JP2993982B2 - 生細胞に対する細胞作用剤の効果を検出するための方法及び装置 - Google Patents

生細胞に対する細胞作用剤の効果を検出するための方法及び装置

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は、1988年10月21日に出願された継続中の出願
第260,521号の部分継続出願である。
本発明は、生細胞に対する細胞作用剤の効果を検出す
るための方法及び、この方法を実施するために適用され
る装置に関する。細胞作用剤の溶液又は懸濁液は、細胞
上に流し、この剤の効果を測定する。
発明の背景の記述 生細胞に対する種々の細胞作用剤の効果の研究は、文
献中に報告されている。例えば、Meisner,H.及びTenny,
K.（1977）の“含脂肪細胞からの遊離脂肪酸の放出の指
標としてのpH"（pH as an indicatior of free fat
ty acid release fromadipocytes）J.Lipid Resear
ch,18:774−776;Nilsson,N and Belfroge,P.（1979）
“pH−安定 滴定による含脂肪細胞からの遊離脂肪酸放
出の連続モニターリング”（Continuous monitoring
of free fatty acid relase fromadipocytes by
pH−stat titration）J.Lipid Research 20:557〜
560;Reuss,L.,Weinman,S.及びConstantin,J.（1984）
“胆嚢上皮の頂端膜におけるH+とHCO3 -の運搬”（H+ a
nd HCO3 - transport at the apical membrans o
f the gallbladder epithelium）p85〜96,Forte,J.W
arnock,D.及びRector,F.Jr.（版）上皮における水素イ
オンの運搬（Hydrogen Ion Transport in Epitheli
a;Wiley−Interscience;Zeuthen,T.及びMachen,T.（198
4）“サンショウオの胆嚢におけるHCO3 -/CO2のNA+/H+及
びCl-/HCO3 -交換の刺激”（HCO3 -/CO2 stimulates NA
+/H+and Cl-/HCO3 -exchange in Necturus gallblad
der）p97,108（同上）;Handler,J.S.,Preston,A.S.及び
Steele,R.E.（1984）“上皮の運搬機構の分化及びホル
モンへの応答に影響する因子”（Factors affecting
the differentiation of epithelial transport a
nd responsiveness to hormones;Federation Procee
ding）43:2221〜2224;及びSimmons,N.L.,Brown,C.D.A.
及びRugg,E.L.（1984）“マージン−ダービー犬の腎細
胞へのエピネフリンの作用”（The action of epine
phrine on Madin−Darbycanine kidny cells;Feder
ation Proceedings）43:2225〜2229.を参照されたい。
これらの参考文献は、比較的に大量の媒体、即ち、バル
ク媒体中にさらされた細胞に対する細胞作用剤の添加に
よるpH及び他の電位における変化の検出を開示してい
る。これらの手法の欠点は、pH及び他の電位の測定はバ
ルク媒体から行なわれ、必ずしも生細胞の細胞膜に隣接
する実際の値を反映していない。また、細胞容積に対す
るバルク容積の大きな割合は、必然的に細胞外媒体の特
性に対する細胞の効果を薄める。したがって、感度は失
なわれ、又は、大いに減じられる。
生化学系を測定するための光応答性センサーは、本発
明の権利者により所有される種々の特許文献に開示され
ている。米国特許第4,591,550号（Hafemanら）及び同第
4,704,353号（Humphriesら）；欧州特許出願第213,825
号（Hafemanら）。米国特許出願第4,519,890号は流体pH
室を開示している。これらの特許出願は、測定される溶
液の周囲における変化を測定するために微生物を使用す
ることを開示している。これらの出願においては、脂肪
作用剤の効果を測定するために使用する微小流体室にお
ける細胞を開示していない。米国特許第4,737,464号（M
cConnellら）及び同4,741,619号（Humphriesら）、これ
らは同様に本発明の権利者により所有されているもので
あり、これを参照されたい。
生細胞と分析物の細胞外効果を測定するために蛍光を
使用する種々の方法は、文献に記載されている。例え
ば、Briggsら（1985）“繊維光学プローブ細胞メータ
ー”（Fiber Optie Probe Cytometer）J.Immunologi
cal Methods,81:73−81;Hafemanら（1984）“蛍光脂質
単層膜に対する細胞免疫攻撃の間に、スーパーオキサイ
ドは光漂白剤を高める”（Superoxide Enhances Phot
o Bleaching During Cellular Immune Attac Aga
inst Fluorescent Lipid Monolayer Mambranes）Bi
ochemica Biophysica Acta 772:20〜28及び米国特許
第4,560,881号及び同第4,564,598号を参照されたい。
発明の概要 本発明の目的は、高い正確度及び精度をもって、生細
胞に対する細胞作用剤の効果を検出する方法を提供する
ことにある。
本発明のもう１つの目的は、多量のバルク媒体の使用
を避けて、生細胞に対する細胞作用剤の効果を検出する
ための方法を提供することにある。
さらに、本発明の特別な目的は、（ａ）細胞と本質的
に接触する細胞作用剤を含有する溶液又は懸濁液の連続
流又は間欠流に対して適用される微小流体室内に保持さ
れる生細胞を用意し、その際細胞と接触する細胞作用剤
の量をコントロール可能にし；（ｂ）細胞と本質的に接
触する細胞作用剤を含有する溶液又は懸濁液を流し、そ
のことにより、pH、酸化還元電位、細胞表面電位又はト
ランス−細胞性電位における細胞媒介細胞外効果又は変
化を生成させ；そして（ｃ）微小流体室に関連して操作
可能なpH、酸化還元電位、細胞表面電位又は、トランス
細胞性電位を検出するための手段で、細胞作用剤の効果
を測定することにより、生細胞に対する細胞作用剤の効
果を測定するための方法を提供することである。
更にもう１つの本発明の目的は、この発明の方法を実
施するために、特に使用される装置を提供することにあ
る。
本発明の好ましい態様において、細胞は、流体室の内
部表面又は流体室に含まれる多孔膜又は微小担体上に、
細胞の自然の、又は、天然の付着を行ない、微小流体室
中に保持することができる。この細胞は、細胞に対し生
物学的に相容性の結合剤手段により微小流体室に保持す
ることもできる。好ましい結合剤の例は、アガロースで
ある。
本発明のもう１つの好ましい態様において、微小室の
表面上に、細胞を、好ましくは重力沈降により、物理的
に捕獲（trap）するように働く複数のへこみ、くぼみを
有する表面を微小流体室で設けることにより、生細胞を
微小流体室内に保持することができる。これらのくぼみ
は、細胞が通常の流速の間に微小流体室内に残存するの
に十分な広さと深さとすべきである。次に、細胞は、く
ぼみから細胞を洗い出すのに十分な微小流体室を通じて
の高流速の使用を含む適当な手段、又は、くぼみから細
胞を流動流に追い出すための室の逆転位により、捕獲さ
れたくぼみから除去することができる。他の態様におい
て、多孔膜により分離された流体室の仕切り内に捕獲す
ることにより、細胞は流体室に保持することができる。
本発明で使用される微小流体室の好ましい構造のいく
つかの特徴は、この装置の多くの適用において共通して
いる。このうちの主要なものは、付着細胞の最大濃度を
コントロールする、室における容積−表面の割合であ
る。１個の細胞により放出されるプロトン当たりのpHの
変化は細胞濃度に反比例し、それゆえ、表面に対する容
積比に反比例する。第１〜４図に記載のように、室の平
面の平板構造に対して、この割合は、単に室の高さ、典
型的には100μｍである。
容積−表面比を含むデザイントレードオフ（trade−o
ff）は、主に、流体操作の容易さに対する感度のトレー
ドオフである。本発明の好ましい装置に関して、約200
μｍ以上の割合に対して、感度は深刻に低下する。約50
μｍ以下の厚さにおいては、感度の増大を相殺する重大
な流体の操作困難が予期される。しかしながら、センサ
ーの表面に微小機械化された室のような機器の改良は、
ずっと小さい規模で流体工学と室を統合可能にし、10〜
50μｍの割合で１又は少数の生細胞の分析を可能とする
かもしれない。
本発明で使用される微小流体室の好ましい容積は、あ
る程度、意図される装置の適用に依存する。例えば、使
用しうる細胞の数が限られている場合には、サブ−マイ
クロリッターの室容積が好ましい（例えば、約103個の
細胞を含む、1mm2の表面積と100μｍの高さ、又は、100
nlのもの）。より大きな数の細胞を含む他の適用におい
ては、マイクロリットル、又は、さらにはミリリットル
規模の室容積が想定される（約105個/cm2の細胞に関し
ては、平方センチメートルの桁の表面積で、高さは概略
100μｍの室高である）。このように、好ましい微小流
体室は、室内で達成できる小さな全容積及び／又は、小
さな高さ又は容積−表面積比を有する。
本発明の方法で好適に使用される微小流体室の型は、
米国特許第4,591,550号明細書に開示された型のもので
あり、この開示は参考として本明細書に含める。アルゴ
ン及び／又はヘリウム／ネオンレーザーを、米国特許第
4,591,550号明細書に開示された発光ダイオードの位置
において、エネルギー源として使用することができる。
又は、本発明で使用しうる微小流体室は、本発明の譲り
受け人により所有されている。1986年６月20日出願の、
継続中の米国特許出願876,925号に開示された型のもの
であり、この開示は本明細書に参考として含められてい
る。本発明で使用される最も好適な微小流体室は、生細
胞が保持される場所又はその近傍に、シリコン半導体電
極を含む。この電極により、細胞作用剤により引き起こ
される種々の電気的効果が検出又は測定できる。本発明
を実施する際には、溶液又は懸濁液の間欠又は連続流が
使用しうるので、本発明で使用される微小流体室には好
ましくは、溶液又は懸濁液の間欠及び連続流の双方が提
供されるべきである。
本発明は、特定の細胞が微小流体室内に保持できる限
りは、真核細胞又は原核細胞のいずれについても使用で
きる。遺伝子的に複製された細胞も使用できる。加え
て、刺激的、薬物、毒素、他の細胞、受容体リガンド、
受容体拮抗剤、免疫剤、ウイルス、病原体、発熱原及び
ホルモンを含む広範囲の細胞作用剤が使用できる。
本発明にしたがい、細胞作用剤によりもたらされる広
範囲の効果が検出され、又は測定できる。好適な効果に
は、pH、酸化還元電位及び細胞表面電位やトランス細胞
性電位等の微小流体室中で生細胞にじかに接触して流れ
る溶液又は懸濁液の電気的特性が包含される。これらの
効果は、種々の常用手段により測定又は検出しうる。例
えば、pHは細胞外媒体中の、又は室の一部に固定された
蛍光又はフェノールレッド等のpH感応性染料の蛍光又は
吸収を測定することにより検出できる。同様にして、他
の染料も酸化還元電位を検出するために使用できる。
本発明は、また、微生物を同定する方法、薬物の活性
をスクリーニングする方法、毒性物質を検出する方法及
び細胞内反応を検出するための方法に関する。これらの
種々の方法において、所望の細胞作用剤を含む溶液又は
懸濁液は、微小流体室内に保持された生細胞とじかに接
触して流される。細胞作用剤の細胞に対する効果が、次
いで測定され、そして、細菌が同定され、薬物がスクリ
ーンされ、そして、毒性及び細胞内反応が検出される手
段を提供する。本発明は、酸素計測定法やマイクロ熱量
計等の代謝活性を測定する他の方法に比べて、数個の利
点を有する。特に、本発明は、迅速な測定時間、増大し
た感度、非破壊性、普遍性及び一層の小型化及び集積化
の可能性を有する。
本発明の特定の好ましい態様は、好ましい態様の図面
及び詳細な記述に関連して、より一層詳細に、以下に議
論される。これらの好ましい態様は、本発明の範囲又は
性質を限定しない。
図面の簡単な説明 第１〜３図は、好ましい本発明の方法を実施するのに
有用な微小流体室の図解の横断面図である。
第４図は、好ましい本発明の方法を実施する際に有用
な微小流体室の頂部の透視図である。
第５図は、好ましい本発明の方法を実施する際に有用
な器具の概略のダイアグラムである。
第６図は、好ましい本発明の方法を実施する際に有用
な脱ガス装置の図解的なダイアグラムである。
第７図は、微小流体室中のくぼみに位置する付着した
細胞の図解的な側面図である。
第８図は、微小流体室中のくぼみに保持された細胞の
図解的な側面図である。
第９図は、本発明で使用される回路のダイアグラムで
ある。
第10図は、本発明の実行によりなしうる細胞の代謝率
の典型的な測定を表わす。
第11〜23図は、実施例1,2,4,6,9,11及び17に関連して
得られる実験結果を表わす。
第24図は、グラム陰性菌に対して効果をもつ抗生物
質、及び、効果を有しない抗生物質にグラム陰性菌をさ
らした時の結果を表わす。
第25図は、好ましい本発明の方法を実施する際に使用
される、細胞保持用のくぼみの図解的な平面図を表わ
す。
第26〜46図は、実施例19〜23に関連して得られた実験
結果である。
好適な態様の記載 第５図に関連して、好ましい態様の機器の構成は、好
適には、１以上の注入ポンプのドライブ又はポンプ、脱
ガス室、選択バルブは噴射ループ（injection Loops）
バルブ、流体室参照電極貯蔵器及びシリコン半導体電極
センサー及びデータ処理のために必要な関連電子装置か
ら成る。
注入ポンプのドライブは、一定の流速で流体室に溶液
又は懸濁液（即ち、媒体）を提供する。流速及び注入ポ
ンプドライブのオン／オフ周期は、、データ取得の時期
にコンピュータ手段によりコントロールされる。代わり
に、蠕動ポンプのような他の型のポンプを注入ポンプド
ライブの位置で使用しうる。
第６図に関して、脱ガス室は溶液又は懸濁液が通過す
る長いシリコンゴム製の管から成る。管の外側は減圧さ
れた空気圧（約大気圧の2/3）に維持される。注入装置
及び管中の溶液又は懸濁液は室温であり、流体室は通常
は37℃であるから、脱ガス室は好ましい。室温の媒体が
流体室に着くと、37℃に暖まり、室で泡を形成する。流
体室中の泡は幾通りかの方法で測定を妨げる。これは、
参照電極にとり高抵抗性の行路となり、光電流信号にお
いてノイズを増大させる。これは、また、室において水
の容積を変え、室の緩衝能力を変化させる。所定の細胞
代謝速度にとって、室のpHの変化の速さは、泡の数と大
きさを変えるであろう。泡は室で生成し、時間とともに
成長する。これが一定の大きさになると、流れの中に移
動し、運び去らせる。これは、流体室の緩衝能力におい
て低周波ノイズを生ずる。
選択バルブは、使用者が１又は２個の注入装置から流
体室に流れを向けることを可能とする。代替物は噴射ル
ープバルブである。これは、使用者が流れに干渉するこ
となく、流れ中に一定量の溶液又は懸濁液を噴射するこ
とを可能とする。典型的には噴射ループバルブが使用さ
れるときは、注入装置には媒体が負荷され、噴射ループ
手段により流れを潅流するのに使用される。剤を含む溶
液又は懸濁液及び剤に対する細胞の露出時間は、噴射ル
ープの大きさ、及び潅流液の流速度を変えることによ
り、変化させることができる。
第１〜４図は、入口３と出口４をもつシリコンセンサ
ー２を有する、好適な微小流体室１を示している。第１
図において、細胞５はシリコンセンサーの上部表面に単
層で付着し、シリコンセンサー上の応答はレザー光線６
により変調（modulated）される。細胞は透過膜により
シリコンセンサーに隣接して保持してもよい。操作の際
には、細胞作用剤を含む溶液は、入口３を通じて入り、
微小流体室１において細胞５上を流れる。溶液は出口４
から出、この流出液は参照電極と電気的に接触する。シ
リコンセンサー２の上部表面での部分的応答はレザー光
線６により変調され、測定される。第２図は、ゆっくり
した流速の際に細胞が捕獲、保持され、速い流速の際に
流体室からフラッシュされる、くぼみ７を示す。
流体室は、好ましくは、底部がシリコンセンサー２
で、頂部がインジウム−オキサイド（ITO）で被覆され
たガラス製のカバースリップ８で閉ざられる薄いチャン
ネルである。付着電池をシリコン半導体電極に代えて、
カバースリップの表面上に形成することもできる。シリ
コンセンサーとカバースリップの間隔は、約100μｍで
ある。センサー２とカバースリップ８の間隔は、流体室
を形成する相応するチャンネルカットアウトを有するテ
フロンスペーサーにより形成されうる。制御電極13、好
ましくはプラチナ線は、ITO制御電極と電気的に接触さ
せるために、流体室のプラスチックの囲いを貫通する。
シリコンセンサーとの電気的接触は、流体室の金属の基
板９を介してなされる。テフロン入口及び出口チュー
ブ、３と４はプラスチックの囲いを貫通し、媒体が流体
室を通して流れることを可能とする。出口チューブ４
は、Ag/AgCl参照電極を有する貯蔵器で止まる。こうし
て、出口チューブ４は塩架橋として作用し、流体室の溶
液又は懸濁液の電位の測定を可能とする。全流体室は、
コントロールされた循環する水浴10により一定温度、典
型的には37℃に維持される中空の金属支持体上にとり着
けられる。カバースリップ８は移動可能なシリコンゴム
のガスケット11と保持部材12により、操作位置に維持さ
れる。
シリコンセンサーに照明を施して適切な光応答（phot
oresponse）を発生させるためには、２つの異なる装
置、即ち、レーザ装置と光放射ダイオード（LED）装置
が使用される。
レーザ装置中で、流体室は光学顕微鏡のステージ上に
とりつける。150mWのアルゴンイオンレーザからのビー
ムは10KHzの機械的チョッパーを通じて、ビームエキス
パンダーに向けられ、直径約2.5cmのビームを生成す
る。次に、ビームは偏光フィルター（可変減衰器）を通
過し、鏡により、四列ナイフエッジ調節可能孔を通じて
顕微鏡の鏡胴（barrel）に向う。これに代わる他の装置
の説明として、室は顕微鏡のステージに取り付けられ、
次いで、10mWのHeNeレーザからのビームは付帯照明シス
テムを通してセンサーに投影される。これらの配置にお
いて、人は顕微鏡を通して流体室中の細胞をみることが
でき、あらゆる所望の大きさの方形又は長方形のプロー
ブビームを流体室のシリコン表面のいかなる部位にも向
けることができる。非融合性の（nonconfluent）細胞培
地が使用されるときは、このことは特に有用である。こ
れは、プローブビームを最も細胞密度の濃い部位に向け
ることを可能とする。さらに、人は、細胞のみれない領
域にビームを向けることにより、装置の移動をコントロ
ールすることができる。
LED装置において、２個の流体室が温度のコントロー
ルされた板上に、並置される。照明のため、各室に導か
れたファイバーオプチック光線は温度制御板を貫通し、
下面（媒体に接触する表面と反対側の面）からシリコン
センサーを照明する。４個のファイバーのうち、１個は
入口チューブの近傍に、１個は出口チューブの近傍に、
そして、２個は入口及び出口から等間隔にして、一直線
に並べる。この装置は、比較的堅く、均一の密度に成長
するセルとともに使用するのが好ましい。しかしなが
ら、なお最大密度の採取領域内にいくらかの裕度を与え
ている。光ファイバーの一端はシリコンセンサーにぶつ
かり、他端は赤外LEDに連結する。各ファイバーの直径
は1.5mmである。データは８個の場所（２個の室各々に
４個ずつ）から、４秒ごとに同時に集めることができ
る。
室への３個の一次電気結合が存在しうる：（１）薄い
プラチナリボン又は線を介して、カバースリップ上のイ
ンジウム−スズ−酸化物へ結合する制御電極；（２）室
の出口チューブから成る塩架橋を介して、流体室中の溶
液の電極を測定する、外部くぼみにあるAg/AgCl参照電
極；及び（３）シリコンチップのベースへのオーム結
合。カスタムサーキットボードを有するパーソナルコン
ピュータは、当該分野でよく知られた方法で、捕捉、分
析及び表示を操作しうる。
本発明で使用するのに好適な回路は、第９図に示され
ている。センサー電極システムは、シリコンセンサー、
参照電極（R.E.）及び制御電極（C.E.）より成ることが
示されている。制御電極は、地面への低インピーダンス
接触を介して、地面に対して自由な電位（arbitrary p
otential）に溶液を維持する。自由電位は電極／溶液界
面における表面電位及び電極材料と地面との間の種々の
接触電位により定義される。参照電極は塩架橋型のもの
であり、溶液の組成に無関係に溶液の電位を測定する。
電子回路の目的は２面を有する。第１に、これは、溶液
からシリコンへの電気接触への電位を変えることを可能
とする。第２に、発光（photogenerated）交流を交番電
圧（アウトプット信号）に変える。U2Aは参照電極電位
が緩衝される規約電圧フォロアー（follower）として配
列されている。U1はデジタル的に制御される二極性の電
流源である。ピン18と19の間の結合は、電流ループを形
成する。このループにおける電流の信号（sign）と大き
さは、13を通してピン１に適用されるディジタル言語に
より制御される。ピン18と19の電位は、地面に対して変
動する。回路に配列されているように、U1とU2Aの組み
合わせは、U2Bのピン５における電圧をU2Aのピン３にお
ける電圧からオフセット（offset）されるのを可能とす
る。この電圧オフセットの信号と大きさは、U1へ適用さ
れたディジタル言語及びR1とR2の値により決定される。
U2Bは既知のオフセット電圧をR3とR4を通してシリコン
に適用するための電圧フォロアーとして、かつ、交流光
電流をピン７における交番電圧に変えるための電圧コン
バータとして使用される。U2Bの信号利得はR3により決
定される。R4は回路のインピーダンスをセンサーのイン
ピーダンスに整合させるために使用される。シリコンか
ら溶液への電圧は、増大する一連の言語をU1に適用する
ことにより一掃される。信号の巾（amplitude）（交流
光電流）は、溶液からシリコンへ適用される電位の関数
としてU2Bのピン７で読み出される。
生細胞は、種々の方法により室に付着しうる。第７図
に示されているように、自然に付着した細胞は、培養器
中のシリコンセンサー又はカバースリップのいずれかの
表面又はその双方上で成長する。流体室は、細胞を湿め
らしつつとり付けられる。流れは、媒体を過度に酸性化
し、室中の全酸素を消費することから細胞を守るよう
に、素早くもうけられる。付着しない細胞については、
細胞を37℃でアガロース溶液と混合し、湿雰囲気下で約
50μｍの層の厚さで、シリコンセンサー又はカバースリ
ップの表面上に置く。次いでシリコンセンサーを、アガ
ロースを固化するために、約15分間冷却する。次いで流
体室を組みこみ、使用する。
コラーゲン及びゼラチンも、アガロースとともに、又
はその代わりに使用しうる。フィブロネクチン、コンド
ロネクチン、ラミニン又は他の類似の物質が、微小流体
室の表面に生細胞を付着させる際に、適宜使用されう
る。代わりに、生細胞は、生物学的に許容しうる微小担
体ビーズ上又はその中にも分散されうる。
他の態様において、細胞を多孔膜上又はその中で増大
させることができる。この膜は、培養媒体が少くとも膜
の一面に沿って流れるように、制御電極とセンサー表面
の間で流体室内に挿入することができる。上皮細胞のよ
うな細胞は、頂部表面と基部側表面で単層を形成する。
このような場合には、細胞シートの両側の特性は、膜の
どちらかの側をセンサー表面に一層近接させるようにコ
ントロールすることにより、別々に研究することができ
る。
一般に、好ましい発明の方法は、次のようにして実施
される。室を、そこに保持された生細胞とともに組み立
て、装置中の流体部にとり付ける。低緩衝容量の溶液又
は懸濁液の流れ（典型的には100μ／分）をもうけ、
センサーからの信号を安定化させる。重炭酸塩及びHEPE
Sのような緩衝液が除外され、そして、所望により血清
を含んだ通常の細胞細胞媒体を使用することができる。
最初は、室の加温及び新しい媒体による室の平衡のため
偏流が見られる。一旦安定した室の流れを停止し、シリ
コンセンサーの信号をモニターする。電位の減少は、細
胞の代謝による室におけるpHの減少を反映する。pHの減
少の速度と傾斜は、細胞の代謝速度の尺度である。pHは
線の傾斜を正確に測定するために（数％の誤差）十分な
データ点が得られるまで十分に低下させる。典形的に
は、これは約0.1から0.5pH単位のpHの落下を意味し、約
１〜４分を必要とする。次いで、流れを再び開始させ、
pHは最初の値に戻る。この操作を、再現性のある傾斜が
得られるまで繰り返す。代謝速度の典形的な測定を、第
10図に示す。
他の好ましい態様において、媒体を細胞上に連続的に
流し、電位を複数の個所で測定する。もし、１つの個所
が他のものよりも流れの方向において上流に存在し、干
渉する細胞が存在する場合には、２つの個所の間にはpH
の差異が存在し、上流の個所における酸性度は少ない。
このpHの差異は、媒体が２つの個所の間の空間を移動す
る際のこの媒体に対する細胞の代謝作用によるものであ
る。シリコン半導体電極により検出されるpHの差異の大
きさは、２つの個所の間に存在する細胞の代謝割合の尺
度である。
細胞作用物質を試験するためには、２つの方法を有利
に使用することができる。１つの方法においては、２個
の注入（シリンジ）ドライブが使用される。第一の代謝
率は、コントロールの媒体で上述のようにして測定され
る。次いで、コントロール媒体の注入ドライブを止め、
同じ媒体に細胞作用剤を加えたもので注入ドライブを開
始する。適当な選択バルブが、流れを注入ドライブから
流体室に向ける。次いで、代謝率の測定を、細胞作用剤
の存在下で実施する。細胞作用剤の影響からの細胞の回
復を観察するために、流れをコントロール媒体に戻す。
第２の方法においては、噴射ループバルブを使用す
る。代謝率を上述のように測定する。一度代謝率が安定
化したら、細胞作用物質を噴射ループに導入し、流れる
媒体流に細胞作用剤が導入されるようにバルブを操作す
る。次いで、代謝率を細胞作用剤の存在下で測定し、剤
を室から洗い出した後に、測定を続行する。この方法
は、細胞作用剤に短時間さらす際の細胞反応を試験する
ために特に適している。
使用される生細胞が微小流体室の表面に自然に、又
は、天然に付着しないならば、室に細胞を保持する手段
が使用されなければならない。これを達成するための３
つの好ましい方法は、細胞を物理的に保持しうるくぼみ
の準備、溶液又は懸濁液中の細胞作用剤にとって多孔又
は透過性である膜手段により細胞を保持する微小流体室
中の隔室の準備、及び生物学的に耐容性の付着剤の使用
である。
くぼみを使用する態様において、第８図のように流体
室の床部にくぼみを設ける。くぼみは横断面が環状であ
るか、又は、流れの方向に垂直に直線状に堀られた溝で
あってもよい。くぼみの最小の水平寸法は、少くとも１
個の細胞の直径でなければならず、好ましくは、細胞数
個の直径以上ではないものでなければならない。くぼみ
の深さは、数個の細胞の直径とすることができる。直径
が50μｍ、深さ50μｍのくぼみは許容しうる。細胞を保
持するのにくぼみを使用することは、引き続くサイクル
での操作を実行することにより、細胞の多数のバッチを
分析するのに適している。
第一の工程は、くぼみに細胞を載荷させることであ
る、十分にゆっくりとした流速で、細胞はくぼみに沈澱
し、そこに捕獲される。
次いで、細胞の挙動を分析する。くぼみの上を流れる
媒体の組成は、所望の分析情報に応じて変えることがで
きる。媒体からの化合物は、拡散及び対流の組みあわせ
によりくぼみ中の細胞に到達する。
最後に、細胞はくぼみから流し出される。十分に高い
流速において、くぼみ中の渦巻挙動は、細胞を再び懸濁
させ、くぼみ及び室から細胞を洗い出すのに十分に強い
ものである。これは、新しい細胞を次に載荷させるた
め、室をきれいにする。
このくぼみ手法には、少くとも２つの重要な利点が存
在する。第１に、固定化の方法が混乱を生じない。第２
に、このシステムは容易に自動化でき、同じ微小流体室
において新鮮な細胞バッチの反復性のある分析を提供す
る。
生物学的に耐容性の付着剤を使用する態様において
は、非付着性の細胞は、全深さが100μｍで、約1cm2の
表面積を有する流体室の床部を覆う非常に薄い（好まし
くは50μｍの厚さ）アガロース層にて流体室に保持する
ことができる。媒体は、室の天囲とアガロース層の頂部
の間に存在する50μｍのすき間を通して、流れる。
アガロース層の薄さは、固定された細胞がアガロース
上を流れる媒体の分画へ、速やかに、かつ、実質的に妨
害を受けずに接近するのを可能とする。細胞と流動媒体
との間の移送は拡散性である。１〜２秒のオーダーの拡
散速度が多くの溶解物に対して期待される。細胞を保持
するくぼみは、好ましくは、シリコン半導体電極又はセ
ンサーの表面に形成される。くぼみは、電極表面のくぼ
みとして、又は、電極の上部表面の頂部にグリッド構造
を設けることにより形成してもよい。グリッド構造は、
好ましくは電気的に耐容性の半導体材料、即ち、シリコ
ンで形成されるが、電気的に中性の材料で形成してもよ
い。例えば、直径25μｍの糸で編まれ、25平方μｍの穴
を形成するナイロン網が、スプレー接着剤でシリコン半
導体電極の表面に接着される。接着剤は、シリコン電極
上に広範囲に分散した細かな小滴を形成し、それゆえ、
いくつかの別個の点でナイロン網を表面上に接着させる
だけである。このようにして、ナイロン網は、接着剤で
シリコン電極を、完全に被覆することなく、そして、そ
のことにより、電極の光応答を破壊することなく、シリ
コン電極に接着することができる。
付着細胞によりパターン化されていないシリコンの表
面は、先ず薄い（30nm）熱SiO2フィルムを成長させ、次
いで低圧化学蒸着により100nmのSi3N4を沈着させて、製
造される。非付着細胞に使用される微小機械化センサー
の製造の第１工程は、上記酸化により１μｍの厚さのSi
O2を形成させ、次いで、写真平版パターン化により、空
洞が存在する開口を形成させることである。この空洞は
SF6/C2ClF5プラズマ中で異方性にエッチングされ、水平
から＞85゜の角度の側壁をもつ空洞が形成される。この
製造の最終工程は、非パターン化の場合と同様に、薄い
酸化物と窒化物の沈着の増大である。このような微小機
械化センサーは、空洞の間の領域に厚い酸化物層を有
し、そこではセンサー能力が効率的に不活性化される。
活性なセンサー表面は空洞の内部壁面と床部のみであ
り、装置のこの態様の信号対ノイズ動作を改善する。
この装置は、電解質とSi3N4絶縁体の間の界面で表面
電位を検出する。この表面上におけるプロトン化しうる
シラノール及びアミン基の存在は、この電位がネルスチ
アン形（Nerstian fashion）でpHに依存することを保
証する。pHはシリコンの照明された領域に対応する界面
の部位でのみ検出される。
本発明は、広範囲の原核及び／又は真核細胞に関して
使用しうる。かかる細胞の例は、ヒトのケラチン生成細
胞、ネズミＬ繊維芽細胞、犬MDCK上皮細胞、ハムスター
BHK繊維芽細胞、ネズミCTLLリンパ球細胞、腫瘍細胞及
びバクテリアである。一般に、複製細胞含む、あらゆる
生細胞で、微小流体室中に保持するのに成功しうるもの
は、使用できる。
本発明は、広範囲の細胞作用剤に関して使用しうる。
かかる細胞作用剤の例は、塩化ベンザルコニウム、プロ
ピレングリコール、メタノール、アセトン、ナトリウム
ドデシルスルフェート、過酸化水素、１−ブタノール、
エタノール等の刺激物質；バリノマイシン、ドキソルビ
シン、ビンクリスチン、リバビリン、アミロライド及び
テオフィリンのような薬物;T3及びT4、エピネフリン、
バソプレシンのようなホルモン；シアニッド、カルボニ
ルシアニッド、クロロフェニルヒドラゾン、エニドトキ
シン及びバクテリアのリポポリサッカライド等の毒素；
インターロイキン−２、上皮成長因子及びモノクローナ
ル抗体のような免疫物質；イソプロテレノール、カルバ
コール、プロスタグランディンE1及びアトロピンのよう
な受容体拮抗剤；及びホルボール ミリステート アセ
テート（hporbol myristate acetate）、塩化マグネシ
ウム、他の細胞、受容体リガンド、ウイルス、病原体及
び発熱物質のような種々の他の型の細胞作用物質であ
る。本発明は、また、粒状物、グリース、細胞上の油の
ような水と非混和性の細胞作用物質の作用を測定するこ
とに向けられる。これらの物質は、水性又は非水性の流
体により細胞の近傍へ移送される。
本発明は、酵母、バクテリア及びカビのような微生物
を同定するための方法を含む。これらの発明方法におい
ては、同定されるべきバクテリアは流体室中で捕獲さ
れ、又は保持される。予め定められたセットの溶液及び
／又は懸濁液が、バクテリアと接触するように微小流体
室を通して順次流される。これらの溶液及び／又は懸濁
液のそれぞれは、既知のバクテリアから特定の応答を生
ずる成分を含む。この成分を含有する溶液及び／又は懸
濁液が同定されるバクテリアと接触すると、微小流体室
中の微生物は特徴を有する応答を生ずるか、又は、何ら
かの応答も生じない。応答又は応答の非存在は、シリコ
ン半導体電極手段により測定される。予め定められたセ
ットの溶液及び／又は懸濁液への応答又は応答の欠除
は、次いで、試験されるべきバクテリアを積極的に同定
するために、既知のバクテリアの予め定められたセット
の溶液及び／又は懸濁液に対する応答と比較される。
本発明は、又、医薬品の活性をスクリーンするための
方法を含む。この発明の方法においては、スクリーンさ
れる医薬品に応答する生細胞は、微小流体室中で捕獲さ
れ、又は、保持される。次いで、医薬品を含有すると思
われる溶液又は懸濁液を、これらの生細胞に接触して流
すことができる。生細胞と接触すると、医薬品を含有す
ると思われる溶液又は懸濁液は生細胞中で応答を生じる
か、又は、何らの応答も生じない。生細胞への医薬品の
この作用、又は、作用の欠除は、シリコン半導体電極を
用いて測定される。これらの医薬品は、微生物の細胞に
対して活性な抗生物質を含む。期待する作用の存在又は
非存在は、溶液又は懸濁液中の医薬品の存在をスクリー
ンするための手段として使用しうる。
本発明は、また、毒性物質を検出するための方法を含
む。この発明の方法において、試験される毒性物質に応
答する生細胞が微小流体室中で捕獲され、又は、保持さ
れる。毒性物質を含有する恐れのある溶液又は懸濁液
は、次いで、生細胞に接触して流される。溶液又は懸濁
液への生細胞の反応、又は、反応の欠除が測定され、そ
のことにより、恐れのある毒性物質の存在を検出するた
めの手段を提供する。
本発明は、細胞内反応を検出するための方法をも含
む。この発明方法において、２個のセットの生細胞が微
小流体室に提供される。第１のセットの細胞に作用する
剤を含む溶液又は懸濁液が微小流体室に流される。これ
は、第１のセットの細胞に第２の細胞作用剤を合成させ
る。そして、第２の細胞作用剤は、第２のセットの生細
胞中で応答を起こさせる。この反応を、シリコン半導体
電極により測定する。このようにして、異なるセットの
生細胞の細胞内反応が測定できる。第１及び第２のセッ
トの細胞は、同一の型であってもよく、又、異なった型
のものでもよい。
実施例１ ケラチン生成細胞（karatinocytes）は、表皮を生成
する細胞である。研究は、作業所、化粧品及び他の場所
において皮膚と接触しうる刺激物に対するこれらの細胞
の応答を評価するために実施された。例えば、ショプシ
ス及びエング（Shopsis,C.及びEng.B.（1988）,Alterna
tive Methods in Toxicology,第６巻）は、ケラチン
生成細胞の刺激物を48時間培養した時に、蛋白合成を50
％抑制するのに必要な刺激物の濃度を測定した。この方
法による一連の洗剤の順位は、眼の刺激についての標準
インビボドレーズ試験（Draize）により得られた順位と
良く一致した。（Draize,J.,Woodard,G及びClavery H.
（1944）,J.Pharmacol.Exp.Ther.,82:377〜390）。
正常なヒトのケラチン生成細胞は、クロネチクス社
（サンジエゴ,CA）から入手し、販売業者の指示に従が
って培養した。細胞を、細胞流体室で使用されるガラス
のカバースリップの伝導性のインジウム−スズ−酸化物
表面上で、50％〜100％の間の集合（confluency）に増
殖させた。試験刺激物は、塩化ベンザルコニウム（BAC;
カチオン性洗剤）、過酸化水素（H2O2）、１−ブタノー
ル（BuOH），エタノール（EtOH）、ジメチルスルホキシ
ド（DMSO）、プロピレングリコール、メタノール、アセ
トン及びナトリウムドデシルスルフェートであった。
カバースリップを室内にとりつけ、媒体を流し始め
た。クロネチクス社は、この目的のために、低緩衝性に
修正したケラチン生成細胞成育媒体を提供した；これ
は、重炭酸塩及びHEPES緩衝液を含まない。
媒体の流れを、コンピュータに接続された注入ポンプ
により制御した。流れは、200秒間のオンと200秒間のオ
フを交互に行なった。流れがオフの間に、代謝速度をセ
ンサー電位（即ち、pH）対時間の傾きとして測定した。
刺激物を、流れがオンになる期間の開始時に300μ
の試料噴射ループ（液体クロマトグラフィにおいて使用
される型のもの）により注入した。流速は、100μ ml/
分のオーダーで、刺激物が次の流れがオフの間は細胞室
に存在し、２回目の流れがオフの間に一掃されるよう
に、調節した。典型的には、試料を800秒の間隔で注入
し、各注入（刺激物が存在するもの、それが一掃された
後のもの）に対して、２個の代謝速度の測定を可能とし
た。
刺激物の存在しない時に安定した代謝速度が達成され
た後で、低濃度から高濃度に実施しながら、上述のよう
にして刺激物を注入した。しばしば、各濃度において２
個の注入をした。各投与量の刺激物に対する応答は、試
料が注入された後400秒で得られたが、全実験には３〜
４時間かかった。対照として、刺激物が投与されない一
組のケラチン生成細胞の代謝速度を、数時間かけて測定
した。
対照細胞の代謝速度は、約６％の変動率をもって、全
実験中安定していた。第11図は代謝速度対刺激物の濃度
の対数としてプロットされた。５個の刺激物についての
結果を示している。代謝速度は刺激物が導入される前の
値のパーセントとして表わされている。２個の連続した
投与を同濃度で行ない、２個の組のデータが存在する。
例えば、30μg/mlのBAC等の点における大きな差異は、
単にデータの散乱ではなく、２個の投与の間の細胞の代
謝速度の真の減少を表わしている。H2O2の濃度は媒質中
における化合物の酸化還元反応及び不均化反応のため、
指摘されたものより、一層小さいかもしれない。いくつ
かの刺激物に対しては、代謝を抑制するのに十分な濃度
より低い刺激物濃度であるため、対照のレベルより増大
する。
第12図は、刺激物が存在する間及び洗い流した後にな
された測定の比較である。閉じた符号は細胞に対する刺
激物の存在時に得られた速度を表わす；開放符号は刺激
物が洗い流された直後に得られた速度に対応する。刺激
物BACについては、回復は得られない；事実、代謝はよ
り高濃度の後、各測定ごとに減少し続ける。EtOHについ
ては、実質的な回復が生ずる。別個の試験において、DM
SOからの回復はみられるが、エタノールからの回復はみ
られない（第13図参照）。これらの化合物の刺激強度
は、ドレーズ試験のようなインビボ試験により下記のよ
うに分類される。（Dubin H,.及びGhodgaonkar,R.（19
87）,in vitro Toxicology,1:233〜240を参照）： この実施例において、上記のlog10（MRD50）として表
わされる代謝を抑制するのに必要な濃度の順位は、イン
ビボ試験により得られたものと、よく一致する。
本発明の方法は、細胞を刺激物にさらす時間と濃度の
両方の柔軟性のあるコントロールを可能とする。さら
に、これは、刺激物が細胞と接触している間、及び、そ
の後、刺激物が洗い流された後の双方において、これら
の剤の細胞代謝に対する影響をモニターすることを可能
とする。障害からの回復の速度は、主要な抑制分析によ
り測定することができる。
この実施例は、本発明により迅速なインビトロの毒性
学上のアッセイを実施しうる可能性を示している。急に
さらしたことに対する応答は、２〜３分で得られた。パ
ラレリズムの一層の自動化と開発は、全実験に必要とす
る時間を、その時間量に短縮するだろう。これは、現行
のインビトロの方法に対するスピード及び性能における
重大な利点である。
実施例２ バリノマイシンは、それ自体を細胞膜に挿入し、細胞
膜にカリウムイオンの透過性を付与することにより効果
を発揮するペプチド抗生物質である。これは、イオンに
対する膜透過性が重要な場合における研究応用において
一般に使用される。100μＭのバリノマイシンにさらし
た後、わずか２〜３分以内で、Ｌ細胞の代謝率は有意に
増大する；ピーク時においては、これは初期の率の倍以
上である。ピークの後、この率は低下する。
第14図は、本発明方法による、バリノマイシンを短時
間適用することへの応答を示している（媒質流に75μ
を注入；流速約100μL/分）。類似の結果は、第15図に
示されている。他の実験において（グラフは未掲載）、
同濃度のバリノマイシンを連続的に８分間投与し、そし
て、代謝活性がさらし始めて４分で、初期値の約2.4倍
のピークに上昇した。これは、抗生物質を除去して20分
以内に概ね初期の値に戻った。この２相の応答は、電解
質の恒常性を維持するためにとられる細胞性代謝エネル
ギーの消費であり、その後、これを達成しえなくなった
毒性効果であろう。
実施例３ Ｌ細胞を、流体室のシリコンセンサー表面で集団に成
長させ、そして、通常の媒体及び甲状腺ホルモンのトリ
ヨードチロニン（T3）とチロキシン（T4）をそれぞれ10
nM含有する媒体を交互に潅流させた。１実験において、
最初にホルモンを導入されると、代謝率は12％増大し、
ホルモンを除去すると初期値より９％下に減少した。こ
れは、ホルモンが細胞の全代謝活性を増大するという予
想と一致する。
実施例４ ホルボールミリステートアセテート（PMA）は、腫瘍
促進ホルボールエステルの１つである。その作用の中に
は、細胞性サイクリックAMPレベルの増大と、リン脂質
の脱アセチル化によるアラキドン酸の製造があり；プロ
テインキナーゼＣと相互作用することが知られている
（例えば、Daniel,L.（1985）Phosphatidylinositol T
urnover in MDCK Cells,in Inositol and Phospo
ino sitides,Metabolism and Regulation,leds.）Bl
easdale,J.,Eichberg,J.,and Hauser,G.Humana Pres
s）.MDCK細胞（Madin−Darby Canine Kidney マージ
ン−ダービーイヌ腎臓）は、腎臓の細管の上皮の多くの
機能的特性を保持する上皮ラインである。１つの特徴
は、これらの細胞の集合の単層は比較的隙間のないシー
ルを形成し、電気的にも、イオンの拡散に対しても、細
胞の２つの側に水性領域を分離する。
MDCK細胞のシーリング特性は、細胞がシリコンセンサ
ーの表面で成長すると、信号は必ずしも流体室中の流体
のpHのみを表わさないということを意味する。これは細
胞とセンサーの間の小さな水性の隔室のpHについての情
報を含み、そして、これはセンサーの電気回路に関して
本質的に直列の電池であるトランス−細胞性電位につい
ての情報を含む。隙間のないシールを形成しない細胞に
おいては、細胞下（sub−cellular）のpHは本質的には
流体室の流体のpHと同一であり、あらゆるトランス−細
胞性電位はセンサーに関する限り不十分である。
第16図は、10ng/mlのPMAを含有する媒体がシステムに
導入されたときに観察される強力で迅速な応答を示して
いる。センサーにより報告される定常状態の電位（流体
の流れがオンの時）は、センサーが活性化された時点か
らPMAが導入される迄、徐々に減少した。PMAが移動され
てから約40分で電位は急速に最小値に低下し、次いで増
大し、最終的には、実験の終了時までには、初期の値近
くまで戻った。この信号は、トランス−細胞性電位と細
胞下pHの合成物（pH単位当たり59mVに相当する後者にお
ける変化）である。
PMAの導入は、約１時間後のピークにおける、２倍以
上の細胞の代謝率における急激な増大と一致する。室の
カバースリップ表面上で増大するMDCK細胞に関する同様
の実験は、トランス−細胞性電位について何ら情報を与
えないが、PMAの添加時における代謝率（データは示さ
れていない）の増大を示す。
センサー表面上で成長した細胞から測定される代謝率
は細胞処理に対して一層敏感であり、一般には、カバー
スリップ上で成長した細胞よりは安定でない。これは、
室の容積に比べて細胞下の水性の隔室の小さな容積とい
う観点で理解しうる；細胞膜を横断しての二酸化炭素と
プロトンの輸送における小さな変化は、より小さな容積
においてはより大きな変化を生ずることができる。
定常状態の電位におけるPMAの作用は、PMAが作用間の
抵抗性の密閉に寄与する、隙間のない接合を破壊するこ
とが知られていることに照らして、特に興味がある。そ
れゆえ、PMAはトランス−細胞性電位の効果を不十分に
し（short out）、そして、細胞下の空間の組成を一般
の流体室の流体の組成に一層似たものとすることが期待
されよう。
実施例５ シアニド（CN-）は、チトクロームオキシダーゼの酸
素結合箇所に結合し、電子の輸送を抑制する（このこと
により、細胞呼吸を抑制する）アニオンである。細胞
は、CN-にさらされた後では、解糖的になる。Ｌ細胞
（マウス繊維芽細胞セルライン）は流体室のシリコンセ
ンサーの表面で集合体に成長し、100μＭのシアン化ナ
トリウムの注入にさらされる。化合物が導入されると、
代謝率は数分以内に約39％増大し、次いで率は徐々に減
少し始めた。この時点で細胞は凝集し、死に始める。
実施例６ BHK細胞（幼ハムスター腎臓から得られた繊維芽セル
ライン）を流体室のシリコンセンサー表面で成長させ、
通常の媒体と0.6又は0.06E.U.の細胞リポポリサッカラ
イドエンドトキシンを含有する媒体を交互に潅流させ
る。第17図に示されているように、0.06E.U.のエンドト
キシン（蛋白担体として0.001％のBSAとともに）の導入
は、媒体のみが存在するときに得られる細胞の代謝率よ
りも（コントロール値よりも）31〜36％増大させる。代
謝率は、0.001％のBSA媒体（牛血清アルブミン）、又は
0.01％のBSAに加えて0.6E.U.のエンドトキシンを加えた
媒体が導入された時は（媒体のみが存在する中に細胞が
あるときに観察される率に比べて）変化しなかった。こ
れは、BHK細胞のエンドトキシンに対する二相の応答を
反映しているであろう。これは、しばしば細胞の受容体
媒介刺激においてみられる。低容量の刺激は応答を与え
るが、非常に高い用量は何ら刺激を与えないか、又は、
低用量とは反対の応答を与える。
実施例７ アミロリドは（Amiloride）、腎臓及びヒキガエルの
膀胱に存在する輸送上皮細胞のNa+チャンネルの抑制剤
として広く使用されている利尿薬である。タウブ（Tau
b）らは、MDCKセルラインが腎臓の塩位細管に存在する
細胞のアミロリド感受性Na+チャンネル特性を有するこ
とを実証した（J.Cellular Physiology,106:191〜199
（1981））。MDCK細胞が流体室のカバースリップ部位で
成長すると、1.5mMのアミロリドの導入は、媒体のみに
おいて観察された代謝率よりも徐々に16％まで増大させ
た。薬物へさらすのを停止させると、代謝率は元の対照
値に戻り、そして、徐々に減少し続けた。
MDCK細胞が流体室のシリコンセンサー表面で成育する
とき、1.5mMのアミロリドを導入すると、媒体のみが存
在する時に観察される率に対して、直ちに、20％の見か
けの代謝率の減少を生じた。
MDCK細胞から得られたデータの解釈は、（媒体の流れ
を停止させた後）細胞呼吸が媒体をより酸性にするの
で、細胞はpHの変化に対応し、これにより本来の代謝率
に変化を生じ、それにも細胞が応答しうるという事実に
より困難なものとなる。この複雑な細胞の応答は、媒体
の流れが一定時間停止されるとき、多相曲線を生ずる。
細胞がシリコンセンサー表面で成長する場合には、この
現象は特に劇的である。
実施例８ テオフィリン（利尿薬、心臓刺激剤、及び平滑筋弛緩
剤）は、ホスホジエステラーゼ抑制を示し、細胞内でcA
MPの量を増大する。MDCK細胞がシリコンセンサー表面で
成長した時に、10mMのテオフィリンを導入すると対照値
に対して代謝率は47％減少する。テオフィリン含有媒体
が除去された後では、代謝率は10分以内に対照値に戻っ
た。シリコンセンサー表面上で成長したMDCK細胞に導入
された治療量のテオフィリン（111μＭ）は代謝率にお
いて約10％の減少を示し、細胞環境からテオフィリンが
除去された時には、対照値に対して28％の増大が観察さ
れた。
カバースリップ上で成長したMDCK細胞は、細胞が10mM
のテオフィリンにさらされたときは代謝率において同様
な減少（59％）が示され、この率は徐々に減少すること
が観察された（対照値の下わずか48％まで）。テオフィ
リンが環境下から除去されると、代謝率は対照に対して
30％増大した。
実施例９ MDCK細胞は、その底部側（basolateral）表面（細胞
がその上で成長する基質に結合する細胞の表面）にエピ
ネフリン受容体を有することが知られている。それゆ
え、MDCK細胞がシリコンセンサー表面で成長するとき
は、エピネフリン受容体は細胞の単層のセンサー側に志
向している。３μＭのエピネフリンを含有する媒体が細
胞の単層上に流されると、エピネフリンは細胞層を横断
して拡散し、受容体に到達しなければならない。第１回
目のエピネフリン含有媒体の導入は代謝率を対照の率に
比べて有意には変えない。しかしながら、第18図に示さ
れているように、エピネフリンを加えた媒体に再度さら
すと、代謝率は20％増大した。エピネフリン含有媒体が
細胞周囲から除去されたときは、代謝率は対照の率より
も12％高いところに留まった。細胞が再度エピネフリン
含有媒体にさらされると、さらに７％の代謝率の増加が
達成された（即ち、対照の率よりも代謝率が20％上昇す
る）。
実施例10 細胞を固定する他の方法は、これをアガロースゲル中
にカプセル化することである。融合（confluent）Ｔ−7
5フラスコ中のMDCK細胞を、その成長容器から細胞を除
くためにトリプシン処理した。この細胞を200RPMで５分
間遠沈させ、そして、上澄みを捨てた。細胞を5mlの媒
体中に再懸濁させ、そして、3000RPMで５分間遠沈させ
た。上澄み液を再度捨て、細胞をFMCからの1.2％からの
シープラク（sea plaque）アガロース（媒体中の）中
に再懸濁させた。細胞を3000RPMで３分間遠沈させ、こ
れをペレット化した。この細胞ペレットから２μの部
分を直接採取し、シリコンセンサー表面（部分的に室に
組み込まれている）上に約40mm2の広さで広げた。アガ
ロースをゲルにするために、室を15分間冷蔵した。流体
室を次いで完全に組み立て、細胞を、媒体のみ、208μ
Ｍのエピネフリンを加えた媒体、又は３μＭのエピネフ
リンを加えた媒体で交互に潅流させた。208μＭのエピ
ネフリンの存在は、媒体のみの場合に観察された率に比
べて、代謝率が３％減少した。しかしながら、細胞周囲
からエピネフリンを除くと、対照に比べて代謝率が14％
増加した。同様に、３μＭのエピネフリンが細胞に導入
されると、高い方のエピネフリン濃度が除去された直後
に観察された代謝率に比べて、4.5％の減少を生じた。
３μＭのエピネフリンが細胞周囲から除去されると、代
謝率はその導入前に観察された率よりも17％増加した。
実施例11 CTLL細胞（マウスから得られる細胞毒性Ｔ−セルライ
ン）は、生存するためにインターロイキン−２（IL−2;
免疫調節剤）の存在を必要とする非付着性のセルライン
である。CTLL細胞の融合Ｔ−25フラスコから2mlの細胞
を取り出し、遠沈して、細胞をペレット化する。上澄み
液を捨て、細胞を２％のアガロース溶液（媒質中）300
μ中に再懸濁された。細胞を再び遠沈させてペレット
とし、そして、２μの部分を細胞ペレットから取り出
し、湿めった室に置かれたカバースリップ上で約40mm2
の円状に拡散させた。次いでカバースリップ室を、20分
間冷蔵し、アガロースをゲル化した。カバースリップを
湿った室から取り出し、そして流体室に置いた。20単位
/mlのIL−２を含有する媒体、又は、媒体単独のものを
交互に細胞上に流した。IL−２を含有する媒体が除去さ
れると、第20図に示されるように、代謝率は対照の率に
比べて減少し始めた。この率は、IL−２を含有する媒体
がシステムに導入される迄減少を続け、導入時点で（率
は対照の率の値までは戻らないが）上昇し始めた。この
時点で、細胞はアガロースゲルから離れ始めた。予想さ
れる通り、細胞密度が減少すると、室の酸性化率も減少
した。
実施例12 Ｌ細胞を流体室のシリコンセンサーの表面上で成長さ
せて集合体にし、次いで、通常の媒体及び0.6E.U.の細
胞リポポリサッカライドエンドトキシンを含有する媒体
を交互に潅流させた。一の実験において、エンドトキシ
ンの導入は媒体単独に対して観察された割合より、初期
の代謝率を20％増加させ、そして、２回目に細胞をエン
ドトキシンにさらすと、媒体単独に対して観察された率
よりも15％増加させた。両方の場合において、率はエン
ドトキシン含有媒体が除去されると（２〜３分以内に）
最初の値へ戻った。
実施例13 オキシトシンは、主に、子宮を収縮し、及び、乳汁分
泌を刺激する脳下垂体後葉のホルモンである。カバース
リップ上で成長したMDCK細胞への１μＭのオキシトシン
を導入すると、対照値に比べ、代謝率の即時の変化は何
ら生じなかったが、代謝率は徐々に（10％まで）減少し
た。細胞周囲からオキシトシンを除去しても細胞代謝率
はすぐには対照値に戻らなかったが、10分以内に100％
の回復が達成された。MDCK細胞なオキシトシン受容体を
有しておらず、また、オキシトシンはバソプレシンとは
わずか２個のアミノ酸が異なるだけのノナペプチドであ
るので、これは対照実験であった。MDCK細胞はバソプレ
シン受容体を有する。以下に示すように、シリコンセン
サー表面上で成長した細胞のみがバソプレシンに応答し
たので、これは必ずしも最善の対照実験ではなかった。
実施例14 0.1μＭのバソプレシン（抗利尿ホルモン）をシリコ
ンセンサー表面で成長したMDCK細胞に導入すると、対照
値に比べて代謝率が14％上昇した。0.1μＭのバソプレ
シンの直後に１μＭのバソプレシンを添加すると、代謝
率においてさらに増加を生じた（0.1μＭのバソプレシ
ンの存在下で達成された率より19％高く、対照値に対し
て42％の増大である）。
カバースリップ上で成長したMDCK細胞に１μＭのバソ
プレシンが導入されるときは、代謝率には何らの増大も
観察されなかった。
実施例15 対照媒体に10mMのMgClを添加したものは、媒体単独の
ものにMDCK細胞をさらしたときに観察される代謝率に比
較して、40〜46％の増大を生じた。
実施例16 すでに述べたとおり、上部表面にナイロンメッシュが
付着されたシリコン半導体電極を製造した。約10μL/分
の流速でCTLL細胞を室に流した。この流速において、細
胞の一部は重力によりナイロンメッシュの穴に沈降し
た。次いで流速を、約100μL/分に増大し、細胞は穴に
維持した。細胞は顕微鏡で見ることができた。レザー光
線を、細胞が存在する３個の異なった領域と細胞が存在
しない１つの領域に向けた。各箇所で、媒体の流れをオ
ン及びオフにして、時間に対するpHの変化を測定した。
流れがオフにおけるμV/秒でのpHの変化の傾きから流れ
がオンにおける同じ変化を引いたものは、以下の通りで
あった： 実施例17 この実験は、単一“捕獲（catch）”された細菌に、
連続的にある時間に供給された幾つかの可能性のある炭
素源化合物の存在下において、そのすぐ周りのpHを変化
させる能力に基づいて、部分的、又は、完全な細菌の同
定を確認する可能性を示すために企図された。選択され
た基質の連続的供給（sereial delivery）というこの
方法は潜在的ないくつかの利点を有するが、異なる捕獲
の細菌に選択的な基質を平行的に供与するのも、一定の
条件下で有効であろう。さらに、細菌が抗生物質の感受
性又は抗生物質の活性をスクリーニングするために使用
されるならば、薬物の相互作用という潜在的な問題のた
め、異なる捕獲物に平行的に供給するのは、より適切で
あろう。
細菌、E.コリ及びプロテウス・ミラビリス（Proteus
mirabilis）を成育培地中において約５×108個細胞/m
lの懸濁物として準備し、次いで、グルコースを含有す
る滅菌試験培地中で希釈した（バクトペプトン,2g/L;Na
Cl,5g/L;K2HPO4,1.7mM;グルコース,1g/L;pH7.3）。1986
年６月20日に出願された継続中の米国特許出願第876,92
5号において開示されているように、制御電極ピストン
を上部位置に保持しつつ、既知の数の細菌を含有する細
菌懸濁物1mlを、細胞が表面と平行に位置するヌクレオ
ポア（Nucleopore）膜により、シリコンセンサー表面に
隣接して保持されるようにしながら、装置内に流す。細
胞を、同じグルコース含有試験媒体でパルス導入し、次
いでピストンを下げて細胞周囲の容積を減少させ、細菌
の代謝によるpH変化をモニターした。次ぎに、ピストン
を持ち上げ、グルコースの代わりに尿素を含有する第２
の試験媒体を通した。ピストンを下げた後で、pHの変化
を再びモニターした。この過程を、炭素源としてピルベ
ートを含有する媒体を用いて繰り返した。
第21図は、E.コリが、３つの媒体全ての存在下におい
て、pHを減少させることにより応答した（各媒体は、次
の媒体を試験する前に、引き続いて３回試験された）こ
とを示している。第22図は、P.ミラビリスがグルコース
及びピルベートの存在下でpHを減少させ、尿素の存在下
でpHを上昇させることを示している。第23図は、グルコ
ース媒体中でのpHの変化率が装置に捕獲された細菌の数
に依存することを示している。
第24図は、細胞が膜により保持されており、この膜の
面は媒体の流れに対して垂直よりはむしろ平行であると
いう、第21及び22図に示されている実験に対して使用さ
れているシステムとは異なるシステムにおけるE.コリを
示している。
第24図において、E.コリは、経時的な細菌の数の増加
に一致して、pH変化の増幅（amplihide）が時間ととも
に増大することを示している。流体セル中における細菌
の複製の明らかな証明に加えて、第24図は、E.コリはグ
ラム陰性菌に対して低い活性を有する抗生物質（Ａ点で
添加されたペニシリン）に対しては応答せずに、グラム
陰性菌に対して活性な抗生物質（Ｂ点で添加されたポリ
ミキシン）に対しては応答することを示している。
実施例18 CTLL細胞を流体質中で方形のくぼみ中に捕獲した。第
25図に関して、長さ1000μｍ、巾50μｍのスロットの列
１をスロット間の間隔50μｍで、エキシマーレーザによ
り、厚さ50μｍのステンレススチールホイール２上に切
り込んだ。これは、カバースリップが取り付けられた
時、シリコン半導体電極表面に対してこのホイールを圧
するように配列された50μｍの厚さのプラスチック３の
部位の下において、100μｍの深さの流体室に取り付け
られた。こうすると、スロットの上方には、約１ミリの
巾で50μｍの深さのチャンネルが残り、こうしてくぼみ
が形成された。
CTLL細胞を、わずか約15μm/秒のチャンネルにおける
媒体の線形流速度で、くぼみ中に沈澱させた。細胞がく
ぼみ上で懸濁する迄15μm/秒より早く媒体を流し、次い
で、細胞がくぼみ中に沈降する間約10秒間流れを完全に
停止することにより、このくぼみに載荷することもでき
る。この流れ／防止方法を、十分の細胞が捕獲される迄
繰り返した。
細胞は、約100μm/秒以下の流速度においてはくぼみ
中に残存し、それ以上では多くのものが洗い流された。
代わりに、室の瞬間的な倒置は、細胞を流れ中に沈降さ
せ、低い流速度で押し流した。
ステンレススチールの有りうる破壊に加えて、ホイー
ルとシリコン電極の間の流体の薄いフィルムが基底電位
を幾分か不安定にした。この問題は、シリコン半導体電
極にくぼみを直接に微小機械化することにより克服しう
るだろう。
−30から−60μV/秒の代謝率が、CTLL細胞から得られ
た。これは、付着細胞に関して観察された範囲に近い。
実施例11の実験に類似するIL−２による実験は、IL−２
が存在しない数時間の後では、細胞の代謝率が対照値の
約20〜30％に減少したことを示し;IL−２（20単位/ml）
を加えると数時間後には、他の細胞の率は対照値の50％
以上であったことを示している。このことは、IL−２の
存在は、２〜３時間のタイムスケールで検出しうること
を示唆している。装置を最適のものにすればこの時間を
かなり短縮できよう。
実施例19 NIHのクレイグベンター博士（Craig Venter）から提
供された３個のセルラインは、特定の受容体に関して、
作動薬と拮抗剤の機能的な相互作用を検出することを可
能とした。基本のセルラインは、B82と呼ばれ、Ｌセル
ライン（マウス繊維芽細胞ライン）の誘導体であり、唯
一の天然の受容体（プロスタグランジンE1（PGE1）受容
体）を含むものと考えられる。これらの細胞は、我々の
実験では対照としてのみ機能する。
本発明者は、又、２個の異なるトランスフェクション
をもつセルラインを入手した。MIC−２と命名されたラ
インは、ラットのM1ムスカリン受容体がトランスフェク
トされたB82ラインである。821と命名されたラインは、
ヒトのβ２−アドレナリン作動性受容体がトランスフェ
クトされたB82ラインである。ベンターと共同研究者
は、主動薬は相応する第２のメッセンジャーシステム
（MIC−２に対するホスホイノシトール、821に対するサ
イクリックAMP）を刺激するという意味で、トランスフ
ェクションは機能的であると決定した。これらの、及び
類似の細胞の特性化は、フレーザ,C.（Fraser,C.）、チ
ャン,F.−Z.（Chung,F.Z）、及び、ベンター,JC.（Vent
er,J.C.）（1987）予めβ−受容体を欠いたマウスセル
ラインにおけるヒトβ２−アドレナリン作動性受容体の
連続的高密度表現、J.Biol.Chemistry,262:1483−1486;
マイ,L.（Mei.L）、レイ,J.（Lai,J.）、ロスケ W.（R
oeske W.）、フレザー,C.（Fraser,C），ベンター,J.C
（Venter,J.C.）及びヤマムラ,H（1989）ネズミの繊維
芽細胞B82細胞中で発現されたM1ムスカリン性受容体の
薬理学的特徴化、J.Pharmacol.Exp.Therapentics 248:6
61〜670中に見い出しうる。
この３個のセルラインは、各々、10％の胎児牛血清で
補充されたＦ−12DME培地中で成育された。トランスフ
ェクションの反転を防止するために、821細胞の培地
に、常にゲネチシン（50μg/ml）を加えた。当該細胞を
インジウム−スズ−酸化物で被覆されたスリップ上に置
き、60〜90％の集団に増殖させた。実験の16〜24時間前
に、成育培地を除去し、胎児牛血清を含まない培地に置
き換えた。MIC−２細胞の場合には、血清を有しない媒
体とともに１μＭのデキサメサゾンを添加し、引続く工
程で、デキサメサゾン誘引可能MMTVプロモーターの本質
的なコントロールの下にあるM1遺伝子の転写を引き起こ
した。
細胞から血清を不足させた後に、シリコンセンサーに
細胞を向けながら、カバースリップを流体室中に載荷さ
せる。低緩衝媒体（重炭酸ナトリウム又はHEPESが添加
されていないＦ−12 DME）を100μ／分で細胞室を通
して流す。主作動薬の導入の前に、細胞は対照媒体中で
２〜３時間平衡させる。次のグラフの時間ゼロは、作動
薬及び／又は拮抗薬が細胞室に導入された時点を示す。
第26図は、821細胞を使用するイソプロテレノールの
用量−作用曲線の例である。対照媒体にさらされた細胞
は比較的一定に留まるが、イソプレテレノールは代謝率
の急激な上昇を引き起こし、最初の30分以内にピークを
生ずる。用量−作用の関係が観察された。
第27図は、M1ムスカリン性及びPGE1受容体の両方を含
有する、MIC−２細胞におけるカルバコール（M1作動
薬）、PGE1及びイソプロテレノールの効果を示してい
る。カルバコールは代謝率において80％の増加を生じ、
そのピークは約50秒後であり、200秒で代謝率が約40％
増加した定常状態まで落下した。PGE1によるMIC−２細
胞の刺激は、ピークが約1000秒にある代謝率80％の増加
をもたらし、4000秒で基線の代謝率に戻った。ピーク時
刻の差異は、カルバコールのムスカリン受容体への結合
が影響するのとは異なる第２のメッセンジャ経路（サイ
クリックAMP）に、PGE1のPGE1受容体への結合は影響す
るという事実に帰すことができる。第27図は、また、イ
ソプロテレノールの導入が何らの効果をもたらさないの
で、MIC−２細胞にはβ２−アドレナリン作動性受容体
が欠けていることを示している。
第28図は、MIC−２細胞における作働薬−拮抗薬の相
互作用を示している。MIC−２細胞へ10mMのカルバコー
ル（ムスカリン性作働薬）を導入すると、代謝率の基線
に対して75％の代謝率の増加を生ずる。強力なムスカリ
ン拮抗薬であるアトロピンは、カルバコールに対するこ
れらの細胞の応答を抑制した。アトロピン単独では細胞
に対して何らの有意の効果ももたない。
第29及び30図は、カルバコールに対するMIC−２細胞
の急速な応答の時間的解像を増大させるためにわずかに
変更したプロトコールで得られた結果を示している。２
つの室（１つは実験用で、１つはコントロール）には細
胞を入れ、上述のようにして平衡させた。
オフの時間の間に、流速度を100μ／分から200μ
／分に変えた。流れが再開された時、注入バルブがスイ
ッチされて、カルバコールを含有する媒体が細胞室に導
入された。流れを45秒後に停止し、媒体の酸性化を続け
た（第29図）。センサー電位（pHと等価）の経時変化
は、５つの点の二次のサビスキ−ゴレイ（Savitsky−Go
lay）（1964）アルゴリズムを使用して計算され、これ
は第30図に示されている（サビスキー,A.,及びゴレイ,
M.（1964）単純化した最少二乗法によるデータの平滑化
及び分化、Analytical Chem 36:1627〜1639参照）。
こうして、酸性化率は、流れがオフである時間に亙っ
て２秒の改善された解像でフォローすることができる。
この実験の時間は、細胞が流れていない媒体のpH及び代
謝物の濃度を有意に摂動させるのに必要な時間の長さに
よってセットされる。この時点で流れは再開され、デー
タは収集保持されなければならない。
応答のピークは、媒体の流れの停止後、50〜60秒で生
じた。５点サビスキーゴレイアルゴリズムが計算におい
て使用されるから、最初の２〜３点は有効でないことに
留意されるべきである；これらは、媒体が流れている間
のデータ点を含む。
この実施例における対照細胞は、Ｂ−82セルライン、
ネズミの繊維芽細胞ラインである。Ｂ−82細胞は、プロ
スタグランジンE1受容体を含有する。これは、ムスカリ
ン性又はアドレナリン作働性受容体のいずれも含有しな
い。Ｂ−82細胞はヒトのベータ２−アドレナリン作働性
受容体（821細胞）により、及び、ラットのM1ムスカリ
ン性コリン作働性受容体（MIC−２細胞）によりトラン
スフェクトされた。このセルラインはJ.C.ペンター博士
より提供された。上述のすべてのセルラインは10％の胎
児牛血清（FBS）を含有するＦ−12 DME中で成育され
た。トランスフェクトされた821細胞成育培地はトラン
スフェクションの逆転を防止するために50μg/mlゲネチ
シンを含有した。ゲネチシンは、低緩衝性の実験培地中
にも含有された。各セルラインをインジウム−スズ−酸
化物で被覆されたカバースリップ上に置き、85〜100％
の集合に成長させた。実験の約24時間前に、成育培地を
除去し、血清のない培地で置き代えた。
次いで、カバースリップを細胞がシリコンセンサーに
対向するようにして流体室に載荷した。低緩衝媒体を室
を通じて流した（37゜に維持）。821細胞を50μg/mlゲ
ネチシンを有する媒体にさらした。MIC−２細胞が１μ
Ｍのデキサメサゾンを有する媒体にさらした。B82細胞
を0.5％のエタノールを有する媒体にさらした（なぜな
らば、エタノールはPGE1を溶解するのに必要である）。
約２時間細胞を平衡にさせた後で、当該受容体作働薬を
導入した（100μＭのPGE1をB82細胞に、10μＭのイソプ
ロテレノールを821細胞に、かつ、3.12μＭのカルバコ
ールをMIC−２細胞に導入した）。この図における時間
ゼロは、作働薬を導入するためにバルブがここでスイッ
チされたことを示す。作働薬が実際に流体室に入る迄
に、わずかな遅れがあることに留意すべきである。
実施例20 組織培養中の細胞を小水疱性口内炎ウイルス（VSV）
で感染させると、蛋白質及びRNA合成の停止の結果とし
て、細胞性代謝に変化が生ずる。ウイルス感染及び複製
の結果は、宿主細胞の細胞溶解であり、この前に、例え
ば細胞の腫張及び球状化という病理的効果が生ずる。こ
れらの感染による形態学的な結果は、細胞培養における
ウイルス感染を検出するために使用しうる。理論的に
は、宿主細胞代謝の変化は、ウイルス複製を検出し、モ
ニターするのにも使用できる。本実施例においては、酸
性代謝物の生成を測定する、シリコンを基材とするバイ
オセンサーを、VSV感染の間のマウスＬ細胞の代謝をモ
ニターするために使用した。感染した、及び、非感染の
細胞を薄い（100μｍ）流体室中に保持し、この室が流
れが停止する間に、バイオセンサーにより媒体の酸性化
について鋭敏で定量的な測定を可能とした。代謝測定の
間に、新鮮な媒体を細胞の最適成長状態を維持するため
に、流体室に潅流させる。バイオセンサーシステムを使
用して、VSV感染後２〜４時間の間Ｌ細胞の代謝率にお
ける抑制を検出し、サイクルの後半、感染後８〜14時間
で起きた率の急激な低下を検出した（第31及び32図を参
照）。宿主細胞代謝が減少する程度及び時間は、感染の
多様性の関数であることが見い出された（第33及び34図
を参照）。宿主細胞代謝に対するVSV効果の特異性は、
ウイルス接種物のVV照射に対する感受性（第35図参
照）、モノクローナル抗−VSV抗体による中和（第36図
参照）及び媒体にリバビリン（ribavirin）を加えた時
の抑制（第37A及び37B図参照）により確認された。本発
明者は、また、バイオセンサーを使用して、マウスイン
ターフェロンによる宿主Ｌ細胞のVSV感染からの保護を
実証した（第38及び39図参照）。
第40,41A,41B及び41C図は、Ｌ細胞をVSV、インフルエ
ンザＡ（WSN株）及びHSV−１で感染させて得られた付加
的データを示している。インフルエンザＡは、ヒトにイ
ンフルエンザを起こすマイナス−ストランドのRNAウイ
ルスである。HSV−１はヒトにヘルペス感染を起こすDNA
ウイルスである。アシクロビールはHSV−１を抑制する
ために、アマンタジンはインフルエンザＡを抑制するた
めに使用できる。
実施例21 多くの型の哺乳動物細胞に関して、集合した単層（約
107個細胞/mlに相当）は、通常、100μV/秒の２つの因
子内で酸性化率を生ずる。59mV/pH及び媒体の緩衝容量1
mMにおいて、これは典型的な細胞について、１・108/秒
のH+生成の真の計算速度に相当する。これらのプロトン
の代謝源は培養媒体中の栄養及び細胞中で活性な代謝経
路に依存する。この点の洞察は、補助的な生化学用装置
及び特定の代謝毒を使用することにより得ることができ
る。
酸素消費量は、クラーク（Clark）酸素電極を備えた
別個の灌流装置中で測定された。ネズミの繊維芽細胞Ｌ
セルラインの単層による媒体からの酸素の除去は、定常
流の状態で流出してくる流れにおいて測定された。ラク
テートの製造も、NAD＋の減少に基づく分光光度計によ
る酵素アッセイを使用して、測定された。培養媒体が浸
漬用（bathig）媒体として使用されたときは、酸素消費
率（おおむね、CO2生成に相当する）及び１個の細胞当
たりのラクテート製造は、約3.1（±0.3）・107/秒に等
しいことがわかった。同様の結果は、由一の炭素源とし
て5mMのグルコースを有する均衡塩類溶液中で細胞が試
験されたときに得られる。
代謝性毒のカルボニルシアニドクロロフェニルヒドラ
ゾン（CCCP）は、ミトコンドリアの酸素取り込みをまね
ることが示された呼吸器系非カプラーである。第42図
は、エッチングされたくぼみ中に捕獲された非−付着性
のネズミマクロファージ様ラインP388D1における20μＭ
のCCCPの効果を示している。刺激は、装置の解像よりも
早く、すみやかなものである。これは、非カプラーを除
去した後では、約20分の回復時間をもつ、可逆的なもの
である。用量応答の実験は、２〜５μM CCCP近辺で最高
の酸性化率の刺激を示している。恐らく、メカニズム
は、恒常性を維持するための増大したCO2製造と解糖の
刺激の組み合わせである。
実施例22 通常のヒトのケラチン生成細胞は、分化せずに増殖す
るには上皮成長因子（EGF）を必要とする。ケラチン生
成細胞（クロネチクス社製）を、実験に先立って24時間
EGFの非存在下で培養した。実験に関して、ケラチン生
成細胞を４つの流体室に入れ、EGFを含まない媒体で停
止−流れ開始の工程を交互に行なった。第43図における
矢印で示されている時間における、媒体の注入は４つの
すべての流体室で変えられた。第２の媒体は5ng/mlのマ
ウスEGF、又は、1.25μg/mlの中和ウサギ抗−マウス−E
GFポリクローナルIgC又はその双方を含有した。EGF又は
IgCをもたないコントロールも使用された。EGFを添加す
るとケラチン生成細胞による代謝のバースト（burst）
がもたらされ、これは抗EGF抗体を含有させることによ
り中和された。抗EGF抗体の添加だけでは何らの効果も
なかった。
これらの実験は、その結果は第43図に示されている
が、マイクロフィジオメーターが生体細胞中のリガンド
−受容体の相互作用を機能的に検出しうることを示して
いる。
別の実験において、通常のヒトの上皮ケラチン生成細
胞に対する成育媒体には、ケラチン生成細胞に対して分
裂誘引性であることが知られている物質であるネズミEG
F10ng/mlを含有させた。第44図は、EGFを24時間不足さ
せた後、シリコンマイクロフィジオメーター中でケラチ
ン生成細胞に50ng/ml EGFを導入した後５分以内におけ
る代謝率の増大は顕著であることを示している。15分内
での応答のピークにおいて、代謝率はほぼ２倍であっ
た；その後15分して、それは徐々に上昇した基線へ戻っ
た。第44図にも示されているように、EGFを含有しない
媒体のにせの変化をもつ平行コントロール試験は、この
２相の態様を何ら示さない。これは同様に上昇する基線
を示すが、これは流体室中の細胞増殖及び環境状態への
適用の組み合わせを示すものであろう。
酸性化率の刺激は、0.1ng/ml EGF以下までも観察しう
る。対照試験において、刺激は、受容体結合を抑制する
ことが知られているEGFに対するモノクローナル抗体に
より有効でなくなる。これらの実験は、分のタイムスケ
ールでリガンド−受容体結合への細胞の応答を検出しる
うバイオセンサの能力を示している。
ケラチン生成細胞に対するEGFの効果は、以前報告さ
れたマウス及びヒトの繊維芽細胞に対するものと平行し
ており、EGFによる刺激は解糖速度における急激な増大
をもたらす。速度の増大は、強力な刺激剤である酵素、
フルクトース−2,6−ビホスフェートの増大した濃度の
結果としての増大した６−ホスホフルクト−１−キナー
ゼ活性に帰される。フルクトース−2,6−ビホスフェー
トは、また、血清、インシュリン及びホルボールエステ
ルによる繊維芽細胞における解糖の刺激において役割を
有することが知られている。ホルモンの活性化に応答す
る時の解糖速度の調整は、筋及び肝細胞を含む他の細胞
の型においても報告されており、こうして、ホルモン刺
激を検出する手段として代謝活性を測定する支えを与え
る。
実施例23 腫瘍セルラインに対する科学療法薬の細胞毒効果は、
一般には、増殖を検出するアッセイにより測定される。
あらかじめ特性化された細胞系を使用して、本発明者は
シリコンマイクロフィジオメータにおいて細胞毒アッセ
イを実施した。MES−SAはドキソルビシン及びビンクリ
スチンに感受性のヒト子宮ザルコーマラインである。ME
S−SAからドキソルビシンにより選択されたDx5ライン
は、多薬抵抗性を付与する、Ｐ−グリコプロテイン運搬
体の高められた活性により、ドキソルビシン及びビンク
リスチンに抵抗性である。シリコンマイクロフィジオメ
ータを使用する実験は、この結果を再現する。ドキソル
ビシンの治療用量（１μＭ）において、２つのラインに
おいて分化細胞毒性が維持された。第45図に示されてい
るように、減少した酸性化率は15時間MES−SAで明らか
であるが、50時間Dx5では明らかでない。
薬物の高用量（100μＭ）では、類似しているが、よ
り急速な結果が生ずる：ドキソルビシンの細胞毒性はME
S−SAに対して0.5時間で、Dx5に対して2.5時間で発現さ
れる。第46図に示されるように、100μＭのビンクリス
チンに対する結果は、それぞれ５及び10時間である。
このシステムは比較的少ない細胞を要求し、一層の細
胞成長を要求しない。同じ組の細胞において繰り返し測
定をしうるということに加えて、これらの要素は細胞毒
性試験における付加的な応用を示唆する。
本発明は特定の好ましい態様について記述された。こ
こで、特定的に記載されなかった他の態様は、それにも
かかわらず、本発明、又は、以下の請求項の精神又は範
囲内に入りうる。
フロントページの続き (72)発明者 マツコネル，ハーデン エム. アメリカ合衆国 カリフオルニア 94305，パロ アルト エル エスカル パド 421 (72)発明者 ハンフリーズ，ギリアン エム. アメリカ合衆国 カリフオルニア 94022，ロス アルトス ハリントン シーテイー．460 (72)発明者 カークソ，カレン エム. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025，メンロ パーク シックスティ ーンス アヴェニュー 754 (72)発明者 オウイツキー，ジヨン シー. アメリカ合衆国 カリフオルニア 94303，パロ アルト ノース カリフ オルニア アヴエニユー 956 (72)発明者 カークソ，ジヨセフ エレク アメリカ合衆国 カリフオルニア 94306，パロ アルト キプリング ス トリート 3248 (56)参考文献 特開 昭55−16203（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/04 C12M 1/34

Claims (41)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）細胞と接触する細胞作用剤の量を制
    御しうるように、細胞と本質的に接触する細胞作用剤を
    含有する溶液又は懸濁液を連続的又は間欠的に流すのに
    適した微小流体室中に保持された生細胞を用意し； （ｂ）この細胞作用剤を含有する溶液又は懸濁液を、そ
    の剤が生細胞の近傍にくるように流し、そのことによ
    り、細胞媒介細胞外効果を生じさせ、この細胞媒介細胞
    外効果はpH、酸化還元電位、細胞表面電位及びトランス
    −細胞性電位から選ばれたものであり；そして （ｃ）微小流体室と操作的に関係する効果を検出するた
    めの手段を用いて細胞作用剤の効果を測定する ことから成る、細胞作用剤の生細胞への効果を検出する
    ための方法。
  2. 【請求項２】細胞作用剤の効果を検出するための手段が
    生細胞と接触するか又は、生細胞の直近にあるシリコン
    半導体電極から成る、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】生細胞をシリコン半導体電極の表面に付着
    させる、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】生細胞をシリコン半導体電極の近傍にある
    くぼみに保持する、請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】生細胞を、細胞作用剤を透過する膜手段に
    より、シリコン半導体電極近傍にある隔室中に保持す
    る、請求項２記載の方法。
  6. 【請求項６】生細胞をシリコン半導体電極近傍にある膜
    又は微小担体に付着させる、請求項２記載の方法。
  7. 【請求項７】生細胞を微小流体室の表面に付着させる、
    請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】生細胞を微小流体室内の膜又は微小担体に
    付着させる、請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】生細胞を微小流体室内のくぼみに保持す
    る、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】細胞を自然に、又は天然付着により付着
    させる、請求項７記載の方法。
  11. 【請求項１１】細胞を生物学的に許容しうる付着剤手段
    により着脱可能に付着させる請求項７記載の方法。
  12. 【請求項１２】付着剤はアガロースである、請求項11記
    載の方法。
  13. 【請求項１３】細胞を細胞作用剤を透過する膜手段によ
    り、微小流体室中の隔室に保持させる、請求項１記載の
    方法。
  14. 【請求項１４】溶液及び懸濁液を細胞と本質的に接触す
    るようになる前に、部分的に脱ガスする、請求項１記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】細胞作用剤の効果をシリコン半導体電極
    上の複数個所で測定する、請求項２記載の方法。
  16. 【請求項１６】細胞を自然の、又は、天然の付着によ
    り、シリコン半導体電極の表面に付着させる、請求項３
    記載の方法。
  17. 【請求項１７】生細胞を、生物学的に許容しうる付着剤
    手段によりシリコン半導体電極の表面に着脱可能に付着
    させる、請求項３記載の方法。
  18. 【請求項１８】付着剤はアガロースである、請求項17記
    載の方法。
  19. 【請求項１９】溶液又は懸濁液を細胞と完全に接触して
    連続的に流す、請求項１記載の方法。
  20. 【請求項２０】溶液又は懸濁液のpHを、微小流体室の複
    数個所で測定する、請求項19記載の方法。
  21. 【請求項２１】溶液又は懸濁液を、細胞と完全に接触し
    て、間欠的に流す、請求項１記載の方法。
  22. 【請求項２２】溶液又は懸濁液のpHを、流れの停止して
    いるときに測定する、請求項21記載の方法。
  23. 【請求項２３】測定される効果はpHである、請求項１記
    載の方法。
  24. 【請求項２４】測定される効果は酸化還元電位である、
    請求項１記載の方法。
  25. 【請求項２５】細胞作用剤は薬物、ホルモン、ウイル
    ス、毒素又は免疫剤である、請求項１記載の方法。
  26. 【請求項２６】（ａ）微小流体室上又は中で同定される
    微生物を捕獲するための手段を有する微小流体室を通し
    て溶液又は懸濁液を連続して、又は、間欠的に流すのに
    適した微小流体室を用意し； （ｂ）引き続いて、同定すべき微生物と接触した時に、
    試験される微生物に特異的な微生物学的応答をもたら
    す、１は複数の成分を含有する溶液又は懸濁液である、
    あらかじめ決められたセットの溶液又は懸濁液を微小流
    体室に流し； （ｃ）微小流体室と操作的に関連する応答を検出するた
    めの手段により、溶液又は懸濁液のそれぞれに対する微
    生物の応答を測定し；そして （ｄ）あらかじめ決められたセットの溶液及び／又は懸
    濁液に対して測定された微生物の応答を、既知の細菌の
    応答とを比較し、そのことにより同定すべき細菌を同定
    することから成る、微生物の同定法。
  27. 【請求項２７】（ａ）試験されるべき薬物を含有する溶
    液又は懸濁液を微小流体室を通じて連続的又は間欠的に
    流すのに適用される、微小流体室を用意し； （ｂ）さらに、微小流体室中の薬物に応答する生細胞
    を、微小流体室内又はこれに接するように用意し； （ｃ）試験されるべき薬物の溶液又は懸濁液を微小流体
    室内に流すことにより、生細胞と試験される薬物とを接
    触させ；そして （ｄ）微小流体室と操作的に関連する効果を検出するこ
    とによって、試験されるべき薬物の生細胞に対する効果
    を測定することから成る、薬物の存在又は活性をスクリ
    ーニングする方法。
  28. 【請求項２８】薬物は抗生物質である、請求項27記載の
    方法。
  29. 【請求項２９】薬物は抗ウイルス剤であり、生細胞はウ
    イルスにより感染されるものである、請求項27記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】（ａ）毒性物質を含む恐れのある溶液又
    は懸濁液を、連続的又は間欠的に流すのに適した微小流
    体室を用意し； （ｂ）さらに、微小流体室内において試験される毒性物
    質に応答する生細胞を微小流体室内において、又は、こ
    れに接して提供し； （ｃ）溶液又は懸濁液を微小流体室内に流すことによ
    り、毒性物質を含有する疑いのある溶液又は懸濁液と生
    細胞とを接触させ； （ｄ）微小流体室と操作的に関連する効果を検出するた
    めの手段により、生細胞に対する毒性物質の効果を測定
    することから成る、 毒性物質の検出方法。
  31. 【請求項３１】（ａ）溶液又は懸濁液を微小流体室を通
    して連続的又は間欠的に流すのに適した微小流体室を用
    意し； （ｂ）さらに、第１及び第２のセットの生細胞を微小流
    体室に用意し、この際、少くとも第２のセットの生細胞
    は微小流体室内か又はこれに接して存在させ； （ｃ）微小流体室を通して第１の細胞作用剤を含有する
    溶液又は懸濁液を流すことにより、第１のセットの生細
    胞を第１の細胞作用剤と接触させ、そのことにより、第
    １のセットの生細胞に第２の細胞作用剤を同化させ；そ
    して （ｄ）微小流体室と操作的に関連する効果を検出するた
    めの手段により、第２のセットの生細胞における第２の
    細胞作用剤の効果を測定する ことから成る、細胞内反応を検出するための方法。
  32. 【請求項３２】第１及び第２のセットの生細胞は同じ型
    の生細胞である、請求項31記載の方法。
  33. 【請求項３３】第１及び第２のセットの生細胞は異なる
    型の生細胞である、請求項31記載の方法。
  34. 【請求項３４】（ａ）複数の内部表面を有する微小流体
    室、内部表面の１つは床であり、微小流体室はそこに生
    細胞を保持するのに適したものであり、微小流体室はさ
    らに、細胞と接触する細胞作用剤の量をコントロールで
    きるように、細胞作用剤を含有する溶液又は懸濁液を細
    胞と本質的に接触させて連続的に、又は、間欠的に流す
    のに適している微小流体室； （ｂ）微小流体室中に生細胞を保持するための手段、 （ｃ）細胞作用剤を含有する溶液又は懸濁液を、これが
    微小流体室中に保持された生細胞と本質的に接触するよ
    うに流し、そのことにより、pH、酸化還元電位、細胞表
    面電位及びトランス−細胞電位から成る群より選ばれる
    細胞媒介細胞外効果を生じさせる手段及び （ｄ）細胞作用剤の効果を測定するための、微小流体室
    と操作的に関連している手段 を有する、生細胞に対する細胞作用剤の効果を検出する
    ための装置。
  35. 【請求項３５】微小流体室中に生細胞を保持する手段は
    室の床部の複数のくぼみから成る、請求項34記載の装
    置。
  36. 【請求項３６】シリコン含有半導体電極は微小流体室の
    床部の少くとも一部を形成し、そして、生細胞を保持す
    るくぼみの一部がシリコン含有半導体電極により規定さ
    れるものである、請求項35記載の装置。
  37. 【請求項３７】微小流体室中に生細胞を保持するための
    手段は、微小流体室の表面に生細胞を付着させることの
    できる生物学的に許容しうる付着剤である、請求項34記
    載の装置。
  38. 【請求項３８】生物学的に許容しうる付着剤はアガロー
    スである、請求項37記載の装置。
  39. 【請求項３９】微小流体室に生細胞を保持する手段は、
    微小流体室の表面にある隔室及び細胞作用剤を透過させ
    うる膜から成り、この透過性膜は、それが隔室を覆い、
    そして、そこに生細胞を保持するように置かれている、
    請求項34記載の装置。
  40. 【請求項４０】細胞作用剤の効果を検出するための手段
    が、生細胞と接触するか、この直近にあるシリコン半導
    体電極から成る、請求項34記載の装置。
  41. 【請求項４１】微小流体室に生細胞を保持するための手
    段は、生細胞が付着する膜、又は、微小担体から成るも
    のである、請求項34記載の装置。
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