liganden en hun antagonisten produceren in het algemeen tegenovergestelde effecten op de celmembraanpotentiaal. 40 Dientengevolge kunnen bij onderzoek-pogingen gericht op het 7915051 14- ontdekken van produkten, die in staat zijn tot nabootsing, blokkering of het te niet doen van het effect van natuurlijke liganden op cellen van een bijzonder weefsel, de richting, grootte en/of tijdsverloop van membraanpotentiaal-5 veranderingen in een celmonster van het weefsel bepaald worden door meervoudige metingen na blootstelling van de cellen aan het natuurlijke ligand. Daarna kunnen verschillende produkten worden toegevoegd aan evenmatige delen van de celsuspensie. Door vergelijking van de membraanpoten-10 tiaalveranderingen opgewekt in de respectievelijke monsters, kan de onderzoeker als waardige candidaten voor verder onderzoek specifieke produkten identificeren die waarschijnlijk het gewenste fysiologische effect hebben en andere verbindingen kunnen van overweging buiten beschouwing gelaten 15 worden. Onder toepassing van de onderhavige methode kan men ook parameters bepalen zoals de concentratie van antagonist noodzakelijk om het effect op de membraanpotentiaal van een gegeven celtype van een gegeven concentratie agonist te vernietigen. Dergelijke metingen zijn geschikt voor 20 de evaluatie van liganden en hun antagonisten als farmacologische middelen.

In sommige gevallen bestaan verschillende typen specifieke receptoren voor een gegeven ligand. Bijvoorbeeld kan de binding van ligand aan receptoren van een groep cellen 25 resulteren in hyperpolarisatie, terwijl binding van hetzelfde ligand aan receptoren van een tweede groep kan resulteren in depolarisatie. De onderhavige werkwijze kan onderscheidt maken tussen deze twee typen wisselwerkingen. Bekende cel-rangschikkingstechnieken, die gebruikt worden in combina-50 tie met de hier beschreven werkwijze, maken de isolering van celreeksen met een gewenst receptor specificiteit te midden van heterogene populaties mogelijk. Het gebruik van de werkwijze in deze context verschaft een vergrote selectiviteit in vergelijking met de gebruikelijke werkwijze 55 van rangschikking van cellen gebaseerd op de binding van fluorescerend gemerkt ligand omdat het fysiologische effect, alsmede de ligand-binding kan zijn opgenomen in de selectie kriteria. Additionele specificiteit kan verkregen worden door de combinatie van direkte meting van binding 4-0 van optisch gemerkt ligand met bepaling van 7915051 15 de verandering in membraanpotentiaal na de ligandbinding.

Wanneer de aanwezigheid van een bijzonder type ligand in een oplossing, of de aanwezigheid van cellen met een bijzondere ligand-specificiteit de informatie van belang 5 is, kan de membraanpotentiaal worden afgelezen voor en na de menging van het ligand en de celsuspensie en kunnen de resultaten worden vergeleken. Respectievelijke representatieve evenmatige delen van een celsuspensie kunnen bijvoorbeeld geïncubeerd worden met 1) een oplossing, die een 10 onbekende concentratie van een gegeven ligand bevat, 2) een ligand-vrije oplossing en 3) een oplossing, die een bekende concentratie van het ligand bevat. Na incubatie kan een indicatie van de ligandconcentratie van de onbekende verkregen worden door vergelijking van de membraanpotentialen 15 van cellen in de respectievelijke monsters. Aangezien de membraanpotentiaal van afzonderlijke cellen . wordt bepaald, is het mogelijk een subpopulatie van cellen in de suspensie met een geselecteerde ligand specificiteit te identificeren.

20 De methode kan gebruikt worden voor de bepaling en kwantificering van cellulaire immuunreacties door meting van potentiaalveranderingen in lymfocyten, macrofagen of andere cellen van het immuun-systeem na blootstelling aan produkten zoals antigenen, antilichamen, 25 haptenen, allergenen en complement componenten. Aangezien lymfocyten gewoonlijk een heterogene populatie zijn met betrekking tot hun reactiviteit tot een gegeven antigeen, verschaft de fractie van cellen, die reageren op een gegeven antigeen, een geschikte maat van cellulaire immuun-reac-30 tie. Veranderingen van het gebruikelijke patroon van potentiaalveranderingen in voor reactie gevoelige cellen kunnen wijzen op gebreken in de immuun-functie. Op soortgelijke wijze kan de introductie van verschillende allergenen in meervoudige monsters van een serum van een individu gevolgd 35 door incubatie van de monsters met cellen, die betrokken zijn bij de uitscheiding van histamine, gebruikt worden als een niet-storend middel voor * bepaling van de gevoeligheid van een individu ten opzichte van verschillende allergene produkten.

4-0 Aangezien volgens de onderhavige methoden het isoleren 7915051 16 en het merken van een specifieke ligandsoort niet vereist is voor de bepaling van produkten, die in staat zijn cellen te binden met gegeven receptor specificiteiten, is het mogelijk de methode te gebruiken voor de analyse van 5 ligand activiteit in een onzuiver ligand-preparaat en het volgen en registreren van de ligand activiteit in verschillende fracties van dergelijke onzuivere preparaten, afkomstig van werkwijzen, die ontworpen zijn om het gewenste specifieke ligand te zuiveren of te isoleren.

10 De methode kan ook gebruikt worden als een hulpmiddel voor het definiëren van de chemische structuur van opper-vlak-receptoren door mededinging te demonstreren tussen verschillende liganden van bekende specificiteit voor bin-dingsplaatsen op celoppervlakken.

15 De toxische effecten van verschillende middelen op cellen kunnen geëvalueerd worden door achtereenvolgende meting van de membraanpotentialen van cellen na blootstelling aan dergelijke middelen. Het is bekend, dat proeven voor de cel levensvatbaarheid gebaseerd op de toegang van normaal 20 impermeabele kleurstoffen, zoals propidiumjodide slechts die cellen kwalitatief bepalen, die gedesintegreerd zijn.

Voor vele doeleinden, bijvoorbeeld de evaluatie van geneesmiddelen voor kanker-therapie, is het gebruikelijk te bepalen of de toekomstige reproductieve capaciteit van de cel 25 is aangetast of dab een onvoldoende mate van beschadiging, νειηverbreking van de integriteit van het celmembraan heeft plaats gevonden. De potentiaal van een beschadigde cel dient nul te bereiken binnen de limiet, waarbij het membraan wordt gebroken. Mindere maten van beschadiging zijn 30 bepaalbaar door een afname in de grootte van de membraan-potentiaal in vergelijking tot onbeschadigde cellen. De vermindering of vernietiging van reactie voor liganden en andere produkten, die gewoonlijk bekende veranderingen in de potentiaal teweeg brengen, kan eveneens bepaald 35 worden door meting van celmembraanpotentialen.

Aangezien de verdeling van doordringende ionogene verbindingen, bijvoorbeeld geneesmiddelen, door celmembranen afhankelijk is van de membraanpotentiaal, kan de methode gebruikt worden om verschillen in geneesmiddelopname onder 40 verschillende celtypen te voorspellen. De methode kan ook 7915051 17 gebruikt worden voor het verschaffen van een correctie-fac-tor gebaseerd op verschillen in kleurstofopname, voorspeld op basis van gemeten potentiaalverschillen, die het voor een verscheidenheid van doordringende ionogene kleurstoffen, 5 bijvoorbeeld acridinen, mogelijk maken gebruikt te worden als vitale kleurmiddelen voor de kwantificering van verschillende intracellulaire bestanddelen, bijvoorbeeld nu-cleïnezuren en glycosaminoglycanen.

Alle voorafgaande methoden vereisen een snelle, niet-10 storende en bij voorkeur non-destructieve methode van bepaling van de membraanpotentiaal of van het verkrijgen van een maat, die evenredig is met de membraan-potentiaal van de 10^ tot 10 afzonderlijke cellen m een gebruikelijk celmonster. De indringing van micro-elektroden 15 in afzonderlijke cellen beschadigt noodzakelijkerwijze cel-membranen en kan niet werkelijk gebruikt worden voor het bepalen van de membraanpotentiaal in elk van het grote aantal cellen in een celsuspensie. De bepalingsmethode, die de voorkeur verdient, houdt het gebruik in van ka-20 tionogene, celmembraan doordringende fluorescentie-kleurstof-fen die, tijdens incubatie, scheiden tussen tegenovergestelde zijden van de celmembranen als een functie van de membraanpotentiaal. De intracellulaire concentratie van kleurstof of een parameter evenredig aan de concentratie wordt 25 vervolgens gemeten met optische technieken in een micro-fotometer of een stromingscytometer. Bij hyper-polarisatie wordt de affiniteit van het inwendige van de cel voor de kleurstof vergroot; bij depolarisatie wordt de affiniteit van het inwendige van de cel voor de kleurstof verminderd.

$0 Een groep kleurstoffen, die geschikt is voor gebruik bij deze techniek zijn kationogene cyanine-kleurstoffen zoals 3·3'-di-n-butyl-9-methyl- en 3.3'-diethylthiacarbocya-ninen, 3.3'-diethyl-2.2'-oxacarbocyanine, 2.3·3·/Ι,·3,·3'-hexamethylindocarbocyanine en -dicarbocyanine, 3 · 3 * —cLi— 35 ethylthiadicarbocyanine en bij voorkeur 3 · 3'-dihexyl-2.2'-oxacarbocyanine (diO-C^-(3)). Deze kleurstoffen zijn in de handel bijvoorbeeld verkrijgbaar bij Accurate Chemical Company or Eastman Kodak.

Het is doelmatig, dat de gekozen kleurstof een toege-40 nomen fluorescentie kwantum efficiency vertoont met afne- 7915051 18 mende polariteit van het oplosmiddel en dat de fluorescentie en absorptie-maxima van de kleurstof verschuiven met verandering in polariteit in het oplosmiddel. Deze kenmerken maximaliseren de selectiviteit van kwantitatieve bepa-5 ling van met membraan verenigde kleurstof binnen cellen tegen de achtergrond van vrije kleurstof in oplossing. Het is eveneens doelmatig voldoende lage concentraties van de gekozen fluorescentie-kleurstof te gebruiken voor het minimaliseren van de uitdoving van de fluorescentie van intra-10 cellulaire kleurstof tengevolge van vorming van aggregaten. In het geval van de cyanine-kleurstof die de voorkeur verdient (di0-CA-(3)), verdienen concentraties bij of beneden ö -7 ongeveer 3 x 10 'M de voorkeur.

Di0-Cg-(3) wordt gekenmerkt door een toename in kwan-15 turn efficiency van ongeveer 4,5 in n-octanol ten opzichte van water bevattende oplossingen. De absorptie en emissie maxima ervan in n-octanol zijn ongeveer 10 nm hoger dan in water bevattende oplossing. De hoeveelheid diO-Cg-(3) binnen afzonderlijke cellen wordt bepaald door meting van de 20 fluorescentie in het gebied van 504 nm na excitatie bij ongeveer 488 nm. Onder de cyanine-kleurstoffen in het algemeen zijn de gewenste oplosmiddel-effecten op de kwantum efficiency meer uitgesproken in carbocyanine-kleurstoffen, die de algemene formule R-(0H)^-E' bezitten dan in di- en 25 tricarbocyaninen met respectievelijk de algemene formules R-(0H)5-H' en R-(CH)7-R'.

Een microfluormeter kan gebruikt worden voor het meten van de fluorescentie, maar de meting wordt het meest snel en nauwkeurig tot stand gebracht onder toepassing van 30 een stromingscytometer. De methodiek van stromingscytome-trie en celrangschikking wordt beschreven door P.K. Horan en L.L. Wheeless, Jr. in Science, 198, (1977), 149-157· Stromingscytometers onder toepassing van argon ion laser lichtbronnen zijn goed geschikt voor de onderhavige metin-35 gen. Dergelijke instrumenten worden door verschillende fabrikanten verkocht en zijn in staat automatisch cellen ter rangschikken op basis van verschillende kriteria, bijvoorbeeld fluoresceringintensiteit, celgrootte, golflengte van fluorescentie en golflengte of intensiteit van absorptie.

40 Wanneer de celpopulatie onder onderzoek relatief homo- 7915051 19 geen is met betrekking tot grootte en inwendige structuur, en wanneer de concentratie van toegevoegde kleurstof en het aantal cellen gesuspendeerd in het gegeven volume milieu relatief constant worden gehouden, zal de totale hoeveelheid 5 kleurstof binnen een gegeven cel, zoals gemeten door de intensiteit van de fluorescentie uit die cel, direkt evenredig zijn met de concentratie en daarom met de membraanpo-tentiaal. Wanneer echter gemengde celpopulaties of variërende concentraties van cellen en/of kleurstof erbij betrokken 10 zijn, kunnen extra metingen vereist zijn. Aangezien de intracellulaire concentratie van kleurstof gelijk is aan de totale hoeveelheid kleurstof binnen de cel gedeeld door het celvolume, kan een waarde evenredig met de concentratie van kleurstof binnen een gegeven cel verkregen worden door me-15 ting van de totale hoeveelheid kleurstof, zoals hiervoor beschreven, en deling door een hoeveelheid evenredig aan het celvolume. Een meting van het celvolume kan gelijktijdig verkregen worden met een aflezing van intracellulaire fluorescentie in stromingscytometers door elektronische of 20 optische meting van de celgrootte, bijvoorbeeld de 3/2 macht van de cel dwarsdoorsnede, gemeten door verstrooiing van licht bij hoeken nabij de verlichtingshartlijn. Doelmatig maken stromingscytometrische technieken deze te verzamelen, elektronisch gemanipuleerde en vertoonde informatie auto-25 matmsch mogelijk. De cytometer ontwikkelt een signaal, dat representatief is voor de fluorescentie intensiteit, een tweede signaal, dat representatief is voor het celvolume en bepaalt vervolgens de verhouding van de signalen. Deze verhouding, die evenredig is met de membraanpotentiaal, kan 30 dan gebruikt worden als een celrangschikkingskriterium en/of vertoond worden.

Wanneer de te analyseren populatie van cellen merkbaar heterogeen is met betrekking tot het celvolume of de hoeveelheid kleurstofbindingsmateriaal, kan een meting evenre-35 dig aan de membraanpotentiaal verkregen worden door toepassing van twee kleurstoffen met verschillende affiniteiten voor intracellulaire componenten. In dit geval kan de intracellulaire fluorescentie van beide kleurstoffen gemeten worden. De toename of afname in de verhouding van intracel- 4-0 lulaire kleurstof gehalten is dan evenredig met de verande- 7915051 20 ring in membraanpotentiaal- en is afhankelijk van het cel-volume en variaties in het gehalte van kleurstofbindings-materiaal onder de cellen.

Terwijl gevestigde chemie principes de berekening van 5 effecten van variaties in cel en kleurstofconcentraties in het milieu mogelijk maken na de intracellulaire concentratie van kleurstoffen, is het in de praktijk eeenvoudiger verdunningen af te stellen, zodat de concentraties van cellen en van kleurstof ongeveer dezelfde zijn in alle te ver-10 gelijken monsters.

Interferentie met fotometrische potentiaalmetingen kan veroorzaakt worden door non-specifiek verkleuren van het cytoplasma van dode cellen, waarin de integriteit van het membraan verloren is gegaan. Wanneer een kleine hoeveelheid 15 van een normaal impermeabele kleurstof, zoals ethidiumbro-mide of propidiumjodide wordt toegevoegd aan het milieu, zullen de kernen van deze cellen met beschadigde membranen gekleurd worden, terwijl de kleurstof in levensvatbare cellen zal binnentreden. Wanneer de permeabele kleurstof, die 20 gebruikt wordt voor potentiaalmetingen, en de impermeabele kleurstof, die gebruikt wordt voor het kwalitatief bepalen van membraanbeschadiging verschillende optische eigenschappen hebben, is het mogelijk correlatie-metingen te doen van een of meer optische eigenschappen van elke kleurstof bin-25 nen elke cel en aldus bepaalde beschadigde cellen van verdere analyse te elimineren. Wanneer de gebruikte permeabele kleurstof het voorkeurs diO-Cg-(3) is en de impermeabele kleurstof propidiumjodide is, zullen de kernen van beschadigde cellen rode fluorescentie emitteren in het gebied van 30 610 nm na excitatie van 4-88 nm. Deze fluorescentie is gemak kelijk te onderscheiden door de waarnemer of door fotometrische methoden van de groene fluorescentie van diO-G^(3).

Fotometrische metingen van de membraanpotentiaal kunnen gecombineerd worden met andere metingen van dezelfde 35 cellen om het analytische vermogen van de methode te vergroten. Bijvoorbeeld kan de reactie van cellen in verschillende fasen van de cel-kringloop ten opzichte van een gegeven ligand bepaald worden door gelijktijdig kleuren met diO-Cg-(3) en met een DNA fluorochroom, zoals Hoechst 40 verbinding nummer 33542. ____ 7915051 21

Het is mogelijk optische eigenschappen anders dan fluorescentie te meten, bijvoorbeeld absorptie, voor het verkrijgen van een indicatie van de hoeveelheid kleurstof binnen afzonderlijke cellen. In dit geval verdient het de 5 voorkeur kleurstoffen te gebruiken, die intracellulair aggregaten vormen met absorptie-maxima bij golflengten, die verschillen van die van de vrije kleurstof, en die kleurstoffen te gebruiken in voldoende hoge concentraties, zodat een relatief grote fractie bestaat in de cellen in de 10 vorm van aggregaten. Dit maximaliseert de selectiviteit van de bepaling van intracellulaire kleurstof tegen de achtergrond van vrije kleurstof in oplossing. Thiacarbocyanine-kleurstoffen zoals 3.3'-diethyl- en 3.3'-dipropylthiadicarbocyanine kunnen onder bepaalde om-15 standigheden deze eigenschap vertonen. Bij het binden aan rode bloedcellen, is van de eerste kleurstof bekend, dat deze een nieuwe absorptiepiek vertoont bij ongeveer 590 nm, waarschijnlijk tengevolge van complexvorming van intracellulaire kleurstof met hemoglobine. De absorptie van cellen 20 bij deze golflengte kan dus gemeten worden voor het vaststellen van de hoeveelheid kleurstof binnen de afzonderlijke cellen.

Terwijl de fotometrische meting van de opname van ka-tionogene kleurstoffen de voorkeursmethode is voor het me-25 ten van veranderingen in de membraanpotentiaal kunnen andere technieken gebruikt worden. Zelfs hoewel het inwendige van niet prikkelbare cellen negatief is met betrekking tot het uitwendige, kunnen anionogene kleurstoffen, die een affiniteit hebben voor oplosmiddelen van afnemende polari-30 teit, gebruikt worden. In dit geval zal de kleurstof een affiniteit hebben voor intracellulaire componenten niettegenstaande de lading ervan en zal in de cel geabsorbeerd worden, De concentratie ervan zal afnemen bij cel hyper-polarisatie en toenemen met depolarisatie.

35 Het wordt eveneens beoogd, dat niet-fotometrische methoden voor het bepalen van de membraanpoten tiaal toegepast kunnen worden. In dit opzicht kunnen veranderingen in de membraanpotentiaal vastgesteld worden op een bekende wijze onder toepassing van een radioactief ge-40 merkt kation, zoals koolstof 14 of met tritium gemerkte 7915051 22 kwaternaire ammonium- of fosfoniumzouten. Details van deze methode zijn beschreven in Methods of Enzymology, H.R. Eaback, Academic Press, 1974 (biz. 698). Zie eveneens Changes in Membrane Potential of Human Granulocytes Antecede 5 the Metabolic Response to Surface Stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci., No· 8, blz* 3818-5822, Aug., 1978 (H.M. Eorchak c.s.) en Biochemistry 14-:25, 1975 (Schuldiner c.s.). De opname van deze kationen is, zoals die van de kationogene kleurstoffen, een functie van de 10 cellulaire membraanpotentiaal. Intracellulaire radioactiviteit kan geanalyseerd worden na wassen van de cellen door uitspreiden van een monocellulaire laag van cellen op een plaatje en het blootstellen van het plaatje aan een fotografische emulsie. Vergelijkingen worden bijvoorbeeld ge-15 daan door een controle monster te onderwerpen aan dezelfde methode en de verkregen autoradiografische voorstellingen te vergelijken. Terwijl deze methode van meting van verandering van de celmembraanpotentiaal werkzaam is, verdient deze niet de voorkeur, aangezien relatief lange tijdsperio-20 den noodzakelijk zijn om de gebruikte fotografische emulsie bloot te stellen en de cel levensvatbaarheid wordt niet geconserveerd.

Een andere niet-fotometrische methode van meting van de membraanpotentiaal houdt een modificatie in van de tech-25 nieken, die toegepast worden in de gebruikelijke elektronische cel-telinrichtingen. In deze inrichtingen worden afzonderlijke cellen, gesuspendeerd in een zoutoplossing, door een opening geleid, die tussen een paar elektroden is opgesteld, die een stroom handhaven in de suspenderingsop-30 lossing. De passage van een cel door de opening varieert de geleidbaarheid van de oplossing, hetgeen resulteert in een bepaalbare spanningsimpuls. De hoogte van de impuls is indicatief voor het celvolume. Aangezien de membranen van cellen met verschillende membraanpotentiaal gewoonlijk ver-35 schillende ionogene geleidingsvermogens hebben, kunnen signalen, die informatie bevatten, die indicatief is voor variaties in het ionen-geleidingsvermogen van het membraan van afzonderlijke cellen, die door de opening gaan, verkregen worden onder toepassing van wisselstroom. Deze kunnen 4-0 gebruikt worden voor vergelijking van de membraanpotentiaal 7915051 23 van afzonderlijke cellen, bijvoorbeeld met behulp van een pulshoogte-analysator.

Voorbeeld I

Periferale bloedlymfocyten worden verkregen uit ge-5 schonken bloed en geïsoleerd door centrifugeren over

Hypaque-Ficoll dichtheidsgradiënten. Grove bepalingen van het percentage erythrocyten, monocyten en granulocyten in de lymfocyt-preparaten worden verkregen door cytografische analyse van de rode en groene fluorescentie-signalen van 10 cellen in evenmatige delen, die met acridine oranje gekleurd zijn. Cel-tellingen worden verkregen en cel levensvatbaarheid wordt geschat door trypan blauw uitsluiting.

Werkoplossingen van diO-Cg-(3) kunnen bereid worden uit 10-¾ of 5 x 10-½ voorraad-oplossingen in ethanol. De 15 concentraties van de werkoplos singen dienen te worden ingesteld voor het geven van een eindkleurstofconcentratie tussen 10' en 5 x 10“^M, wanneer 10 ml kleurstofoplossing worden toegevoegd aan 1,0 ml cellen verdund in milieu 199 (Gibco).

20 Valinomycin (Sigma Chemical Company), een bekend iono- foor, dat in staat is lymfocyten te hyperpolariseren, wordt opgelost in ethanol met een concentratie van 0,66 mg/ml. Gramicidine (ION), een bekend ionofoor, dat in staat is lymfocyten te depolariseren, wordt eveneens opgelost in 25 ethanol (0,4 mg/ml). Fytohemagglutinine ("PHA", Difco, 2 mg/ml) en Concanavaline A ("Con-A", Sigma, 1 mg/ml) worden in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing opgelost. PHA en Con-A zijn lectinen (liganden), waarvan bekend is, dat zij in staat zijn te binden aan menselijke periferale 30 lymfocyten.

Voordat eventueel andere proeven worden gedaan, worden de kinetica van kleurstofopname van cellen gecontroleerd.

20 ml kleurstofoplossing worden toegevoegd aan 2 ml van een verdunde celsuspensie, die 1-2 x 10“^ cellen/ml bevat. De 35 fluorescentie van de cellen wordt dan gemeten in een stro-mingscytometer. De piek van de fluorescentie-verdeling wordt gelokaliseerd en de plaats ervan wordt vastgelegd bij intervallen van een minuut totdat de verdeling stabiel wordt. Dit heeft gewoonlijk plaats in 12 minuten, wanneer 40 diO-Cg-(3) als de indicator-kleurstof wordt gebruikt.

7 9 1 5 0 5 1 24

Latere experimenten zijn opgezet om het interval tussen toevoeging van kleurstof en lectine of ionofoor constant te houden en fluorescentie te meten, welk interval bij voorkeur enigszins langer is dan de waargenomen tijd 5 tot evenwicht. Een tijdsperiode van 15 of 20 minuten is geschikt voor diO-Cg-(3) bij de hier gebruikte concentraties. Bij een experiment werden de fluorescentie-verdelingen van vijf evenmatige delen celsuspensie vergeleken. Op het tijdstip van kleurstoftoevoeging (10 pi werkoplossing van 10 diO-Cg-(3)/ml cellen, worden ook respectievelijk toegevoegd: a. niets (controle monster) b. PHA (10 ml werkoplossing; eindconcentratie 20 /Ug/ml) c. Oon A (10 ml werkoplossing; eindconcentratie 15 10 jug/ml) d. Valinomycine (10 ml werkoplossing; eindconcentratie 6 x 10~6M) en e. Gramicidine (10 ml werkoplossing; eindconcentratie 2 x 10"5M).

20 Monsters worden bereid bij intervallen van 3 tot 6 minuten om tijd te geven voor het schoonmaken van het stro-mingssysteem van de stromingscytometer tussen de monsters. Fluorescentiemetingen van alle monsters worden gedaan onder toepassing van hetzelfde laser-vermogen en versterkingsin-25 stellingen. Nagenoeg gelijke aantallen cellen worden in elk monster gemeten en de fluorescentie-verdeling van alle monsters wordt op dezelfde schaal van een pulshoogte-analysa-tor vertoond.

De resultaten van de proef zijn toegelicht in de fig.

30 1-5· Deze uitzettingen worden voort gebracht, wanneer de fluorescentie-reactie van de cellen 15 minuten na de toevoeging van de kleurstof en van de lectinen of ionoforen wordt gemeten. Di0-Cg-(3) wordt gebruikt bij een eindconcentratie van 5 x 10-¾. Verwijzend naar fig. 1 (controle 35 monster) kan worden gezien, dat er een verdeling is van de intracellulaire concentratie van de cyanine-kleurstof onder de cellen van de populatie, zoals aangegeven door de verdeling van de intensiteit van de fluoresceringsreactie (x-as). Dus varieert de waargenomen membraanpotentiaal van afzon- 4-0 derlijke leden van de celpopulatie voorafgaande aan de sti- 7915051 ------------------------------- 25 mulering. Echter zijn membraanpotentialen verdeeld bij een piek aangegeven bij lijn A, die een grote subpopulatie van cellen van enige tussenwaarde van de membraanpotentiaal voorstelt.

5 Verwijzend naar fig. 2 wordt het effect van depolari- serend ionofoor gramicidine getoond. Zoals toegelicht is het aantal cellen, dat een vermindering in fluorescentie intensiteit (opgewekt door het depolariserende effect van het gramicidine) vertoont, aanzienlijk toegenomen en er is een 10 verschuiving van de piek naar het punt aangegeven bij B. Daarentegen vertonen de cellen, waaraan het hyperpolarise-rend ionofoor valinomycine was toegevoegd (fig. 3)j een toename in frequentie van cellen met hogere fluorescerende intensiteit, aangegeven bij C.

15 De fluorescentie-intensiteitsverdelingen van de met

gramicidine en valinomycine behandelde monsters geven, indien vergeleken met het controle-monster, een indicatie van de variatie van de fluorescentie-signalen, die verwacht kunnen worden na maximum depolarisatie en hyperpolarisatie. Dit 20 voorbeeld toont aan, dat de kationogene cyanine-kleurstof zich verzamelt in het intracellulaire volume van afzonderlijke cellen als een functie van de membraanpotentiaal. Voorbeeld II

Het effect van toevoeging van Con A aan menselijke 25 lymfocyten wordt toegelicht in fig. 4·. Zoals getoond is de lymfocytsuspensie heterogeen met betrekking tot de reactie ervan op dit lectine. De suspensie bevat een subpopulatie van cellen, die na binding met Con A gehyperpolariseerd is en een andere, die gedepolariseerd is. Gehyperpolariseerde 30 cellen vertoonden een toename in fluorescentie-intensiteit zoals getoond bij D; gedepolariseerde cellen vertoonden een afname in fluorescentie-intensiteit zoals getoond door een zwakke maar te onderscheiden piek bij D'. De grootte van de gehyperpolariseerde populatie is aanzienlijk groter dan die 35 van de gedepolariseerde populatie.

De toevoeging van PHA aan de cellen resulteert in een scheiding van de twee groepen cellen. De brede, bimodale verdeling, toegelicht in fig. 5» geeft aan, dat de subpopulatie van de cellen schijnt t.e depolariseren na binding met 4-0 PHA tot een zodanig punt, dat de fluorescentie-reactie van 7915051 26 afzonderlijke cellen afneemt tot een punt aangegeven bij E. Een tweede subpopulatie van cellen vertoonde een meer ingrijpende depolarisatie aangegeven door een zelfs lagere fluorescentie-reactie aangegeven bij E'.

5 Voorbeeld III

Een voorraadoplossing van PHA en diO-Cg-(3) wordt toegevoegd aan een lymfocytcelsuspensie bereid volgens voorbeeld I. De stromingscytometer wordt dan opgesteld om cellen af te scheiden met een fluorescentie-intensiteit, die 10 overeenkomt met de intensiteiten aangegeven bij E en E' in fig. 3. Na een incubatie van 15 minuten wordt de suspensie afgepast in de stromingscytometer en gesplitst in drie cel-suspensies, waarvan twee rijk zijn aan cellen homogeen met betrekking tot hun fysiologische reactie na binding met 15 pha.

Voorbeeld IV

Aan B verrijkte en T verrijkte populaties van lymfo-cyten (ongeveer 85 % zuiver) worden, verkregen door rozet-vorming, geanalyseerd op hun gevoeligheid ten opzichte van 20 PHA. Fig. 6 laat de fluorescentie-reactie-verdeling zien van de T cellen in de suspensie voorafgaande aan de toevoeging van het lectine; fig. 7 laat de fluorescentie-reac-tie-verdeling zien van dezelfde celsuspensie 20 minuten na blootstelling aan het PHA van de voorraadoplossing van 25 voorbeeld I. Zoals toegelicht resulteert de toevoeging van dit lectine in een gelijkmatige depolarisatie van T lymfo-cyten. Daarentegen ondergaan, zoals getoond in fig. 8 (controle) en 9 (25 minuten na PHA toevoeging) B cellen een gelijkmatige hyperpolarisatie als gevolg van PHA-receptor 30 wisselwerkingen. Deze resultaten laten zien dat de werkwijze van de uitvinding gebruikt kan worden voor vergelijking van de fysiologische reactie van verschillende celtypen ten opzichte van een gegeven ligand. De resultaten laten eveneens zien, dat verschillende celtypen kunnen worden on-35 derscheiden op basis van een fysiologische reactie ten opzichte van een ligand.

7915051

Claims (30)

1. Biologische analysemethode, gekenmerkt d o o r de trappen: (a) bepaling van een kenmerk van afzonderlijke cellen van 5 één of meer niet prikkelbare cellen, die representatief zijn voor de membraanpotentiaal ervan door een niet storende methode en (b) vergelijking van dit celkenmerk met een referentieken-merk om verschillen te bepalen in de membraanpotentiaal van 10 de genoemde afzonderlijke cellen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat trap (a) omvat: (i) incubatie van de cellen met een kleurstof, die zich verenigt met afzonderlijke cellen en 15 (ii) bepaling van een optische eigenschap van kleurstof, die verenigd is met afzonderlijke cellen, welke bepaalde optische eigenschap indicatief is voor de celmembraanpoten-tiaal van afzonderlijke cellen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het 20 kenmerk, dat trap (a) omvat: (i) incubatie van de genoemde cellen met een celmembraan doordringende ionogene kleurstof en (ii) bepaling van een optische eigenschap van de genoemde cellen, welke optische eigenschap representatief is voor de 25 intracellulaire kleurstofconcentratie en vaststelling van het celkenmerk uit deze optische eigenschap.

4. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3» met het kenmerk, dat de genoemde cellen gemodificeerd worden voorafgaande aan de bepaling van de genoemde optische eigen- 30 schap, waarbij een verandering in celmembraanpotentiaal plaats heeft voorafgaande aan de bepaling van de genoemde optische eigenschap.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de celmodificatie farmacologisch, chemisch 35 of biologisch is.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de genoemde modificatietrap de incubatie van de genoemde cellen omvat in een oplossing van liganden onder omstandigheden, waaronder celreceptoren en de genoem- 40 de liganden complementair binden. 7915051

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de genoemde liganden gekozen worden uit neurotransmittoren, hormonen, farmacologische middelen, natuurlijke of synthetische agonisten en antagonisten ervan, 5 antigenen, antilichamen, haptenen, allergenen, complement-componenten en combinaties daarvan.

8. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de genoemde celmodificatie fysische is.

9. Werkwijze volgens conclusie 4, met het 10 kenmerk, dat de genoemde modificatietrap aan de incubatie voorafgaat.

10. Werkwijze volgens conclusies 4 tot 8, met het kenmerk, dat de genoemde modificatietrap op de incubatie volgt.

11. Werkwijze volgens conclusies 2 tot 10, met het kenmerk, dat het genoemde referentiekenmerk een waarde is, representatief voor een vooraf vastgestelde kleurstofconcentratie en de genoemde vergelijkingstrap het verschil in grootte bepaald van de genoemde bepaalde kleur- 20 stofconcentratie en de genoemde vooraf bepaalde concentratie.

12. Werkwijze volgens conclusies 2 tot 10, met het kenmerk, dat het genoemde referentiekenmerk een waarde is, representatief voor een vooraf bepaalde 25 kleurstofconcentratie en de genoemde vergelijkingstrap de veranderingsrichting vaststelt van het verschil in grootte van de genoemde bepaalde kleurstofconcentratie en de genoemde vooraf bepaalde concentratie.

13. Werkwijze volgens conclusies 2 tot 10, met 30 het kenmerk, dat het genoemde referentiekenmerk een stel waarden is, representatief voor een vooraf bepaald concentratietijdsverloop en de genoemde vergelijkingstrap de verschillen in grootte bepaalt van de genoemde bepaalde concentratie en het genoemde vooraf bepaalde concentratie- 35 tijdsverloop.

14. Werkwijze volgens conclusies 2 tot 13, met het kenmerk, dat de genoemde kleurstof een fluo-rescentiekleurstof is en de genoemde kleurstofbepalingstrap de bepaling omvat van de fluorescentie voor één of meer af- 40 zonderlijke cellen van de genoemde cellen. 7915051

15. Werkwijze volgens conclusies 2 tot 13» met liet kenmerk, dat de genoemde kleurstof een fluorescentiekleurstof is en de genoemde kleurstofbepalings-trap de bepaling omvat van de spectrale verschuiving van 5 fluorescentie voor één of meer afzonderlijke cellen van de genoemde cellen.

16. Werkwijze volgens conclusies 2 tot 13» met het kenmerk, dat de genoemde kleurstofbepalings-trap de bepaling omvat van de optische absorptie voor één 10 of meer afzonderlijke cellen van de genoemde cellen.

17· Werkwijze volgens conclusies 2 tot 13» met het kenmerk, dat de genoemde kleurstofbepalings-trap de bepaling omvat van de spectrale verschuiving van de optische absorptie van één of meer afzonderlijke cellen van 15 de genoemde cellen volgend op de aggregatie van de genoemde kleurstof.

18. Werkwijze volgens conclusie 14 of conclusie 15» met het kenmerk, dat de genoemde kleurstof een kationogene fluorescentiekleurstof is met toenemende 20 fluorescentiekwantum-efficiency in oplosmiddelen van afnemende polariteit.

19. Werkwijze volgens conclusie 14 of conclusie 15» met het kenmerk, dat de kleurstof een fluorescerende, kationogene cyanine kleurstof is.

20. Werkwijze volgens conclusie 19» met het kenmerk, dat de kleurstof een zout is van 3.3’--cLi-hexyl-2.2'-oxacarbocyanine.

21. Werkwijze volgens conclusie 14 of conclusie 15» met het kenmerk, dat de concentratie van de 50 kleurstof in de extracellulaire oplossing zodanig is, dat de intracellulaire fluorescentie uitgedoofd door de vorming van complexen van verminderde fluorescentie, geminimaliseerd wordt.

22. Werkwijze volgens elk van de voorafgaande conclu- 35 sies voor de bepaling van de aanwezigheid van een ligand in een oplossing, met het kenmerk, dat de werkwijze de incubatie omvat van één of meer niet prikkelbare cellen, waarvan bekend is, dat deze een membraan gebonden receptor bevatten complementair ten opzichte van het 40 ligand met de genoemde oplossing onder omstandigheden, waar- 7915051 big liganden en receptoren binden, waarbij de aanwezigheid van het genoemde ligand in de genoemde oplossing aangegeven is door een verandering in de membraanpotentiaal in de cellen, die de receptor bevatten. 5

23· Werkwijze volgens conclusies 1 tot 21 voor de be paling van de aanwezigheid van cellen met receptoren, die complementair zijn ten opzichte van een geselecteerd specifiek ligand in een veelvoud van cellen, die heterogeen zijn met betrekking tot de ligandspecificiteit, met 10 het kenmerk, dat de werkwijze de incubatie omvat van de genoemde veelvoud cellen met een oplossing, die het genoemde specifieke ligand bevat onder omstandigheden, waaronder celreceptoren en liganden complementair binden, waarbij de aanwezigheid van de genoemde cellen met recep-15 toren, die complementair zijn ten opzichte van het genoemde ligand, is aangegeven door een verandering in de membraanpotentiaal van de genoemde cellen.

24·. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 21 voor de bepaling van de aanwezigheid in een celpopulatie van cellen 20 met receptorplaatsen complementair ten opzichte van een geselecteerd ligand maar een verschillende fysiologische reactie daarop, met het kenmerk, dat de werkwijze de incubatie omvat van de genoemde celpopulatie met een oplossing, die het genoemde geselecteerde ligand bevat, 25 voor het opwekken van membraanpotentiaalveranderingen in de genoemde cellen van verschillende grootten of richtingen in de genoemde cellen.

25. Werkwijze volgens conclusie 23 of 24·, met het kenmerk, dat cellen, die soortgelijke mem- 50 braanpotentiaalveranderingen vertonen, afgescheiden worden voor het voortbrengen van een celpopulatie, die rijk is aan cellen, die voor het genoemde geselecteerde ligand gevoelig zijn.

26. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 21 voor de ver-35 gelijking van de fysiologische reactie van een celpopulatie blootgesteld aan veelvoudig chemisch verschillende liganden, met het kenmerk, dat de werkwijze incubatie omvat van monsters van de genoemde celpopulatie met respectievelijke liganden onder omstandigheden, waaronder receptoren 40 en liganden binden en het registreren van veranderingen in 7915051 membraanpotentiaal in afzonderlijke cellen van respectievelijke celmonsters.

27. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 21 voor de bepaling van bet cumulatieve effect van blootstelling van 5 meervoudig chemisch verschillende liganden aan een populatie van cellen, met het kenmerk, dat de werkwijze de incubatie omvat van de liganden en de celpopu-latie onder omstandigheden, waaronder celreceptoren en liganden complementair binden.

28. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 21 voor de be paling van de levensvatbaarheid van een celpopulatie na blootstelling aan een celtoxine, met het kenmerk, dat de werkwijze de incubatie omvat van de celpopulatie met het genoemde toxine.

29. Werkwijze volgens conclusies 1 tot 21 voor de be paling van het effect op een celpopulatie van blootstelling aan een celvoedingsmiddel, met het kenmerk, dat de werkwijze de incubatie omvat van de celpopulatie met het genoemde voedingsmiddel»

30. Werkwijze volgens conclusies 2 tot 21, met het kenmerk, dat de cellen geïncubeerd worden met twee of meer dergelijke kleurstoffen en de optische eigenschap representatief is voor de verhouding van de intracellulaire concentraties van de genoemde kleurstoffen. 25 * * * * * 7915051