DE2828232C2

DE2828232C2 - Vorrichtung zur Bestimmung des dielektrischen Durchbruches und der Größe von als Umhüllung eine Membran aufweisenden Partikeln

Info

Publication number: DE2828232C2
Application number: DE2828232A
Authority: DE
Inventors: Michael Dr. 5170 Jülich Groves; Günter Dr. 5162 Niederzier Pilwat; Ulrich Prof. Dr. 5170 Jülich Zimmermann
Original assignee: Kernforschungsanlage Juelich GmbH
Current assignee: Julius Maximilians Universitaet Wuerzburg
Priority date: 1978-06-28
Filing date: 1978-06-28
Publication date: 1986-04-17
Also published as: SE440148B; DE2828232A1; CH640055A5; JPS557696A; US4220916A; GB2024432B; JPS6410772B2; GB2024432A; FR2434399B1; SE7905610L; FR2434399A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung des dielektrischen Durchbruches von in einer Elektrolytloesung suspendierten, als Umhuellung eine Membran aufweisenden Partikeln, wie Zellen von Lebewesen, Liposomen, Protoplasten, Chloroplasten, Vacuolen oder dergleichen, sowie zur Bestimmung der Groesse der Partikeln und der virtuellen Groesse der durch erfolgten dielektrischen Durchbruch veraenderten Partikeln. Das Verfahren ermoeglicht, in einem einzigen Messvorgang an einem Partikel den dielektrischen Durchbruch, die Groesse des Partikels sowie die virtuelle Groesse des Partikels nach erfolgtem dielektrischen Durchbruch zu Bestimmen. Das Verfahren ist so Beschaffen, dass die Bestimmung der vorgenannten Groessen an einer Vielzahl von Partikeln in schneller Folge durchgefuehrt werden kann, so dass in kurzer Zeit eine statistisch hinreichend belegte Aussage ueber eine Partikelart erhalten wird. off direkt freigesetzt oder - falls sich dies als zweckmaessig

Description

a) daß die zweite Kammer in zwei Unterkammern (3, 4) unterteilt ist, daß in der Zwischenwandung, di.- die erste Kammer (2) von den zwei Unterkammern trennt, eine weitere Meßöffnung (5b) angeordnet ist, daß jeweils eine der beiden Meßöffnungen (5a, 5b) die erste Kammer mit jeweils einer UnteiKammer verbindet, daß die Öffnungen (6. S) für die Zuführung von Elektrolytlösung und Suspension in der ersten Kammer (2) so angeordnet sind, daß durch eine der beiden Meßöffnungen (5ojnur partikelfreie Elektrolytlösung fließt, daß beide Unterkammern eine öffnung (7a, Tb) zum Abfluß der Elektrolytlösung bzw. Suspension aufweisen, daß in beiden Unterkammern jeweils Elektroden (9a, 9b) vorgesehen sind,

b) daß beide Elektroden (9a, 9b) mit der Einrichtung (10) zur Erzeugung der elektrischen Spannung verbunden sind, so daß beide Meßöffnungen (5a, 5b) in gleicher Weise von den Stromlinien des elektrischen Feldes durchdrungen werden, und daß die Einrichtung(10) zur Erzeugung der elektrischen Spannung zusätzlich zur Erzeugung eines linearen Anstiegs der Spannung ausgesetzt ist,

c) daß die Elektroden (9a, 9b) mit Einrichtungen (!I) zur Bestimmung der über die beiden Meßöffnungen fließenden Ströme und zur Umwandlung der Ströme in Spannungen verbunden sind,

d) daß den Einrichtungen (II) zur Messung und Umwandlung der Ströme in Spannungen eine Einrichtung (12) zur Erzeugung eines aus den beiden Spannungen gebildeten Differenzsignals und zur Weitergabe des Differerizsignals an'ei¹ ne der Auswertung des Signals dienenden Einrichtung (14) nachgeschaltet ist,

e) und daß ferner eine mit der Einrichtung (10) zur Erzeugung der an den Elektroden angelegten Spannung und mit der Einrichtung (12) zur Bildung des Differenzsignals in Verbindung stehende Steuereinrichtung (15) vorgesehen ist, die nach der beim Eintritt eines Partikels in die eine der Meßöffnungen {5a) erfolgten Stromänderung den linearen Anstieg der an den Elektroden angelegten Spannung and nach einer vorgegebenen Zeitspanne ein Einstellen der ursprünglich an den Elektroden anliegenden Spannung bewirkt

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinrichtung (15) zusätzlich so ausgelegt ist daß sie nach Einritt eines Partikels in die eine der beiden Meßöffnungen (5a,J zunächst ein Gleichbleiben der an den Elektroden (9,9a, 9b) angelegten Spannung bewirkt und erst nach einer vorbestimmten Verzögerungszeit den linearen Anstieg der Spannung auslöst

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeachnet, daß eine mit der Einrichtung (10) zur Erzeugung der an den Elektroden (9, 9a, 9b) angelegten Spannung, mit der Einrichtung (12) zur Bildung des Differenzsignals sowie mit der Steuereinrichtung (15) in Verbindung stehende Einrichtung (16) vorgesehen ist, die für den Fall, daß die für den Durchgang von Partikeln vorgesehene Meßöffnung (5a) frei von Partikeln ist, ein vorgegebenes Wechselspannungssignal einer Frequenz im Bereich von 1 bis 10 kHz erzeugt und der an den Elektroden angelegten Spannung überlagert und zugleich einen derartigen Abgleich der Einrichtung (12) zur Bildung des Differenzsignals bewirkt, daß aufgrund der an den Elektroden angelegten Wechselspannung kein Differenzsignal erzeugt wird.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Wechselspannung eine sinusförmige Wechselspannung ist.

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Bestimmung des dielektrischen Durchbruches von in einer Elektrolytlösung suspendierten, als Umhüllung eine Membran aufweisenden Partikeln, wie Zellen von Lebewesen, Liposomen, Protoplasten, Chloroplasten und Vacuolen sowie zur Bestimmung der Größe der Partikeln und der virtuellen Größe der durch erfolgten dielektrischen Durchbruch veränderten Partikeln gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Eine derartige Vorrichtung ist aus der DE-OS 19 778 bekannt. Sie ist dazu vorgesehen, eine Partikelsuspension durch die Meßöffnung von der ersten Kammer in die zweite Kammer fließen zu lassen, wobei die Leitfähigkeit der Suspension sich zwischen den Elektroden beim Durchtritt eines Partikels proportional mit dem Volumen des Partikels ändert. Eine Volumenbestimmung der Partikel ist dadurch möglich. Sie ermöglicht ferner, den spezifischen Widerstand einer Partikelsuspension in Abhängigkeit von der Potentialdifferenz zwischen den Elektroden zu bestimmen, wobei jtman verschiedene Probensuspensionen bei unterschied-"%lichen,^:für die einzelne Probensuspension aber konstanten Potentialen durch die Meßöffnung fließen läßt. Die

Änderung im Leitfähigkeitsverhalten von zum Beispiel Blutzellen mit steigendem Potential wurden dabei auf einen lonendurchbruch durch die Zellmembran zurückgeführt. Die Ermittlung der eingangs genannten Beslim-

mungsgrößen an einzelnen Partikeln ist mit der bekannten Vorrichtung jedoch nicht möglich.

Eine Vorrichtung zur Bestimmung des dielektrischen Durchbruches ist aus der DE-AS 25 02 621 bekannt. Bei dieser Vorrichtung werden die Partikeln, beispielsweise biologische Zellen, die in einer als Elektrolytlösung dienenden physiologischen Flüssigkeit suspendiert sind, an Meßöffnungen fixiert und eine, an zu beiden Seiten der Meßöffnungen angeordneten Elektroden angelegte Spannung so hege erhöht, bis der dielektrische Durchbruch, der an der Änderung des Stromflusses erkennbar ist, erfolgt. Aufwendig ist, daß die Partikeln, für die der dielektrische Durchbruch bestimmt worden ist, von den Meßöffnungen durch Absaugen erst entfernt werden müssen, bevor neue Partikeln für eine neue Messung an den Meßöffnungen fixiert werden können. Eine Bestimmung der Größe bzw. des Volumens der Partikeln ist mit der bekannten Vorrichtung nicht vorgesehen. Es ist allerdings bekannt, die Größe von Partikeln dadurch zu bestimmen, daß die elektrische Widerstandserhöhung, die durch ein in einer Meßöffnung befindliches Partikel hervorgerufen wird, bestimmt wird.

Derartige Vorrichtungen dienen beispielsweise dazu, die Beschaffenheit der Partikeln, insbesondere auch deren Membranen, auch unter Berücksichtigung des Einflusses von Fremdstoffen zu untersuchen. Hierzu gehören beispielsweise die Untersuchung der Wirkung pharmazeutischer Mittel oder der Wirkung von Giften oder von sonstigen Stoffen in für Zellen von Lebewesen unverträglicher Konzentration oder aber auch d^;e Untersuchung des Einflusses von Krankheiten auf die Beschaffenheit lebender Zellen. Dabei werden Informationen über den Zustand und den Aufbau der Membranen sowie über die Größe der Partikeln erhalten, die beispielsweise im Bereich der klinischen Anwendung als Aussagen über pathologische Zellen von Bedeutung sein können. So kann beispielsweise die Wirkung von Chemotherapeutika oder Pharmazeutika auf Erythrozyten oder auch Gewebezellen untersucht werden.

Das Arbeiten mit den bekannten Vorrichtungen ist jedoch sehr langwierig, da eine hinreichend genaue Bestimmung der vorgenannten Größen nur an einzelnen Partikeln möglich ist und eine statistisch begründete Aussage nur bei einer Vielzahl von Messungen gegeben ist. So ist es beispielsweise notwendig, um eine verwertbare Aussage über den dielektrischen Durchbruch einer bestimmten Art von Zellen von Lebewesen zu erhalten, zugleich auch die Volumenverteilung der Zellen bei verschiedenen Feldstärken zu ermitteln. Bei Verwendung der bekannten Vorrichtungen ist dies jedoch eine zeitraubende Untersuchung, uie es nicht möglich macht — wie es beispielsweise im Bereich der klinischen Anwendung wünschenswert sein kann —, in möglichst kurzer Zeit und mit einer geringeren Zahl von Zellen eine Aussage über pathologische Zellen zu erhalten.

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine Vorrichtung zu schaffen, mit der in einem einzigen Meßvorgang an einem Partikel der dielektrische Durchbruch, die Größe des Partikels sowie die virtuelle Größe des Partikels nach erfolgtem dielektrischen Durchbruch bestimmt werden kann und mittels der die Bestimmung der vorgenannten Größen an einer Vielzahl von Partikeln in schneller'Folge durchgeführt werden kann, um so in kurzer Zeit eine statistisch hinreichend belegte Aussage über eine Partikelart zu erhalten.

Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird bei einer Vorrichtung der eingangs bezeichneten Art durch die kennzeichnende)! Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung erlaubt es, in einem einzigen Meßvorgang, während dem sich das Partikel in der Meßöffnung befindet, die zur Bestimmang der vorgenannten Größen erforderlichen Daten zu messen. Diese Daten werden dabei zweckmäßigerweise in einen Rechner eingespeist und simultan während des Meßvorganges ausgewertet, wobei im Rechner gespeicherte Eichdaten, die an Partikeln vorbestimmter Größe und Beschaffenheit ermittelt worden sind, zur Rechnung herangezogen werden. Bei der Berechnung der Größe der Partikeln sowie der virtuellen Größe der Partikeln, die der Größe oder zumindest der Beschaffenheit der intrazellulären Flüssigkeit zugeordnet werden kann, wird dabei die Abweichung des Stromes von der auf den linearen Anstieg der Spannung zurückzuführenden Stromänderung, das heißt die Änderung der durch den Spannungsanstieg zu erwartenden Stromänderung, als Anstieg desjenigen Anteils des Stromes ermittelt, der auf den Einfluß des in der Meßöffnung befindlichen Partikeis zurüc¹. ..eht.

Unter Berücksichtigung der in der Praxis möglichen Schnelligkeit von Rechnern hat sich als zweckmäßig erwiesen, daß die Geschwindigkeit der Partikeln durch die Meßöffnung derart bemessen wird, daß die Partikeln eine Zeitspanne von etwa 20 bis 200 Microsekunden in der Meßöffnung verbleiben. *

Diese, für die Messung der zur Auswertung notwendigen Daten erforderliche Zeitspanne ist gegenüber den bei den bekannten Verfahren benötigten Zeitspannen äußerst gering, so daß bei Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung schon nach unverhältnismäßig kurzer Zeit Ergebnisse vorliegen, die auch statistischen Anforderungen entsprechen. Dabei ist es selbstverständlich möglich, für den Fall, daß die Auswertung in kürzerer Zeit vorgenommen werden kann, eine kürzere Zeitspanne für den Durchlauf der Teilchen durch die Meßöffnung zu wählen.

Eine sehr vorteilhafte Ausführungsvariai.te de" Vorrichtung ist Patentanspruch 2 zu entnehmen. Diese ermöglicht, daß die Partikeln bei ihrem Durchgang durch die Meßöffnung zunächst einem konstanten elektrischen Feld ausgesetzt werden und daß die durch den Eintritt des Partikels in die Meßöffnung hervorgerufene Stromänderung zur Bestimmung der Größe des Partikels herangezogen wird. Dabei wird die Größe des Partikels bestimmt, was zu einer Vorauswahl von Partikeln genutzt werden kann. Denn auf diese Weise ist es möglich, aus einer Vielzahl von durch die Meßöffnung geschleusten Partikeln für die Bestimmung der interessierenden Größen nur diejenigen Partikeln heranzuziehen, deren Größe in einen vorgegebenen Größenbereich fällt. Die übrigen Partikeln werden dann von der Untersuchu"^ nusgenommen.

Bei der Verwendung der Vorrichtung gemäß der Erfindung wird zusätzl'vh zu dem Strom- bzw. Spannungssignal, das an der eigentlichen, von den Partikeln durchströmten Meßöffnung gewonnen wird, an einer zweiten Meßöffnung, die jedoch während des Meßvorganges von Partikeln freibieibt. ein Referenzsignal gewonnen, wodurch apparativ bedingte Fehlerquellen ausgeschaltet werden. Dabei ist selbstverständlich davon auszugehen, daß sich die Meßbedirigühgen in beiden Behältern entsprechen. Auch sollen die Meßöffnungen gleiche Abmessungen aufweisen, wobei davon auszugehen ist, daß die Länge der Meßöffnung etwa 50 bis 500 μίτι beträgt und der Durchmesser der Meßöffnung im Bereich von 20 bis 200 μίτι liegt, im übrigen je nach der Art der zu

untersuchenden Partikeln gewählt wird.

Weitere vorteilhafte Weiterausgestaltungen der Vorrichtung gemäß der Erfindung sind den Patentansprüchen 3 und 4 zu entnehmen. Sie ermöglichen, die in dem Behältersystem auftretenden und unvermeidlichen Temperaturschwankungen durch eine ständige Kontrolle zu kompensieren, so daß die effektive Temperaturdrift weniger als 0,005^DC beträgt. Auf diese Weise wird erreicht, daß die durch Störungen im System hervorgerufene relative Widerstandsänderung an beiden Meßöffnungen nicht mehr als 0,0001 beträgt.

Ein Ausführungsbeispiel der Vorrichtung gemäß der Erfindung ist in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im folgenden näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 eine Darstellung des Behälterssystems der Vorrichtung in Verbindung mit einem Blockdiagramm der elektrischen Einrichtungen

F i g. 2 ein Blockdiagramm der Vorrichtung gemäß der Erfindung mit einer Einrichtung zum Nullabgleich des Differenzsignals

Fig. 3 eine Darstellung des Behältersystems mit einem Schaltungsbeispiel der elektrischen Einrichtungen

F i g. 4 Darstellung der während eines Meßvorganges an den Elektroden angelegten Spannung sowie der aus der Stromänderung resultierenden Spannung.

Bei der in F i g. 1 dargestellten Ausführungsform der Vorrichtung ist Behälter 1 in drei voneinander getrennte Kammern unterteilt, nämlich in die erste Kammer 2 und die beiden Unterkammern 3 und 4. Dabei sind in der Zwischenwandung, die die Kammer 2 von den Kammern 3 und 4 trennt, Meßöffnungen 5a und Sb so angeordnet, daß sie die Kammern 3 und 4 mit der Kammer 2 verbinden. Die Kammer 2 weist einen Leitungsanschluß 6 für die Zuführung von Elektrolytlösung und die Kammern 3 und 4 jeweils einen Leitungsanschluß Ta beziehungsweise 7b auf, über die die Elektrolytlösung abfließt. Zur Zuführung von die Partikeln enthaltender Suspension ist ferner eine Leitung 8 vorgesehen, die auf die Meßöffnung 5a gerichtet ist, so daß die Partikeln zentriert durch die Meßöffnung Sa gelangen. Die Strömung der Elektrolytlösung kann dabei dadurch eingestellt werden, daß Elektrolytlösung und Suspension unter Druck in die Kammer 2 eingeleitet oder aber Elektrolytlösung aus den Kammern 3 und 4 abgesaugt wird. In die Kammern ragen ferner Elektroden 9. 9a und 9b hinein.

Nach dem in F i g. 1 dargestellten Blockdiagramm stehen die Elektroden 9,9a und 9b mit elektrischen Einrichtungen in Verbindung, von denen der Funktionsgenerator 10 zur Erzeugung einer konstanten sowie einer sägezahnartig verlaufenden Spannung dient, die beim Durchgang eines Partikels durch die Meßöffnung 5a an die Elektroden angelegt wird. Diese an die Elektroden angelegte Spannung führt zu einer entsprechenden elektrischen Feldstärke in den Meßöffnungen 5a und 5b. Den Elektroden 9a und 96 ist ferner eine Einrichtung 11 nachgeschaltet, die aus zwei Stromspannungswandlern besteht. Von diesen werden die erzeugten Spannungssignale an einen nachgeschalteten Differenzverstärker 12 gegeben, der von dem der Meßöffnung 5a zugehörigen Spannungssignal das der Meßöffnung 5b zugehörige Spannungssigna] subtrahiert. Das dadurch gebildete Differenzsignal wird sodann an einen Analog-Digital-Wandler 13 und von da an einen Rechner 14 weitergeleitet.

Bei Eintritt eines Partikels in die Meßöffnung 5a resultiert aus der Widerstandsänderung in der Meßöffnung ein Strom beziehungsweise (nach der Umwandlung in dem Stromspannungswandler 11) eine Spannungsänderung, die an den Differenzverstärker 12 und von diesem außer an den Analog-Digital-Wandler 13 auch an eine Steuereinrichtung 15 weitergeleitet wird, welche den Analog-Digital-Wandler einschaltet und nach einer vorbestimmten Verzögerungszeit die von dem Funktionsgenerator 10 erzeugte Sägezahnspannung startet. Nach einer vorgegebenen Zeit kehrt die Spannung auf ihren Ausgangswert zurück, wonach der Analog-Digital-Wandler (über die Steuereinrichtung 15) wieder abgeschaltet wird. Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist nun wieder bereit für die Messung eines weiteren, die Meßöffnung 5a passierenden Partikels.

Gegenüber der in Fig. 1 dargestellten Ausführungsform der Vorrichtung weist die in Fig.2 als Blockdiagramm (das Behältersystem einschließlich der Elektroden ist in diesem Fall als Block dargestellt) dargestellte Vorrichtung zusätzlich eine Einrichtung 16 auf, die dem Nullabgleich der das Dificferusigiiäi erzeugenden Einrichtung dient. Dazu wird, ausgelöst von der Steuereinrichtung 15, für die Zeitspanne, in der kein Partikel die Meßöffnung 5a passiert, der vom Funktionsgenerator

10 erzeugten konstanten Spannung eine hochfrequente Wechselspannung von beispielsweise 3 kHz überlagert.

Beim Auftreten eines aus der Wechselspannung resultierenden Differenzsignals wird der Differenzverstärker 12 so abgeglichen, daß kein Differenzsignal mehr auftritt. Sobald jedoch ein Partikel in die Meßöffnung 5;?

eintritt, wird das hieraus resultierende Spannungssignal, das sich aus der Stromänderung ergibt, von der Steuereinrichtung 15 aufgenommen und die von der Einrichtung 16 erzeugte Wechselspannung abgeschaltet und somit der automatische Nullpunktabgleich beendet.

In der in F i g. 3 gegebenen Darstellung sind die in den Fig. 1 und 2 mit 11,12 und 16gezeichneten elektrischen Einrichtungen schaltungsmäßig angegeben. Das in Fig.! näher beschriebene Behäkersystem ist dabei als aus zwei getrennten Behältern bestehend schematisch dargestellt. Wie aus der Fig.3 hervorgeht, sind die Elektroden 9 über Abgleichwiderstände 17 und 18 mit dem Funktionsgenerator 10 verbunden. Der Abgleichwiderstand 17 ist regelbar bis 5 \di, der Abgleich widerstand 17 beträgt 2,5 kH. Die aus zwei Strom-Spannungs-Wandlern bestehende Einrichtung 11 weist 2 Operationsverstärker 19 der Bezeichnung Intersil 2525 auf, die mit justierbaren Gleichstrom-Kompensatoren 20 von je 5 ΜΩ verbunden sind. Die Operationsverstärker sind außerdem zur Frequenzanpassung durch Trimmkondensatoren 21 von je 60 pF überbrückt. Die Widerstände 22 von je 35 kQ liefern den notwendigen Rückkoppelstrom.

In der Verbindungsleitung zwischen der Einrichtung

11 und der Einrichtung 12, die der Bildung des Differenzsignals dient, sind zur Wechselstromkopplung Kondensatoren 23 von je 1 μΡ sowie Widerstände 24 von je 11 k£l vorgesehen. Diesen ist ein Differenzverstärker 25 der Bezeichnung Intersil 2525 mit einem zur Rückkopplung dienenden Widerstand 26 von HOkQ nachgeschaltet

Die Einrichtung 16, die dem Nullabgleich des Differenzsignales dient, weist einen in elektrischer Verbindung mit dem Differenzverstärker 25 stehenden Phase-Lock-Verstärker 166 und einen die hochfrequente Wechselspannung liefernden Generator 16a auf. Der Phase-Lock-Verstärker 166 ist dabei über einen CMOS-FET 27 und einen hierzu in Serie geschalteten Widerstand 28 von 110 kii mit einem der Eingänge des Diffe-

renzvcrstärkers 25 verbunden. Der Phase-Lock-Verstärker 166 steht über einen FHT-Schalter (MC 140 16 CP) mit der Steuereinrichtung T5 in elektrischer Verbindung. In dieser Schaltungsanordnung gelangt die vom Wcchselspannungsgenerator 16a gelieferte Wechselspannung über die Meßöffnungen 5a und 5b, wo jede Abweichung vom Nullabgleich zu phasenungleichen Signalen führt, was wiederum zur Folge hat, daß im Differenzverstärker 25 ein von Null unterschiedliches Differenzsigiial gebildet wird. Dieses Signal gelangt in den Phase-Lock-Verstärker 166, der die phasenabhängige, gleichgerichtete Wechselspannung integriert, bis die Spannung am »gate« des FCT 27 so groß ist, daß der Differenzstärker 25 phasengleiche Signale erhält. Das integrale Ausgangssignal des Phase-Lock-Verstärkers 166 wird somit benutzt, um die Abweichung vom Nullabgleich durch Veränderung der Verstärkung im nichtinvertierenden Teil des Differenzverstärkers 25 mit Hilfe des FET 27 der im wesentlichen als elektrisch angepaßter Widerstand benutzt wird, zu kompensieren. Sobald sich ein Partikel in der Meßöffnung 5a befindet, und die Steuereinrichtung 15 das durch die Widerstandsänderung in der Meßöffnung bedingte Signal erhält, werden der Wechselspannungsgenerator 16a und die Abgleichsautomatik abgeschaltet.

In F i g. 4 ist im oberen Teil des Diagramms der zeitliche Verlauf der während eines Meßvorganges an den Elektroden angelegten Spannung und im unteren Teil des Diagramms der Verlauf des Differenzsignals wiedergegeben. Aus dieser Darstellung ist erkennbar, daß zum Zeitpunkt 0, nämlich beim Eintritt des Partikels in die Nwißöffnung, das Differenzsignal zu steigen beginnt. Über die Steuereinrichtung 15 w ird dann die vom Generator 16a erzeugte Wechselspannung abgeschaltet und zunächst die an den Elektroden anliegende Spannung konstant gehalten. In diese Phase kann durch Pulshöhenanalyse die Größe des Partikels bestimmt werden, um entweder nur Partikel bestimmter Größe für die weitere Analyse zuzulassen oder um Koinzidenzen auszuschalten. Erst nach 32 ,usec wird im dargestellten Fall der vom Funktionsgenerator 10 erzeugte lineare Anstieg der Spannung gestartet. Wie aus der Darstellung hervorgeht, folgt der Verlauf des Differenzsignals diesem Anstieg, bis bei erfolgtem dielektrischen Durchbruch — bei noch immer gleichbleibendem Anstieg der an den Elektroden angelegten Spannung — sich der Anstieg des Differenzsignals verringert. Nach 112μ5εο fällt die Spannung auf den ursprünglichen Wert ab, so daß nach etwa 130 μβεΰ auch die vom Differenzverstärker 25 gelieferte Spannung auf ihren ursprünglichen Wert abgefallen ist. Der Wechselspannungsgegenerator 16a sowie die Abgleichautomatik werden sodann wieder eingeschaltet.

Ausführungsbeispiel

55 Zur Ermittlung der Eichdaten wurden Latexteilchen bekannten Durchmessers eingesetzt.

Es wurden etwa 10^s Meßvorgänge ausgewertet. Dabei wurden aus dem Anstieg des Differenzsignals vor dem dielektrischen Durchbruch die Größenverteilung der Erythrozyten ermittelt. Aus dieser Verteilung wurde für die am häufigsten vorkommende Größe unter Berücksichtigung des vorgegebenen Formfaktors von /■=1,09 das häufigste Volumen der Erythrozyten zu 85,1 μπι³ berechnet. Aus dem Verhältnis der Steigungen des Differenzsignales vor und nach dem dielektrischen Durchbruch ergab sich der Umrechnungsfaktor für das virtuelle häufigste Volumen der Erythrozyten zu 0,613 und damit ein fiktives Volumen von 52,2 μΐη³.

Die kritische Potentialdifferenz über den Partikeln, die zum dielektrischen Durchbruch führt, wurde für den Zeitpunkt des Schnittpunktes der beiden Steigungen des Differenzsignales ermittelt. Diesem Schnittpunkt entspricht die kritische Feldstärke £in der Meßöffnung, aus der mit I iilfe der integrierten Lapiacegieichung unter Verwendung des Formfaktors f der Erythrozyten sowie der großen Halbachse α die Potentialdifferenz Kmc-aus der Beziehung

In einer Vorrichtung der in den F i g. 2 und 3 wiedergegebenen Ausführungsform, bei der die Meßöffnungen einen Durchmesser von 70 μπι und eine Länge von 150 jlm besaßen, wurden Erythrozyten aus 1,6 ml menschlichem Blut, das mit einer aus 0,4 ml 3,8%-Tri-Natriumcitrat-5,5-Hydrat bestehenden Lösung als Antikoagulans versetzt worden war, untersucht.

20 ul der vorgenannten Lösung wurden zu 10 ml einer isotonen phosphatgepufferten 138 mMol/1 NaCI, IZ3mMoI/I Na₂HPO₄ und 2,7 mMol/I NaH₂PO₄ enthaltenden Lösung, die eine Leitfähigkeit von 0,0158 Ω-' cm-' aufwies,gegeben.

errechnet wurde. Dabei ist für das häufigste Volumen der Erythrozyten (85.1 μηι³)

f = 1.09

a = 6.6 μη: und

E = Il 12 V/cm.

Das fiktive Volumen der Erythrozyten kann zur Berechnung weiterer Größen dienen, beispielsweise dazu, die Menge an Hämoglobin pro Zelle zu errechnen. Dies deshalb, weil der Zellinhalt von Erythrozyten im wesentlichen aus Hämoglobin besteht. Zur Ermittlung des zur Umrechnung erforderlichen Umrechnungsfaktors wurde daher aus 20 verschiedenen Blutproben der Hämoglobingehalt von Erythrozyten fotometrisch nach der Hämoglobin-Cyanit-Methode bestimmt. Der Umrechnungsfaktor ergab sich dabei zu 0,719 Hämoglobingehalt in pg pro Erythrozyt.

Die Zahl der Zellen, die sich aus dem Durchfluß eines bestimmten Suspensionsvolumens der vorgenannten Suspension durch die Meßöffnung ergab, betrug 34437 in 5,33 μΐ, was (unter Berücksichtigung eines Verdünnungsfaktors von 625,25) 4,5 Mio Zellen pro μΐ ergab. Die Hämoglobinkonzentration errechnete sich zu 15,2 g/100 ml.

Fs wurden ferner als Ghostzellen zu bezeichnende Erythrozyten, die bereits dem dielektrischen Durchbruch unterworfen worden waren und deren intrazelluläre Flüssigkeit durch ein Medium der gleichen Leitfähigkeit wie das äußere Medium ausgetauscht worden war, untersucht Die Untersuchung dieser Erythrozyten führte dabei zu dem Ergebnis, daß das Differenzsignal nach erfolgtem dielektrischem Durchbruch parallel zur Zeitachse verlief, womit gezeigt wurde, daß es mittels der Vorrichtung gemäß der Erfindung möglich ist, die Leitfähigkeit innerhalb von Partikeln zu bestimmen.

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur Bestimmung des dielektrischen Durchbruches von in einer Elektrolytlösung suspendierten, als Umhüllung eine Membran aufweisenden Partikeln, wie Zellen von Lebewesen, Liposomen, Protoplasten, Chloroplasten und Vacuolen sowie zur Bestimmung der Größe der Partikeln und der virtuellen Größe der durch erfolgten dielektrischen Durchbruch veränderten Partikeln, bei der ein durch eine Zwischenwandung in Kammern geteilter Behälter mit jeweils einer in den Kammern angeordneten Elektrode und mindestens einer in der Zwischenwandung vorgesehener Meßöfmung vorgesehen ist, bei der die erste Kammer mit einer öffnung für die Zuführung von Elektrolytlösung und mit einer Öffnung für die Zuführung der die Partikeln enthaltenden Suspension und die zweite Kammer mit zumindest einer Öffnung zum Abfließen der Elektrolytlösung/Suspeii5ion versehen ist und die Elektroden mit einer eine Spannung variabler Höhe erzeugenden Einrichtung verbunden sind, und bei der den Elektroden weitere Einrichtungen nachgeschaltet sind, welche der Erfassung und Auswertung der Stromänderung dienen, die durch in der Meßöffnung befindliche Partikel bewirkt werden, dadurch gekennzeichnet.