NL8003987A - Samenstelling voor het onderzoeken van biologische weefsels en/of vloeistoffen alsmede werkwijze onder toepassing daarvan. - Google Patents

Samenstelling voor het onderzoeken van biologische weefsels en/of vloeistoffen alsmede werkwijze onder toepassing daarvan. Download PDF

Info

Publication number
NL8003987A
NL8003987A NL8003987A NL8003987A NL8003987A NL 8003987 A NL8003987 A NL 8003987A NL 8003987 A NL8003987 A NL 8003987A NL 8003987 A NL8003987 A NL 8003987A NL 8003987 A NL8003987 A NL 8003987A
Authority
NL
Netherlands
Prior art keywords
cells
liquids
dye
composition
sample
Prior art date
Application number
NL8003987A
Other languages
English (en)
Original Assignee
Eni Ente Naz Idrocarb
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eni Ente Naz Idrocarb filed Critical Eni Ente Naz Idrocarb
Publication of NL8003987A publication Critical patent/NL8003987A/nl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
    • C12Q2304/10—DNA staining
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/37—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi
    • G01N2333/39—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts
    • G01N2333/395—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from fungi from yeasts from Saccharomyces

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Description

* -1-
803238/vdV/vL
Korte aanduiding: Samenstelling voor liet onderzoeken van "biologische •weefsels en/of vloeistoffen alsmede werkwijze onder toepassing daarvan
De uitvinding heeft "betrekking op een speciale samenstelling voor het onderzoeken van "biologische weefsels en/of vloeistoffen, d.w.z. het aantonen van "bepaalde daarin aanwezige "bestanddelen. Verder heeft de uitvinding "betrekking op een werkwijze waarbij van deze samenstelling gebruik 5 gemaakt wordt. Voor het volledige begrip van het onderwerp en de oogmerken van de onderhavige uitvinding is het van belang een aantal algemene beginselen die de theoretische grondslag van het betreffende onderwerp vormen nader te beschouwen.
Als een stof zichtbaar of ultraviolet absorbeert zullen zoals be-10 kend de daarin aanwezige elektronen van de grondtoestand in de aangeslagen "singulet" toestand overgaan.
Daarbij kunnen overgangen tussen de verschillende systemen optreden onder vorming van metastabiele "triplet"-toestanden, waarin de elektronen gevangen blijven totdat zij door een reactie (ontmoeting met een 15 ander molecuul) of door lichtemissie (fosforescentie) of door een andere naar verhouding altijd langzaam verlopende reactie hun energie kwijtraken.
Dit verschijnsel kan gemakkelijk in verschillende soorten natuurlijke en synthetische kleurstoffen worden vastgesteld.
20 Een veel toegepaste methode voor het bestuderen en kwantitatief bepalen van deze verschijnselen is de zogenaamde flits-fotolyse-methode, waarbij het monster dat te onderzoeken stof bevat met een pulserende lichtbron (flits) bestraald wordt waardoor een aantal kleurmoleculen in de aangeslagen elektronentoestand overgaat.
25 Men kan het verloop van deze processen waarnemen door met behulp van een geschikt elektronisch apparaat (oscilloscoop enz.) de absorptie door het monster van een continu mono-chromatische lichtstraal als functie van de tijd vast te stellen.
Men heeft deze methode de laatste jaren wat de gevoeligheid betreft 30 aanzienlijk verbeterd door als aanslagbron pulserende lasers te gebruiken.
Dergelijke methoden worden niet voor het onderzoeken en analyseren van biologische weefsels en/of vloeistoffen toegepast met als enige uitzondering weefsels die een grote hoeveelheid natuurlijke lichtgevoe- 800 3 9 87 * -2- lige stoffen bevatten bij voorbeeld de pigmenten van de chlorofyl-foto-synth.ese, rhodopsine en carboxyhemoglobine.
Als het weefsel slechts weinig gekleurd is, wordt het flitslicht in de meeste gevallen verstrooid in plaats.van geabsorbeerd. Men kan het 5 weefsel echter met een synthetische kleurstof kleuren, zoals dat bij optisch microscopisch onderzoek gebruikelijk is. Het feit dat een kleurstof in staat is het weefsel te kleuren betekent dat op een of andere wijze een verbinding tot stand is gekomen.
Er zijn echter bij de toepassing van flitsfotolysetechnieken bij 10 monsters met een sterke diffusiewerking tenminste twee fundamentele problemen.
Als in de eerste plaats de hoeveelheid gebonden kleurstof gering is is het twijfelachtig of men met deze methode voldoende signalen verkrijgt. Ten tweede kon niet voorzien worden of de absorptiesignalen die 15 kenmerkend zijn voor de metastabiele toestand van de kleurstof, in het geval van een met een bijzonder weefsel verbonden kleurstof verschillend zouden zijn van die welke afkomstig zijn van molekulen in oplossing of op andere wijze gebonden molekulen.
Men heeft nu geheel onverwachts gevonden dat het mogelijk is beide 20 moeilijkheden te overwinnen door addukten te bereiden van het bestanddeel van de betreffende biologische weefsels en/of vloeistoffen met een synthetische kleurstof of tenminste een kleurstof die niet in fysiologische vloeistoffen of oplossingen voorkomt, door het te onderzoeken monster in aanraking te brengen met een samenstelling die het eerste onderwerp 25 van de uitvinding vormt en bestaat uit de kleurstof, een medium dat met de biologische weefsels en/of vloeistoffen verenigbaar is. en een stof die in staat is de kleurstofmolekulen bij aanraking van hun energie te ontdoen (quencher).
De samenstelling die met het fysiologische bestanddeel een addukt 30 vormt bestaat uit a) êên van de kleurstoffen azine, oxazine., acridine of xantheen, of uit een in water oplosbare kleurstof van de ”diazo"-groep, of trifenylmethaan; b) een medium dat met het fysiologische bestanddeel verenigbaar is en bestaat uit een waterige oplossing die verschillende zouten bevat, bij voorbeeld NaCl, CaCl^ enz., in een zodanige concentratie 35 dat de oplossing ongeveer isotonisch is met het fysiologische bestanddeel (0,1-1 gev.%) en andere bestanddelen in kleinere hoeveelheden, bij voorbeeld glucose, een buffermengsel enz., die toegevoegd worden om de 800 3 9 87 * -* -3- aanwezige cellen in de gewenste conditie te brengen., waarbij de pH van het medium enigszins van de neutrale toestand kan afwijken (pH tot 9,5)» terwijl kleine hoeveelheden van een organisch oplosmiddel kunnen worden toegevoegd om de oplosbaarheid van de kleurstof te verbeteren; en 5 c) een middel dat de kleurstofmolekulen snel van hun energie kan ontdoen als twee molekulen elkander ontmoeten, d.w.z. kalium- (of natrium) jodide —2 (van 10 tot 0,2 M), of het zout van een paramagnetisch overgangsmetaal —2 (van 10” tot 0,2 M Co, Fe, Ni,‘in de vorm van CoCl^ enz.) eventueel in aanwezigheid van een chelaatvormende verbinding, bij voorbeeld éthyleen-10 diaminotétra-azijnzuur · (EDTA); of een bepaalde hoeveelheid molekulaire zuurstof (Og) opgelost in water (bij voorbeeld door verzadiging van de oplossing van het monster met 0^ bij een bepaalde temperatuur).
De aldus beschreven samenstelling wordt gebruikt om de biologische weefsels en/of vloeistoffen volgens de werkwijze der onderhavige uitvin-15 ding te onderzoeken.
Volgens deze werkwijze wordt een monster van de te onderzoeken stof eerst met de samenstelling behandeld, de verkregen stof eerst met pulserend licht, en vervolgens met monochromatisch licht bestraald, dat door het monster heen gaat, en wordt de uittredende lichtintensiteit van 20 de laatstgenoemde lichtstraal als funktie van de tijd gemeten.
Men heeft hierbij vastgesteld dat de signalen afkomstig van de absorptie door de metastabiele toestand van de met de te onderzoeken cellen verbonden kleurstofmolekulen wat betreft amplitude en/of tijd-variaties aanzienlijk afwijken van de signalen die afkomstig zijn van de 25 opgeloste molekulen of van andere cellen.
Volgens de onderhavige werkwijze kan men dus de afzonderlijke cellen in het weefsel indentificeren.
De werkwijze blijkt bijzonder geschikt te zijn voor het onderzoeken van fermenterende celculturen, het onderscheiden van dode en levende 30 cellen en het onderscheiden van gisteellen en bacteriëncellen; alsmede voor de kwantitatieve analyse van witte bloedlichaampjes.
Volgens de werkwijze is het mogelijk enerzijds automatische metingen uit te voeren (die slechts, enkele seconden duren) in plaats van de langdurige en ingewikkelde routinehandelingen die nodig zijn bij op-35 tisch microscopisch onderzoek, terwijl ook voor het oog onzichtbare eigenschappen met betrekking tot de specifieke molekulaire interaktie van de kleurstof met sommige celbestanddelen kunnen worden aangetoond.
800 3 9 87
De werkwijze kan dus gebruikt worden voor proeven die tot op dit ogenblik onuitvoerbaar waren of die alleen met behulp van zeer ingewikkelde methoden konden worden uitgevoerd. In het bijzonder kan de toepassing worden voorspeld bij tumordiagnose omdat de. DM-kleurstof-inter-5 aktie kwantitatief kan worden bepaald.
In de tekening toontÊg. 1 een schematische voorstelling van het apparaat dat voor deze proeven wordt gebruikt. is een kwiklamp en Sg een laserstraal. , L^, L·^ en zijn kwartslenzen. en Mg zijn spiegels en en Dg zijn vaste-stofdetectoren die de laserpuls meten.
10 MC is een zeer lichtsterke monochromator. S geeft de plaats van het monster aan/en PM is een fotomultiplicator. Terwille van de duidelijkheid zijn filters en diafragma's weggelaten.
De pulserende lichtstraal komt uit een Nd-laser, nl. een in de handel verkrijgbare YAG (Chromatix mod. 1000) die lichtpulsen van 15 0,1-0,5 mJ met een golflengte van ongeveer 150 ns en met een frequentie van ongeveer 50 Hz afgeeft.
De laserkleur is variabel van blauw (X = U73 nm) tot het nabije infrarood. De Qbservatiestraal.wordt verkregen met een.op geschikte wijze . gefilterde hoge-druk-kwiklamp. Beide stralen worden, op een zone van het 20 monster met een diameter van ongeveer 0,2 mm scherp gesteld, zodat tussen beiden een hoek van ongeveer 15° ontstaat. De cel voor het monster is 2 mm dik. Het licht van de lamp gaat via een monochromator,met een grote opening naar een fotomultiplicator (Philips XP1113). Het elektrische uitgangsvermogen van de fotomultiplicator wordt kontinu. als gemiddelde 25 waarde geregistreerd en eveneens naar een voorversterker met een door-gangsband tussen 0,5 KHz en 30 MHz gevoerd, versterkt, in een digitaal-geheugen geregistreerd en in een kleine computer (LABEÏÏ J0) opgeslagen.
Het signaal afkomstig van een enkele puls wordt geregistreerd en toegevoegd aan dat van honderden analoge pulsen. Op deze, wijze verkrijgt 30 men een gemiddeld signaal waarin de ruis gereduceerd is met een faktor van meer dan 10 ten opzichte van het signaal afkomstig van een enkele puls. Omdat de herhalingsfrequentie van de pulsen naar verhouding hoog is, verkrijgt men het resultaat van de metingen binnen enkele seconden. Door de opslag in een computer is reproduktie en verwerking van de signalen 35 met behulp van een magnetische band, plotters enz. mogelijk.
Het opgeslagen signaal bevat een aanzienlijke hoeveelheid gegevens, zoals de amplitude van de absorptie bij verschillende observatiegolf- 8003987 -5- lengten en de verandering ervan met de tijd.
Als deze amplitude gelijk is aan V (X , t), is het in het algemeen mogelijk λ en t zodanig te bepalen dat: V(X , t ) = k + k n , waarin n het voor het onderhavige doel ver-
0 0 I Cm O O
5 eiste aantal cellen voorstelt en k^ en konstanten zijn die men cali-hreren kan, d.w.z. door in het apparaat een monster met een bekende samenstelling te plaatsen.
Voorbeeld I
Onderzoeken van celculturen. Vitaliteitsproef. Toegepast op gistculturen 10 van het Saeeharomyces type, bij voorbeeld Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis enz.
De proef levert kwantitatieve resultaten met betrekking tot het aantal dode cellen in de fermentatie.
Experimentele methode. ïïet te onderzoeken eelmonster wordt met een meng-15 sel vermengd dat 10”^ Trypan Blauw en per·liter 0,1 g ïTaJJ^, 6,8 g KH^PO^, die met KOH op pH 7,2 is ingesteld, en 8,76 g HaCl bevat. CoCl_ wordt . _2 ..... d tot een eindconcentratie van 10 M gelijktijdig met eenzelfde hoeveelheid EDTA toegevoegd. Men roert het mengsel enkele minuten en meet met het hierboven beschreven apparaat.
20 Het monster wordt in een cel van 2 mm met een pulserende laser bij X = 659 nm bestraald, waarbij de absorptievariaties bij λ = 1+05 en ^-35 nm worden waargenomen na een vertraging van de laserpuls van 1 ^us. Kali-brer^ing is noodzakelijk om de waargenomen amplitude ten opzichte van de amplitude van de laserpuls, de optische opstelling enz. te kunnen ijken. 25 Hiervoor gebruikt men een suspensie waarin de gistcellen.geteld en vervolgens door enkele minuten koken allen gedood zijn.
Resultaten:
In fig. 2 toont de ordinaat de absorptie van het doorvallende licht (in mV) bij λ= k35 nm nadat een suspensie, die gedeeltelijk dode 30 Saccharomyces lactis cellen en Trypan blauw bevat, aan de hierboven beschreven pulserende bestraling bij X = 659 nm onderworpen is. De abscis geeft de tijd in microseeonden (^us) aan.
In fig. 3 is op de ordinaat de amplitude van het doorvallende licht (in mV) na 1 yus vanaf het begin van de laserpuls aangegeven. De 35 abscis geeft het volgens een bekende methode, bij voorbeeld tellen onder een optische microscoop, bepaalde percentage dode cellen in de suspensie aan.
800 39 87 -6-
De correlatie is zeer goed en het aantal dode cellen kan automatisch binnen slechts enkele seconden worden vastgesteld. De bereikbare
O
gevoeligheid.varieert ongeveer 100-1000 cellen/mm , d.w.z. minder dan 15¾ van de totale in de kweek aanwezige hoeveelheid.
5 Voorbeeld II
Onderzoek van celculturen. Verontreiniging door verschillende stammen.
Met dezelfde Tryp^an Blauw bevattende samenstelling die voor het reaktiemengsel van voorbeeld I gebruikt is kan men verschillende soorten cellen in een fermentatie onderscheiden. Bij twee verschillende gist-10 soorten van het Saccharomyces type verandert het waargenomen doorvallende licht bij 435 ma verschillend met de tijd. Bij voorbeeld bedraagt de halveringstijd (d.w.z. de tijd waarbinnen de amplitude van het doorvallende licht met een faktor 2 verminderd wordt) 2,3yus voor Saccharomyces lactis en 1,7 yus voor Saccharomyces fragilis.
15 Bij de dode bacteriëncellen van het Arthrobaeter type wordt geen doorvallend licht waargenomen. De werkwijze kan dus voor het onderzoek van gistverontreinigingen in bacteriëncultures, of voor het onderscheiden van verschillende gistsoorten toegepast worden. Hiervoor wordt voor de analyse een monster getrokken, alle aanwezige cellen door enkele minuten 20 koken gedood, het monster met het kleurstof bevattende mengsel behandeld en-de amplitude en de halveringstijd/liet doorvallende licht bij λ= 435 om van het monster na bestraling met pulsen bij \ - 650 nm gemeten.
Voorbeeld III
Meting van de hoeveelheid DNA in weefsels.
25 De werkwijze is geschikt voor de kwantitatieve bepaling van nucle- inezuren in menselijke cellen. Voor deze proef gebruikt men witte bloedlichaampjes in verschillende samenstellingen.
Men bereidt verschillende cellen bevattende monsters met gemakkelijk meetbare hoeveelheden DNA uit geëpariniseerd.menselijk bloed volgens 30 een bekende methode door centrifugeren in een Ficoll-gradiënt. Men gebruikt een lineaire Ficoll-gradiënt van 18$ tot 15$, waarbij de in lagen op de gradiënt aanwezige cellen 5 min. bij 50 x g en 7 min. bij 250 x g gecentrifugeerd worden. Er ontstaan verschillende banden.die na zuivering lymphocyten, monocyten. en granulocyten alsmede kleine hoeveelheden rode 35 bloedlichaampjes bevatten. De aldus verkregen witte cellen worden onder een microscoop op de bekende wijze op strips geteld en geanalyseerd.
Hierbij kan men de DNA in het monster kwantitatief bepalen omdat het ge- 80 0 3 9 87 -7- middelde chromatinegehalte in elk celtype bekend is.
De verschillende verkregen frakties worden afzonderlijk en in bekende hoeveelheden met elkaar vermengd gekleurd.
Voor het kleuren centrifugeert men de cellen.en suspendeert in -5 . . . . .
5 5 x 10 M Acridine Oranje m een fysologische oplossing die 0,05 M van -2 —2 een fosfaatbuffer (pH J,2) alsmede 10“ M CoCl^ en 10 M EDTA bevat.
.De aldus verkregen suspensie wordt in het hierboven beschreven apparaat met pulserende lichj: met een. golflengte tussen λ = lf-73 en X= 532 nm bestraald.
10' .De waarnemingen worden bij continu licht met λ = 1^35 om uitgevoerd.
Men past dezelfde werkwijze toe op een monster dat dezelfde reagentia maar geen kleurstof bevat. Dit is noodzakelijk omdat kleine hoeveelheden carboxyhemoglobine de absorptie van het doorvallende licht zouden kunnen beïnvloeden.
15 Het doorvallend licht dat men met het monster zonder kleurstof verkrijgt wordt afgetrokken van dat van het •volledige mengsel, waardoor men de resultaten zoals weergegeven in fig. 1+ verkrijgt.
De ordinaat geeft de amplitude van het doorvallend licht aan (in mV) en de abscis de tijd in ^us.
20 De veranderingen in de absorptie worden van het doorvallend licht op de eerder beschreven wijze bij A= h-35 nm vastgesteld, bij bestraling bij λ = 532 nm van een suspensie die menselijke granulocyten en Acridine Oranje bevat.
De amplitude 1 ^us na de bestraling met de laser is. evenredig met 25 het DNA-gehalte van het monster zoals weergegeven in fig. 5· in deze figuur is de amplitude van het doorvallend licht (in mV) aangegeven als funktie van het DHA-gehalte (uitgedrukt in mg/l) voor verschillende soorten cellen, nl. lymphocyten en monocyten in verschillende verhoudingen, of uitsluitend monocyten, uitsluitend granulocyten of uitsluitend leuco- 30 cyten. De monsters bevatten verschillende hoeveelheden erythroeyten en zijn van verschillende donors afkomstig.
Het feit dat deze evenredigheid verkregen wordt-voor verschillende gehalten van verschillende cellen afkomstig van verschillende personen maakt het waarschijnlijk dat de werkwijze ook betrouwbaar kan worden toe- 35 gepast op biologische weefsels van andere oorsprong, bij voorbeeld epitheel-weefsels enz.
Bepaling van het DHA-gehalte en van het aantal cellen in weefsels 800 3 § 87 -8- kan van belang zijn bij vroege diagnose van kanker.
Voorbeeld IV
Bepaling van bet aantal leucoeyten in menselijk bloed.
Toepassing op niet stollende bloedmonsters.
5 Hierbij kan het totale aantal leucoeyten .en het aantal granulocyten, monocyten en lymphocyten kwantitatief bepaald worden.
Experimentele methode. Aan een monster van menselijk aderlijk bloed dat met 0,1 tot 0,2 mg heparine, of met 1 mg natrium-EDTA per ml bloed niet stollend gemaakt is, voegt men 3,5% dextranoplossing (molgewicht 250.000) 10 tot een uiteindelijke concentratie van 1,5% toe, waarna men het mengsel 20 min. bij een konst ante temperatuur van 37°C bewaart. Men verwijdert de bovendrijvende vloeistof die de witte cellen en ongeveer 1% van de rode cellen bevat en voegt gedestilleerd water toe om het zoutgehalte tot 0,25%®(promille) te verlagen. Na precies 30 sec. wordt het isotonisch 15 karakter door toevoeging van een 3,5%'s NaCl-oplossing in water hersteld.
Men verzamelt de cellen door centrifugeren bij bOO x g (zwaartekracht) gedurende 5 min, waarna men ze in een waterige 0,9%’s NaCl-oplos-sing of een 0,1 M fosfaatbuffer met pH 7,1 in een dergelijke hoeveelheid 3 suspendeert dat het aantal lymphocyten ongeveer 8000 per mm bedraagt.
20 De leucoeyten worden tot ongeveer 95% teruggewonnen, met een procentuele samenstelling die niet van die van bloed te. onderscheiden is waarbij de overblijvende rode cellen in een verhouding 1:1 tot de witte cellen staan. De metingen worden uitgevoerd met 200 microliter celsuspensie in een cel met een optische weg van 2 mm, waaraan een kleurstof en een energie-ont-25 trekker (quencher) zijn toegevoegd. De cellen kunnen van tevoren worden gefixeerd. Hierbij worden de volgende kleurtechnieken toegepast.
Men voegt aan de celsuspensie CoCl0-EDTA en Brilliant Groen in 2 -2 -b
een uiteindelijke concentratie van resp. 10 en 9.10 M toe. Volgens een andere kleuringsmethode worden.de cellen tot een uiteindelijke con-30 centratie van 12%·.met ethanol behandeld. Na 1 min. voegt men CoCl^-EDTA
en Brilliant Cresyl Blauw tot een uiteindelijke concentratie, van resp.
-2-5 . .
10 en 5.10 M toe. Een derde gunstig gebleken kleuringsmethode is gelijk aan de tweede, waarbij men echter de kleurstof Nile Blauw in een hoeveelheid van 8.10 ^ M toevoegt.
35 De aldus verkregen monsters worden vervolgens met het in de inlei ding beschreven pulserende lasersysteem bij 559 nm bestraald en met monochromatisch licht bij λ= 1+35 om en daarna λ = 5^7 nm onderzocht.
800 3 9 87 -9-
Met de twee verschillende kleurtechnieken kan men dus vier verschillende transmissies verkrijgen, waarvan de eigenschappen met de te meten grootheden kunnen worden gecorreleerd.
Resultaten: 5 De waarnemingen van de aldus behandelde bloedmonsters worden ver geleken met die van de bekende methoden, d.w.z. microscopisch onderzoek van normaal bloed. In de fig. 6 en 7 zijn als voorbeeld een aantal van dergelijke transmissies weergegeven. Fig. 6 toont meer in het bijzonder de amplitude in mV bij λ = 5^7 nm bij het met Brilliant Cresyl Blauw ge-10 kleurde en met ethanol gefixeerde monster, waarbij de abscis de tijd in microseconden aangeeft. De amplitude Δν zoals gemeten in de figuur tussen de piek en de waarde na een lang tijdsverloop is evenredig met het totale aantal monoeyten. Hierbij wordt erop gewezen dat in dit voorbeeld de aanwezigheid van Co-EDTA van belang is om de verdwijning van de signa-15. len afkomstig van andere cellen of van de vrije kleurstoffen te kunnen bepalen. Fig. 7 toont de transmissie bij λ = U35 ma bij een met Brilliant Groen gekleurd monster (de ordinaat is in mV en de abscis in microseconden zoals in het voorgaande geval). De breedte van de trap, overeenkomende met de aanslag van de triplettoestand van de kleurstof, die waarschijnlijk 20 verbonden is met de celkernen zoals waargenomen onder de microscoop, kan goed met het totale aantal leucocyten gecorreleerd worden.
Zoals uit de tekening blijkt is het verloop van het verval bovendien dubbelfasig. De snelle fase die gewoonlijk bij λ = lj-35 om en λ = 5hj nm gemeten wordt is tenslotte evenredig met het aantal lymphocyten. 25 Op deze wijze heeft men de drie belangrijke parameters vastgesteld (aantal lymphocyten (1), aantal monoeyten (m) en het aantal, granulocyten (g), terwijl het totale aantal leucocyten (n) gelijk is aan het totaal van de drie, d.w.z. n = 1+m+g). Hierbij wordt de aandacht erop gevestigd dat slechts een klein gedeelte van de geregistreerde informatie van de waar-30 genomen transmissies voor deze bepalingen gebruikt is terwijl men beschikt over de onafhankelijke waarnemingen van de duur van het verval van de triplettoestanden en de verhoudingen tussen de amplituden.bij verschillende waarden van A, waarmee andere bepalingen., bij voorbeeld de aanwezigheid van pathologische cellen, kunnen worden uitgevoerd.
800 39 87

Claims (3)

1. Samenstelling voor het vaststellen van de "bestanddelen van biologische weefsels en/of vloeistoffen, bestaande uit: a) êén van de kleurstoffen xantheen, azine, oxazine of acridine, een in water oplosbare kleurstof van de diazo-reeks, of trifenylmethaan; 5 b) een medium dat met de biologische weefsels en/of vloeistoffen verenigbaar is; c) een stof die in staat is de kleurstofmoleculen bij ontmoeting snel van hun energie te ontdoen.
2. Samenstelling volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de kleur- . . . . _5 _1| 10 stof aanwezig is m een hoeveelheid, van 10. tot 10 M.
3. Werkwijze voor het onderzoeken van biologische weefsels en/of vloeistoffen, met het kenmerk, dat men de betreffende monsters behandelt met een samenstelling bestaande uit: a) een van de kleurstoffen xantheen, azine, oxazine of acridine, een in 15 water oplosbare kleurstof van dédiazo-reeks,. of trifenylmethaan; b) een medium dat met de biologische weefsels en/of vloeistoffen verenigbaar is; c) een stof die in staat is de kleurstofmolekulen bij ontmoeting snel van hun energie te ontdoen, waarna men het verkregen mengsel met een 20 eerste bundel pulserend licht bestraalt en een tweede bundel monochroma-tisch licht door het aldus behandelde monster laat vallen, en de optische intensiteit van het uittredende licht van de tweede bundel als funktie van de tijd analyseert. 25 800 39 87
NL8003987A 1979-09-10 1980-07-10 Samenstelling voor het onderzoeken van biologische weefsels en/of vloeistoffen alsmede werkwijze onder toepassing daarvan. NL8003987A (nl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT2556879 1979-09-10
IT25568/79A IT1123573B (it) 1979-09-10 1979-09-10 Composizione adatta al controllo di tessuti e/o liquidi biiologici e metodo impiegante la stessa

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NL8003987A true NL8003987A (nl) 1981-03-12

Family

ID=11217121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NL8003987A NL8003987A (nl) 1979-09-10 1980-07-10 Samenstelling voor het onderzoeken van biologische weefsels en/of vloeistoffen alsmede werkwijze onder toepassing daarvan.

Country Status (20)

Country Link
US (2) US4331759A (nl)
JP (1) JPS5640740A (nl)
AT (1) AT371837B (nl)
AU (1) AU536677B2 (nl)
BE (1) BE884217A (nl)
BR (1) BR8004357A (nl)
CA (1) CA1150603A (nl)
CH (1) CH648125A5 (nl)
DE (1) DE3026185C2 (nl)
DK (1) DK157264C (nl)
ES (1) ES493614A0 (nl)
FI (1) FI72611C (nl)
FR (1) FR2466019A1 (nl)
GB (1) GB2059582B (nl)
IE (1) IE50002B1 (nl)
IT (1) IT1123573B (nl)
LU (1) LU82587A1 (nl)
NL (1) NL8003987A (nl)
NO (1) NO153869C (nl)
SE (1) SE442347B (nl)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4707454A (en) * 1981-08-10 1987-11-17 Bio-Diagnostics, Inc. Fluorescent chlorophyll labeled assay reagents
US4906561A (en) * 1981-09-14 1990-03-06 Thornthwaite Jerry T Nuclear isolation medium and procedure for separating cell nuclei
US4622291A (en) * 1984-06-11 1986-11-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Method and device for quantitative end point determination in immunofluorescence using microfluorophotometry
US4707451A (en) * 1985-09-18 1987-11-17 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes
EP0226272B1 (en) * 1985-11-01 1991-03-06 Becton, Dickinson and Company Detection of reticulocytes
US5319079A (en) * 1986-05-15 1994-06-07 Beckman Instruments, Inc. Process for terminal substituting of a polynucleotide
US5171669A (en) * 1987-05-04 1992-12-15 Eastman Kodak Company Cobalt(III) reagents in combination with water soluble polymers
US5141855A (en) * 1986-07-28 1992-08-25 Eastman Kodak Company Signal amplifying cobalt (III) redox reagents and methods for the determination of analytes in aqueous fluids
US4963478A (en) * 1988-07-05 1990-10-16 Immucor, Inc. Article for preforming immunological assays utilizing organic dyes and method for producing and utilizing same
US5413915A (en) * 1988-07-12 1995-05-09 Resource Technologies Group, Inc. Method and sensor for detecting toxic chemical exposure effects and metabolic activation of carcinogenic chemical agents
FR2636646B1 (fr) * 1988-09-19 1990-12-21 Tepral Sa Procede de detection specifique et de denombrement des micro-organismes dans des produits filtrables
JP2595423B2 (ja) * 1992-08-05 1997-04-02 大和ハウス工業株式会社 無溶接トラス
US5407794A (en) * 1992-09-08 1995-04-18 Cytocolor Inc. Oxazine stained lymphocytes and method
US5480613A (en) * 1992-10-22 1996-01-02 Riordan; Neil H. Apparatus kit for detecting Dientamoeba fragilis
US5610027A (en) * 1992-10-30 1997-03-11 Micro-Med, Inc. Microphoto lysis-anlaysis process to measure cell characteristics
EP1089078B1 (en) * 1994-10-20 2007-02-28 Sysmex Corporation Reagent and method for analyzing solid components in urine
JP4509607B2 (ja) * 2004-03-17 2010-07-21 シスメックス株式会社 細胞分析装置および方法
US20090042241A1 (en) 2007-04-06 2009-02-12 California Institute Of Technology Microfluidic device
US20140170678A1 (en) 2012-12-17 2014-06-19 Leukodx Ltd. Kits, compositions and methods for detecting a biological condition
US10610861B2 (en) 2012-12-17 2020-04-07 Accellix Ltd. Systems, compositions and methods for detecting a biological condition
JP6298474B2 (ja) 2012-12-17 2018-03-20 レウコドゥックス，リミテッド 生物学的状態を検出するシステムおよび方法
CN116990101B (zh) * 2023-09-27 2023-12-15 四川大学华西医院 一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL251599A (nl) * 1959-05-15
US3298789A (en) * 1964-12-14 1967-01-17 Miles Lab Test article for the detection of glucose
US3682783A (en) * 1971-03-15 1972-08-08 Photovolt Corp Method for coulometric karl fischer titration
US4146604A (en) * 1973-05-31 1979-03-27 Block Engineering, Inc. Differential counting of leukocytes and other cells
US4094745A (en) * 1973-06-22 1978-06-13 John Scholefield Method of staining microscopic organisms
US3899297A (en) * 1973-12-19 1975-08-12 Block Engineering Biological staining technique and mixture thereof
US4174384A (en) * 1975-06-30 1979-11-13 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4207469A (en) * 1975-08-02 1980-06-10 Sir Howard Grubb Parsons and Company Ltd. Analysis of emulsions and suspensions
US4233402A (en) * 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4219337A (en) * 1978-04-27 1980-08-26 The Medical College Of Wisconsin Assay for proteins and polypeptides
US4225783A (en) * 1978-07-24 1980-09-30 Abbott Laboratories Determination of microbial cells in aqueous samples
US4225669A (en) * 1979-04-27 1980-09-30 Melnick Joseph L Staining and analysis of bacteria
JPS55116259A (en) * 1979-03-01 1980-09-06 Fuji Photo Film Co Ltd Microimmunoassay method
US4252783A (en) * 1979-06-18 1981-02-24 Syva Company Reducing fluorescent background in fluorescent immunoassays
US4336029A (en) * 1980-08-15 1982-06-22 Ortho Diagnostic Systems Inc. Method and reagents for quantitative determination of reticulocytes and platelets in whole blood

Also Published As

Publication number Publication date
FR2466019B1 (nl) 1983-12-23
DE3026185A1 (de) 1981-03-19
DK282480A (da) 1981-03-11
DK157264B (da) 1989-11-27
SE8005060L (sv) 1981-03-11
GB2059582A (en) 1981-04-23
JPH0131139B2 (nl) 1989-06-23
NO802050L (no) 1981-03-11
AU536677B2 (en) 1984-05-17
FR2466019A1 (fr) 1981-03-27
FI72611C (fi) 1987-06-08
US4376820A (en) 1983-03-15
FI72611B (fi) 1987-02-27
IE50002B1 (en) 1986-01-22
LU82587A1 (fr) 1981-02-02
ES8106057A1 (es) 1981-07-01
AT371837B (de) 1983-08-10
ES493614A0 (es) 1981-07-01
CH648125A5 (it) 1985-02-28
AU5961580A (en) 1981-03-19
BE884217A (fr) 1981-01-08
US4331759A (en) 1982-05-25
DE3026185C2 (de) 1983-11-24
BR8004357A (pt) 1981-04-28
ATA357580A (de) 1982-12-15
CA1150603A (en) 1983-07-26
JPS5640740A (en) 1981-04-17
IT7925568A0 (it) 1979-09-10
IT1123573B (it) 1986-04-30
NO153869B (no) 1986-02-24
NO153869C (no) 1986-06-04
SE442347B (sv) 1985-12-16
DK157264C (da) 1990-05-07
IE801417L (en) 1981-03-10
FI802211A (fi) 1981-03-11
GB2059582B (en) 1983-08-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NL8003987A (nl) Samenstelling voor het onderzoeken van biologische weefsels en/of vloeistoffen alsmede werkwijze onder toepassing daarvan.
Lakowicz et al. Fluorescence lifetime-based sensing of pH, Ca2+, K+ and glucose
US4751188A (en) Method for the simultaneous quantitative determination of cells and reagent therefor
Chen et al. Fluorescence fluctuation spectroscopy
Müller et al. [4] Fluorescence correlation spectroscopy
EP0552241B1 (en) Method and apparatus for performing phase fluorescence lifetime measurements in flow cytometry
Dahan et al. Ratiometric measurement and identification of single diffusing molecules
JP2802710B2 (ja) 全血中の網状赤血球を識別する方法及びそのための試薬組成物
Szmacinski et al. Lifetime-based sensing
US5175109A (en) Reagent for classifying leukocytes by flow cytometry
Visser et al. Intracellular pH-determination by fluorescence measurements.
Du et al. Calibration of the calcium dissociation constant of Rhod2in the perfused mouse heartusing manganese quenching
EP4257974A1 (en) Sample analysis method, sample analyzer, and computer-readable storage medium
Worthington et al. Flow cytometric analysis of megakaryocyte differentiation
AU596270B2 (en) Process and equipment for the rapid determination of the spermium cell count and/or living spermium count
EP0259833B1 (en) Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry
WO1988003955A1 (en) Differential binding of potential sensitive materials by lymphocytes
Gerritsen et al. One-and two-photon confocal fluorescence lifetime imaging and its applications
Raudsepp et al. Spatiotemporal studies of lipid oxidation by optical microscopy
Steinkamp Fluorescence lifetime flow cytometry
Rüttinger Confocal microscopy and quantitative single molecule techniques for metrology in molecular medicine
US20030036049A1 (en) Optical method for testing sensitivity of cells
Steinkamp et al. Phase-sensitive detection as a means to recover fluoresence signals from interfering backgrounds in analytical cytology measurements
CA1200477A (en) Method for detecting luminescence in living cell system
Docchio et al. Time-resolved fluorescence microscopy: Examples of applications to biology

Legal Events

Date Code Title Description
BATV A request for search has been withdrawn
BA A request for search or an international-type search has been filed
BB A search report has been drawn up
A85 Still pending on 85-01-01
BC A request for examination has been filed
BV The patent application has lapsed