JPS5938540B2 - けい光物質の観測方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は測光装置に関し、特に染料やけい光染色剤を染
着した組織学的粒子のようなけい光物の観測装置に関す
る。

通常用いられている技術には、例えばけい光染色剤を染
着させた組織学的試料のような１つまたはそれ以上の物
質を該染色剤の励起波長にある放射で照射して該染色剤
にけい光を発生させるけい光スペクトル分析あるいは発
光スペクトル分析の利用が含まれる。

つぎに、けい光のパラメータ（例えば、強度、崩壊寿命
、スペクトル分布、その他）を用いて試料が特徴づけら
れる。例えば、多くの自動的流れ装置におけるように個
々の粒子を順次に観測するならば、各粒子からのけい光
放出の強度は粒子の大きさに比例し、また放出の分布は
粒子の形状に関係づけられる。組織学的スペクトル分析
においてはこのようなパラメータが臨床的同定にしばし
ば有用である。しかし上述の技術には多くの問題が付随
していてその応用の可能性を制限している。

第１に、多くの染料は励起放射の強度に比例して極めて
低い強度のけい光放出を与えるのでけい光スペクトル分
析での使用に適しているとは思われない。励起放射の強
度を増大して高強度のけい光染料を用いたとしても、染
料は一般的には励起の強度に比例した割合で、典型的に
は光分解によつて、脱色する。従つて先行技術の処理法
は、高い量子効率（すなわち、染料分子によつて放出さ
れた光子の吸収された励起波長の入射光子の数に対する
比）を示す染料、および脱色を減少あるいは最小とする
ために比較的低い強度の励起放射の使用に限定される。
多くの場合には、バツクグラウンドに対して強いけい光
を得るために、染色はフルオロクロム染料すなわち溶液
内に自由染料分子として存在するときよりも基体に結合
されているときにはるかに大きな量子効率をもつてけい
光を発する染料を用いてなされる。しかし染料の量子効
率の増大は基体の性質に依存するであろうし、もし基体
が存在しなければ染料はフルオロクロム染料ではない。
さらに、けい光スペクトル分析においては濃度消光とし
て知られている現象が現わる。

すなわち、染料の局所的高密度が存在すると（有機分子
のような組織学的粒子が相互に極めて接近して該粒子に
結合された複数個の染色分子を有しているときのように
）、このような多重的増量は結合された染料分子内に誘
起されるけい光の量子効率を減少させる傾向を有する。
従つて本発明の主要な目的は、けい光染色剤で染色され
た粒子から最大限に可能なけい光信号を得るための方法
および装置を提供することである。

本発明の他の目的は、１つまたはそれ以上のけい光染色
剤で染色された微小粒子の観測装置であつて、けい光染
料の量子効率の変化（例えば多重増量に上る濃度消光に
もとずく）がけい光出力信号に及ぼす効果あるいは高レ
ベルの励起照射による脱色の効果が最小あるいは無視可
能とされる観測装置を提供することである。本発明の他
の目的は、適切な量子効率あるいはけい光強度の不足の
ために先行技術においては普通けい光スペクトル分析に
有用とはみなされないけい光染料で染色された粒子の観
測方法を提供し、かつ新規なけい光スベクトル分析の方
法を提供することである。本発明の他の目的は、けい光
物質の２つの状態間での量子効率の差を測定する装置を
提供し、染料の２つの異なる量子効率状態を識別する装
置を提供し、かつ染料の量子効率とは無関係にけい光物
質の濃度を測定する方法を提供することである。本発明
の他の目的は、一部は明白となろうしまた一部は後述さ
れよう。従つて本発明は、以下の詳細な開示に例示され
また応用の範囲が特許精求の範囲内に述べられている、
構造、素子の組合せ、部品の配列を有する装置といくつ
かの段階、関係、順序を含む方法とを含有する。本発明
の性質および目的のより完全な理解のために、以下に図
面を参照して説明する。

キルヒホツフ（ＫｉｒｃｈＯｆｆ）の等価関係によれば
、けい光放出率（すなわち、単位時間当り１染料分子当
りの放出確率）あるいはその逆数、自然けい光寿命（τ
Ｆ）（すなわち、けい光が最大値１から励起の停止に続
いてＩ／ｅの値まで減衰するのに要する時間、ただしｅ
は自然対数の底）は、例えばけい光分子の数の局所的濃
度の変化によつて誘起される外的摂動に染料分子がさら
されても、このような摂動が極端な場合吸収スペクトル
の大幅な変化を生ずるのに十分なほど強くなければ、不
変である。

上述したように、濃度上昇の効果、すなわち濃度消光は
けい光の量子効率を減少させるが平均的励起分子のけい
光放出率には影響を及ぼさない。従つて、減少するのは
励起状態にある平均的分子の寿命（τＬ）であると仮定
してよい。換言すれば、非放射的過程が大部分エネルギ
ーを持去るために量子効率が低下し、この減衰機構がそ
のとき分子の励起状態の寿命を低めるのである。自然け
い光寿命（τＦ）は少くとも第１次までにおいては不変
であるから、けい光量子効率（ＱＦ）は励起状態の寿命
に比例する。骨子効率はこの場合励起状態の寿命の自然
けい光の寿命に対する比（τＬ／τＦ）とに定義され得
るから、（ＱＦ）は自然けい光寿命の逆数に比例するこ
とがわかる。けい光分子が、典型的には極端感度作業に
必要とされるような、極めて高度の定常状態照射下で（
例えば、フルオレセインに対して１００ワツト／ＣＴｉ
ｉ以上といつた）試験されるときには、けい光分子は極
めて短かい時間間隔で反復して励起され、時間のかなり
の部分を励起状態で過すことになろう。

このような条件下では、このような励起状態が光分解ま
たは他の化学反応による分解を受け得ることは極めて重
要である。換言すれば、強力な照射は分子が分解すると
急速な退色的けい光放出すなわち脱色を生成させる傾向
がある。励起分子によつて放出される全エネルギーは、
初期放出けい光仕事率（存在するけい光分子の数、照射
強度およびけい光分子の量子効率によつて決定される）
および分子の分解寿命の関数である。この関数の完全脱
色の点までの積分は、全放出工ネルギ一が量子効率と分
解寿命との積に比例することを示している。分解寿命は
必然的に分子が励起状態で過す時間の割合に逆比例し、
この時間割合はまた任意の与えられた照射強度において
分子励起状態の寿命に比例する。従つて、励起状態にあ
る平均分子の寿命τＬと脱色寿命τＢ（すなわち、与え
られた照射強度下で複数個の染料分子のほぼ完全な脱色
を行うのに要する時間）とが比例することを考慮するな
らば、量子効率と脱色寿命との積は一定であることがわ
かる。

出力放射あるいはけい光放出が実質的に非検知可能ある
いは検知装置の雑音レベル以下であるとき脱色は完全で
あると考えられる。与えられた数の特定染料分子の励起
分子数によつて放出される光子の全量あるいは全数が一
定である限り、染料の脱色寿命の間の全出力けい光の積
分を測定することによつて該励起分子から得ることので
きる最大の信号が得られる。

従つて本発明は、一般的には、それ自体がけい光性ある
いはけい光染色剤で染色されるサブミクロンの大きさに
も達する組織学的粒子等のようなけい光物質の検査装置
であり、最初に該物質を励起波長にあつてかつ脱色を生
じさせるのに十分な照射量（すなわ・ち、強度、時間積
）の放射で照射する諸段階を含む。

物質をこのような放射にさらす照射時間は実際の目的に
対しては数ミリ秒から数百ミリ秒まで変化し得るが脱色
寿命の相当部分（例えば、〉％）であることだけが必要
である。けい光物質が励起照射にさらされる間、物質か
らの瞬時的けい光放出強度が検知され、けい光強度が脱
色の間初期強度１０から初期強度のある予定の割合１０
／ｅまで減衰するのに要する時間間隔の測定がなされる
。ただしｅは自然対数の底である。このようにして測定
された時間間隔はτＦ従つて１／ＱＦに比例する。もし
所望されるならば、全放出工ネルギ一に比例する量、典
型的には該時間間隔にわたる光電検知器からの信号の積
分が得られる。この積分はけい光粒子から得られる最大
エネルギーに比例する。本明細書中で用いられる「けい
光」の語は、放射によつて刺げきされかつ刺げきの間放
出されるルミネセンスを意味するものとする。

「けい光染色剤」の語は、文意が許す限り、けい光染色
剤あるいはけい光染料のみならずフルオロクロームをも
含むものとする。図には、本発明の原理を実施した粒子
検知装置を示すが、該粒子検知装置は干渉性の光のビー
ムを発生させる光源２０を含む。

空間的干渉性は必要でないが、光源２０は、典型的には
、例えば染色された粒子の所望の吸収波長において１０
ミリワツトの出力を提供する（例えばスペクトラフイジ
ツクス製造のような）レーザでよい。光源２０からのビ
ームの行路内にシヤツタ２２が配置されているが、該シ
ヤツタ２２は、開口を確定する装置と該シヤツタ開口を
例えば立上り時間約０．５ミリ秒で５０分の１秒の間露
出させるすなわち開くことのできる、絞りのような、ブ
レードあるいは閉塞体とを有する標準型の電気リレー作
動のシヤツタであることが好ましい。シヤツタ２２を通
過する放射の行路には光学素子列２４が配置されている
が、該光学素子列２４は、典型的には、４５×対物レン
ズを有しそれに典型的には口径２２ｍｍおよび焦点距離
４４ｍｍを有するアクロマートレンズが従つている。

光学素子列２４は光源２２からシヤツタ２２を通過した
光を試料保持器２６に指向させるためのものである。試
料保持器２６は試験されるべき粒子含有する試料を保持
するためのものであり、流れセルその他でよい。例えば
ベツクマンの１Ｔｔｍ石英試料セルのような試料保持器
２６は顕微鏡２８の対物レンズの焦点面内にある。顕微
鏡２８は、典型的には、４Ｘ対物レンズを有し、その前
に直径約１００ミクロンのピンホール開口を有する絞り
が備えられている。顕微鏡はまた、特定の励起波長を消
滅させ（すなわち完全に吸収し）また一方で好ましくは
けい光放出を完全に透過させるフイルタも備えられてい
る。顕微鏡２８の接眼レンズのところには光電子倍増管
３０のような光検知器が配置されていて、顕微鏡２８に
よつてみられる光の振幅を電圧のような比例的電気信号
に変換する。

光電子倍増管３０の出力は手動スイツチ３２をへて出力
表示装置に接続可能であるが、第１図において出力表示
装置はテクストロニクス型５４６Ｂのような蓄積型陰極
線オシロスコープ３４として示されている。オシロスコ
ープ３４とシヤツタ２２の両者は手動可能な電気トリガ
３６に接続されており、該電気トリガ３６は付勢される
とシヤツタ２２の作動を同時に始動させるパルスを提供
し、その結果シヤツタ２２は例えば１／５０秒の露出を
してオシロスコープ３４が光電子倍増管３０からの信号
を蓄積することを可能にする。蓄積オシロスコープ３４
の面上に表示された軌跡は例えばカメラ３８によつて直
ちに永久記録される。光電子倍増管３０の出力はまたス
イツチ３２をへて電気的積分回路に接続されて、試料支
持器２６からのけい光故射の初期強度の関数である可変
な時間間隔にわたつて検知器３０の出力を積分すること
も可能である。

図示の形の電気的積分回路はスイツチ３２の出力および
トリガ３６に接続された公知のサンプル、保持回路４０
を含有していて、トリガ３６によつて付勢されるとシヤ
ツタ２２の開故に直ちに引続いて検知器３０の出力をサ
ンプルする。電気的積分回路はまた公知のコンパレータ
４２を含んでおり、該コンパレータ４２はスイツチ３２
をへて検知器３０の出力に接続された１つの入力とサン
プル、支持回路４０の出力に接続されたもう１つの入力
とを有している。比較器４２は、検知器３０からの入力
信号の大きさの比に依存する振幅を有する出力信号を提
供するためのものである。比較器４２の出力は公知の限
界増幅器４４に入力として接続される。限界増幅器４４
は典型的には、入力に入る信号がある限界値以上に上昇
しているときにのみ、この場合好ましくは比較器が回路
４０からの信号の振幅が検知器３０からの信号の振幅の
ｅ倍であることを指示したときにのみ、信号出力を提供
する。検知器３０の出力はまた、スイツチ３２をへてス
イツチ４６の入力にも接続される。

スイツチ４６の出力は積分器４８、典型的には積分演算
増幅器の入力に接続されている。積分器４８の出力は計
器５０、線プリンタ、等のような表示装置に接続されて
いる。スイツチ４６は限界増幅器４４の出力に接続され
ていて限界増幅器４４からの信号によつて「オフ」にさ
れ、またトリガ３６にも接続されていてトリガ３６から
のパルスによつて「オン」にされる。本発明が観測を意
図している物質は、任意のけい光物質、あるいは、直接
の共有化学結合、中間構造による結合、吸着、等によつ
てけい光染料を結合し得る組織学的粒子でよい。

上述のような粒子には、以下のものに厳密に限定される
わけではないが、酵素、毒素、タンパク質、多糖、リポ
タンパク質、等の複雑な有機分子、細菌、ウイルス、原
生動物、等の微生物の生死を問わずそれぞれのすべてあ
るいは一部、細胞、細胞切片、ミトコンドリア、細胞核
、等の組織学的試料、金属イオン、配位子、分子クラス
ター、等の無機物質が含まれる。粒子のすべての染色は
けい光染料分子を用いて遂行される。

例えば、吸収帯内の放射によつて直接励起されたときそ
れ自身でけい光故出し得る染料、あるいはフルオロクロ
ーム、すなわち、自由な染料分子として存在するときよ
りも粒子に結合されているときに非常に大きな量子効率
をもつてけい光を発する染料を用いて遂行される。何故
ならば、前述したように、染料の量子効率は限定的因子
ではないから、本発明は在来はけい光スペクトル分析に
おいて有用性を見出されていなかつたような低い量子効
率の、従つて非常に弱いけい光の多くの染料を使用し得
るからである。本発明に用いられるけい光染料には以下
のようなものがある。多くの例においては、当業者には
公知のように一染料は特定の性質を有する粒子に直接に
結合する。

染料が特定の粒子に直接に結合しなかつたり、特定の粒
子に結合座位よりも多数の染料分子を結合させることが
所望されたり、あるいはまた染料分子が粒子に多重に結
合することによつて消光が生ずるといつた他の例におい
ては、長い鎖状重合体のような仲介分子あるいは担体分
子を結合させてからつぎに染料を結合した重合体を粒子
に結合させることが所望される。多数のけい光染料分子
が重合体の主鎖によつて共有的に結合する例は、米国特
許第４１６６１０５号に記載されている。特に上述の米
国特許第４１６６１０５号には、重合体鎖が結合した抗
体であつて抗体の特殊性を実質的にそこなうことなく重
合体鎖に多数個のけい光分子が結合している抗体が記載
されている。典型的には、仲介体あるいは想持体は、反
応座位が鎖の長さにそつて散在しまた鎖の端には化学的
に異なる反応座位がある重合体分子である。このような
担持体あるいは仲介体の分子は、典型的には、例えば、
１２００から６０，０００の範囲の分子量のポリエチレ
ンイミン、ポリリシンのようなポリペプチド、ナイロン
６のようなポリアミド、重合カルボン酸、等を含み得る
。このような担持体を染色して該担持体を粒子に結合さ
せる技術は上述の米国特許第４１６６１０５号に記載さ
れている。前述したように、本発明は、これらに限定さ
れるわけではないがエリトロシン、増感基体に結合され
ていないフルオロクローム染料、アンチフルオロクロー
ム、等のような微弱なけい光染料のけい光スペクトル分
析の利用を可能とする。図の装置の作動に際しては、適
当な染色された粒子の試料が脱色強度の故射にさらされ
、その結果得られたけい光信号の強度が、初期故出から
該強度が初期値の予定の割合まで減衰する時までの可変
な設定時間間隔にわたつて検知されかつ監視される。

例えば、信号は適当に時間較正された水平時間軸に対し
てオシロスコープ３４上で表示されかつ観測される。初
期強度が観測されつぎに制限された時間間隔後の強度が
観測される。強度の減衰増分と該減衰増分が得られるの
に要する時間とから、脱色寿命τＢ（初期強度１からＩ
／ｅまで減衰するのに要する時間として定められた）が
ただちに得られる。もつとも脱色寿命はもちろん所望さ
れるならば当業者には公知のようにＩ／ｅの任意の倍数
として定義されることもできる。τＢの間の全故出を積
分するためには、オシロスコープ軌路が十分に長いと仮
定して、初期強度０ｔ）５１／ｅ（すなわちＩｔ）まで
減少する時間軸上の点が決定され、ＩＯとＩｔとの間で
の曲線下の面積がつぎに測定される。減衰曲線の積分は
該減衰曲線の鏡像であるから積分は直接に測定され得る
かあるいはまた減衰曲線からただちに計算され得る。も
しオシロスコープの軌跡が非常に短かければ、公知の減
衰方程式（単一減衰モードに対してのみ有効）が用いら
れ得る。

１′八１ １０，Ｉｔおよびｔを測定することによつて、Ｋしたが
つてτ３の値を求めることができる。

また、自動的積分は以下のように遂行され得る。スイツ
チ３２を閉じてサンプル、保持回路４０を検知器３０の
出力に接続させる。トリガ３６が付勢されてシヤツタ２
２を開いた直後、サンプル、保持回路４０は検知器３０
からの出力電圧を読みとり得るようにされる。もし所望
されるならば、適当に時間設定された遅延線を回路４０
への入力内に導入することによつて、シヤツタ２２の開
放とサンプル、保持回路４０の付勢との間に時間増分を
導入することができる。すなわち、回路４０は検知器３
０からの電圧出力の初期最大振幅１ｍをサンプルして比
較器４２の１つの入力にほぼ一定のレベルで保持する。
比較器４２のもう１つの入力における電圧は検知器３０
からの時間的減衰電圧ｔである。従つて、比較器の出力
は比１ｍ／Ｉｔに比例し、この比がある任意の値（例え
ばここではｅの値）に達するまでにＩｔが減衰したとき
、限界増幅器４４が付勢されて出力パルスを発生する。
トリガ３６が付勢されるとまたスイツチ４６が閉じられ
て検知器３０の出力が積分増幅器４８に接続され、また
増幅器４４からの出力パルスがスイツチ４６を開いて積
分（またサンプル、保持回路４０をも）を終了させる。

従つて、増幅器４８によつてなされる積分は検知器３０
によつてみられるけい光の初期振幅に応じて変化し得る
時間間隔にわたるものであることがわかる。得られた積
分は表示され得るしまたそうでなければさらに計器５０
内で処理される。信号の量子効率からの相対的独立性を
確立する図の装置の作動を以下の諸例において説明する
が、該諸例の各々において、染色された粒子を含有する
試料は光源２０によつて染料の吸収帯内で照射され、連
続的に照射された試料からのけい光は入力光の強度を対
応電圧に変換する光電子倍増管３０によつて１つまたは
それ以上のピーク故出波長で検知される。

前述したように、光電子倍増管３０の出力は、蓄積され
てオシロスコープ３２上に時間に対する強度の連続的軌
跡として表示され該オシロスコープデータから脱色寿命
を計算しそれから所望の積分を決定することもできるし
、あるいはまた自動的に決定される脱色寿命にわたつて
直接に積分もされ得る。次の例１−Ｖは本願発明に用い
られる第１順序理論（ＦｉｒｓｔＯｒｄｅｒｔｈｅＯｒ
ｙ）の有効性を証明するものである。

例えば例１，は本願発明による種々の測定が第１順序に
対して集中クエンチング（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）により
生ずる量子効率の変化に無関係であることを示す。例，
は上記例１〜の重合体が抗体で成り立つていることを示
す。例は本願発明に用いられる理論の有効性を示す他あ
実施例である。例１ ポリエチレンイミン分子を以下のようにしてフルオレセ
インで染色される。

フルオレセインはＨＮＯ３でニトロ化し、該硝酸塩をＨ
ＣＩおよびＺｎを添加することによつて生成された発生
期水素で還元し、つぎにチオフオスゲンを添加してフル
オレセイン、イソチオシアネートを形成させるという公
知の技術によつて機能を与えられる。

しかし、フルオレセイン、イソチオシアネートはまた商
業的に入手可能でもある。ＰＨ値７．０にある０．１Ｍ
カコジル酸ナトリウム１ｍ１中のポリエチレンイミンＰ
ＥＩ（分子量２０，０００）２ηの水溶液に、水１．５
ｍ１中のフルオレセイン、イソチオシアネート５０〜を
添加する。混合物を約１６時間連続的にかくはんしその
間光は遮断される。過剰の染料は、セフアデクスＧ−２
５（シリカゲル）カラム（０．９×３０ＣＴｒＬ）を通
過させ、それで生じたカラムの溶離を０．１Ｍ，ｐＨ７
．０のカコジル酸ナトリウム水溶液を用いることによつ
て除去される。得られた重合体、染料結合体はフオラン
ーシオコルトタンパク質試金によつて分析され得る。

この試金はポリエチレンイミンに関して直線を与えるの
で存在する重合体の量の評価に適している。４９５ｎｍ
におけるフルオレセイン、イソチオシアネートの吸光係
数は７３Ｘ１０３であり、結合に際してはこの値の７５
％まで降下する。

該結合体の与えられた試料内に存在する重合体と染料と
の双方を測定することによつて、染料結合の程度が評価
される。この結合の程度は初期反応混合物内の染料濃度
に依存する。この例の方法で調製された結合体はＰＥＩ
ｌ分子当り約８０個の染料分子を含有する。

濃度５ｐｐｍの純粋なフルオレセイン溶液の量子効率が
１００％であるとすれば、５２４ｍμにおける吸収測定
はこの例の染色された重合体の量子効率が１．７９０１
）であることを確認した。

量子効率と脱色寿命との積は量子効率が１．７９％、脱
色寿命が８１．４ｍｓｅｃなので１．７９×８１．４二
１４５ｍｓｅｃ／（ｆｌ）となる。

染色された重合体の溶液を純粋の水で希釈して２０×希
釈とし、試料を１ｍ１Ｌのベツクマン石英試料セル２６
内に置いた。

試料を励起波長４８８０λ、照射強度１．２４×１０４
ワツト／ｄのレーザ２０によつて照射すると、ピーク放
出波長、５２４ｍμのけい光が光電子倍増管３０によつ
て検知されて６０ｍの値としてオシロスコープに現れた
。３３ミリ秒後、５２４ｍμにおけるけい光強度はオシ
ロスコープに４０ｍＶで現れた。

脱色寿命は８１．４ミリ秒と計算され、シヤツタ２２の
作動への補正として約０．２５ミリ秒が許容された。例
例１の処理の後に、染料対ポリエチレンイミン（分子量
２０，０００）のモル比を変えて、ポリエチレンイミン
の分子１個当り約１００個の染料分子を含有する重合体
、染料結合体を得た。

脱色すると、データから補正脱色寿命値として１１７．
４ミリ秒が得られた。この例における染色されたＰＥＩ
の量子効率は吸収によつて１３．２０１）と測定され、
この値は例１に比べて結合染料分子数が増大しているこ
とに一致する。量子効率と脱色寿命との積は１５５であ
り、このことは脱色寿命と量子効率との積の間の実質的
同値性（ずれは７（ｆｌ）以下）、従つて第１近似にお
ける量子効率からの独立性を示すものである。例 例１の重合体、染料結合体を前述の米国特許第４１６６
１０５号に記載の方法によるエコー１２抗体の商業的に
入手された試料に結合させた。

すなわち、染色する以前にＰＥＩをまずＰＨ７．Ｏに緩
衝されたグルタルアルデヒド（２５％水溶液）で処理し
、つぎに重合体、染料結合体を直接に抗体と反応させる
。抗体に染料担持重合体分子が結合している重合体、染
料、抗体結合体を例１に従つて照射したら、得られたデ
ータより、脱色寿命４９．５ミリ病、量子効率２．０３
％が得られ従つてこれら２つの値の積は１０１となつた
。例 例の重合体、染料結合体を例による同じエコーに抗体の
試料に結合させ、得られた結合体を例におけるように照
射したら、脱色寿命８８．９ミリ秒、ＱＦが１．２１０
１）を与えるデータが得られた。

寿命、ＱＦ積は１０８であつて、これは再びＱＦに関す
る本発明の技術の第１近似的独立性を示している。例 分子量１２００のポリエチレンアミン（５重量％水溶液
）を例１に従つてフルオレセインで染色し、染色された
重合本の試料を希釈していくつかの異なる濃度を得た。

各々を照射して、けい光出力を例１に従つて積分すると
以下の結果が得られた。最後の列の一定性からのずれは
低量子効率における驚くべき信号増加を示すものである
が、これは減衰曲線の尾部における指数関数性からのず
れに起因する。この極めて小さな範囲における減衰率の
減少は周囲からの拡散によると考えられる。これが上述
した思わざる改良の原因であるということは、一方にお
いては例および例他方においては例および例の試料にお
いて拡散率が非常に低ければ変化が小であることから導
かれる。このことは、フルオレセインでは約０．７μま
た重合本では約０．３μという１０ミリ秒間の平均のブ
ラウン運動的変位と予盾しない。例の諸試料の減衰寿命
、量子効率積と他の諸例の減衰寿命、量子効率積との同
値性は期待されるべきではない、何故ならそれらが染料
分子の異なる化学的状態に対応するからである。

１分子当りの受信信号が比例する、最後の列の量子効率
からの第１近似的独立性は明らかに理解される。

全受信信号はこの数と結合分子数の積に比例しよう。前
述したように、本発明の原理はけい光物質の２つの状態
間の量子効率の差を決定する方法を提供する。

例えば、染料がけい光源として実際にどのように効果的
であるかを決定するためにフルオロクローム染料の結合
状態と非結合状態との間の量子効率の差異を決定するこ
とがしばしば所望される。本発明の原理を用いる量子効
率の差の決定は極めて簡単である。第１状態にあるけい
光物質の第１試料を前述したように照射して脱色させ、
脱色過程の間に生成された瞬時的けい光放出を検知する
だけでよい。照射された試料からのけい光故出が例えば
初期強度の１／ｅ倍まで減衰するのに要する時間間隔の
測定がなされる。つぎに他の状態にある該物質の試料に
関してまつたく同様の操作が行われる。

これら２つの試料は、溶液であると仮定して、けい光物
質に関しては実質的に同一の濃度および大きさにある。
脱色寿命τβは定数Ｋと１ＱＦとの積に等しいから２つ
の脱色寿命の比τβ１／τβ２はＫの値に無関係であり
、従つてけい光物質の２つの状態の量子効率の比の目安
である。上述の事柄は例ｖの表から直ちに理解され得る
。

すなわち、例の表では、少くとも染色されたポリエチレ
ンイミンの始めの３つの濃度に対しては脱色寿命が量子
効率に反比例していることが示されている。従つて、例
えば例における第１および第３の試料の脱色寿命の比３
／４はこれらの２つの試料の量子効率の逆比に極めて近
い。本発明の原理はまた、例えば溶液内の既知のけい光
物質の未知の濃度を決定するためにも用いられ得る。

これは以下の考えに従つて決定され得る。ある与えられ
た種の各分子からの全けい光故出は不変であり、しかも
分子分解寿命の分子自然けい光寿命に対する比に比例す
る。すなわち、けい光物質の既知の質量を測り分けてそ
れを小体積の溶媒内に溶解させて較正試料を提供するだ
けでよい。つぎにけい光物質の全質量を脱色照射量のし
かも該けい光物質に対してけい光励起波長にある故射で
照射する。その結果生ずるけい光故出が検知されかつそ
の初期強度がＩＯ／ｅのようなある値まで減衰するまで
相加あるいは積分される。得られる積分は該分量のけい
光物質に対して不変である。つぎに、未知量のけい光物
質を含有する溶液の試料体積を同じ励起故射波長にある
脱色照射量で照射し、けい光放出を出力レベルがＩＯ／
ｅまで降下するまで検知しかつ積分する。第２積分の第
１積分に対する比は試験溶液内のけい光物質の未知量の
較正試料内のけい光物質の既知量に対する比に等しい。
明らかに、試験溶液の体積の測定は該溶液内のけい光物
質の濃度を得るために必要なデータを提供する。本発明
の原理はまた、ある場合に、けい光物質の混合物内のけ
い光物質、例えば溶液内の染料混合物中のある染料を検
知しかつ検査するのに用いられ得る。

例えば２染料の混合物が同一のフルオロクローム染料の
２つの状態である場合、あるいは量子効率は異なるが故
出帯波長はほぼ同一の２つのけい光物質の混合溶液であ
る場合には、該２染料の合流的けい光減衰は指数関数の
和となることがわかる。従つて放出曲線は非常に複雑で
あつて上述したような簡単な減衰方程式によつて記述し
たり解析したりすることはできない。しかし本発明によ
れば、２つの物質の量子効率が異なるのであるから該混
合物を高い量子効率を有する物質のみを実質的に脱出さ
せるのに十分な放射にさらすだけでよい。

その後に混合物中で励起されかつ該混合物から観測され
るけい光は実質的には弱い量子効率を有するけい光物質
のみに起因する。この技術によつて、２つの物質を分離
し、また所望されるならば、それらの個々の減衰特性を
再構成することが可能となる。本発明の範囲を逸脱する
ことなく上述の方法および装置に若干の変更をほどこし
得るから、上述の説明に含まれかつ図面に図示されたす
べての事柄は限定的意味ではなく例示的意味に理解され
たい。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ けい光物質の観測方法であつて、 前記けい光物質のけい光励起波長により前記けい光物質
   の脱色を生じさせるのに十分な照射量の放射で前記けい
   光物質を照射することと、前記けい光物質の初期照射で
   始まる時間間隔にわたつて、前記照射による前記けい光
   物質の脱色の間前記けい光物質により生成されるけい光
   放出量を検知することと、前記けい光物質の脱色の間検
   知されたけい光放出量を前記時間間隔にわたつて積分し
   、且つ積分値を表示することの段階を有するけい光物質
   の観測方法。 ２ 混合物内にある２つのけい光染料間での量子効率の
   差異を決定する方法であつて、前記混合物の試料を、前
   記第１染料の励起波長にありかつ前記第１染料の脱色を
   生じさせるのに十分な照射量の放射で照射することと、
   前記第１染料の初期照射と共に始まる時間間隔にわたつ
   て、前記放射による前記第１染料の脱色によつて生成さ
   れるけい光放射を検知することと、前記の照射された第
   １染料からのけい光放出の初期強度が該初期強度の予定
   の割合まで減衰するのに要する時間間隔を測定すること
   と、前記混合物の前記試料を、前記第２染料の励起波長
   にありかつ前記第２染料の脱色を生じさせるのに十分な
   照射量の放射で照射することと、前記第２染料の初期照
   射と共に始まる時間間隔にわたつて、前記放射による前
   記第２染料の脱色によつて生成されるけい光放出を検知
   することと、前記の照射された第２染料からのけい光放
   出の初期強度が該初期強度の予定の割合まで減衰するの
   に要する時間間隔を測定することと、前記の第１および
   第２の染料からのけい光放出の初期強度が減衰するのに
   要する前記の時間間隔を比較すること、との段階を有す
   る、混合物内にある２つのけい光染料間での量子効率の
   差異を決定する方法。