SE442347B - Komposition for provning av biologiska vevnader eller vetskor innehallande ett dna-interaktivt fergemne och ett avexciterande emne, samt ett sett att anvenda kompositionen - Google Patents

Description

8005860-2 10 15 20 25 30 -ss När det är fråga om en vävnad, som är blott lätt färgad, underkastas blixtljuset företrädesvis difusions- processer, snarare än absorption. Emellertid kan vävnaden _ färgas med syntetiska färger på samma sätt som är vanligt vid optiska mikroskopundersökningar. Det förhållandet att färgen kan färga en vävnad, visar att den på något sätt blir bunden till vävnaden.

Emellertid föreligger åtminstone två grundläggande svårigheter vid användning av blixtfotolysteknik på prov med stark difusionsverkan.

Den första är att de bundna färgkoncentrationerna är mycket låga, varför det kan betvivlas att signifikanta Signaler kan erhållas med användning av denna metod. För det andra kan man inte förutsäga att signaler som härrör från absorptioner som är karakteristiska för de metasta- bila tillstânden hos färgen när det är fråga om en färg bunden till en viss vävnad skulle skilja sig från de som härrör från molekyler i lösning eller bundna på annat sätt.

Det har nu egendomligt nog visat sig vara möjligt att komma över båda dessa svårigheter genom att frænställa addukter av den väsentliga beståndsdelen i den biologiska vävnaden och/eller vätskan i fråga med en färg, som är syntetisk eller åtminstone inte förekommer i fysiologiska vätskor eller lösningar, genom att man bringar ett prov som skall undersökas i kontakt med en komposition enligt föreliggande uppfinning och som består av färgämnet, ett medium kompatibelt med den biologiska vävnaden och/eller vätskan och ett ämne, som har förmåga att avexcitera färgmolekylerna när det kommer i beröring med dem (av- exciterare).

Den komposition som utgör addukten till den fysio- logiska konstituenten bildas av a) ett färgämne valt bland azin-, oxazin-, akridin- eller xantengruppen, eller bland vattenlösliga färgämnen i diazogruppen,eller tri- fenylmetan, b) ett medium kompatibelt med den fysiologiska beståndsdelen, bestående av en vattenlösning innehållande salter, exempelvis NaCl, CaCl2 och dylikt, i sådan koncent- 10 15 20 25 30 8005060-2 ration att den är väsentligen isotonisk med den fysiolo- giska beståndsdelen (0,1-l viktprocent), och andra kompo- nenter i mindre mängd, exempelvis glukos, bufferblandningar etc, tillsatta för konditionering av vitaliteten hos före- kommande celler, varvid pH hos mediet kan variera i viss grad omkring neutralt (från pH 4,5 till pH 9,5), och mindre mängder organiska lösningsmedel, som kan tillsättas för ökning av färgämnets löslighet, och c) ett avexciterande medel (quencher), d.v.s. ett medel som medför snabb av- exciterlng av färgämnesmolekylerna vid beröring mellan respektive molekyler, och som företrädesvis kan vara till 0,2 M), eller 2 till kalium- eller natriumjodid (från 10-2 salt av en paramagnetisk övergångsmetall (från 10- 0,2 M Co, Fe, Ni, exempelvis av samma form som CoCl2 eller liknande), eventuellt i närvaro av ett kelaterande ämne, exempelvis etylendiamintetraättiksyra (EDTA), eller en mängd molekylärt syre (02) löst i vatten (exempelvis genom mättning av provlösningen med 02 vid en viss tempe- ratur).

Den ovan angivna kompositionen används för utföran- det av ett sätt för provning av biologiska vävnader och/ eller vätskor enligt föreliggande uppfinning.

Detta sätt innebär att man först behandlar ett prov av den substans som skall undersökas med kompositionen, att den behandlade substansen utsätts för strålning med en första strâle av pulsat ljus, att provet därefter bestryks med en andra strâle av monokromatiskt ljus, och att den utgående optiska intensiteten hos den senare som funktion av tiden analyseras.

Det har visat sig att de signaler, som härrör från absorptionen av metastabila tillstånd hos de i de under- sökta cellerna bundna färgämnesmolekylerna är distinkt skilda med avseende på amplitud och/eller tidvariation från de som härrör från molekylerna i lösning eller från andra celler.

På detta sätt lyckas man sålunda att karakterisera de individuella, i vävnaden förefintllga cellerna.

Detta sätt har visat sig vara speciellt lämpat för _ »m7 'FT '7- *I- -. .... ('Ä«-'-' ' kam-e” ö' I r Ü ïfi 8805860-2 l0 l5 20 25 30 '35 provning av fermenterande cellkulturer, vid särskiljning av döda celler från levande och jästceller från bakterie- celler, samt vid kvantitativ analys av blodleukocyter. \ o Vid tillämpning av sättet kan man a ena sidan åstadkomma automatiska mätningar (som tar blott några få sekunder), ~ i stället för långa och besvärliga rutinprocedurer, som erfordras när det är fråga om användning av optiskt mikro- skop. Man kan också lyckas återge egenskaper som icke kan iakttas med ögat till följd av den specifika molekylära ömsesidiga påverkan mellan färgämnet och några av cell- beståndsdelarna.

Sättet kan därför användas för prov, som hittills inte kunnat genomföras eller som är möjliga blott med an- vändning av mycket mer komplicerade metoder. Speciellt kan man förutse tillämpning av sättet vid tumördiagnos, tack vare möjligheten att kvantitativt bestämma interaktionen mellan DNA och färgämnet.

Uppfinningen framgår ytterligare av följande be- skrivning i anslutning till de bifogade ritningarna, på vilka fig. l som exempel schematiskt återger utförandet av en apparat som kan användas för utförandet av proven, medan figurerna 2-7 visar strålningsdiagram, som förklaras närmare i följande exempel.

I fig. l är S1 och La är linser av kvarts. M1 en laser- stråle. Ll' L2, L3 _ och M2 är speglar och Dl och D2 halvledardetektorer för detektering en kvicksilverlampa och S2 av laserpulser. MC är en monokromator för hög luminositet.

S anger läget hos provet och PM är en fotomultiplikator.

För enkelhets skull visas inga filter och bländare.

En pulsad ljusstråle erhölls från en Nd-laser, nämligen en kommersiell YAG (Chromatix mod. 1000), som avger ljuspulser på 0,1-0,5 mJ med en längd på omkring 150 ns och med en upprepningsfrekvens på omkring 50 Hz.

Laserfärgen är yarierbar från blått (Å = 473 nm) till nära infrarött. Observationsstrålen framställdes med en på lämpligt sätt filtrerad högtryckskvicksilverlampa.

De båda strålarna fokuserades mot ett område på provet medå omkring 0,2 mm diameter och med en vinkel mellan strålarna 10 15 20 25 30 -35 8005060-2 på omkring 150. Provcellen var 2 mm tjock. Ljuset från kvicksilverlampan gick genom en monokromator med stor öppning och matades till en fotomultiplikator (Philips XPlll3). Don elektriska utsignalen från fotomultiplika- torn registrerades kontinuerligt som genomsnittsvärde och matades också till en förförstärkarf med ett passband mellan 0,5 kHz och 300 MHz och förstärktes därefter, re- gistrerades i digitala minnen och ackumulerades i en liten dator (LABEN 70).

Den från en enda puls erhållna signalen registre- rades och adderades till signalerna från hundratals analoga pulser. Därigenom erhölls ett signalgenomsnitt i vilket störsignaler reducerats med en faktor på mer än 10 i för- hållande till den signal som erhållits från en endalpuls.

Eftersom upprepningsfrekvensen hos pulserna var förhållan- devis hög, erhölls mätresultatet på några få sekunder.

Magasineringen i datorn möjliggjorde reproduktion och be- handling av signalen med användning av magnettejp, plottning och annat.

Den magasinerade signalen innehåller en avsevärd mängd data, exempelvis amplituden hos absorptionen vid olika observationsvâglängder, och dess variation med tiden.

Om denna amplitud är V(A,t), är det i allmänhet möjligt att fastlägga A och t så att: V(Äo,to) = kl + k2 nc där nc är antalet för ifrågavarande ändamål relevanta celler och kl och kg är konstanter, som kan erhållas genom ett kalibreringsförfarande, exempelvis genom att man inför ett prov med känd sammansättning i apparaten.

EXEMPEå_l Provning av cellkulturer.

Vitalitetsprov.

Detta tillämpas på jästkulturer av Saccharomyces- typen, exempelvis Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis eller dylikt. Provet ger ett kvantitativt mått på antalet döda celler i fermenteringen. . Å Éæšrçsïlzuurrfir s psoosu§o~2 10 15 lzo '25 30 "35 Experimentell metod Det cellprov som skall testas blandas med en bland- ning som per liter innehåller lO~4 g trypanblått tillsammans med 0,1 g NaN3, 6,8 g KHZPO4, reglerad till pH 7,2 med KOH, och 8,76 g NaCl. CoCl2 tillsätts till en slutlig koncentration av 10-2 M i närvaro av EDTA i samma koncent- ration. Blandningen omrörs under några minuter och mäts därefter med den ovan beskrivna apparaten.

Provet bestrålas i en 2 mm cell med användning av den pulsade lasern vid Å = 659 nm, och absorptionsvaria- tionerna vid Å = 405 och 435 nm observerades efter l us fördröjning från laserpulsen. Kalibrering är nödvändig förjämförelse av observerad amplitud med amplituden hos laserpulsen, kontroll av optiska arrangemanget etc. För detta ändamål används en suspension, i vilken jästcellerna räknas och därefter dödas genom kokning under några I minuter.

Resultat: I fig. 2 representerar ordinatan den transienta absorptionen (mätt i mv) bestämd vid_A = 435 am när en suspension innehållande delvis dödade celler av Saccharo- myces lactis och trypanblått utsätts för pulsad strålning vid Å = 65! nm enligt ovanstående. Abskissan anger tiden i mikrosek1nder (us).

I f-g. 3 representerar ordinatan den transienta amplituden (i mV) efter l us från början av laserpulsen.

Abskissan 'epresenterar procentsatsen döda celler i suspensionrn, bestämd på konventionellt sätt, exempelvis genom räkn.ng med optiskt mikroskop.

Kor'elationen är mycket god och möjliggör automa- tisk mätniig av antalet döda deller på några få sekunder.

Den uppnåeliga känsligheten kan variera kring 100-1000 celler/mm3, det vill säga mindre än l % av den totala populationen i vätskan.

EXEMPEL 2 Provning av cellkulturer.

Förorening 10 15 20 25 30 -35 8005060-2 Samma komposition som den som användes för reak- tionsblandningen enligt exempel l, innehållande trypan- blått, möjliggör särskiljning av olika typer av celler i fermentation. För två olika jäster av Saccharomycestypen har den vid Å = 435 nm observerade transienten olika variation med tiden. Så exempelvis är halveringstiden (dvs. den tid under vilken transientamplituden minskar till hälften) för Saccharomyces lactis 2,3 us och för Saccharomyces fragilis 1,7 uš.

Ingen transient kan observeras i döda bakterie- celler av Arthrobactertypen. Metoden är därför lämplig för provning jästförorening i bakteriekulturer eller för särskiljning av olika jästarter. För detta ändamål dödar man genom kokning under några minuter alla celler i ett prov som skall analyseras, varefter provet behandlas med den färgämnet innehållande blandningen och mätningar görs med avseende på amplituden och avtyningstiden hos den vid 435 nm registrerade transienten när provet be- strålas med 650-nm-pulser.

EÄEMPEL 3 Mätning av mängden DNA i vävnader.

Metoden är lämplig för kvantitativ mätning av nukleinsyror i celler av människa.

Vita blodkroppar i olika kompositioner användes för detta prov, Prover innehållande olika celler med lätt mätbara mängder DNA erhålles från hepariniserat blod på känt sätt genom centrifugering i en Ficoll-gradient. Man till 15 %, varvid de på gradienten stratifierade cellerna centrifu- använder en linjär Ficollgradient från 18 % geras under fem minuter vid 50 x g och under 7 minuter i 250 x g. Olika band erhålls, vilka efter rening innehåller lymfocyter, monocyter och granulocyter med små mängder röda blodkroppar. De på detta sätt erhållna vita cellerna räknas och analyseras på band med mikroskop på vanligt sätt. Detta möjliggör en kvantitativ utvärdering av i provet förekommande DNA, eftersom genomsnittliga inne- hållet av kromatin i varje slag av cell är känt.

De' olika erhållna fraktionerna färgas såväl PQQR QuALrrY 8005060-2 10 15 20 25 30 _35 separat som blandade med varandra i kända proportioner.

För färgningen centrifugeras cellerna och suspen- X 1o"5 i fysiologisk lösning innehållande 0,05 M fosfatbuffer vid pH 7,2 och även innehållande 10-2 M CoCl2 och 10-2 M , EDTA. deras i en lösning innehållande 5 M akridinorange å Den erhållna suspensionen pulsbestrålas med använd- ning av den ovan beskrivna apparaten vid en våglängd mellan 473 och 532 nm.

Suspensionen observeras med kontinerligt ljus vid 435 nm.

Samma procedur genomförs med ett prov innehållande samma reagenter, ehuru utan färgen. Detta är nödvändigt på grund av att mindre mängder förekommande karboxihemo- globin skulle kunna bidra till den transienta absorptionen.

Den med prov utan färg erhållna transienten dras ifrån den som erhållits med de fullständiga blandningarna för att ge det resultat som visas i fig. 4.

Ordinatan representerar transientens amplitud (mätt i mV) och abskissan representerar tiden i us.

Transientabsorptionens variation bestäms vid 435 nm när en suspension innehållande granulocyter av människa o=h akridinorange bestrålas vid 532 nm på sätt som beskriflits ovan.

Amp ituden hos pulsen 1 us efter bestrålningen med lasern är roportionell mot DNA-innehållet i provet enligt fig. 5. I «enna figur visas transientens amplitud (i mV) som funktion av DNA-innehållet (uttryckt som mg/1) för olika cell yper, nämligen lymfocyter och monocyter i olika proportion-r eller blott monocyter eller blott granulo- cyter eller samtliga leukocyter. Proven innehåller olika mängder erftrocyter och härrör från olika donatorer.

Det förhållandet att denna proportionalitet erhålls för olika innehåll av olika celler tagna från olika indi- vider, möjliggör att sättet också kan tillförlitligt tillämpas på biologiska vävnader av annat ursprung, exempel-_ vis epitelvävnader etc.

I Mätningen av DNA-innehållet tillsammans med mät- ewa-w' I' 10 15 20 25 30 '35 8005060-2 ningen av antalet i vävnaden förekommande celler kan vara av vikt vid tidig diagnos av cancertillstånd.

EÄEMPEL 4 Karakterisering leukocyter i blod av människa.

Det tillämpas på blodprov, som har behandlats så att det inte koagulerar. Det ger en kvantitativ utvärde- ring av totala antalet leukocyter och antalet granulocyter, monocyter och lymfocyter.

Experimentell metod Till ett prov av venöst blod av människa, som be- handlats mot koagulering med heparin i en koncentration av 0,l till 0,2 mg/ml blod, eller med natrium-EDTA i en kon- centration av l mg/ml, sätts en 3,5-%-ig lösning av dextran (molvikt 250.000) tills man får en slutlig kon- centration av 1,5 %, varefter blandningen hålls i termo- stat vid 37o C under 20 min. överliggande vätska, som innehåller celler av den vita serien och omkring l % av de röda blodkropparna, avlägsnas och destillerat tillsätts för sänkning av saltkoncentrationen till 0,25 O/oo. Efter exakt 30 sekunder återställs den isotoniska karaktären genom tillsatte av en 3,5 %-ig lösning av NaCl i vatten.

Cellerna uppsamlas genom centrifugering vid 400 x g under 5 min och uppslammas därefter i en 0,9 %-ig lösning av NaCl i vatten eller fosfatbuffer med pH 7,1, 0,1 M i sådan mängd att antalet lymfocyter är omkring 8.000 per mm3.

Utvinningen av leukocyterna är omkring 95 % med en pro- centuell sammansättning som inte kan skiljas från samman- sättningen hos blod: De röda blodkroppar som återstår står i ett förhållande på omkring l:l till de vita blodkropparna.

Mätningarna görs på 200 ul av en cellsuspension, i en prov- behållare med 2 mm optisk haga, till vilken färgämne och ett ämne med förmåga att snabbt stimulera emission hos färgämnesmolekylerna (quencher, stimulator). Cellerna kan vara immobiliserade på förhand.

Speciellt har följande färgningstekniker använts: Till cellsuspensionen sätts CoCl2-EDTA-stimulâtor och brilliantgrönt i en slutlig koncentration av lO 4 respektive 9.10- M. En annan färgningsteknik är att Abu-ww- PÛÛR Qlï Ä? å: JT u \ *w 8005060-2 10 15 gzo 25 30 .35 10 immobilisera cellerna med etanol vid en slutlig koncentra- tion av 12 O/oo. Efter en minut tillsätts CoCl2-EDTA och brilliantkresylblått i den slutliga koncentrationen 10-2 5 respektive 5.10- M. Ett tredje färgningssätt, vilket visat sig användbart, liknar det andra, men färgämnet är niibiått vid s.1o"5 M.

Det så erhållna proverna bestrålas därefter med det beskrivna pulslasersystemet vid våglängden 659 nm, och observeras därefter med monokromatiskt ljus vid vågläng- derna 435 nm och 547 nm.

Med två olika färgningstekniker kan man sålunda få fyra olika transienter, vilkas egenskaper är sådana att de kan korreleras med de storheter som skall mätas.

Resultat Observationen av de på detta sätt behandlade blodproverna korreleras med resultat erhållna med konven- tionella metoder, dvs med mikroskopisk observation av blod- streck. I fig. 6 och 7 visas som exempel några sådana transienter. Fig. 6 visar speciellt amplituden i mV som iakttagen vid bestrålning vid våglängden 547 nm i det prov som färgats med brilliantkresylblått och fixerats med etanol. Abskissan ger tiden i mikrosekunder. Amplituden A V, mätt som visat på figuren mellan undre spetsen och värdet efter lång tid är proportionell mot det totala an- talet monocyter. Det må nämnas att närvaron av Co-EDTA i detta exempel är väsentligt för bestämning av försvinnan- det av signaler från andra celler eller från fritt färg- ämne.

Fig. 7 visar transienten som observerad vid 434 nm i det prov som färgats med brilliantgrönt (ordinatan i mv och abskissan i mikrosekunder som förut). Bredden hos steget, motsvarande exciteringen av triplettillståndet hos färgämnet, förmodligen bundet till cellkärnan som iakttagen med mikroskop, kan noga korreleras med det totala antalet leukocyter.

Trenden hos ändringen har dessutom två faser, som framgår av figuren. Det snabba stadiet, vilket mäts lätt såväl vid 435 nm som vid 547 nm är slutligen proportionellt ___ »q ______[9 10 8005060-2 ll mot antalet lymfocyter. Därmed har sålunda alla tre obe- roende parametrar (antal lymfocyter l, antal monocyter m och antal granulocyter g) bestämts. Det totala antalet leukocyter (n) är summan av de tre, dvs n = l+m+g. Det må nämnas att blott en liten del av den information som ingår i det registrerade diagrammet för de observerade tran- sienterna har utnyttjats för dessa bestämningar och man har tillgång till oberoende observation av tidförloppet vid utslocknandet av triplettstadierna och förhållandena mellan amplituderna vid olika värden på våglängden för kontroller av annat slag, exempelvis för indikering av förekomst av patologiska celler.

PQQR QÜÃLITY

Claims (3)

8DD5Û6Û~2 |¿ Patentkrav

1. j Komposition för provning av biologiska vävnader och/eller vätskor med avseende på vissa beståndsdelar hos dessa, k ä n n e t e c k n a d av, att den består av: f __ ~s-,|_ a) ett färgämne valt bland xanten-, azin-, oxazin- och askridinfärgämnen, bland vattenlösliga diazofärgämnen eller trifenylmetan, b) ett medium som är kompatibelt med den biologiska väv- naden och/eller vätskan, c) ett ämne med förmågan att snabbt avexcitera färgämne- molekylerna vid inbördes molekylkollisioner.

2. Komposition enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d av att färgämnet förekommer i densamma i en koncentration av mellan 10-5 och 10-4 M.

3. Sätt att prova biologiska vävnader och/eller vätskor med hjälp av den i krav 1 angivna kompositionen bestående av: a) ett färgämne valt bland xanten-, azin-, oxazin- och askridinfärgämnen, bland vattenlösliga diazofärgämnen eller trifenylmetan, b) ett medium som är kompatibelt med den biologiska väv- naden och/eller vätskan, c) ett ämne med förmågan att snabbt avexcitera färgämne- molekylerna vid inbördes molekylkollisioner'i ändamål att bestämma närvaron av substanser, som kan användas för tumördiagnos tack vare möjligheten att bestämma växelverkan mellan DNA och färgämne eller att skilja döda celler frånlevande celler, och jästceller från bak- terieceller, k ä n n e t e c k n a t av, att man blandar ett prov som skall undersökas med nämnda kom- position och därefter utsätter den erhållna bland- ningen för bestrålning med en första stråle av pulsat ljus, att man släpper en andra, av monokromatiskt ljus bestående stråle genom det behandlade provet och att man analyserar den optiska intensiteten hos denna andra ljusstråle vid utgången från provet som funktion av tiden.