CH648125A5 - Composizione adatta al controllo di tessuti e/o liquidi biologici e utilizzazione della stessa. - Google Patents

Description

La presente invenzione si riferisce ad una particolare composizione adatta al controllo di tessuti e/o liquidi biologici, alla verifica cioè della presenza, in questi, di particolari costituenti; essa si riferisce inoltre al metodo di controllo che prevede l'impiego della composizione suddetta.

È opportuno considerare, per una completa comprensione degli oggetti e degli scopi della presente invenzione, alcuni concetti di carattere generale che costituiscono il supporto teorico della materia considerata.

È noto che, quando una sostanza assorbe luce visibile o ultravioletta, un elettrone in essa contenuto passa dallo stato fondamentale ad uno stato eccitato di «singoletto». Successivamente può avvenire il processo cosiddetto di «in-tersystem crossing» con la creazione di stati metastabili di «triplette» nei quali l'elettrone rimane intrappolato finché non avviene la diseccitazione attraverso una reazione di «quenching» (mediante l'incontro con un'altra molecola) ovvero per emissione di luce (fosforescenza) o tramite altri processi tutti relativamente lenti.

Questi fenomeni sono facilmente rilevabili in diverse categorie di sostanze colorate sia nautrali che di sintesi.

Un metodo largamente usato per lo studio e la determinazione quantitativa di questi fenomeni è quello cosiddetto di «flash photolysis», nel quale il campione contenente la sostanza da studiare viene sottoposto all'irraggiamento di ima sorgente luminosa impulsiva (flash) che porta un discreto numero di molecole colorate nello stato elettronico eccitato.

L'evolversi dei processi sopra menzionati viene poi osservato mediante la rivelazione dell'assorbimento da parte del campione di un secondo fascio di luce, continuo e monocromatico, che si registra nel tempo con un opportuno dispositivo elettronico (oscilloscopio, ecc.).

Questo tipo di tecniche ha subito negli anni recenti un notevole progresso qualitativo, in termini di una più elevata sensibilità ottenibile, grazie all'impiego di laser impulsati come sorgente perturbativa.

Non è noto l'impiego di tecniche di questo genere per lo studio e la caratterizzazione di tessuti e/o liquidi biologici, fatta salva la notevole eccezione riguardante il caso in cui nel tessuto in esame sia contenuta in grande quantità una sostanza fotosensibile naturale, come nel caso dei pigmenti della fotosintesi clorofilliana, della rodopsina, della carbossiemoglobina.

In un tessuto poco colorato, infatti, la luce del flash subisce preferenzialmente processi di diffusione piuttosto che essere assorbita. Si può però colorare il tessuto con sostanze coloranti sintetiche come usuale nelle procedure di osservazione al microscopio ottico: il fatto stesso che la sostanza riesce a colorare un tessuto significa infatti che essa in qualche modo vi si lega.

Tuttavia esistevano almeno due difficoltà di principio per l'impiego di tecniche di flash photolysis in questo contesto, in campioni con forti effetti di diffusione.

In primo luogo, essendo le concentrazioni del colorante legato piuttosto basse, era alquanto dubbio che si riuscisse ad ottenere segnali significativi con questo metodo. Ed in secondo luogo non era prevedibile a priori che i segnali provenienti dagli assorbimenti caratteristici degli stati metastabili del colorante fossero differenti nel caso del colorante legato ad un particolare tessuto rispetto a quelli provenienti dalle molecole in soluzione ovvero legate diversamente.

Ora noi abbiamo sorprendentemente trovato che è possibile superare entrambe queste difficoltà se si preparano addotti del costituente del tessuto e/o liquido biologico cui si è interessati con una sostanza colorante sintetica, o comunque, non presente in fluidi o soluzioni fisiologiche, mettendo in contatto il campione da esaminare con una composizione che costituisce il primo oggetto dell'invenzione, costituita dalla sostanza colorante, appunto, e da un mezzo compatibile con il tessuto e/o liquido biologico e inoltre da una sostanza capace di diseccitare le molecole del colorante quando si incontra con esse («quencher»).

Come accennato, la composizione che forma l'addotto con il costituente fisiologico è formata da: a) una sostanza colorante scelta nella serie delle Azine, delle Ossazine,

delle Acridine o nella serie dello Xantene, ovvero tra alcuni coloranti solubili in acqua della serie «disazo», e del «tri-fenilmetano»; b) da un mezzo compatibile con il costituente fisiologico, costituito da una soluzione acquosa contenente sali diversi, quali NaCl, CaCl2 e simili in concentrazione tali da essere circa isotonica con il componente fisiologico (0,1-1% in peso) e da altri componenti in proporzione minore come glucosio, miscele tampone, ecc. aggiunti in modo da condizionare la vitalità delle cellule presenti, il pH del mezzo può variare alquanto intorno alla neutralità (da pH n 4,5 a pH n 9,5), inoltre piccole quantità di solventi organici possono essere aggiunti per aumentare la solubilità del colorante; c) da una sostanza «quencher» (che cioè causa la rapida diseccitazione delle molecole del colorante quando le due molecole si incontrano) che può essere potassio (o sodio) ioduro (da IO-2 a 0,2 M), ovvero il sale di un metallo di transizione paramagnetico (da IO-2 a 0,2 M di Co, Fo, Ni, scelto come CoCl2 o simili) anche in presenza di una sostanza chelante come acido etilendiammino tetraacetico (EDTA); ovvero infine si può usare come quencher una quantità definita di ossigeno molecolare (Oa) sciolto nell'acqua (saturando per esempio di 02 la soluzione campione ad una temperatura determinata).

La composizione di cui alle precedenti righe viene utilizzata per l'esecuzione di un metodo di controllo di tessuti e/o liquidi biologici, che costituisce a sua volta il secondo oggetto della presente invenzione.

Tale metodo consiste in un preliminare trattamento del campione di sostanza da esaminare con la composizione stessa, nel sottoporre quanto ottenuto ad un irraggiamento con un primo raggio di luce ad impulsi, nel far attraversare il campione così trattato con un secondo raggio di luce monocromatica e nell'analizzare l'intensità ottica in uscita di quest'ultimo in funzione del tempo.

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Si è trovato in questo modo che i segnali provenienti dall'assorbimento di stati metastabili di molecole di colorante legate nelle cellule da esaminare sono nettamente differenti in ampiezza e/o nello sviluppo temporale da quelli provenienti dalle molecole in soluzione o da altre cellule. Il metodo riesce così a caratterizzare le singole cellule presenti nel tessuto.

Questo metodo è risultato particolarmente adatto nel controllo di culture di cellule in fermentazione, per distinguere le cellule morte dalle vive, e le cellule di lievito da quelle dei batteri; e nell'analisi quantitativa dei leucociti del sangue.

Il metodo è in grado di fornire da una parte misure automatiche (di pochi secondi di durata) sostitutive di lunghe e fastidiose procedure di routine che utilizzano il microscopio ottico. D'altra parte può riuscire ad evidenziare caratteristiche non distinguibili a occhio, relative all'interazione molecolare specifica del colorante con alcuni dei costituenti cellulari.

Può quindi essere utilizzato per controlli oggi non effettuabili ovvero possibili solo con tecniche assai più complesse. È in particolare facilmente prevedibile un suo impiego eventuale nella diagnostica anti-tumori per la possibilità di rivelare in modo quantitativo l'interazione DNA-colorante. A titolo illustrativo, ma non limitativo, si mostra nella fig. 1 lo schema dell'apparato da noi usato in queste prove.

Sx è la lampada a mercurio ed S2 è il fascio laser.

Lj, L2, L3, L4 sono lenti di quarzo. Mx, M2 specchi, Dj, D2 sono detectors a stato solido che rivelano l'impulso del laser. MC è il monocromatore ad alta luminosità. S indica la posizione del campione. PM il fotomoltiplicatore. Filtri e diaframmi sono omessi per chiarezza.

Il fascio di luce impulsato era ottenuto con un laser a Nd: YAG commerciale (Chromatix mod. 1000) che emette impulsi di luce di 0,1-0,5 mJ, lunghi circa 150 ns, e con una frequenza di ripetizione di circa 50 Hz.

Il colore del laser è variabile dal blu (X = 473 nm) all'infrarosso vicino. Il fascio di osservazione era realizzato con una lampada al mercurio ad alta pressione opportunamente filtrata. Entrambi i fasci venivano focalizzati in una zona del campione di circa 0,2 mm di diametro formando tra di essi un angolo di circa 15°. La cella porta-campioni era spessa 2 mm. La luce proveniente dalla lampada passava attraverso un monocromatore a grande apertura ed era inviata ad un fotomoltiplicatore (Philips XP 1113). L'uscita elettrica del fotomoltiplicatore da una parte veniva registrata come valore medio in continuo, dall'altra era inviata ad un preamplificatore con banda passante tra 0,5 KHz a 30 MHz e successivamente amplificata, registrata su memorie digitali e memorizzata su un piccolo calcolatore (LABEN 70).

Il segnale ottenuto con un singolo impulso era registrato e sommato a quello proveniente da centinaia di impulsi analoghi: si otteneva così una media del segnale in cui il rumore era ridotto di oltre un fattore 10 rispetto al segnale dovuto ad un singolo impulso. Essendo la frequenza di ripetizione degli impulsi relativamente alta, il risultato delle misure è ottenibile in pochi secondi. La memorizzazione su calcolatore rendeva possibile poi la riproduzione e l'elaborazione del segnale utilizzando unità a nastro magnetico, plotter, ecc.

Il segnale memorizzato contiene una notevole quantità di informazioni, come l'ampiezza, con la sua evoluzione temporale, dell'assorbimento a diverse lunghezze d'onda di osservazione.

Sia tale ampiezza V (X, t), risulta in genere possibile fissare X e t in modo che:

V (X0, to) = kj + k2 nc dove nc è il numero di cellule interessanti per i nostri fini e kt e k2 sono costanti ottenibili con un procedimento di taratura, introducendo cioè nell'apparecchio un campione di composizione nota.

Esempio 1

Controllo di culture di cellule. Teste di vitalità

Si applica a culture di lieviti del genere Saccharomyces, come Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis, o analoghi. Il test fornisce una misura quantitativa del numero di cellule morte presenti nella fermentazione.

Metodo sperimentale. Il campione di cellule da controllare si mescola con una miscela contenente IO-4 M di Try-pan Blue ed inoltre per ogni litro, 0,1 g di NaN3, 6,8 g di KH2P04 portato a pH 7,2 con KOH, e 8,76 g di NaCl. Si aggiunge CoCl2 ad una concentrazione finale IO-2 M in presenza di una eguale concentrazione di EDTA. Si agita per qualche minuto poi si sottopone a misura, con l'apparato descritto sopra. Si irraggia il campione in una cella di 2 mm utilizzando il laser impulsato a X = 659 nm, e si osservano le variazioni di assorbanza a X = 405 e 435 nm, dopo 1 p,s di ritardo dall'impulso laser.

Una taratura è necessaria per calibrare l'ampiezza osservata con l'ampiezza dell'impulso laser, l'allineamento ottico, ecc. Si utilizza per questo scopo una sospensione in cui le cellule del lievito sono contate e quindi uccise tutte mediante ebollizione per qualche minuto.

Risultati:

In fig. 2 è riportato in ordinata l'andamento dell'assorbimento transiente (in mV) osservato a X = 435 nm, quando si irraggia a X = 659 nm ad impulsi una sospensione contenente cellule di Saccharomyces lactis in parte uccise, e Trypan Blue, come descritto in precedenza. In ascissa è riportato il tempo in microsecondi (|ìs).

In fig. 3 è riportato l'andamento dell'ampiezza del transiente (in mV) osservata dopo 1 |xs dall'inizio dell'impulso laser. In ascissa è riportata la percentuale di cellule morte della sospensione letta con metodi convenzionali, cioè per conteggio al microscopio ottico.

- La correlazione è molto buona e permette la misura automatica del numero di cellule morte in pochi secondi. La sensibilità ottenibile si può valutare intorno alle 100-1000 cellule/mm3 ovvero a meno dell'I % della popolazione totale presente nel brodo.

Esempio 2

Controllo di culture di cellule. Inquinamento da ceppi diversi

La stessa composizione della miscela di reazione dell'esempio 1, contenente Trypan Blue, consente di distinguere tra diverri tipi di cellule in una fermentazione. Tra due diversi lieviti del genere Saccharomyces il transiente osservato a X = 435 nm risulta avere diverso sviluppo temporale, essendo per esempio il tempo di dimezzamento (cioè il tempo in cui l'ampiezza del transente si riduce di un fattore 2) di 2,3 [ìs per il Saccharomyces lactis e di 1,7 [ìs per il Saccharomyces fragilis.

Nessun transiente si osserva invece in cellule morte di batteri del genere Arthrobacter. li metodo si presta quindi al controllo di inquinamenti di lieviti in culture di batteri, ovvero di diversi lieviti tra loro. Per questo scopo basta prelevare il campione da analizzare, uccidere mediante ebol-

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Iizione per qualche minuto tutte le cellule presenti, trattare con la miscela contenente il colorante, e successivamente misurare l'ampiezza ed il tempo di decadimento del transiente registrato a X = 435 nm, quando si irraggia il campione con impulsi a X = 650 nm.

Esempio 3

Misura della quantità di DNA presente nei tessuti

Il metodo è adatto per la misura quantitativa di acidi nucleici presenti in cellule umane. Per questa prova abbiamo utilizzato cellule bianche del sangue in diverse composizioni.

Campioni contenenti cellule diverse con quantitativi facilmente misurabili di DNA sono ottenuti da sangue umano eparinizzato con procedure note di centrifugazione in gradiente di Ficoll. Si utilizza un gradiente lineare in Ficoll dal 18% al 15%, si centrifugano le cellule stratificate al di sopra del gradiente per 5 min. a 50 X g e per 7 min. a 250 X g. Si ottengono diverse bande che contengono, purificati, linfociti, monociti e granulociti, con piccoli quantitativi di globuli rossi. Le cellule bianche così ottenute sono contate ed analizzate su strisci al microscopio, con le tecniche usuali. Ciò permette una valutazione quantitativa del DNA contenuto nel campione essendo noto il contenuto medio di cromatina di ogni tipo di cellula.

Le diverse frazioni ottenute vengono colorate sia separatamente che mescolate tra loro in proporzioni note.

Per ottenere la colorazione le cellule sono centrifugate e sospese in una soluzione contenente Arancio Acridina 5 . X10"5 M in soluzione fisiologica contenente tampone fosfato 0,05 M a pH = 7,2, contenente inoltre IO-2 M di CoCl2 e IO-2 M di EDTA. Si irraggia ad impulsi la sospensione ottenuta utilizzando l'apparato descritto precedentemente ad una lunghezza d'onda compresa tra X = 473 e X -1532 nm.

Si osserva con luce continua a X = 435 nm.

La stessa procedura si segue per un campione che contiene gli stessi reagenti salvo il colorante. Quest'ultima operazione è resa necessaria dal fatto che piccoli quantitativi di carbossiemoglobina presenti potrebbero contribuire all'assorbimento transiente.

Il transiente ottenuto con il campione senza colorante viene sottratto a quello ottenuto con le miscele complete, ottenendo così il risultato come illustrato in fig. 4.

In ordinata è riportata l'ampiezza del transiente (in mV) ed in ascissa è riportato il tempo in [ìs.

L'andamento dell'assorbimento transiente è osservato a X = 435 nm quando si irraggia a X = 532 nm una sospensione contenente granulociti umani ed arancio acridina come descritto in precedenza.

L'ampiezza dell'impulso 1 [as dopo l'irraggiamento con il laser risulta proporzionale al contenuto di DNA del campione come riportato in fig. 5.

In tale figura l'ampiezza del transiente (in mV) è osservata in funzione del contenuto di DNA (espresso come mg/1) per diversi tipi di cellule: o linfociti e monociti in proporzioni varie; □ monociti soli; O granulociti solamente; ▼ tutti i leucociti. I campioni contengono quantità variabili di eritrociti e provengono da donatori diversi.

Il fatto che questa proporzionalità si ottenga con diversi contenuti di cellule diverse prelevate da individui diversi fa ritenere probabile che il metodo si possa applicare bene anche a tessuti biologici di altre provenienze, come i tessuti epiteliali, ecc.

La misura del contenuto di DNA, accoppiata a quella del numero di cellule presenti nel tessuto potrebbe risultare rilevante nella diagnosi precoce di stati cancerosi.

Esempio 4

Caratterizzazione di leucociti del sangue umano

Si applica a campioni di sangue reso incoagulabile. Fornisce una valutazione quantitativa del numero totale di leucociti, e di quello di granulociti, monociti e linfociti.

Metodo sperimentale

Ad un campione di sangue umano venoso, reso incoagulabile con eparina in concentrazione 0,1-0,2 mg/ml di sangue o con sodio EDTA in concentrazione 1 mg/ml, viene aggiunta una soluzione al 3,5 % di destrano (peso molecolare 250 000) fino a concentrazione finale 1,5 % e tenuto in termostato a 37°C per 20 minuti. Si preleva il sopranatante, che contiene le cellule della serie bianca e circa l'l% degli eritrociti, e is aggiunge H20 distillata fino ad abbassare la concentrazione salina allo 0,25%. Dopo 30 secondi esatti si ripristina l'isotonicità per aggiunta di NaCl al 3,5%. Si raccolgono le cellule per centrifugazione a 400 X g (5 min.) e si sospendono in NaCl 0,9% o tampone fosfato pH 7,1 0,1 M in un volume tale che il numero dei linfociti sia circa 8000/mm3. Il recupero dei leucociti è del 95 % con una composizione percentuale non distinguibile da quella del sangue del donatore; gli eritrociti rimasti sono in rapporto circa 1:1 con le cellule bianche.

Le misure vengono effettuate su 200 jjlI di sospensione cellulare in una cella da 2 mm di cammina ottico a cui viene aggiunto colorante e quencher; le cellule possono essere preventivamente fissate.

In particolare sono state usate le seguenti colorazioni.

Alla sospensione cellulare viene aggiunto quencher CoCI2-EDTA e Brilliant Green in concentrazione finale IO-2 e 9. IO-4 M rispettivamente. In un altro tipo di colorazione le cellule sono fissate con etanolo in concentrazione finale 12%. Dopo un minuto si aggiunge CoCl2-EDTA e Brilliant Cresyl Blue in concentrazione finale IO-2 e 5. IO-5 M. Una terza colorazione risultata utile è uguale nella precedente solo che il colorante è Blu Nilo 8. IO-5 M.

I campioni così ottenuti vengono successivamente irradiati con il sistema laser ad impulsi descritto nella parte generale, a X = 659 nm, ed osservati con luce monocromatica a X = 435 nm e X = 547 nm, successivamente.

Con due diverse colorazioni si possono così ottenere quattro diversi transienti le cui caratteristiche sono corre-labili alle grandezze da misurare.

Risultati

L'osservazione dei campioni di sague così trattati viene correlata con quella ottenuta con metodi tradizionali, cioè con l'osservazione al microscopio di strisci del sangue intero. In figg. 6 e 7 sono riportati a titolo di esempio alcuni di questi transienti. In particolare in fig. 6 è riportata l'ampiezza in mV osservata a X = 547 nm del campione colorato con Brilliant Cresyl Blue e fissato con etanolo; in ascissa è riportato il tempo in [is. L'ampiezza AV, misurata come in figura tra il picco ed il valore a tempi lunghi risulta proporzionale al numero totale di monociti. Si noti che in questo esempio è essenziale la presenza di Co-EDTA per determinare la scomparsa dei segnali provenienti da altre cellule o dal colorante libero. In fig. 7 è riportato il transiente osservato a X = 435 nm nel campione colorato con il Brilliant Green (l'ordinata è in mV e l'ascissa in [is come nel caso precedente). L'ampiezza dello scalino, corrisponde all'eccitazione dello stato di tripletto del colorante legato (presumibilmente al nucleo cellulare, come si osserva al microscopio), risulta ben correlabile con il numero totale di leucociti.

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L'andamento del decadimento è inoltre bifasico come si vede in figura. La fase rapida, che si misura bene sia a X = 435 nm, che a X = 547 nm risulta infine proporzionale al numero di linfociti. Sono così determinati tutti e tre i parametri indipendenti [numero di linfociti (1), di monociti (m), di granulociti (g)] essendo il numero totale di leucociti (n) eguale alla somma dei tre, cioè n = 1+m+g. Si noti che solo una parte esigua dell'informazione contenuta nella traccia registrata dei transienti osservati è stata utilizzata per queste determinazioni, e si dispone dell'osservazione indipendente dei tempi di decadimento degli stati di s tripletta e dei rapporti tra le ampiezze a diverse X, per eseguire controlli di altra natura per esempio segnalare la presenza di cellule patologiche.

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1. Composizione adatta al controllo di costituenti di tessuti e/o liquidi biologici costituita da:

a) una sostanza colorante scelta nella serie dello Xante-ne, delle Azine, lldee Ossazine, delle Acridine, ovvero tra le sostanze solubili in acqua della serie «disazo», e del tri-fenilmetano,

b) un mezzo compatibile con il tessuto e/o liquido biologico,

c) una sostanza «quencher» capace di diseccitare rapidamente le molecole del colorante quando si incontra con esse.

2. Composizione secondo la rivendicazione 1, caratterizzata dal fatto che la sostanza colorante è presente ad una concentrazione compresa tra IO-5 e IO-4 mol.

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RIVENDICAZIONI

3. Utilizzazione della composizione secondo la rivendicazione 1 per il controllo di tessuti e/o liquidi biologici, caratterizzata dal fatto che si sottopone il campione così trattato alle radiazioni di un primo fascio di luce ad impulsi,

e che il campione viene quindi esposto ad un secondo fascio di luce monocromatica, ed infine si analizza l'intensità ottica in uscita da detto campione, in funzione del tempo.