NO153869B - Preparat for undersoekelse av bestanddeler av biologiske vev og/eller vaesker samt anvendelse av dette. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører et preparat for undersøkelse av bestanddeler av biologiske vev og/eller væsker, bestående av

a) et fargestoff valgt fra xanten-, azin-, oksazin- eller akridin-fargestoffer eller vannløselige diazofargestoffer

eller trifenylmetanfargestoffer i en konsentrasjon regnet på hele preparatet på 10 -5 til 10 -4 M, og

b) en vandig fysiologisk saltløsning som er isotonisk og forlikelig med det biologiske vev eller væsken, og det særegne

ved preparatet i henhold til oppfinnelsen er at preparatet også inneholder c) en forbindelse som ved sammenstøt med de aktiverte fargestoff molekyler muliggjør deres raske avenergisering (quencher-forbindelse) og som består av kaliumjodid, natriumjodid eller salt av et paramagnetlsk overgangsmetall, idet denne forbindelse foreligger i en konsentrasjon på fra 0,01 til 0,2 M regnet på hele preparatet.

Preparatet anvendes for undersøkelse av biologiske vev og/eller væsker hvor man foretar en farging av det biologiske vev og/eller væske.

Disse trekk ved oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Når en forbindelse absorberer synlig eller ultrafiolett lys er det kjent at et elektron inneholdt deri passerer fra sin grunntilstand til en eksitert "singlett"-tilstand. Intersystem-kryssing kan da foregå,-med etablering av metastabile "triplett'^tilstander hvori elektronet for-blir "låst" inntil av-energisering foregår ved hjelp av en av-energiserende reaksjon (ved møte med et annet molekyl) eller ved lysutsendelse (fosforescens) eller ved andre prosesser som alle foregår relativt sakte.

Disse fenomener bestemmes lett med forskjellige kate-gorier av naturlige og syntetiske fargestoffer.

En metode som i stor utstrekning anvendes for å studere og kvantitativt å bestemme disse fenomener er den så-kalte "pu]s-lys"-fotolysemetode hvor prøven som inneholder substansen som skal undersøkes underkastes bestråling fra en puls-lyski]de som bringer et bestemt antall av fargede molekyler inn i den eksiterte elek-trontilstand.

Utviklingen av de nevnte prosesser iakttas ved å detek-tere absorbsjonen av en kontinuerlig monokromatisk lysstråle av prøven, idet dette opptegnes i forhold til tiden ved hjelp av en passende elektronisk innretning (oscilloskop etc).

Denne type metoder er blitt betraktelig kvalita-tivt forbedret i de senere år, med hensyn til en høyere sensitivitet, oppnåelig ved å anvende pulslasere som eksitasjonskilde. Det er imidlertid ikke kjent å anvende metoder av den ovennevnte type for å studere og karakterisere biologiske vev og/eller væsker, med den viktige unntagelse av det tilfelle hvor vevet under undersøkelse inneholder en stor mengde av en fotosensitiv naturlig substans, som i tilfellet med pigmenter fra klorofyll-fotosyntesen, rhodopsin og karboksyhemoglobin.

I dette henseende, i tilfellet med et vev som bare

er svakt farget, vil pulslyset preferert undergå dif-fusjonsprosesser snarere enn absorpsjon. Vevet kan imidlertid farges med syntetiske fargestoffer som vanlig ved optiske mikroskop-undersøkelsesmetoder. I dette henseende betyr det forhold at fargestoffet lykkes å farge et vev at det blir bundet til vevet på en eller annen måte.

Der er imidlertid i det minste to grunnleggende vanskeligheter ved å anvende puls-fotolyseteknikk i denne sammenheng, i prøver med sterke diffusjonsvirk-ninger.

For det første, når de fikserte fargestoffkonsentrasjoner er ganske lave, har det vært tvilsomt om tydelige signaler kunne opphås ved å anvende denne metode. For det annet kunne det tidligere ikke forutsies at signaler som skrev seg fra absorpsjons-karakteristikkene for de metastabile tilstander av fargestoffet ville være forskjellige for et fargestoff bundet til et spesielt vev i forhold til signalene som skrev seg fra molekyler i oppløsning eller bundet på en annen måte.

Det er nå overraskende funnet at det er mulig å over-vinne begge disse vanskeligheter ved å fremstille adduk-ter av bestanddeler av angjeldende biologiske vev og/ eller væsker, ved hjelp av et fargestoff som er synte- tisk eller i det minste ikke tilstede i fysiologiske væsker eller oppløsninger, ved å bringe en prøve som skal undersøkes i kontakt med et preparat i henhold til oppfinnelsen.

Den vandige fysiologiske saltløsning som er forlikelig med det biologiske vev eller væske inneholder forskjellige salger som NaCl, CaCl2og lignende i en konsentrasjon slik at den er tilnærmet isotonisk med den fysiologske komponent (0,1 - 1 vektprosen), og eventuelt andre komponenter i mindre mengdeforhold som f.eks. glukose, buffer-blandinger etc, slik at vitaliteten av de tilstedeværende celler opprettholdes, idet pH av mediet er i stand til i en viss utstrekning å variere omkring nøytralreaksjon (fra pH 4,5 - pH 9,5), og eventuelt mindre mengder av organiske oppløsningsmidler kan tilsettes for å øke fargestoff-oppløseligheten.

Som salt av et paramagnetisk overgangsmetall anvendes (fra

_2 10 - 0.2 M og Co, Fe, Ni, valgt i form av CoCl2eller lignende) eventuelt i nærvær av en chelaterende substans som f.eks. etylendiamintetraedikksyre (EDTA).

Det angitte preparat anvendes for undersøkelse av biologiske vev og/eller væsker.

Fremgangsmåten består i initialt å behandle prøven som skal undersøkes med det nevnte preparat, underkaste det resulter-ende produkt for bestråling ved hjelp av en første stråle av pulslys, den således behandlede prøve gjennomlyses med en ytterligere stråle av monokromatisk lys, og den optiske utgangsintensitet av det sistnevnte analyseres som funksjon av tiden.

Den teknikk som kommer til anvendelse ved undersøkelser av angjeldende type av biologiske vev og/eller væsker er f.eks. omhandlet i US patentskrifter 3.899.297, 4.094.745, 4.174.384 og 4.252.783, men ingen av disse gir noen som helst anvisning om tilstedeværelse av en forbindelse som ved sammenstøt.med aktiverte fargestoffmolekyler muliggjør deres raske avenergisering (såkalt "quencher"-forbindelse). Liknende preparater av tidligere kjent type for farging av levende eller døde celler eller vev er f.eks. beskrevet i B. Romeis, Mikrosko-pische Technik, 1968', s. 185-193.

På denne måte er det kjent at de signaler som skriver seg fra absorpsjonen av metastabile tilstander av fargestoffmolekyler bundet i de celler som skal.- undersøkes er distinkt forskjellige med hensyn, til.amplitude.og/eller tid-variasjon fra dem som skriver seg fra molekylene i oppløsning eller fra andre celler. Metoden lykkes således..! å karakterisere de individu-elle celler som er tilstede i vevet.

Den kjente metoden er spesielt egnet' for testing av fermen-terende cellekulturer, ved å skille døde celler fra levende celler, og gjær-celler fra bakterie-celler, og i den kvanti-tative analyse av blod-leukolytter. Fremgangsmåten er. i stand til å muliggjøre automatiske målinger" (idet de tar bare et fåtall sekunder) som en erstatning for langvarige og omstende-lige rutinemetoder som er nødvendige i tilfellet med det optiske mikroskop. Metoden kan også med hell anvendes for å bestemme egenskaper som ikke er synlige for øyet, f.eks. den spesifikke molekylære interaksjon av fargestoffet med noen av cellebestanddelene.

Metoden kan derfor anvendes for tester som hittil ikke

har kunnet utføres, eller bare under anvendelse av med kompliserte metoder. Det er spesielt lett å forutsi

metodens anvendelse for svulstdiagnoser på grunn av muligheten til kvantitativ bestemmelse av DNA-farge-stoffinteraksjonen.

Fig. 1 er en skjematisk fremstilling av en foretrukket utførelsésform av apparatet anvendt i disse tester.

S.j er kvikksølvlampen og S2er laserstrålen. Ly, L2

L3og L4er kvartslinser. , M2speil og D1, D2er fasttilstand-detektorer som detekterer laserpulsen.

MC er monokromatoren med høy .lysstyrke. S indikerer posisjoner av prøven, og PM er fotoforsterkeren. Filtere og iriser er utelatt for å lette forståelsen.

Den pulserte lysstråle ble oppnådd fra en Nd-laser, nemlig en kommersiell YAG ("Chromatix" modell 1000) som av^ir lyspulser på 0 ,1 - 0,5 mJ på omtrent 150 ns varighet, og med en repetisjonsfrekvens på omtrent 50 Hz.

Laserfargen kah varieres fra blå ( /\.= 473 nm) til nær infrarød. Observasjonsstrålen ble fremstilt ved hjelp

. av en passende filtrert høytrykks-kvikksølvlampe.

Begge strålene ble fokusert til en sone av prøven med omtrent 0,2 mm diameter slik at det ble dannet en vinkel på omtrent 15° mellom dem. Prøvecellen var 2 mm tykk. Lyset fra lampen passerte gjennom en monokromatisk lyskilde med stor apertur og ble tilført en fotoforsterker ("Philips" XP1113). Den elektriske energi-avgivelse fra fotoforsterkeren ble opptegnet kontinuerlig som den gjennomsnittlige verdi og ble også tilført en forforsterker med et passeringsbånd mellom 0,5 KHz og 30 MHz og deretter forsterket, opptegnet på digital-hukommelser, og lagret i en liten komputer ("LABEN" 70).

Signalet oppnådd fra en enkel puls ble opptegnet og

addert med signalene fra hundreder av analoge pulser.

Det ble således oppnådd et signalgjennomsnitt hvori støyen var redusert med en faktor på mer enn ti i forhold til signalet som skrev seg fra en enkel puls. Da repetisjonsfrekvensén av.pulsene var forholdsvis høy, ble resultatet av målingene oppnådd i.løpet av et fåtall sekunder. Lagringen i regnemaskinen gjorde reproduksjon og behandling av signaler mulig ved å anvende magnetbånd, plottere, etc. Det lagrede signal inneholder en betraktelig mengde data, spm amplityden av absorpsjonen ved forskjellige observasjonsbølge-lengder og dens variasjon, med tiden.

Hvis denne ampi i tyde er V (\, t) er det generelt mulig å fiksere X og t slik at : V. (X q i t^) = k^+ k^i nc hvori ■-n- • er antallet av celler relevant for angjeldende formål, og k^og. k2 er konstanter som kan oppnås .vpd en kalibreringsprosess, f.eks. ved å innføre en prøve av kjent sammensetning i apparatet.

EKSEMPEL 1

. Testing av cellekulturer. Vitalitetstest. Det anvendes cellekulturer av typen Saccharomyces, som Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis eller lignende.

Testen gir en kvantitativ måling av antallet av døde celler tilstede under gjæringen.

Eksperimentell metode..Celleprøven som skulle testes blandes med en blanding inneholdende 10 -4 trypan blått sammen med 0,1 g NaN^, 6,8 g KH2PQ4innstilt til pH

7,2 med KOH, og 8,76 g NaCl pr. liter. CoGl- tilsettes til en endelig konsentrasjon på 10 -2 Mi nærvær av én like stor konsentrasjon av EDTA. Blandingen omrøres i noen minutter og måles så med det beskrevne apparat.

Prøven bestråles i en 2 mm celle under anvendelse av den pulserte laser med X = 659 nm, og absorpsjons-variasjonene ved 405 og 435 nm iakttas etter ett mikrosekunds forsinkelse fra laserpulsen. Kalibrering er nødvendig for å bedømme den iakttatte amplitude i forhold til amplituden av laserpulsen, den optiske innretning etc. For dette formål anvendes en suspensjon hvori gjærcellene er talt opp og deretter samtlige drept ved koking i noen minutter.

RESULTATER;

I fig. 2 representerer ordinaten den gjennomgående absorpsjon (i mV) iakttatt ved/V= 435 nm når en suspensjon inneholdende delvis drepte celler av Saccharomyces lactis og trypåh blått, underkastes pulsbestrålirig ved

X 659 nm som tidligere beskrevet. Abscissen representerer tiden i mikrosekunder. I fig. 3 representerer ordinaten den gjennomgående amplitude (i mV) iakttatt ett mikrosekund fra begynnelsen av laserpulsen. Abscissen representerer prosentandelen av døde celler i suspen-sjonen bestemt ved hjélp av konvensjonelle metoder, f.eks. ved hjelp av optisk mikroskop~telling.

Korrelasjonen er meget god og muliggjør automatisk måling av antallet av døde celler i løpet av bare noen få sekunder. Den sensitivitet som kan oppnås kan variere omkring 100 - 1000 celler/mm 3 d.v.s mindre enn 1% av den totale mengde celler som er tilstede i dyrk-ingsmediet.

EKSEMPEL 2

Testing av cellekulturer. Forurensning av forskjellige stammer.

Den samme sammensetning ble anvendt som for reaksjons-blandingen i eksempel 1, inneholdende trypan blått og muliggjør at forskjellige typer av celler under en gjæring kan bestemmes. For to forskjellige gjærstammer av Saccharomyces-type har den gjennomgående stråjiing iakttatt ved X = 435 nm forskjellig variasjon med tiden, f.eks. er halveringstiden (d.v.s. den tid hvor-under gjennomgangsamplituden reduseres med en faktor på 2) 2,3 mikrosekunder for Saccharomyces lactis, og 1,7 mikrosekunder for Saccharomyces fragilis.

Ingen lysgjennomganq iakttas i døde bakterieceller av Arthro-bacter-type. Metoden er derfor egnet for testing av gjærforurensing i bakteriekulturer, eller for å skille mellom forskjellige gjærtyper. For dette formål blir alle tilstedeværende celler i den prøve som skal analyseres drept ved koking i noen minutter, prøven be-handles så med blandingen inneholdende fargestoffet,

og målinger foretas så av amplituden og halveringstiden for lysgjennomgangen opptegnet ved X =4 35 nm, når prøven bestråles med pulser på 650 nm.

EKSEMPEL 3

Måling av DNA-mengden tilstede i vev.

Metoden er. egnet for kvantitativ måling av nukleinsyrer tilstede i humane celler. Hvite blodlegemer i de forskjellige sammensetninger ble anvendt for denne test.

Prøver inneholdende forskjellige celler med lett mål-bare mengder av DNA oppnås fra heparinisert menneskeblod ved hjelp av kjente metoder omfattende sentrifugering i en Ficoll-gradient. En lineær Ficoll-gradient fra 18% til. 15% anvendes og cellene lagdelt på gradienten sentrifugeres i 5 minutter ved 50 x g og i 7 minutter ved 250

x g. Forskjellige bånd oppnås som når de renses inneholder lymfocytter, monocytter og granulocytter, med små mengder røde blodmengder. De hvite celler oppnådd

på denne måte telles og analyseres ved hjelp av et mikroskop under anvendelse av de vanlige metoder. Dette muliggjør en kvantitativ bedømmelse av DNA -innholdet i prøven da det gjennomsnittlige innhold av kromatin i hver type av celler er kjent.

De forskjellige oppnådde fraksjoner farges både separat og blandet sammen i kjente mengdeforhold.

For fargingen sentrifugeres cellene og suspenderes i en

-15

løsning inneholdende 5 x 10 M åkridin orange i en fysiologisk løsning inneholdende 0,05 M av en fosfat--2

buffer ved pH 7,2 og også inneholdende 10 M CoCl_

-2

og 10 MEDTA.

Den oppnådde suspensjon pulsbestråles under anvendelse av det tidligere beskrevne apparat ved en bølgelengde mellom A» 437 og A. = 532 nm. Det observeres med kontinuerlig lys ved X_ = 435 nm.

Den samme metode følges for en prøve inneholdende de samme reagenser men uten fargestoffet. Denne siste operasjon er nødvendig på grunn av at tilstedeværende små mengder av karboksyhemoglobin kunne bidra til transient- absorpsjonen.

Transienten oppnådd under anvendelse av prøven uten fargestoffet trekkes fra den som oppnås med de fullsten-dige blandinger, til å gi resultatet vist i fig. 4.

Ordinaten representerer amplituden av transienten (i mV) og abscissen representerer tiden i mikrosekunder.

Variasjonen av transient-absorpsjonen iakttas ved = 435 nm ved bestråling av en suspensjon inneholdende human-granulocytter og akridin orange ved = 532 nm, som tidligere beskrevet.

Amplituden av pulsen et mikrosekund etter bestråling med laseren er proposjonal med DNA-innholdet i prøven som vist'i fig. 5. I denne figur er amplituden av transienten (i mV) vist som en funksjon av DNA-innholdet (uttrykt som mg/l) for forskjellige typer av celler,

■nemlig lymfocytter og monocytter i forskjellige mengdeforhold, eller monocytter alene, eller granulocytter alene, eller bare leukocytter. Prøven inneholder variable mengder av erytrocytter og skriver seg fra forskjellige donorer.

Det forhold at denne proporsjonalitet oppnås for forskjellige innhold av forskjellige celler tatt fra forskjellige individer gjør det sannsynlig at metoden også kan anvendes med sikkerhet for biologiske vev av andre opprinnelser, som f.eks. epitelvev, etc.

Målingen av DNA-innboldet sammen med målingen av antallet av celler tilstede i vevet kan være viktig ved tidlig diagnose av cancer-tilstander.

EKSEMPEL 4

Karakterisering av leukocytter i menneskeblod.

Det anvendes prøver av blod som er blitt gjort ikke-levrende.

Metoden tilveiebringer en kvanitativ bedømmelse av det totale antall leukocytter og av antallet av granulocytter, monocytter og lymfocytter.

Eksperimentell metode. Til en prøve av venøst menneskeblod som er blitt gjort ikke-levrende med heparin i en konsentrasjon på 0,1 - 0,2 mg/ml blod eller med natrium-EDTA i konsentrasjon 1 mg/ml, tilsettes en 3,5% løsning av dekstran (molekylvekt 250.000) inntil det oppnås en sluttkonsentrasjon på 1,5%, idet blandingen holdes i

en termostat ved 37°C i 20 minutter. Supernatan-

ten fjernes idet denne inneholder de hvite celle-typer og omtrent 1% av de røde celler, og destillert vann tilsettes slik at saltkonsentrasjonen nedsettes til 0,25% (pr. tusen deler). Etter nøyaktig 30 sekunder gjenopprettes isotonisk karakter ved tilset-ning av 3,5% vandig NaCl. Cellene samles ved sentrifugering ved 400 g (gravitasjonskraft) i 5 minutter og oppslemmes så i vandig 0,9% NaCl eller fosfat-buffer,

pH 7,1, 0,1 M i et slikt volum at antallet av lymfocytter er omtrent 8000 pr. kubikk millimeter. Gjen-vinningen av leukocyttene er omtrent 95% med en prosent-vis sammensetning som ikke kan skilles fra sammensetningen av blod. De røde celler som er tilbake er i et forhold på omtrent 1 : 1 med de hvite celler. Målingene gjøres med 200 raikroliter av en cellesuspensjon, i en celle med 2 mm optisk bane hvortil fargestoff og et av f-energiserende middel tilsettes . Cellene kan fik-seres på forhånd.

Mer spesielt har den følgende fargeteknikk vært anvendt. Til cellesuspensjonen tilsettes CoCl2-EDTA-av-energiser-ingsmidlet plus brilliant grønn i en endelig konsentra--2 -4

sjon på 10 henholdsvis 9 x 10 M. En annen fargeteknikk er å fiksere cellene med etanol ved en endelig konsentrasjon på 12% (pr. tusen). Etter 1 minutt tilsettes CoCl-EDTA og brilliant kresyl blått i den endelige konsentrasjon på 10 -2 henholdsvis 5 x 10 -5M. En tredje fargemetode som har vist seg brukbar er lik den andre av dem som er beskrevet her, men fargestoffet er nil blått ved 8 x IO-5 M.

De således oppnådde prøver bestråles deretter med puls-laser-systemet beskrevet i den første del av beskrivel-sen, ved X= 659 nm, og iakttas med monokromatisk lys ved A = 435 nm og deretter X = 547 nm.

Med to forskjellige fargeteknikker kan det således oppnås fire forskjellige transienter med egenskaper slik at de kan korrelereres med de størrelser som skal måles.

RESULTATER:

Cbservasjonen av de således behandlede blodprøver korre-leres med den som oppnås med de konvensjonelle metoder, d.v.s. med den mikroskopiske observasjon av utstryk av fullblod. i fig. 6 og 7 gjengis som eksempel et fåtall slike transienter. Mer spesielt viser fig. 6 amplituden i mV observert ved X = 547 nm i prøven farget med brilliant kresyl blått og fiksert med etanol. Abscissen gjengir tiden i mikrosekunder. Amplituden,

/\ V, som målt i figuren mellom toppen og verdien etter lengere tid er proporsjonal med det totale antall monocytter. Det bemerkes at i dette eksempel er det vesentlig med nærvær av Co-EDTA for å bestemme for-svinningen av signalene som kommer fra andre celler eller fra det frie fargestoff. Fig. 7 viser transienten som iakttatt ved X = 435 nm i prøven farget

med brilliant grønn (ordinaten er i mV og abscissen i mikrosekunder som i det foregående tilfellet. Bredden av trinnet, tilsvarende eksitasjonen av triplett-tilstanden av fargestoffet, antagelig bundet til celle-kjernen som iakttatt i mikroskopet, kan godt korre-leres med det totale antall leukocytter.

Falltendensen er dertil i to faser, som det fremgår av figuren. Det hurtige trinn som passende måles ved

A = 435 nm og X = 547 nm er tilslutt proposjonalt med antall lymfocytter. Det ble således bestemt alle tre uavhengige parametere (antallet av lymfocytter (1), antallet av monocytter (m) og antallet av granulocytter (g), det totale antall av leukocytter (n), tilsvarende summen av de tre nevnte, d.v.s. n = 1+m+g. Det bemerkes at bare en liten fraksjon av den opplysning inneholdt i opp-tegnelsen for de iakttatte transienter er blitt utnyttet for disse bestemmelser og man har tilgjengelig den uavhengige observasjon av falltidene for triplett-trinnene og forholdet mellom amplitudene ved forskjellige verdier av A , til å fjennomføre bestemmelser av annen natur, som f.eks. å indikere nærværet av patologiske celler.

Claims (2)

1. Preparat for undersøkelse av bestanddeler av biologiske vev og/eller væsker, bestående av

a) et fargestoff valgt fra xanten-, azin-, oksazin- eller akridin-fargestoffer eller vannløselige diazofargestoffer eller trifenylmetanfargestoffer i en konsentrasjon regnet på hele preparatet på 10 -5 til 10 -4 M, og b) en vandig fysiologisk saltløsning som er isotonisk og forlikelig med det biologiske vev eller væsken, karakterisert vedat preparatet også inneholder c) en forbindelse som ved sammenstøt med de aktiverte fargestoff molekyler muliggjør deres raske avenergisering (quencher-forbindelse) og som består av kaliumjodid, natriumjodid eller salt av et paramagnetisk overgangsmetall, idet denne forbindelse foreligger i en konsentrasjon på fra 0,01 til 0,2 M regnet på hele preparatet.

2. Anvendelse av preparatet angitt i krav 1 for under-søkelse av biologiske vev og/eller væsker.