DE68922390T2

DE68922390T2 - Verfahren und apparat zur messung der effekte von zellwirksamen mitteln auf lebende zellen.

Info

Publication number: DE68922390T2
Application number: DE68922390T
Authority: DE
Inventors: Gillian Humphries; Josef Kercso; Karen Kercso; Harden Mcconnell; John Owicki; John Parce
Original assignee: Molecular Devices LLC
Current assignee: Molecular Devices LLC
Priority date: 1988-10-21
Filing date: 1989-10-06
Publication date: 1995-10-05
Anticipated expiration: 2009-10-07
Also published as: DE68922390D1; ATE121790T1; JP2993982B2; CA2001212A1; WO1990004645A1; EP0394406B1; US5496697A; JPH03502642A; EP0394406A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum Nachweis der Wirkungen zellbeeinflussender Mittel auf lebende Zellen und auf Vorrichtungen, die für die Durchführung solcher Verfahren angepaßt sind. Man läßt Lösungen oder Suspensionen zellbeeinflussender Mittel über Zellen fließen und mißt die Wirkungen dieser Mittel.

Beschreibung des Hintergrunds der Erfindung

Untersuchungen über die Wirkung verschiedener zellbeeinflussender Mittel auf lebende Zellen wurden in der Literatur beschrieben. Siehe z.B.: Meisner, H. und Tenny, K. (1977) PH as an indicator offree fatty acid release from adipocytes," J. Lipid Research 18:774-776; Nilsson, N. und Belfrage, P. (1979) "Continuous monitoring of free fatty acid release from adipocytes by pH-stat titration," J. Lipid Research 20:557-560; Reuss, L., Weinman, S. und Constantin, J. (1984) ±H&spplus; and HCO&sub3;&supmin; transport at the apical membrane of the gallbladder epithelium," S. 85-96 von Forte, J., Warnock, D. und Rector, F. Jr. (Hrsg.) Hydrogen Ion Transport in Epithelia, Wiley Interscience; Zeuthen, T. und Machen, T. (1984) "HCO&sub3;&supmin;/CO&sub2; stimulates Na&spplus;/H&spplus; and Cl&supmin;/HCO&sub3;&supmin; exchange in Necturus gal1bladder," S. 97, 108 (ibid.); Handler, J.S., Preston, A.S. und Steele, R.E. (1984) "Factors affecting the differentiation of epithelial transport and responsiveness to hormones," Federation Proceedings 43:2221-2224; sowie Simrnons, N.L., Brown, C.D.A. und Rugg, E.L. (1984) "The action of epinephrine on Madin- Darby canine kidney cells," Pederation Proceedings, 43:2225-2229.
Diese Literaturstellen offenbaren den Nachweis von Veränderungen des pH-Werts und anderer elektrischer Potentiale durch die Zugabe zellbeeinflussender Mittel zu Zellen, die in einer relativ großen Menge von Medium, d.h. einem Bulk-Medium, vorliegen. Ein Nachteil dieser Techniken ist, daß die Messungen des pH-Werts und anderer elektrischer Potentiale an dem Bulk-Medium vorgenommen werden und nicht unbedingt die tatsächlichen Werte in unmittelbarer Nachbarschaft der Zellmembranen der lebenden Zellen widerspiegeln. Außerdem verdünnt das große Verhältnis des Bulk-Volumens zum Zellvolumen unvermeidlich die Auswirkungen der Zellen auf die Eigenschaften des extrazellulären Mediums. Entsprechend geht die Empfindlichkeit verloren oder wird stark reduziert.
Lichtempfindliche Sensoren zur Messung biochemischer Systeme sind in verschiedenen Patentschriften offenbart. Siehe z.B.: US- Patente Nr. 4,591,550 (Hafeman et al.) und 4,704,353 (Humphries et al.); und europäische Patentanmeldung Nr. 213,825 (Hafeman et al.). Das US-Patent Nr. 4,519,890 offenbart eine Fließ-pH-Kammer. Diese Patentveröffentlichungen offenbaren die Verwendung von Mikroorganismen zur Messung von Veränderungen in der Umgebung der zu messenden Lösung. In diesen Veröffentlichungen werden keine Zellen in Mikrofließkammern offenbart, die verwendet werden, um die Wirkungen zellbeeinflussender Mittel zu messen. Siehe auch: US-Patente Nr. 4,737,464 (Mcconnell et al.) und 4,741,619 (Humphries et al.). EP-A-0 060 509 offenbart eine Fließkammer mit Vorrichtungen zum Zurückhalten der in Schalen kultivierten Zellen. Man läßt eine zu testende Substanz durch die Kammer fließen, und eine extrazelluläre Wirkung, z.B. DO&sub2;, wird mit einer Vorrichtung nachgewiesen, das operativ mit der Fließkammer verbunden ist.
Verschiedene Arten der Verwendung von Fluoreszenz zur Messung extrazellulärer Wirkungen lebender Zellen und Analyten sind in der Literatur offenbart. Siehe z.B.: Briggs et al. (1985) "Fiber Optic Probe Cytometer", J. Immunological Methods, 81:73-81; Hafeman et al. (1984) Superoxide Enhances Photo Bleaching During Cellular Immune Attack Against Fluorescent Lipid Monolayer Membranes" Biochemica Biophysica Acta 772:20-28; und US-Patente Nr. 4,560,881 und 4,564,598.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Nachweis der Wirkungen zellbeeinflussender Mittel auf lebende Zellen mit größerer Genauigkeit und Präzision bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Nachweis der Wirkungen zellbeeinflussender Mittel auf lebende Zellen bereitzustellen, die die Verwendung von Bulk-Medien mit großem Volumen vermeiden.
Es ist ein spezifisches Ziel der vorliegenden Erfindung, Verfahren zum Nachweis einer Wirkung eines zellbeeinflussenden Mittels auf lebende Zellen bereitzustellen durch: (a) Bereitstellen lebender Zellen, die in einer Mikrofließkammer zurückgehalten werden, welche für den kontinuierlichen oder portionsweisen Durchfluß einer Lösung oder Suspension, die das zellbeeinflussende Mittel enthält, in innigem Kontakt mit den Zellen angepaßt ist, so daß die Menge des mit den Zellen in Kontakt stehenden zellbeeinflussenden Mittels gesteuert werden kann; (b) Hindurchfließenlassen einer Lösung oder Suspension, die das zellbeeinflussende Mittel enthält, in innigem Kontakt mit den Zellen, so daß eine zellvermittelte extrazelluläre Wirkung oder eine Änderung von PH-Wert, Redoxpotential, Zelloberflächenpotential oder transzellulärem Potential erzeugt wird; sowie (c) Messen der Wirkung des zellbeeinflussenden Mittels mit einer Vorrichtung zum Nachweis des pH-Werts, Redoxpotentials, Zelloberflächenpotentials oder transzellulären Potentials, die sich innerhalb der Mikrofließkammer befindet.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung bereitzustellen, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren besonders angepaßt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung können die Zellen durch spontane oder natürliche Haftung der Zellen an der inneren Oberfläche der Fließkammer oder an einer porösen Membran oder einem Mikroträger, die in der Fließkammer enthalten sind, in der Mikrofließkammer zurückgehalten werden. Alternativ dazu können die Zellen mittels eines Bindemittels, das biologisch mit den Zellen verträglich ist, in der Mikrofließkammer zurückgehalten werden. Ein bevorzugtes Beispiel für ein solches Bindemittel ist Agarose.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Zellen in der Mikrofließkammer zurückgehalten werden, indem man die Mikrofließkammer mit einer Oberfläche ausstattet, die eine Vielzahl von Vertiefungen oder Senken aufweist, die so wirken, daß sie die Zellen Physikalisch auf der Oberfläche der Mikrokammer festhalten, vorzugsweise durch Sedimentation unter der Schwerkraft. Diese Vertiefungen sollten ausreichend breit und tief sein, so daß die Zellen bei normalen Fließgeschwindigkeiten in der Mikrofließkammer bleiben. Die Zellen können dann durch jedes geeignete Mittel aus den sie festhaltenden Vertiefungen entfernt werden, einschließlich der Verwendung hoher Fließgeschwindigkeiten durch die Mikrofließkammer, die die Zellen aus den Vertiefungen spülen, oder durch Umdrehen der Kammer, so daß die Zellen aus den Vertiefungen in die Fließströmung ausgetrieben werden. In einer alternativen Ausführungsform können die Zellen in der Fließkammer zurückgehalten werden, indem man sie in einem Kompartiment der Fließkammer, das durch eine poröse Membran abgetrennt ist, festhält.
Einige Merkmale der bevorzugten Geometrie der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikrofließkammer sind den meisten Anwendungen der Vorrichtung gemeinsam. Das wichtigste davon ist das Volumen-Oberflächen-Verhältnis in der Kammer, das die maximale Konzentration anhaftender Zellen bestimmt. Die pH-Änderung pro Proton, das von einer Zelle ausgeschieden wird, ist "umgekehrt proportional" zu der Zellkonzentration und damit zum Volumen- Oberflächen-Verhältnis. Bei der planaren Blockgeometrie der Kammer, wie sie in den Figuren 1-4 beschrieben ist, ist dieses Verhältnis einfach die Kammerhöhe, typischerweise 100 um.
Der Kompromiß bei der Gestaltung in bezug auf das Volumen-Oberflächen-Verhältnis ist hauptsächlich einer zwischen Empfindlichkeit und Leichtigkeit bei der Handhabung der Flüssigkeit. Bei ünserer gegenwärtig bevorzugten Vorrichtung geht die Empfindlichkeit bei Verhältnissen von über ungefähr 200 um stark zurück. Bei Dicken von unter ungefähr 50 um erwarten wir erhebliche Probleme bei der Handhabung der Flüssigkeit, die Gewinne bei der Empfindlichkeit wieder kompensieren könnten. Instrumentelle Verbesserungen, wie mikromaschinell in die Sensoroberfläche eingearbeitete Kammern, könnten jedoch eine Integration von Flüssigkeiten und Kammer in viel kleinerem Maßstab ermöglichen, was bei Verhältnissen von 10-50 um die Analyse von einer oder von wenigen lebenden Zellen erlauben würde.
Das bevorzugte Volumen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Mikrofließkammer wird in gewissem Maße von der beabsichtigten Anwendung der Vorrichtung abhängen. Wenn zum Beispiel die Zahl der verfügbaren Zellen eine Einschränkung darstellt, so werden Kammervolumina im Submikroliter-Bereich bevorzugt (z.B. 1 mm² Oberfläche und 100 um Höhe oder 100 nl, die etwa 10³ Zellen enthalten). Für andere Anwendungen, bei denen eine größere Zahl von Zellen beteiligt ist, können Kammervolumina in einer Größenordnung von Mikrolitern oder sogar Millilitern ins Auge gefaßt werden (Oberflächen in der Größenordnung von Quadratzentimetern mit etwa 10&sup5; Zellen/cm², wobei jedoch eine Kammerhöhe von ungefähr 100 um beibehalten wird). Die bevorzugte Mikrofließkammer hat also sowohl ein kleines in der Kammer erreichbares Gesamtvolumen als auch/oder eine geringe Höhe, also ein kleines Volumen-Oberflächen-Verhältnis.
Der beim erfindungsgemäßen Verfahren vorzugsweise verwendete Typ von Mikrofließkammer ist der im US-Patent Nr. 4,591,550 offenbarte. Anstelle der im US-Patent Nr. 4,591,550 offenbarten lichtemittierenden Dioden kann ein Argon- und/oder Helium/Neon-Laser als Energiequelle verwendet werden. Alternativ dazu kann die für die vorliegende Erfindung geeignete Mikrofließkammer eine des in der EP-Anmeldung Nr. 255 223 offenbarten Typs sein. Am bevorzugtesten umfaßt die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Mikrofließkammer eine Silicium-Halbleiterelektrode, an der oder in deren Nähe die lebenden Zellen zurückgehalten werden. Mittels dieser Elektrode können die verschiedenen elektrischen Wirkungen, die das zellbeeinflussende Mittel verursacht, nachgewiesen oder gemessen werden. Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Mikrofließkammer sollte vorzugsweise sowohl Portionsweisen als auch kontinuierlichen Durchfluß von Lösungen oder Suspensionen vorsehen, da bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung entweder portionsweiser oder kontinuierlicher Durchfluß von Lösungen oder Suspensionen verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung kann in Verbindung mit eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen verwendet werden, solange die besonderen Zellen in der Mikrofließkammer zurückgehalten werden können. Genetisch transfizierte Zellen können ebenfalls verwendet werden. Außerdem kann eine große Vielfalt zellbeeinflussender Mittel verwendet werden, einschließlich Reizstoffen, Medikamenten, Toxinen, anderen Zellen, Rezeptorliganden, Rezeptoragonisten, immunologischen Agentien, Viren, Pathogenen, Pyrogenen und Hormonen.
Eine große Vielfalt von Wirkungen, die von den zellbeeinflussenden Mitteln verursacht werden, können gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen oder gemessen werden. Zu den bevorzugten Wirkungen gehören PH-Wert, Redoxpotential und andere elektrische Eigenschaften der Lösung oder Suspension, die in innigem Kontakt mit den lebenden Zellen in der Mikrofließkammer fließt, wie Zelloberflächenpotential und transzelluläres Potential. Diese Wirkungen können mit einer Viel zahl konventioneller Mittel gemessen oder nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann der pH-Wert durch Messen der Fluoreszenz oder Extinktion eines pH-empfindlichen Farbstoffs, wie Fluorescein oder Phenolrot, der an einem Teil der Kammer befestigt ist, nachgewiesen werden. Ähnlich können andere Farbstoffe verwendet werden, um das Redoxpotential nachzuweisen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Identifizierung von Mikroben, Verfahren zur Durchmusterung im Hinblick auf die Wirkung von Medikamenten, Verfahren zum Nachweis toxischer Substanzen und Verfahren zum Nachweis interzellulärer Reaktionen. Bei diesen verschiedenen Verfahren läßt man Lösungen oder Suspensionen, die das gewünschte zellbeeinflussende Mittel enthalten, in innigem Kontakt mit den lebenden Zellen, die in der Mikrofließkammer zurückgehalten werden, fließen. Die Wirkung(en) des zellbeeinflussenden Mittels auf die Zellen wird (werden) dann gemessen und liefern das Mittel, mit dem Bakterien identifiziert, Medikamente durchmustert und Toxine sowie interzelluläre Reaktionen nachgewiesen werden können.
Die vorliegende Erfindung hat mehrere Vorteile gegenüber anderen Verfahren zur Messung einer metabolischen Aktivität, wie Oximetrie und Mikrokalorimetrie. Insbesondere besitzt die vorliegende Erfindung eine kurze Meßzeit, erhöhte Empfindlichkeit, nichtinvasive Eigenschaft, Allgemeinheit und die Möglichkeit zur weiteren Miniaturisierung und Integration.
Bestimmte bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden unten in Verbindung mit den Zeichnungen und der ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen ausführlicher besprochen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Die Figuren 1-3 stellen schematische Querschnitte von Mikrofließkammern dar, die zur Durchführung der bevorzugten Verfahren der Erfindung geeignet sind.
Figur 4 stellt eine schematische perspektivische Ansicht von oben einer Mikrofließkammer dar, die zur Durchführung der bevorzugten Verfahren der Erfindung geeignet ist.
Figur 5 stellt ein schematisches Diagramm von Vorrichtungen dar, die zur Durchführung der bevorzugten Verfahren der Erfindung geeignet sind.
Figur 6 stellt ein schematisches Diagramm eines Entgasers dar, der zur Durchführung der bevorzugten Verfahren der Erfindung geeignet ist.
Figur 7 stellt eine schematische Seitenansicht anhaftender Zellen dar7 die sich in einer Mikrofließkammer befinden.
Figur 8 stellt eine schematische Seitenansicht von Zellen dar, die in Vertiefungen in einer Mikrofließkammer zurückgehalten werden.
Figur 9 stellt ein Diagramm einer Schaltung dar, die für die vorliegende Erfindung geeignet ist.
Figur 10 stellt eine typische Bestimmung von Zellstoffwechselraten dar, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung vorgenommen werden kann.
Die Figuren 11-23 stellen die experimentellen Ergebnisse dar, die im Zusammenhang mit den Beispielen 1, 2, 4, 6, 9, 11 und 17 erhalten wurden.
Figur 24 stellt Ergebnisse der Behandlung gramnegativer Bakterien mit einem Antibiotikum, das eine Wirkung, sowie mit einem, das keine Wirkung auf gramnegative Bakterien hat, dar.
Figur 25 stellt eine schematische Draufsicht von Vertiefungen zum Zurückhalten von Zellen dar, die zur Durchführung der bevorzugten Verfahren der Erfindung geeignet sind.
Die Figuren 26-46 stellen die experimentellen Ergebnisse dar, die im Zusammenhang mit den Beispielen 19-23 erhalten wurden.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Unter Bezugnahme auf Figur 5 besteht der instrumentelle Aufbau der bevorzugten Ausführungsform vorzugsweise aus einem oder mehreren Spritzenantrieben oder Pumpen, einer Entgasungskammer, einem Umschaltventil oder Injektionsschleifenventil, einer Fließkammer, einem Bezugselektrodenreservoir und der zugehörigen Elektronik, die für den Silicium-Halbleiterelektroden-Sensor und die Datenverarbeitung erforderlich ist.
Die Spritzenantriebe liefern die Lösungen oder Suspensionen (d.h. das Medium) mit gesteuerten Fließgeschwindigkeiten an die Fließkammern. Sowohl die Fließgeschwindigkeit als auch der An/Aus- Cyclus der Spritzenantriebe können während der Datenerfassungsphase mit Hilfe eines Computers gesteuert werden. Alternativ dazu können andere Pumpentypen, wie Schlauchpumpen, anstelle der Spritzenantriebe verwendet werden.
Unter Bezugnahme auf Figur 6 besteht die Entgasungskammer aus der Länge eines Silikonkautschukrohrs, durch das die Lösungen oder Suspensionen hindurchtreten. Das Äußere des Rohres wird in einer Luftatmosphäre mit reduziertem Druck gehalten (ungefähr 2/3 Atmosphärendruck). Eine Entgasungskammer wird bevorzugt, da die Lösungen oder Suspensionen in der Spritze und im Rohr Raumtemperatur haben und die Fließkammer gewöhnlich eine Temperatur von 37ºC hat. Wenn das Medium mit Raumtemperatur die Fließkammer erreicht, erwärmt es sich auf 37ºC, was zur Bildung von Blasen in der Kammer führt. Blasen in der Fließkammer stören die Messungen auf mehrere Arten. Sie können einen Weg zur Bezugselektrode mit hohem Widerstand erzeugen, was zu einer Verstärkung des Rauschens des Photostromsignals führt. Sie können auch das wäßrige Volumen in der Kammer ändern und so die Pufferkapazität der Kammer verändern. Bei einer gegebenen Zellstoffwechselrate variiert die Änderungsgeschwindigkeit des PH-Werts in der Kammer mit der Zahl und Größe der Blasen. Blasen bilden sich in der Kammer und wachsen mit der Zeit. Wenn sie eine bestimmte Größe erreicht haben, lösen sie sich ab und werden in dem fließenden Strom weggetragen. Dies kann zu Rauschen mit geringer Frequenz in der Pufferkapazität der Fließkammer führen.
Das Umschaltventil erlaubt es dem Anwender, den Fluß aus einer von zwei Spritzen in die Fließkammer zu leiten. Eine Alternative ist ein Injektionsschleifenventil. Dies erlaubt es dem Anwender, einen Bolus von Lösung oder Suspension in den Strom zu injizieren, ohne den Fluß zu unterbrechen. Wenn das Injektionsschleifenventil verwendet wird, ist typischerweise eine Spritze mit Medium beladen und wird verwendet, um den Strom mit Hilfe der Injektionsschleife zu perfundieren. Das Volumen der Lösung oder Suspension mit dem Mittel und die Zeit der Einwirkung des Mittels auf die Zellen können variiert werden, indem man die Größe der Injektionsschleife und die Fließgeschwindigkeit des Perfusionsstroms variiert.
Die Figuren 1-4 veranschaulichen eine bevorzugte Mikrofließkammer 1, die einen Siliciumsensor 2 mit einer Eintrittsöffnung 3 und einer Austrittsöffnung 4 aufweist. In Figur 1 haften die Zellen 5 in einer einfachen Schicht (Monolayer) an der oberen Fläche des Siliciumsensors, und die Reaktion am Siliciumsensor wird durch Laserlicht 6 moduliert. Alternativ dazu kann die Zelle durch eine permeable Membran in der Nähe des Siliciumsensors zurückgehalten werden. Im Betrieb tritt eine Lösung, die ein zellbeeinflussendes Mittel enthält, durch die Eintrittsöffnung 3 ein und fließt über die Zellen 5 in die Mikrofließkammer 1. Die Lösung tritt durch die Austrittsöffnung 4 aus, wo sich die austretende Lösung in elektrischem Kontakt mit einer Bezugselektrode befindet. Die lokale Reaktion an der oberen Fläche des Siliciumsensors 2 wird durch Laserlicht 6 moduliert und gemessen. Figur 2 veranschaulicht Vertiefungen 7, die Zellen bei niedrigen Fließgeschwindigkeiten festhalten bzw. zurückhalten und aus denen die Zellen bei hohen Fließgeschwindigkeiten aus der Fließkammer herausgespült werden können.
Die Fließkammer ist vorzugsweise ein dünner Kanal, der unten durch den Siliciumsensor 2 und oben durch ein mit Indiumzinnoxid (ITO) beschichtetes Deckglas 8 begrenzt wird. Die anhaftenden Zellen kann man auch auf der Oberfläche des Deckglases anstatt auf der Silicium-Halbleiterelektrode wachsen lassen. Der Abstand zwischen dem Siliciumsensor und dem Deckglas beträgt ungefähr 100 um. Der Abstand zwischen dem Sensor 2 und dem Deckglas 8 kann mit Hilfe eines Teflon-Abstandshalters 14 erreicht werden, der einen geeignet ausgeschnittenen Kanal aufweist, welcher die Fließkammer bildet. Eine Steuerelektrode 13, vorzugsweise ein Platindraht, durchdringt das Kunststoffgehäuse der Fließkammer, um einen elektrischen Kontakt mit der ITO-Steuerelektrode herzustellen. Der elektrische Kontakt mit dem Siliciumsensor wird über die Metallgrundplatte 9 der Fließkammer hergestellt. Teflon-Eintritts- und Austrittsrohre 3 und 4 durchdringen das Kunststoffgehäuse und ermöglichen das Fließen von Medium durch die Fließkammer. Das Austrittsrohr 4 endet in einem Reservoir, das eine Ag/Agcl-Bezugselektrode enthält. Das Austrittsrohr 4 wirkt also als Salzbrücke, um eine Messung des Potentials von Lösungen oder Suspensionen in der Fließkammer zu ermöglichen. Die gesamte Fließkammer ist auf einem hohlen Metallträger montiert, der mit einem temperierten Umlaufwasserbad 10 auf einer konstanten Temperatur, typischerweise 37ºC, gehalten wird. Das Deckglas 8 ist abnehmbar und kann mit Hilfe abnehmbarer Silikonkautschukdichtungen 11 und Rückhalteglieder 12 in der Betriebsposition gehalten werden.
Zwei verschiedene Instrumente können vorzugsweise verwendet werden, um den Siliciumsensor zu beleuchten und so eine geeignete Photoreaktion zu erzeugen: ein Laserinstrument und ein LED-Instrument (light emitting diode).
In dem Laserinstrument ist die Fließkammer auf einem Lichtmikroskoptisch montiert. Der Strahl aus einem 150-mW-Argonionen-Laser wird durch einen mechanischen 10-kHz-Unterbrecher und in einen Strahlenexpander gerichtet, der einen Strahl mit einem Durchmesser von ungefähr 2,5 cm erzeugt. Der Strahl tritt dann durch ein Polarisationsfilter (variabler Dämpfer) und wird von Spiegeln durch eine einstellbare Vierblattblende in den Tubus des Mikroskops gerichtet. Alternativ dazu wird die Kammer in einer Version der Vorrichtung auf einen Mikroskoptisch montiert, und der Strahl aus einem 10-mW-He/Ne-Laser wird durch ein Auflichtsystem auf den Sensor projiziert. Bei diesen Konfigurationen kann man die Zellen in der Fließkammer durch das Mikroskop sehen und einen quadratischen oder rechteckigen Sondenstrahl jeder gewünschten Größe auf jeden Bereich der Siliciumoberfläche in der Fließkammer richten. Dies ist besonders nützlich, wenn nichtkonfluente Zellkulturen verwendet werden. Es erlaubt einem, den Sondenstrahl auf Bereiche der größten Zelldichte zu richten. Außerdem kann man auf Instrumentendrift prüfen, indem man den Strahl auf Bereiche richtet, wo keine Zellen sichtbar sind.
In dem LED-Instrument sind zwei Fließkammern nebeneinander auf einer temperierten Platte montiert. Zur Beleuchtung durchdringen vier faseroptische Lichtleiter für jede Kammer die temperierte Platte, um den Siliciumsensor von unten (der Seite gegenüber der Fläche, die mit dem Medium in Kontakt ist) zu beleuchten. Die vier Fasern sind so ausgerichtet, daß sich eine in der Nähe des Eintrittsrohrs, eine in der Nähe des Austrittsrohrs und zwei in gleichem Abstand zwischen dem Eintritt und dem Austritt befinden. Dieses Instrument wird vorzugsweise mit Zellen verwendet, die zu einer ausreichend konsistenten und gleichmäßigen Dichte wachsen. Es gibt jedoch noch etwas Spielraum, um Bereiche mit der größten Zelldichte auszusuchen. Ein Ende der optischen Fasern stößt gegen den Siliciumsensor, und das andere Ende ist mit einer infraroten LED gekoppelt. Jede Faser hat einen Durchmesser von 1,5 mm. Daten können alle vier Sekunden simultan von acht Stellen (vier für jede der beiden Kammern) gesammelt werden.
Es kann drei primäre elektrische Verbindungen zu der Kammer geben: (1) eine Steuerelektrode, die über ein dünnes Platinband oder -draht mit dem Indiumzinnoxid-Überzug auf dem Deckglas verbunden ist; (2) eine Ag/AgCl-Bezugselektrode in einer externen Vertiefung, die das Potential der Lösung in der Fließkammer über eine Salzbrücke mißt, die das Austrittsrohr der Kammer umfaßt; und (3) eine Ohmsche Verbindung zu der Basis des Siliciumplättchens. Ein Personal-Computer mit einer maßgefertigten Leiterplatte kann die Erfassung, Analyse und Ausgabe von Daten in einer Weise durchführen, die in dieser Technik wohlbekannt ist.
Eine bevorzugte Schaltung zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist in Figur 9 offenbart. Gezeigt ist das Sensorelektrodensystem, das einen Siliciumsensor, eine Bezugselektrode (R.E.) und eine Steuerelektrode (C.E.) umfaßt. Die Steuerelektrode hält die Lösung über eine Erdung mit geringer Impedanz auf einem beliebigen Potential gegen die Erde. Das beliebige Potential ist definiert durch das Oberflächenpotential an der Grenzfläche Elektrode/Lösung und den verschiedenen Kontaktpotentialen zwischen dem Elektrodenmaterial und der Erde. Die Bezugselektrode ist vom Salzbrückentyp und mißt so das Potential der Lösung unabhängig von der Zusammensetzung der Lösung. Der Zweck der elektronischen Schaltung ist ein Zweifacher. Erstens erlaubt sie ein Variieren des Potentials von der Lösung zum elektrischen Kontakt zum Silicium. Zweitens wandelt sie einen lichterzeugten Wechselstrom in eine Wechselspannung (das Ausgabesignal) um. U2A ist als konventioneller Spannungsfolger konfiguriert, wodurch das Bezugselektrodenpotential gepuffert wird. U1 ist eine digital gesteuerte zweipolige Stromquelle. Eine Verbindung zwischen den Anschlüssen 18 und 19 bildet eine Stromschleife. Das Vorzeichen und die Größe des Stromes in dieser Schleife werden durch das digitale Wort gesteuert, das an die Anschlüsse 1 bis 13 angelegt wird. Das Potential an den Anschlüssen 18 und 19 ist gegen die Erde potentialfrei. Wie sie in der Schaltung konf iguriert ist, erlaubt die Kombination von U1 und U2A, daß die Spannung an Anschluß 5 von U2B gegenüber der an Anschluß 3 von U2A versetzt ist. Das Vorzeichen und die Größe dieses Spannungsunterschieds werden durch das an U1 angelegte digitale Wort und die Werte von R1 und R2 bestimmt. U2B wird sowohl als Spannungsfolger verwendet, um über R3 und R4 eine bekannte versetzte Spannung an das Silicium anzulegen, als auch als Strom-Spannungs-Umwandler, um den Photowechselstrom in eine Wechselspannung an Anschluß 7 umzuwandeln. Der Signalzuwachs von U2B wird durch R3 bestimmt. R4 wird verwendet, um die Impedanz der Schaltung an die des Sensors anzugleichen. Man läßt die Spannung zwischen Silicium und Lösung einen Wertebereich durchlaufen, indem an U1 eine Reihe portionsweise zunehmender Wörter angelegt wird. Die Signalamplitude (Photowechselstrom) wird an Anschluß 7 von U2B als Funktion des zwischen Lösung und Silicium angelegten Potentials abgelesen.
Lebende Zellen können auf vielerlei Art an die Kammer angeheftet werden. Wie in Figur 7 gezeigt, kann man natürlich haftende Zellen in einem Inkubator entweder auf der Oberfläche des Siliciumsensors oder des Deckglases wachsen lassen oder beides. Die Fließkammer wird zusammengesetzt, während die Zellen feucht gehalten werden. Ein Fluß wird rasch erzeugt, damit die Zellen das Medium nicht übersäuern oder den ganzen Sauerstoff in der Kammer verbrauchen. Nichthaftende Zellen können bei 37ºC mit einer Agaroselösung gemischt und in einer feuchten Atmosphäre in einer ungefähr 50 um dicken Schicht auf die Oberfläche des Siliciumsensors oder Deckglases aufgestrichen werden. Der Siliciumsensor wird dann etwa 15 min gekühlt, so daß die Agarose fest wird. Dann wird die Fließkammer zusammengesetzt und verwendet.
In Verbindung mit oder anstelle von Agarose können auch Collagen und Gelatine verwendet werden. Fibronectin, Chondronectin, Laminin oder andere ähnliche Substanzen können gegebenenfalls zum Anheften der lebenden Zellen an die Oberfläche der Mikrofließkammer verwendet werden. Alternativ dazu können die lebenden Zellen an oder in biologisch verträglichen Mikroträgerkügelchen dispergiert werden.
In einer anderen Ausführungsform können Zellen an oder in einer porösen Membran gezüchtet werden. Diese Membran kann zwischen der Steuerelektrode und der Sensoroberfläche in die Fließkammer eingesetzt werden, so daß Kulturmedium entlang wenigstens einer Seite der Membran fließt. Manche Zellen, wie Epithelzellen, bilden eine Monoschicht mit unterschiedlichen apikalen und basolateralen Flächen. In solchen Fällen können die Eigenschaften beider Seiten der Zellplatte getrennt untersucht werden, indem man steuert, welche Seite der Membran näher an der Sensoroberfläche ist.
Das im allgemeinen bevorzugte Verfahren der Erfindung kann wie folgt durchgeführt werden. Die Kammer wird mit darin zurückgehaltenen lebenden Zellen zusammengesetzt und an die Fließvorrichtungen in dem Instrument angeschlossen. Ein Fluß (typischerweise 100 ul/min) einer Lösung oder Suspension mit geringer Pufferkapazität wird in Gang gesetzt, und man läßt das Signal von dem Sensor sich stabilisieren. Ein normales Zellkulturmedium kann verwendet werden, einschließlich Serum, falls gewünscht, außer daß Hydrogencarbonat und Puffer wie HEPES ausgeschlossen sein sollten. Anfangs beobachtet man eine Drift aufgrund der Erwärmung der Kammer und der Äquilibrierung der Kammer mit dem neuen Medium. Einmal stabil, wird der Fluß in der Kammer angehalten, und das Siliciumsensorsignal wird überwacht. Eine Abnahme des Potentials spiegelt die Abnahme des pH-Werts in der Kammer aufgrund des Zellstoffwechsels wider. Die Geschwindigkeit oder Steigung der pH-Abnahme ist ein Maß für die Stoffwechselrate der Zellen. Man läßt den pH-Wert weit genug abfallen, so daß genügend Datenpunkte erhalten werden, um die Steigung der Geraden genau zu bestimmen (innerhalb eines Fehlerbereichs von wenigen Prozent). Typischerweise bedeutet dies einen pH-Abfall von ungefähr 0,1 bis 0,5 pH-Einheiten und erfordert ungefähr 1 bis 4 Minuten. Dann wird der Fluß wieder gestartet, und der pH kehrt zu seinem Anfangswert zurück. Diese Folge wird wiederholt, bis man reproduzierbare Steigungen erhält. Eine typische Bestimmung einer Stoffwechselrate ist in Figur 10 gezeigt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform läßt man Medium kontinuierlich über die Zellen fließen, und das Potential wird an mehreren Stellen gemessen. Wenn sich eine Stelle stromaufwärts der Richtung des Flusses von einer anderen befindet und es sind Zellen dazwischen, so gibt es einen pH-Unterschied zwischen den beiden Stellen, wobei die stromaufwärts gelegene Stelle weniger sauer ist. Dieser pH-Unterschied geht zurück auf die Stoffwechselwirkung der Zellen auf das Medium, während es den Raum zwischen den Stellen durchquert. Die Größe dieses pH-Unterschieds, wie sie mit der Silicium-Halbleiterelektrode nachgewiesen wird, ist ein Maß für die Stoffwechselrate der zwischen den beiden Stellen befindlichen Zellen.
Zum Testen zellbeeinflussender Mittel können zwei Strategien mit Vorteil eingesetzt werden. Bei dem einen Ansatz werden zwei Spritzenantriebe verwendet. Zuerst werden die Stoffwechselraten mit einem Kontrollmedium bestimmt, wie oben beschrieben. Dann wird der Spritzenantrieb mit dem Kontrollmedium abgestellt, und ein Spritzenantrieb mit dem gleichen Medium plus dem zellbeeinflussenden Mittel wird angestellt. Ein geeignetes Umschaltventil richtet den Fluß von dem einen oder anderen Spritzenantrieb in die Fließkammer. Dann werden Messungen der Stoffwechselrate in Gegenwart des zellbeeinflussenden Mittels vorgenommen. Der Fluß kann zum Kontrollmedium zurückgeschaltet werden, um die Erholung der Zellen von der Wirkung des zellbeeinflussenden Mittels zu beobachten.
In einem zweiten Ansatz wird ein Injektionsschleifenventil verwendet. Stoffwechselraten werden bestimmt wie oben beschrieben. Sobald sie stabil sind, wird das zellbeeinflussende Mittel in die Injektionsschleife eingeführt, und das Ventil wird so gedreht, daß das zellbeeinflussende Mittel in den fließenden Mediumstrom eingeführt wird. Dann können Stoffwechselraten in Gegenwart des zellbeeinflussenden Mittels gemessen werden und können verfolgt werden, nachdem das Mittel aus der Kammer ausgespült worden ist. Diese Technik ist besonders zum Testen von Zellreaktionen auf eine kurze Einwirkung zellbeeinflussender Mittel geeignet.
Wenn die zu verwendenden lebenden Zellen nicht natürlich oder spontan an einer Oberfläche der Mikrofließkammer haften, müssen Mittel verwendet werden, um die Zellen in der Kammer zurückzuhalten. Drei wünschenswerte Möglichkeiten, dieses Ergebnis zu erzielen, sind das Bereitstellen von Vertiefungen, die die Zellen physikalisch zurückhalten können, das Bereitstellen eines Kompartiments in der Mikrofließkammer, das die Zellen mittels einer Membran, die porös oder für das zellbeeinflussende Mittel in der Lösung oder Suspension durchlässig ist, zurückhält, sowie die Verwendung biologisch verträglicher Haftmittel.
In der Ausführungsform, bei der Vertiefungen verwendet werden, wie in Figur 8 gezeigt, enthält der Boden der Fließkammer die Vertiefungen. Die Vertiefungen können einen kreisförmigen Querschnitt haben oder können Gräben sein, die senkrecht zur Fließrichtung ausgerichtet sind. Die kleinste horizontale Abmessung der Vertiefungen sollte wenigstens einen Zelldurchmesser und vorzugsweise nicht mehr als einige Zelldurchmesser betragen. Die Tiefe der Vertiefungen kann mehrere Zelldurchmesser betragen. Vertiefungen mit einem Durchmesser von 50 um und einer Tiefe von 50 um sind annehmbar. Die Verwendung von Vertiefungen, um die Zellen zurückzuhalten, ist gut für die Analyse mehrerer Zellchargen geeignet, wobei der folgende Cyclus von OPerationen verwendet wird.
Der erste Schritt ist das Einfüllen von Zellen in die Vertiefungen. Bei ausreichend geringen Fließgeschwindigkeiten setzen sich die Zellen in die Vertiefungen ab und werden darin festgehalten.
Dann wird das Verhalten der Zellen analysiert. Die Zusammensetzung des über die Vertiefungen fließenden Mediums kann nach der gewünschten Analysevorschrift verändert werden. Verbindungen aus dem Medium erreichen die Zellen in den Vertiefungen durch eine Kombination von Diffusion und Konvektion.
Schließlich werden die Zellen aus den Vertiefungen ausgespült. Bei ausreichend hohen Fließgeschwindigkeiten der Flüssigkeit wird das Wirbelverhalten in den Vertiefungen stark genug, um ein erneutes Suspendieren und Ausspülen der Zellen aus den Vertiefungen und aus der Kammer heraus zu bewirken. Dadurch wird die Kammer für die nächste Beschickung mit frischen Zellen gereinigt.
Das Vertiefungsverfahren hat wenigstens zwei wichtige Vorteile. Erstens ist das Verfahren der Immobilisierung nichtstörend. Zweitens läßt sich das System leicht automatisieren, so daß man wiederholte Analysen frischer Zellchargen in derselben Mikrofließkammer erhält.
In der Ausführungsform, bei der biologisch verträgliche Haftmittel verwendet werden, können nichthaftende Zellen in einer sehr dünnen (vorzugsweise 50 um dick) Agaroseschicht, die den Boden einer Fließkammer mit einer Gesamttiefe von 100 um und einer Fläche von etwa einem cm² bedeckt, in der Fließkammer zurückgehalten werden. Medium fließt durch die 50 um weite Lücke, die zwischen der Decke der Kammer und der Oberseite der Agaroseschicht verbleibt.
Die geringe Dicke der Agaroseschicht erlaubt einen schnellen und praktisch ungehinderten Zugang der immobilisierten Zellen zu den Komponenten des über die Agarose fließenden Mediums. Der Transport zwischen den Zellen und dem fließenden Medium erfolgt durch Diffusion. Für die meisten gelösten Stoffe sind Diffusionszeiten in der Größenordnung von einer bis zehn Sekunden zu erwarten.
Die Vertiefungen, die die Zellen zurückhalten, werden vorzugsweise auf der Oberfläche der Silicium-Halbleiterelektrode oder des Siliciumsensors gebildet. Sie können als Einkerbungen in der Oberfläche der Elektrode oder durch Aufbringen einer Gitterstruktur auf die obere Fläche der Elektrode gebildet werden. Die Gitterstruktur besteht vorzugsweise aus einem elektrisch kompatiblen Halbleitermaterial, z.B. Silicium, kann aber auch aus elektrisch neutralen Materialien bestehen. Zum Beispiel kann ein Nylongeflecht, das aus Fäden mit einem Durchmesser von 25 um besteht, die unter Bildung von 25 um großen quadratischen Löchern miteinander verwoben sind, mit einem Sprühkleber auf die Oberfläche der Silicium-Halbleiterelektrode geklebt werden. Der Kleber bildet weit verteilte feine Tröpfchen auf der Siliciumelektrode und befestigt das Nylongeflecht daher nur an wenigen diskreten Punkten an der Oberfläche. Auf diese Weise kann das Nylongeflecht an der Siliciumelektrode befestigt werden, ohne die Siliciumelektrode ganz mit Kleber zu überziehen und dadurch die Lichtempfindlichkeit der Elektrode zu zerstören.
Bei haftenden Zellen können Siliciumoberflächen ohne Muster hergestellt werden, indem man zuerst einen dünnen (30 nm) thermalen SiO&sub2;-Film wachsen läßt, auf dem dann 100 nm Si&sub3;N&sub4; durch chemisches Aufdampfen bei niedrigem Druck abgeschieden werden. Der erste Schritt bei der Herstellung des mikromaschinell bearbeiteten Sensors zur Verwendung mit nichthaftenden Zellen besteht darin, eine 1 um dicke SiO&sub2;-Schicht durch Dampfoxidation wachsen zu lassen, wobei anschließend unter Bildung von Öffnungen, wo sich die Hohlräume befinden werden, photolithographisch ein Muster aufgebracht wird. Die Hohlräume werden dann in einem SF&sub6;/C&sub2;ClF&sub5;-Plasma anisotrop geätzt, wobei Hohlräume mit Seitenwänden in einem Winkel von > 85º zur Horizontalen gebildet werden. Die letzten Schritte bei dem Verfahren sind das Wachsenlas sen des dünnen Oxids und die Abscheidung des Nitrids wie in dem Fall ohne das Muster. Die mikromaschinell bearbeiteten Sensoren haben also eine dicke Oxidschicht auf den Bereichen zwischen den Hohlräumen, so daß die Sensorfähigkeit dort effektiv desaktiviert wird. Die aktiven Sensorflächen sind nur die Innenwände und der Boden der Hohlräume, was das Signal-Rausch- Verhältnis dieser Version der Vorrichtung verbessert.
Die Vorrichtung weist das Oberflächenpotential an der Grenzfläche zwischen dem Elektrolyten und dem Si&sub3;N&sub4;-Isolator nach. Die Gegenwart protonierbarer Silanol- und Aminogruppen an dieser Fläche gewährleistet, daß dieses Potential in Nernstscher Weise vom PH-Wert abhängt. Der pH-Wert wird nur an Teilen der Grenzfläche nachgewiesen, die beleuchteten Siliciumbereichen entsprechen.
Die vorliegende Erfindung kann mit einer großen Vielzahl prokaryontischer und/oder eukaryontischer Zellen verwendet werden. Beispiele für solche Zellen sind Human-Keratinocyten, Mäuse-L- Fibroblasten, Hunde-MDCK-Epithelzellen, Hamster-BHK-Fibroblasten, Mäuse-CTLL-Lymphocyten, Tumorzellen und Bakterien. Im allgemeinen können alle lebenden Zellen einschließlich transfizierter Zellen, die erfolgreich in einer Mikrofließkammer zurückgehalten werden können, verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung kann mit einer großen Vielzahl von zellbeeinflussenden Mitteln verwendet werden. Beispiele für solche zellbeeinflussenden Mittel sind Reizstoffe, wie Benzalkoniumchlorid, Propylenglycol, Methanol, Aceton, Na-Dodecylsulfat, Wasserstoffperoxid, 1-Butanol, Ethanol und DMSO; Medikamente, wie Valinomycin, Doxorubicin, Vincristin, Ribavirin, Amilorid und Theophyllin; Hormone, wie T&sub3; und T&sub4;, Epinephrin und Vasopressin; Toxine, wie Cyanid, Carbonylcyanid, Chlorphenylhydrazon, Endotoxine und bakterielle Lipopolysaccharide; immunologische Mittel, wie Interleukin-2, Epidermis-Wachstumsfaktor und monoklonale Antikörper; Rezeptoragonisten, wie Isoproterenol, Carbachol, Prostaglandin E&sub1; und Atropin; sowie verschiedene andere Typen zellbeeinflussender Mittel, wie Phorbolmyristatacetat, Magnesiumchlorid, andere Zellen, Rezeptorliganden, Viren, Pathogene und Pyrogene. Diese Erfindung umfaßt auch die Messung der Wirkungen wasserimmergierbarer zellbeeinflussender Mittel, wie teilchenförmiger Stoffe, Fette und Öle, auf Zellen. Diese Substanzen können durch wäßrige oder nichtwäßrige Flüssigkeiten in die Nähe von Zellen gebracht werden.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet Verfahren zum Identifizieren von Mikroben, wie Hefe, Bakterien und Pilze. Bei diesen Verfahren der Erfindung werden die zu identifizierenden Bakterien in der Fließkammer festgehalten oder zurückgehalten. Eine vorbestimmte Menge von Lösungen und/oder Suspensionen läßt man dann nacheinander durch die Mikrofließkammer fließen, so daß sie mit den Bakterien in Kontakt kommen. Jede dieser Lösungen und/oder Sus-Pensionen enthält einen Bestandteil, der eine bestimmte Reaktion eines bekannten Bakteriums hervorruft. Wenn die Lösung und/oder Suspension, die diesen Bestandteil enthält, mit zu identifizierenden Bakterien in Kontakt gebracht wird, zeigen die Bakterien in der Mikrofließkammer entweder eine charakteristische Reaktion, oder sie zeigen keine Reaktion. Die Reaktion oder fehlende Reaktion wird dann mit der Silicium-Halbleiterelektrode gemessen. Die Reaktion oder fehlende Reaktion auf die vorbestimmte Menge von Lösungen und/oder Suspensionen kann dann mit der Reaktion bekannter Bakterien auf die vorbestimmte Menge von Lösungen und/oder Suspensionen verglichen werden, um die getesteten Bakterien positiv zu identifizieren.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Verfahren zum Durchmustern auf die Wirkung eines Medikaments hin. Bei diesen Verfahren der Erfindung werden lebende Zellen, die auf das Medikament, auf das hin durchmustert werden soll, ansprechen, in der Mikrofließkammer festgehalten oder zurückgehalten. Eine Lösung oder Suspension, von der man annimmt, daß sie das Medikament enthält, kann man dann in innigem Kontakt mit diesen lebenden Zellen fließen lassen. Beim Kontakt mit den lebenden Zellen wird die Lösung oder Suspension, von der man annimmt, daß sie das Medikament enthält, bei den lebenden Zellen eine Reaktion hervorrufen oder keine Reaktion hervorrufen. Diese Wirkung oder fehlende Wirkung des Medikaments auf die lebenden Zellen wird dann mit der Silicium-Halbleiterelektrode gemessen. Solche Medikamente können Antibiotika umfassen, die gegen Mikrobenzellen aktiv sind. Die Anwesenheit oder Abwesenheit der erwarteten Wirkung kann als Mittel verwendet werden, um Lösungen oder Suspensionen auf die Gegenwart eines Medikaments hin zu durchmustern.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Verfahren zum Nachweis toxischer Substanzen. Bei diesen Verfahren der Erfindung werden lebende Zellen, die auf die toxische Substanz, auf die getestet wird, ansprechen, in der Mikrofließkammer festgehalten oder zurückgehalten. Die Lösung oder Suspension, von der man annimmt, daß sie die toxische Substanz enthält, läßt man dann in innigem Kontakt mit den lebenden Zellen fließen. Jede Reaktion oder fehlende Reaktion der lebenden Zellen auf die Lösung oder Suspension wird gemessen, wodurch man ein Mittel zum Nachweis der Gegenwart der angenommenen toxischen Substanz erhält.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Verfahren zum Nachweis interzellulärer Reaktionen. Bei diesen Verfahren der Erfindung werden zwei Gruppen lebender Zellen in der Mikrofließkammer bereitgestellt. Eine Lösung oder Suspension, die ein Mittel enthält, das die erste Gruppe von Zellen beeinflußt, läßt man durch die Mikrofließkammer fließen. Dies bewirkt, daß die erste Gruppe von Zellen ein zweites zellbeeinflussendes Mittel erzeugt. Das zweite zellbeeinflussende Mittel bewirkt wiederum eine Reaktion bei der zweiten Gruppe lebender Zellen. Diese Reaktion wird mit der Silicium-Halbleiterelektrode gemessen. Auf diese Weise können die interzellulären Reaktionen verschiedener Gruppen lebender Zellen gemessen werden. Die erste und zweite Gruppe von Zellen können vom selben Typ oder von unterschiedlichen Typen sein.

Beispiel 1

Keratinocyten sind die Zellen, die die Epidermis bilden. Untersuchungen wurden durchgeführt, um die Reaktion dieser Zellen auf Reizstoffe zu bewerten, die am Arbeitsplatz, in Kosmetika und sonstwo mit der Haut in Kontakt kommen könnten. Shopsis und Eng (Shopsis, C. und Eng, B. (1988) in Alternative Methods in Toxicology, Vol. 6) bestimmten zum Beispiel die Konzentration eines Reizstoffes, die notwendig ist, um bei einer 48stündigen Inkubation von Keratinocyten mit dem Reizstoff die Proteinsynthese um 50% zu hemmen. Die nach diesem Verfahren erhaltene Rangfolge einer Reihe von Tensidreizstoffen stimmte gut mit den Rangfolgen überein, die nach dem Standard-in-vivo-Draize-Test der Augenreizung erhalten wurden (Draize, J., Woodard, G. und Clavery, H. (1944) J. Pharmacol. Exp. Ther., 82:377-390).
Normale humane Keratinocyten wurden von Clonetics, Inc. (San Diego, CA) erhalten und nach den Anweisungen des Händlers kultiviert. Die Zellen wurden auf den leitenden Indiumzinnoxidflächen der in der Zellenfließkammer verwendeten Deckgläser bis zu einer Konfluenz von zwischen 50% und 100% wachsen gelassen. Die getesteten Reizstoffe waren Benzalkoniumchlorid (BAC; ein kationisches Tensid), Wasserstoffperoxid (H&sub2;O&sub2;), 1-Butanol (BuOH), Ethanol (EtOH), Dimethylsulfoxid (DMSO), Propylenglycol, Methanol, Aceton und Natriumdodecylsulfat.
Das Deckglas wurde in die Kammer eingebaut, und das Fließen des Mediums wurde eingeleitet. Clonetics lieferte zu diesem Zweck eine niedriggepufferte Modifikation ihres Keratinocyte Growth Medium; es enthielt weder Hydrogencarbonat noch HEPES-Puffer.
Das Fließen des Mediums wurde mit einer an einen Computer angeschlossenen Spritzenpumpe gesteuert. Der Fluß war abwechselnd 200 s lang an und 200 s lang aus. In der Zeit des abgeschalteten Flusses wurde die Stoffwechselrate als Steigung der Kurve des Sensorpotentials (d.h. des pH-Werts) gegen die Zeit bestimmt.
Die Reizstoffe wurden zu Beginn einer Phase mit angeschaltetem Fluß über eine 300-ul-Probeninjektionsschleife (des bei der Flüssigchromatographie verwendeten Typs) injiziert.
Die Fließgeschwindigkeiten in der Größenordnung von 100 ul/min wurden so eingestellt, daß der Reizstoff während der nächsten Phase mit abgeschaltetem Fluß in der Zellenkammer zugegen war, bis zur zweiten Phase mit abgeschaltetem Fluß jedoch ausgespült worden war. Typischerweise wurden Proben in Abständen von 800 s injiziert, was zwei Bestimmungen von Stoffwechselraten für jede Injektion erlaubte (eine mit vorhandenem Reizstoff, eine nach dessen Ausspülung).
Nachdem sich in Abwesenheit von Reizstoffen eine stabile Stoffwechselrate aufgebaut hatte, wurden wie oben beschrieben Reizstoffe injiziert, wobei man von niedriger zu hoher Konzentration überging. Häufig gab es für jede Konzentration zwei Injektionen. Ein ganzes Experiment dauerte drei bis fünf Stunden, obwohl eine Reaktion auf jede Reizstoffdosis 400 s nach der Probeninjektion erhalten wurde. Zur Kontrolle wurden die Stoffwechselraten einer Gruppe von Keratinocyten, denen keine Reizstoffe verabreicht wurden, über mehrere Stunden gemessen.
Die Stoffwechselrate der Kontrollzellen blieb während des ganzen Experiments stabil mit einem Variationskoeffizienten von etwa 6%. Figur 11 zeigt die Ergebnisse für fünf der Reizstoffe, aufgetragen als Stoffwechselrate gegen den Logarithmus der Reizstoffkonzentration. Die Stoffwechselrate ist als Prozent des Wertes vor der Einführung von Reizstoff ausgedrückt. Wenn zwei aufeinanderfolgende Dosen mit derselben Konzentration verabreicht wurden, sind beide Gruppen von Daten angegeben. Die großen Unterschiede in solchen Punkten bei z.B. 30 ug/ml BAC stellen eine reale Abnahme der Zellstoffwechselrate zwischen den beiden Verabreichungen dar, nicht nur eine Streuung in den Daten. Die tatsächliche Konzentration von H&sub2;O&sub2; kann aufgrund von Redoxreaktionen mit Verbindungen im Medium sowie Disproportionierungsreaktionen geringer gewesen sein als angegeben. Bei einigen Reizstoffen stieg die Stoffwechselrate über das Kontrollniveau für Reizstoffkonzentrationen gerade unterhalb von denen, die ausreichten, um den Stoffwechsel zu hemmen.
Figur 12 ist ein Vergleich von Messungen, die in Gegenwart des Reizstoffes und nach dem Ausspülen vorgenommen wurden. Die ausgefüllten Symbole stellen Raten dar, die in Anwesenheit der Reizstoffe bei den Zellen erhalten wurden; die nicht ausge füllten Symbole entsprechen den Raten, die erhalten wurden, unmittelbar nachdem die Reizstoffe ausgespült worden waren. Bei einem Reizstoff, BAC, wurde keine Erholung erhalten; nach den höheren Dosen nahm der Stoffwechsel tatsächlich weiterhin mit jeder Messung ab. Bei EtOH gab es eine wesentliche Erholung. In einem getrennten Test wurde eine Erholung von DMSO, jedoch nicht von Ethanol gezeigt (siehe Figur 13).
Für die Reizstärken dieser Verbindungen wurde anhand von in-vivo- Tests, wie dem Draize-Test (siehe z.B. Dubin, H. und Ghodgaonkar, R. (1987) In Vitro Toxicology, 1:233-240), die folgende Klassifizierung vorgenommen: Tabelle I Reizstoff in-vivo-Reizung -log&sub1;&sub0;(MRD&sub5;&sub0;) Dimethylsulfoxid Propylenglycol Ethanol Aceton n-Butanol Benzalkonium-Cl schwach mäßig-schwach mäßig stark
Die Rangfolge der oben als -log&sub1;&sub0;(MRD&sub5;&sub0;) gezeigten Konzentrationen, die notwendig sind, um den Stoffwechsel zu unterdrücken, stimmen in diesem Beispiel gut mit der durch in-vivo-Tests erhaltenen überein.
Das Verfahren der Erfindung erlaubt eine flexible Steuerung sowohl der Dauer als auch der Konzentration der Einwirkung der Reizstoffe auf die Zellen. Weiterhin erlaubt es eine Überwachung der Wirkungen dieser Mittel auf den Zellstoffwechsel sowohl, während die Reizstoffe mit der Zelle in Kontakt sind, als auch dann später, nachdem die Reizstoffe ausgespült wurden. So kann die Kinetik der Erholung von der Schädigung zusammen mit der Hauptinhibitionsanalyse bestimmt werden.
Dieses Beispiel zeigt die Möglichkeit, mit dem Verfahren der Erfindung schnelle toxikologische in-vitro-Assays durchzuführen. Reaktionen auf akute Einwirkungen wurden in wenigen Minuten erhalten. Eine weitere Automatisierung und Ausnutzung paralleler Verarbeitung würde die Zeit für ein ganzes Experiment auf diese Zeitspanne herabsetzen. Dies ist ein erheblicher Vorteil in bezug auf Geschwindigkeit und Möglichkeiten gegenüber bestehenden in-vitro-Verfahren.

Beispiel 2

Valinomycin ist ein Peptidantibiotikum, das seine Wirkungen ausübt, indem es sich in Zellmembranen einschiebt und sie für Kaliumionen durchlässig macht. Es wird gewöhnlich in Forschungsanwendungen verwendet, bei denen eine Membrandurchlässigkeit für Ionen wichtig ist. Innerhalb von nicht mehr als ein paar Minuten nach der Einwirkung von 100 uM Valinomycin steigt die Stoffwechselrate von L-Zellen signifikant an; ihr Spitzenwert kann mehr als das Doppelte des Anfangswerts betragen. Nach dem Spitzenwert fällt die Rate ab.
Figur 14 zeigt die Reaktion auf einen kurzen Valinomycinpuls gemäß dem Verfahren der Erfindung (75 ul in den Mediumstrom injiziert; Fließgeschwindigkeiten etwa 100 ul/min). Ähnliche Ergebnisse sind in Figur 15 gezeigt. In anderen Experimenten (Kurve nicht gezeigt) wurde dieselbe Valinomycinkonzentration 8 Minuten lang kontinuierlich verabreicht, und die Stoffwechselaktivität stieg vier Minuten nach dem Beginn der Einwirkung auf einen Spitzenwert von ungefähr 2,4mal dem Anfangswert. Innerhalb von 20 Minuten nach dem Entfernen des Antibiotikums kehrte sie ungefähr auf den Anfangswert zurück. Diese zweiphasige Reaktion kann einen anfänglichen Aufwand an Zellstoffwechselenergie bedeuten, um zu versuchen, eine Elektrolythomöostase aufrechtzuerhalten, gefolgt von den toxischen Auswirkungen des Versagens der Zelle, dies zu erreichen.

Beispiel 3

L-Zellen wurden auf der Siliciumsensorfläche der Fließkammer bis zur Konfluenz wachsen gelassen und abwechselnd mit normalem Medium und Medium, das jeweils 10 nM der Schilddrüsenhormone Triiodthyronin (T&sub3;) und Thyroxin (T&sub4;) enthielt, perfundiert. In einem Experiment stieg die Stoffwechselrate zuerst, als das Hormon eingeführt wurde, um 12% und fiel auf 9% unter das Anfangsniveau, als das Hormon wieder entzogen wurde. Dies ist im Einklang mit der Erwartung, daß das Hormon die Gesamtstoffwechselaktivität der Zellen erhöht.

Beispiel 4

Phorbolmyristatacetat (PMA) ist einer der tumorfördernden Phorbolester. Zu seinen Wirkungen gehören eine Erhöhung der zellulären Konzentration an cyclischem AMP und die Deacylierung von Phospholipiden unter Bildung von Arachidonsäure; man weiß, daß es mit Protein-Kinase C wechselwirkt (siehe z.B. Daniel, L. (1985) Phosphatidylinositol Turnover in MDCK Cells, in Inositol and Phosphoinositides: Metabolism and Regulation, (Hrsg.) Bleasdale, J., Eichberg, J. und Hauser, G, Humana Press) MDCK-Zellen (Madin-Darby Canine Kidney) sind eine epithelische Linie, die viele der funktionellen Merkmale von Nierenkanälchen- Epithelen behalten. Ein Merkmal ist, daß eine konfluente Monoschicht dieser Zellen eine relativ dichte Abdichtung bildet, sowohl elektrisch als auch in bezug auf die Diffusion von Ionen, so daß sie die wäßrigen Bereiche auf den beiden Seiten der Zellen voneinander trennen.
Diese Abdichtungseigenschaft der MDCK-Zellen bringt es mit sich, daß das Signal, wenn man die Zellen auf der Oberfläche des Si1iciumsensors wachsen läßt, nicht unbedingt nur den pH-Wert der Flüssigkeit in der Fließkammer darstellt. Es enthält Informationen über den pH-Wert des kleinen wäßrigen Kompartiments zwischen den Zellen und dem Sensor, und es enthält Informationen über transzelluläre Potentiale, bei denen es sich im wesentlichen um Zellen in Reihe mit der elektronischen Schaltung des Sensors handelt. Bei Zellen, die keine dichte Abdichtung bilden, ist der subzelluläre pH-Wert im wesentlichen identisch mit dem PH-Wert der Fließkammerflüssigkeit, und alle transzellulären Potentiale werden, was den Sensor betrifft, kurzgeschlossen.
Figur 16 zeigt die starke und schnelle Reaktion, die beobachtet wurde, als Medium, das 10 ng/ml PMA enthielt, in das System eingeführt wurde. Das von dem Sensor gemeldete stationäre Potential (mit eingeschaltetem Fluß der Flüssigkeit) nahm von dem Zeitpunkt an, als der Sensor aktiviert wurde, allmählich ab, bis das PMA eingeführt wurde. Zu diesem Zeitpunkt fiel es rasch auf ein Minimum vierzig Minuten später, als das PMA entfernt wurde, dann stieg es an und kehrte schließlich am Ende des Experiments zu einem Wert in der Nähe seines Anfangswerts zurück. Dieses Signal ist aus dem transzellulären Potential und dem subzellulären pH- Wert zusammengesetzt (wobei die Änderungen des letzteren 59 mV pro pH-Einheit entsprechen).
Die Einführung von PMA fiel mit einem scharfen Anstieg der Stoffwechselrate der Zellen zusammen, auf der Spitze fast eine Stunde später auf mehr als das Doppelte. Ähnliche Experimente mit MDCK- Zellen, die auf der Deckglasoberfläche der Kammer gezüchtet wurden, ergeben keine Informationen über transzelluläre Potentiale, zeigen aber ebenfalls bei Zugabe von PMA eine Erhöhung der Stoffwechselrate (Daten nicht gezeigt).
Die Stoffwechselraten, die von Zellen bestimmt wurden, die auf der Sensoroberfläche gezüchtet wurden, sind gegenüber der Behandlung der Zellen empfindlicher und im allgemeinen weniger stabil als die von Zellen, die auf den Deckgläsern gezüchtet wurden. Dies läßt sich anhand der Tatsache verstehen, daß das Volumen des subzellulären wäßrigen Kompartiments im Vergleich zu dem Volumen der Kammer klein ist; kleine Veränderungen beim Transport von Kohlendioxid und Protonen durch Zellmembranen können in kleineren Volumina größere pH-Änderungen bewirken.
Die Wirkungen von PMA auf das stationäre Potential sind besonders interessant im Lichte der Tatsache, daß PMA bekanntermaßen die festen Verbindungen zerstört, die für die Ohmsche Versiegelung zwischen diesen Zellen verantwortlich sind. Man würde daher erwarten, daß PMA die Wirkungen transzellulärer Potentiale kurzschließt und die Zusammensetzung des subzellulären Raums mehr der der allgemeinen Fließkammerflüssigkeit angleicht.

Beispiel 5

Cyanid (CN&supmin;) ist ein Anion, das an das Sauerstoffbindungszentrum von Cytochrom-Oxidase bindet und den Elektronentransport hemmt (wodurch es die Zellatmung hemmt). Zellen werden glycolytisch, nachdem sie CN ausgesetzt worden sind. L-Zellen (eine Mäuse- Fibroblasten-Zellinie) wurden auf der Siliciumsensorfläche der Fließkammer bis zur Konfluenz wachsen gelassen und einer Injektion von 100 uM Natriumcyanid ausgesetzt. Innerhalb von Minuten stieg die Stoffwechselrate auf 39% über die Rate, als die Verbindung eingeführt wurde, und dann begann die Rate allmählich abzunehmen. Zu diesem Zeitpunkt waren die Zellen rund geworden und begannen abzusterben.

Beispiel 6

BHK-Zellen (eine Fibroblasten-Linie aus Babyhamsternieren) wurden auf der Siliciumsensorfläche der Fließkammer wachsen gelassen und abwechselnd mit normalem Medium und Medium, das 0,6 oder 0,06 E U. bakterielles Lipopolysaccharid-Endotoxin enthielt, perfundiert. Wie in Figur 17 gezeigt, führte die Einführung von 0,06 E.U. Endotoxin (mit 0,001% BSA als Proteinträger) zu einer 31- bis 36%igen Erhöhung der Stoffwechselrate gegenüber der Rate, die erhalten wurde, wenn sich die Zellen nur in Gegenwart von Medium befanden (Kontrollwert). Die Stoffwechselrate blieb unverändert (in bezug auf die Rate, die beobachtet wurde, wenn sich die Zellen nur in Gegenwart von Medium befanden), wenn Medium mit 0,001% BSA (Rinderserumalbumin) oder Medium mit 0,01% BSA plus 0,6 E.U. Endotoxin eingeführt wurde. Dieses Ergebnis kann eine zweiphasige Reaktion von BHK-Zellen auf Endotoxin widerspiegeln. Dies findet man häufig bei rezeptorvermittelter Stimulation von Zellen. Eine niedrige Dosis von Stimulans ergibt eine Reaktion, während eine sehr hohe Dosis keine Reaktion oder eine zu der bei einer niedrigen Dosis entgegengesetzte Reaktion ergibt.

Beispiel 7

Amilorid ist ein diuretisches Medikament, das ausgedehnt als Inhibitor des Na&spplus;-Kanals transportierender Epithelzellen, die sich in der Niere und der Krötenblase befinden, verwendet wird. Taub et al. zeigten, daß die MDCK-Zellinie einen amiloridempfindlichen Na&spplus;-Kanal besitzt, der für die Zellen charakteristisch ist, die sich im distalen Nierenkanälchen befinden (J. Cellular Physiology, 106:191-199 (1981)). Wenn MDCK-Zellen auf dem Deckglasteil der Fließkammer gezüchtet wurden, führte die Einführung von 1,5 mM Amilorid zu einer allmählichen Zunahme der Stoffwechselrate bis zu 16% über die Rate, die nur für Medium beobachtet wurde. Sobald die Einwirkung des Medikaments beendet wurde, kehrte die Rate auf den ursprünglichen Kontrollwert zurück und nahm dann allmählich weiter ab.
Wenn MDCK-Zellen auf der Siliciumsensorfläche der Fließkammer gezüchtet wurden, führte die Einführung von 1,5 mM Amilorid zu einer unmittelbaren 20%igen Abnahme der scheinbaren Stoffwechselrate gegenüber der Rate, die in Gegenwart nur von Medium beobachtet wurde.
Die Interpretation der an MDCK-Zellen gewonnenen Daten wurde durch die Tatsache erschwert, daß die Zellen, während die Zellatmung das Medium saurer machte (nachdem der Mediumfluß gestoppt worden war), auf die pH-Änderung reagierten, was zu einer Änderung der ursprünglichen Stoffwechselrate führte, auf die die Zellen ebenfalls reagieren konnten. Diese komplizierte Zellreaktion führte zu einer mehrphasigen Kurve, wenn der Mediumfluß eine zeitlang gestoppt wurde. Im Falle, daß die Zellen auf der Siliciumsensorfläche gezüchtet wurden, war dieses Phänomen besonders dramatisch.

Beispiel 8

Es wurde gezeigt, daß Theophyllin (ein Diuretikum, Herzstimulans und Relaxans der glatten Muskulatur) Phosphodiesterase hemmt, was zu einer Erhöhung der Menge von cAMP in der Zelle führt. Wenn MDCK-Zellen auf der Siliciumsensorfläche gezüchtet wurden, führte die Einführung von 10 mM Theophyllin zu einer 47%igen Abnahme der Stoffwechselrate in bezug auf den Kontrollwert. Nach der Entfernung des theophyllinhaltigen Mediums kehrte die Stoffwechselrate innerhalb von zehn Minuten auf den Kontrollwert zurück. Während die Einführung der therapeutischen Menge von Theophyllin (111 uM) bei MDCK-Zellen, die auf der Siliciumsensorfläche gezüchtet wurden, zu einer ungefähr 10%igen Abnahme der Stoffwechselrate führten, wurde eine 28%ige Zunahme der Rate in bezug auf die Kontrollwerte beobachtet, wenn Theophyllin aus der Zellumgebung entfernt wurde.
MDCK-Zellen, die auf einem Deckglas gezüchtet wurden, zeigten eine ähnliche Abnahme der Stoffwechselrate (59%), wenn die Zellen 10 mM Theophyllin ausgesetzt wurden, obwohl eine allmähliche Zunahme der Rate beobachtet wurde (bis zu lediglich 48% unter dem Kontrollwert). Sobald das Theophyllin aus der Zellumgebung entfernt wurde, nahm die Stoffwechselrate auf 30% über den Kontrollwert zu.

Beispiel 9

Man weiß, daß MDCK-Zellen Epinephrinrezeptoren auf ihrer basolateralen Oberfläche aufweisen (der Oberfläche der Zellen, die an dem Substrat haftet, auf dem sie wachsen). Wenn MDCK-Zellen auf der Siliciumsensorfläche gezüchtet werden, sind die Epinephrinrezeptoren daher auf der Sensorseite der zellulären Monoschicht ausgerichtet. Wenn man Medium, das 3 uM Epinephrin enthielt, über die Zellmonoschicht fließen ließ, mußte das Epinephrin durch die Zellschicht diffundieren, um den Rezeptor zu erreichen. Die primäre Einführung von Medium plus Epinephrin änderte die Stoffwechselrate in bezug auf die Kontrollrate nicht signifikant. Wie in Figur 18 gezeigt ist, führte eine weitere Einwirkung von Medium plus Epinephrin jedoch zu einer 20%igen Erhöhung der Stoffwechselrate. Die Stoffwechselrate blieb 12% höher als die Kontrollrate, nachdem das epinephrinhaltige Medium aus der Zellumgebung entfernt wurde. Eine weitere 7%ige Erhöhung der Stoffwechselrate wurde erreicht, als die Zellen wiederum dem epinephrinhaltigen Medium ausgesetzt wurden (d.h. eine 20%ige Erhöhung der Stoffwechselrate gegenüber der Kontrollrate).

Beispiel 10

Ein weiteres Verfahren, um Zellen zu immobilisieren, besteht darin, sie in ein Agarosegel einzukapseln. MDCK-Zellen in einem konfluenten T-75-Kolben wurden mit Trypsin behandelt, um sie aus ihrem Zuchtbehälter zu entnehmen. Die Zellen wurden 5 Minuten bei 2000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden in 5 ml Medium resuspendiert und 5 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde wiederum verworfen, und die Zellen wurden in 500 ul 1,2%iger Seeplattenagarose aus FMC (in Medium) resuspendiert. Die Zellen wurden 3 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert, um die Zellen zu sedimentieren. Ein 2-ul- Aliquot wurde direkt aus dem Zellsediment entnommen und über eine Fläche von ungefähr 40 mm² auf der Siliciumsensorfläche verteilt (in einer teilweise zusammengesetzten Kammer). Die Kammer wurde 15 Minuten gekühlt, um die Agarose gelieren zu lassen. Der Zusammenbau der Fließkammer wurde dann beendet, und die Zellen wurden abwechselnd mit nur Medium, Medium plus 208 uM Epinephrin oder Medium plus 3 uM Epinephrin perfundiert. Die Anwesenheit von 208 uM Epinephrin führte zu einer 3%igen Abnahme der Stoffwechselrate in bezug auf die Rate, die nur für Medium beobachtet wurde. Wie in Figur 19 gezeigt, führte das Entfernen des Epinephrins aus der Zellumgebung jedoch zu einer 14%igen Erhöhung der Stoffwechselrate gegenüber der Kontrollrate. Ähnlich führte die Einführung von 3 uM Epinephrin zu den Zellen zu einer 4,5%igen Abnahme der Stoffwechselrate in bezug auf die Rate, die beobachtet wurde, unmittelbar nachdem die höhere Epinephrinkonzentration entfernt wurde. Wenn das 3 uM Epinephrin aus der Zellumgebung entfernt wurde, nahm die Stoffwechselrate auf 17% über die vor seiner Einführung beobachtete Rate zu.

Beispiel 11

CTLL-Zellen (eine cytotoxische T-Zellinie von Mäusen) sind eine nichthaftende Zellinie, die die Gegenwart von Interleukin-2 (IL-2; ein Immunmodulator) erfordert, um lebensfähig zu bleiben. Zwei ml Zellen wurden aus einem konfluenten T-25-Kolben mit CTLL- Zellen entnommen und zentrifugiert, um die Zellen zu sedimentieren. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 300 ul einer 2%igen Agaroselösung (in Medium) resuspendiert. Die Zellen wurden erneut zu einem Sediment zentrifugiert, und ein 2-ul-Aliquot wurde aus dem Zellsediment entnommen und über einen Kreis von ungefähr 40 mm² auf einem Deckglas, das in einer feuchtgehaltenen Kammer aufbewahrt wurde, verteilt. Die Kammer mit dem Deckglas wurde dann 20 Minuten gekühlt, um die Agarose gelieren zu lassen. Das Deckglas wurde aus der feuchtgehaltenen Kammer entnommen und in eine Fließkammer gegeben. Medium, das 20 Einheiten/ml IL-2 enthielt, oder nur Medium wurden abwechselnd über die Zellen fließen gelassen. Wenn das Medium, das IL-2 enthielt, entfernt wurde, wie in Figur 20 gezeigt, begann die Stoffwechselrate in bezug auf die Kontrollrate abzufallen. Die Rate fiel weiterhin ab, bis Medium, das IL-2 enthielt, wieder in das System eingeführt wurde; zu diesem Zeitpunkt begann die Rate anzusteigen (obwohl die Rate nicht auf den Wert der Kontrollrate zurückkehrte). Zu diesem Zeitpunkt begannen die Zellen, sich von dem Agarosegel abzulösen. Wie erwartet, nahm die Versäuerungsrate der Kammer mit der Zelldichte ab.

Beispiel 12

L-Zellen wurden auf der Siliciumsensorfläche der Fließkammer bis zur Konfluenz wachsen gelassen und abwechselnd mit normalem Medium und Medium, das 0,6 E.U. bakterielles Lipopolysaccharid- Endotoxin enthielt, perfundiert. In einem Experiment erhöhte die Einführung von Endotoxin die Anfangsstoffwechselrate auf 20% über die nur für das Medium beobachtete Rate, und eine zweite Einwirkung von Endotoxin auf die Zellen erhöhte die Rate auf 15% über die nur für das Medium beobachtete Rate. In beiden Fällen kehrte die Rate auf den Anfangswert zurück, als das endotoxinhaltige Medium entfernt wurde (innerhalb weniger Minuten).

Beispiel 13

Oxytocin ist das hauptsächliche uteruskontrahierende und die Milchbildung stimulierende Hormon des Hypophysenhinterlappens. Die Einführung von 1 uM Oxytocin zu MDCK-Zellen, die auf einem Deckglas gezüchtet wurden, führte zu keiner unmittelbaren Änderung der Stoffwechselrate in bezug auf den Kontrollwert, obwohl die Stoffwechselrate allmählich abnahm (auf bis zu 10%). Das Entfernen des Oxytocins aus der Zellumgebung führte die Zellstoffwechselrate nicht sofort auf ihren Kontrollwert zurück, obwohl innerhalb von 10 Minuten eine 100%ige Erholung erreicht wurde. Dies war ein Kontrollexperiment, da MDCK-Zellen keine Oxytocinrezeptoren haben und Oxytocin ein Nonapeptid ist, das sich von Vasopressin nur durch zwei Aminosäuren unterscheidet. MDCK-Zellen haben hingegen Vasopressinrezeptoren. Dies war nicht unbedingt das beste Kontrollexperiment, da, wie unten gezeigt, nur Zellen, die auf der Siliciumsensorfläche gezüchtet wurden, eine Reaktion auf Vasopressin zeigten.

Beispiel 14

Die Einführung von 0,1 uM Vasopressin (antidiuretisches Hormon, Adiuretin) zu MDCK-Zellen, die auf der Siliciumsensorfläche gezüchtet wurden, führte zu einer 14%igen Erhöhung der Stoffwechselrate gegenüber den Kontrollwerten. Die Zugabe von 1 uM Vasopressin unmittelbar nach dem 0,1 uM Vasopressin führte zu einer weiteren Erhöhung der Stoffwechselrate (auf 19% über die Rate, die in Gegenwart von 0,1 uM Vasopressin erreicht wurde, was eine 42%ige Erhöhung gegenüber dem Wert der Kontrollrate bedeutet).
Wenn 1 uM Vasopressin zu MDCK-Zellen eingeführt wurde, die auf einem Deckglas gezüchtet wurden, wurde keine Erhöhung der Stoffwechselrate beobachtet.

Beispiel 15

Die Zugabe von 10 mM MgCl&sub2; zu dem Kontrollmedium führte zu einer 40-46%igen Erhöhung der Stoffwechselrate in bezug auf die Stoffwechselrate, die beobachtet wurde, wenn die MDCK-Zellen nur Medium ausgesetzt worden waren.

Beispiel 16

Eine Silicium-Halbleiterelektrode mit einem Nylongeflecht, das wie oben beschrieben haftend an ihrer oberen Fläche befestigt wurde, wurde hergestellt. Man ließ CTLL-Zellen mit einer Fließgeschwindigkeit von ungefähr 10 ul/min in die Kammer einfließen. Bei dieser Fließgeschwindigkeit setzten sich einige der Zellen unter der Schwerkraft in die Löcher in dem Nylongeflecht ab. Die Fließgeschwindigkeit wurde dann auf ungefähr 100 ul/min erhöht, und die Zellen blieben in den Löchern. Die Zellen konnten mit dem Mikroskop sichtbar gemacht werden. Der Laserstrahl wurde auf drei verschiedene Bereiche, wo Zellen vorhanden waren, und einen Bereich, wo keine Zellen vorhanden waren, gerichtet. An jeder Stelle wurde die zeitliche Änderung des pH-Werts mit an- und mit ausgeschaltetem Mediumfluß gemessen. Die Steigung der pH-Änderung in uV/s bei abgeschaltetem Fluß minus derselben Änderung bei angeschaltetem Fluß war wie folgt: Tabelle II (Fluß aus - Fluß an) Messung Zellen vorhanden nicht vorhanden

Beispiel 17

Dieses Experiment wurde entworfen, um die Möglichkeit der Bestimmung, d.h. der teilweisen oder vollständigen Identifizierung, von Bakterien aufzuzeigen auf der Basis ihrer Fähigkeit, in Gegenwart mehrerer Verbindungen, die mögliche Kohlenstoffquellen sind und die einem einzigen "Fang" von Bakterien nacheinander einzeln angeboten wurden, den PH-Wert ihrer unmittelbaren Umgebung zu verändern. Während dieses Verfahren der seriellen Abgabe selektiver Substrate bestimmte mögliche Vorteile hat, könnte unter bestimmten Umständen auch eine parallele Abgabe selektiver Substrate an getrennte Bakterienfänge nützlich sein. Wenn weiterhin Bakterien verwendet werden, um auf Anfälligkeit gegenüber Antibiotika oder antibiotische Wirkung zu durchmustern, kann eine parallele Abgabe an getrennte Fänge wegen möglicher Probleme durch Arzneimittelwechselwirkungen durchaus geeigneter sein.
Die Bakterien, E. coli und Proteus mirabilis, wurden als Suspensionen mit etwa 5 x 10&sup8; Zellen/ml in einem Kulturmedium vorbereitet und dann in einem sterilen glucosehaltigen Testmedium (Bactopeptone, 2 g/l; NaCI, 5 g/l; K&sub2;HPO&sub4;, 1,7 mM; Glucose, 1 g/l; pH 7,3) verdünnt. Mit dem Kolben der Steuerelektrode in der angehobenen Position, wie es in der anhängigen US-Patentanmeldung, Serial No. 876,925, eingereicht am 20. Juni, 1986, offenbart ist, ließ man ein ml Bakteriensuspension, die eine bekannte Zahl von Bakterien enthielt, durch die Vorrichtung fließen, so daß die Zellen an der Siliciumsensorfläche durch eine Nucleopore-Membran, die sich parallel zu der Oberfläche befand, zurückgehalten wurden. Die Zellen wurden mit dem gleichen glucosehaltigen Testmedium pulsiert, dann wurde der Kolben gesenkt, um das die Zellen umgebende Volumen zu vermindern, und die Änderung des PH-Wert s aufgrund des bakteriellen Stoffwechsels wurde überwacht. Dann wurde der Kolben angehoben, und man ließ ein zweites Testmedium hindurchfließen, das Harnstoff anstelle von Glucose enthielt. Nach Absenken des Kolbens wurde wiederum die pH-Änderung überwacht. Dieses Verfahren wurde mit Medium wiederholt, das Pyruvat als Kohlenstoffquelle enthielt.
Figur 21 zeigt, daß E. coli reagiert, indem es den pH-Wert in Gegenwart aller drei Medien senkt (jedes Medium wurde dreimal hintereinander getestet, bevor das nächste Medium getestet wurde) Figur 22 zeigt, daß P. mirabilis den PH-Wert in Gegenwart von Glucose und Pyruvat senkte, den pH-Wert in Gegenwart von Harnstoff jedoch erhöhte. Figur 23 zeigt, daß die Geschwindigkeit der pH-Änderung in glucosehaltigem Medium von der Zahl der in der Vorrichtung festgehaltenen Bakterien abhängt.
In dem Experiment, dessen Ergebnis in Figur 24 gezeigt ist, wird E. coli in einem System verwendet, das sich von dem für die in Figur 21 und 22 gezeigten Experimente verwendeten dadurch unterscheidet, daß die Zellen durch eine Membran zurückgehalten wurden, deren Ebene parallel zu dem Fluß des Mediums und nicht senkrecht dazu war.
In Figur 24 zeigt E. coli eine Erhöhung der Amplitude der pH-Änderung mit der Zeit, was mit einer Erhöhung der Zahl der Bakterien mit der Zeit im Einklang ist. Neben diesem offensichtlichen Beweis der bakteriellen Replikation in der Fließzelle zeigt Figur 24, daß E. coli nicht auf ein Antibiotikum anspricht, das eine geringe Aktivität gegen gramnegative Bakterien besitzt (am Punkt A zugesetztes Penicillin), jedoch auf ein Antibiotikum anspricht, das gegen gramnegative Bakterien aktiv ist (am Punkt B zugesetztes Polymyxin).

Beispiel 18

CTLL-Zellen wurden in rechteckigen Vertiefungen in der Fließkammer zurückgehalten. Unter Bezugnahme auf Figur 25 wurde eine Anordnung 1 von 1000 um langen, 50 um breiten Schlitzen mit einem Abstand von 50 um zwischen den Schlitzen mit einem Excimer-Laser in ein 50 um dickes Stück einer Folie 2 aus rostfreiem Stahl geschnitten. Dieses wurde unter Stücken von 50 um dickem Kunststoff 3, die so angeordnet waren, daß sie die Folie gegen die Oberfläche der Silicium-Halbleiterelektrode drückten, wenn das Deckglas montiert wurde, in die 100 um tiefe Fließkammer montiert. Dabei blieb ein etwa 1 mm breiter und 50 um tiefer Kanal über den Schlitzen, wodurch Vertiefungen entstanden.
Man ließ CTLL-Zellen bei einer linearen Fließgeschwindigkeit des Mediums im Kanal von nicht mehr als etwa 15 um/s sich in die Vertiefungen absetzen. Alternativ dazu konnten die Vertiefungen beladen werden, indem man das Medium schneller als mit 15 um/s fließen ließ, bis die Zellen über den Vertiefungen suspendiert waren, und dann den Fluß umgefähr 10 Sekunden ganz stoppte, während sich die Zellen in den Vertiefungen ablagerten. Dieses Flow/Stop-Verfahren wurde wiederholt, bis genügend Zellen festgehalten wurden.
Die Zellen blieben bei Fließgeschwindigkeiten unter ungefähr 100 um/s in den Vertiefungen, darüber wurden viele ausgespült. Alternativ dazu bewirkte ein vorübergehendes Umdrehen der Kammer, daß sich die Zellen in den Fließstrom absetzten und bei geringeren Fließgeschwindigkeiten weggespült wurden.
Der dünne Flüssigkeitsfilm zwischen der Folie und der Siliciumelektrode sowie eine mögliche Korrosion des rostfreien Stahls machen das Grundlinienpotential etwas instabil. Dieses Problem konnte durch mikromaschinelle Einarbeitung der Vertiefungen direkt in die Silicium-Halbleiterelektrode gelöst werden.
Bei CTLL-Zellen wurden Stoffwechselraten von -30 bis -60 uV/s erhalten. Dies ist nahe an dem Bereich, der bei anhaftenden Zellen beobachtet wurde. Ähnliche Experimente wie in Beispiel 11 mit IL-2 legten nahe, daß die Stoffwechselrate der Zellen nach mehreren Stunden ohne IL-2 auf etwa 20-30% ihres Kontrollwerts abgenommen hatte; nach mehreren Stunden mit IL-2 (20 E/ml) betrug die Rate anderer Zellen über 50% des Kontrollwerts. Dies weist darauf hin, daß die Gegenwart von IL-2 innerhalb weniger Stunden nachgewiesen werden kann. Eine Optimierung der Vorrichtung kann diese Zeit beträchtlich verkürzen.

Beispiel 19

Drei Zellinien, die von Dr. Craig Venter am NIH zur Verfügung gestellt wurden, setzten uns in die Lage, die funktionelle Wechselwirkung von Agonisten und Antagonisten mit spezifischen Rezeptoren nachzuweisen. Die Grundzellinie, die B82 genannt wird, ist von der L-Zellinie (Mäuse-Fibroblastenlinie) abgeleitet, und man glaubt, daß sie nur einen natürlichen Rezeptor (den Prostaglandin-E&sub1;-Rezeptor (PGE1)) enthält. Diese Zellen dienen nur als Kontrolle für unsere Experimente.
Wir haben außerdem die Zellinie mit zwei unterschiedlichen Transfektionen erhalten. Die als M1C-2 bezeichnete Linie ist die B82-Linie, in die ein Ratten-M&sub1;-Muscarin-Rezeptor transfiziert wurde. Die als 821 bezeichnete Linie ist die B82-Linie, in die ein Human-B&sub2;-adrenergischer Rezeptor transfiziert wurde. Venter und Mitarbeiter bestimmten, daß die Transfektionen funktionell sind, in dem Sinne, daß Agonisten die entsprechenden Second- Messenger-Systeme (Phosphoinositol für M1C-2, cyclisches AMP für 821) stimulieren. Die Charakterisierung dieser und ähnlicher Zellen kann gefunden werden in Fraser, C., Chung, F.-Z. und Venter1 J.C. (1987) : Continuous high density expression of human B&sub2;-adrenergic receptors in a mouse cell line previously lacking B-receptors, J. Biol. Chem. 262:1483-1486; Mei, L., Lai, J., Roeske, W., Fraser, C., Venter, J.C. und Yamamura, H. (1989): Pharmacological characterization of the M&sub1; muscarinic receptors expressed in murine fibroblast B82 cells, J. Pharmacol. Exp. Therapeutics 248:661-670.
Jede der drei Zellinien wird in F-12-DME-Medium gezüchtet, dem 10% Rinderfetusserum zugesetzt wurden. Geneticin (50 ug/ml) ist stets in dem Medium der 821-Zellen enthalten, um eine Umkehrung der Transfektion zu verhindern. Die interessierenden Zellen werden auf indiumzinnoxidbeschichtete Deckgläser aufgetragen und bis zu 60-90% Konfluenz wachsen gelassen. Sechzehn bis vierundzwanzig Stunden vor dem Experiment wird das Kulturmedium entfernt und durch Medium ersetzt, das kein Rinderfetusserum enthält. Im Falle der M1C-2-Zellen wird 1 uM Dexamethason mit dem serumfreien Medium und in anschließenden Schritten hinzugefügt, um die Transcription des M&sub1;-Gens zu induzieren, das sich unter der konstitutiven Kontrolle des dexamethasoninduzierbaren MMTV-Promotors befindet.
Nachdem die Zellen serumfrei gehalten wurden, werden die Deckgläser in die Fließkammer montiert, wobei die Zellen dem Siliciumsensor gegenüberliegen. Niedriggepuffertes Medium (F-12- DME ohne zugesetztes Natriumhydrogencarbonat oder HEPES-Puffer) wird mit 100 ul/min durch die Zellkammer fließen gelassen. Die Zellkammer wird auf 370 gehalten, mit einem Fließcyclus von 300 s an und 200 s aus. Vor der Einführung des Agonisten läßt man die Zellen zwei bis drei Stunden in Kontrollmedium äquilibrieren. Der Zeitpunkt Null gibt bei den folgenden Kurven die Zeit an, bei der Agonist und/oder Antagonist in die Zellkammer eingeführt wurde.
Figur 26 ist ein Beispiel für eine Isoproterenol-Dosis-Wirkungs- Kurve unter Verwendung von 821 Zellen. Die dem Kontrollmedium ausgesetzten Zellen blieben relativ konstant, während Isoproterenol einen raschen Anstieg der Stoffwechselrate bewirkte, die innerhalb der ersten 30 Minuten ihren Spitzenwert erreichte. Eine Dosis-Wirkungs-Beziehung wurde beobachtet.
Figur 27 zeigt die Wirkung von Carbachol (einem M&sub1;-Agonisten), PGE1 und Isoproterenol auf M1C-2-Zellen, die sowohl den M&sub1;-Muscarin- als auch den PGE&sub1;-Rezeptor enthalten. Carbachol bewirkte eine 80%ige Erhöhung der Stoffwechselrate, die in ungefähr 50 Sekunden ihren Spitzenwert erreichte und in 200 Sekunden auf ein stationäres Niveau einer ungefähr 40%igen Erhöhung der Stoffwechselrate zurückfiel. Die Stimulation von M1C-Zellen mit PGE&sub1; führte zu einer 80%igen Erhöhung der Stoffwechselrate, die in ungefähr 1000 Sekunden ihren Spitzenwert erreichte und in 4000 Sekunden auf Grundlinien-Stoffwechselraten zurückkehrte. Der Unterschied in der Zeit zur Erreichung des Spitzenwerts kann der Tatsache zugeschrieben werden, daß die Bindung von PGE&sub1; an den PGE&sub1;-Rezeptor einen anderen Second-Messenger-Weg (cyclisches AMP) beeinflußt als die Bindung von Carbachol an den Muscarin- Rezeptor. Figur 27 zeigt auch das Fehlen von B&sub2;-adrenergischen Rezeptoren in M1C-2-Zellen, da die Einführung von Isoproterenol keine Wirkung hatte.
Figur 28 zeigt Agonist/Antagonist-Wechselwirkungen mit dem Muscarin-Rezeptor in M1C-2-Zellen. Die Einführung von 10 mM Carbachol (einem Muscarin-Agonisten) zu M1C-2-Zellen führte zu einer 75%igen Erhöhung der Stoffwechselrate in bezug auf die Grundlinien-Stoffwechselraten. Atropin, ein wirkungsvoller Muscarin-Antagonist, blockierte die Reaktion dieser Zellen auf Carbachol. Atropin allein hatte auf die Zellen keine signifikante Wirkung.
Figur 29 und 30 zeigen Ergebnisse, die mit einer leicht modifizierten Vorschrift erhalten wurden, wobei die zeitliche Auflösung der raschen Reaktion der M1C-2-Zellen auf Carbachol erhöht wurde. Zwei Kammern (eine für das Experiment und eine als Kontrolle) wurden mit Zellen zusammengesetzt und wie oben beschrieben äquilibriert.
Während einer Phase mit ausgeschaltetem Fluß wurde die Fließgeschwindigkeit von 100 ul/min auf 200 ul/min geändert. Als der Fluß wieder einsetzte, wurde ein Injektionsventil so geschaltet, daß es carbacholhaltiges Medium in die Zellkammer einführte. Der Fluß wurde nach 45 Sekunden angehalten, und die Versäuerung des Mediums wurde verfolgt (Figur 29). Die zeitliche Ableitung des Sensorpotentials (äquivalent zum pH-Wert) wurde unter Verwendung eines quadratischen 5-Punkte-Algorithmus nach Savitsky-Golay (1964) berechnet und ist in Figur 30 gezeigt. (Siehe Savitsky, A. und Golay, M. (1964) : Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures; Analytical Chem. 36:1627- 1639).
Die Versäuerungsgeschwindigkeit kann also mit einer verbesserten Auflösung von 2 Sekunden während der Zeit, in der der Fluß ausgeschaltet ist, verfolgt werden. Die Dauer dieses Experiments wird durch die Zeitspanne bestimmt, die die Zellen benötigen, um den PH-Wert und Metabolitkonzentrationen des stagnierenden Mediums signifikant zu stören. An diesem Punkt muß der Fluß wiederhergestellt und die Datensammlung gestoppt werden.
Der Reaktionspeak erschien 50-60 Sekunden nach der Beendigung des Mediumflusses. Es sollte angemerkt werden, daß die ersten paar Punkte nicht gültig sind, da bei den Berechnungen ein Savitsky- Golay-5-Punkte-Algorithmus verwendet wurde; dazu gehören Datenpunkte während der Zeit des Fließens des Mediums.
Bei den Kontrollzellen handelt es sich in diesem Beispiel um die B-82-Zellinie, eine Mäuse-Fibroblasten-Zellinie. Die B-82-Zellen enthalten einen Prostaglandin-E&sub1;-Rezeptor. Sie enthalten weder Muscarin- noch adrenergische Rezeptoren. B-82-Zellen wurden mit den Human-β&sub2;-adrenergischen Rezeptoren (821-Zellen) und mit Ratten-M&sub1;-Muskarin-cholinergischen Rezeptoren (MIC-2-Zellen) transfiziert. Die Zellinien wurden von Dr. J. C. Venter zur Verfügung gestellt. Alle oben erwähnten Zellinien werden in F-12- DME mit 10% Rinderfetusserum (FBS) gezüchtet. Das Kulturmedium für die transfizierten 821-Zellen enthielt 50 ug/ml Geneticin, um eine Umkehrung der Transfektion zu verhindern. Geneticin ist auch in dem niedriggepufferten Medium für das Experiment enthalten. Jede der Zellinien wird aufindiumzinnoxidbedeckte Deckgläser aufgetragen und bis zu 85-100% Konfluenz wachsen gelassen. Ungefähr vierundzwanzig Stunden vor dem Experiment wird das Kulturmedium entfernt und durch serumfreies Medium ersetzt. Im Falle der M1C-2-Zellen wird 1 uM Dexamethason zu dem serumfreien Medium hinzugefügt.
Dann werden die Deckgläser in die Fließkammer montiert, wobei die Zellen dem Siliciumsensor gegenüberliegen. Niedriggepuffertes Medium wird durch die (auf 370 gehaltene) Kammer fließen gelassen. 821-Zellen werden Medium mit 50 ug/ml Geneticin ausgesetzt. M1C-2-Zellen werden Medium mit 1 uM Dexamethason ausgesetzt. B82-Zellen werden Medium mit 0,5% Ethanol ausgesetzt (da Ethanol benötigt wird, um PGE&sub1; aufzulösen). Nachdem die Zellen ungefähr 2 Stunden äquilibrieren gelassen wurden, wird der interessierende Rezeptoragonist eingeführt (100 uM PGE&sub1; wird zu B82-Zellen, 10 uM Isoproterenol zu 821-Zellen und 3,12 uM Carbachol zu M1C-2-Zellen eingeführt). Der Zeitpunkt 0 zeigt in diesen Figuren an, wann die Ventile so geschaltet wurden, daß sie die Agonisten einführten. Es sollte angemerkt werden, daß es eine leichte Verzögerung gibt, bevor der Agonist tatsächlich in die Fließkammer eintritt.

Beispiel 20

Die Infektion von Zellen in Gewebekultur durch das vesikuläre Stomatitisvirus (VSV) führt zu einer Veränderung des Zellstoffwechsels als Folge eines Abbruchs der Protein- und RNA-Synthese. Das Ergebnis viraler Infektion und Replikation ist eine Cytolyse der Wirtszellen, der cytopathische Wirkungen, d.h. ein Aufquellen und Abrunden der Zellen, vorangehen. Diese morphologischen Konsequenzen der Infektion können verwendet werden, um die Virusreplikation in der Zellkultur nachzuweisen. Theoretisch könnte auch die Modifikation des Wirtszellstoffwechsels verwendet werden, um die Virusreplikation nachzuweisen und zu überwachen. Im vorliegenden Beispiel wurde ein Biosensor auf Siliciumbasis, der die Erzeugung von sauren Metaboliten mißt, verwendet, um den Stoffwechsel von Mäuse-L-Zellen während einer VSV-Infektion zu überwachen. Infizierte und nicht infizierte Zellen werden in einer dünnen (100 um) Fließkammer gehalten, die eine empfindliche und quantitative Messung der Versäuerung des Mediums bei angehaltenem Fluß mit dem Biosensor ermöglicht. Zwischen den Stoffwechselmessungen wird frisches Medium durch die Fließkammer perfundiert, um die Zellen unter optimalen Wachstumsbedingungen zu halten. Mit Hilfe des Biosensorsystems wurde zwischen 2-4 Stunden nach der VSV-Infektion eine Absenkung der L-Zellstoffwechselrate nachgewiesen, und ein steiler Abfall der Rate trat später in dem Cyclus, 8-14 Stunden nach der Infektion, auf (siehe Figur 31 und 32). Es wurde gefunden, daß das Ausmaß und die Zeit, mit dem bzw. zu der der Wirtszellstoffwechsel abnahm, eine Funktion der Multiplizität der Infektion ist (siehe Figur 33 und 34). Die Spezifität der VSV-Wirkung auf den Wirtszellstoffwechsel wurde durch die Empfindlichkeit des Virusimpfmaterials gegenüber UV-Strahlung (siehe Figur 35), durch Neutralisierung mit monoklonalem Anti- VSV-Antikörper (siehe Figur 36) und durch Hemmung bei Aufnahme von Ribavirin in das Medium (siehe Figur 37A und 37B) bestätigt. Wir wiesen mit Hilfe des Biosensors (siehe Figur 38 und 39) auch den Schutz der Wirts-L-Zellen vor VSV-Infektion durch Mäuse- Interferon nach.
Die Figuren 40, 41A, 41B und 41C zeigen weitere Daten, die durch die Infektion von L-Zellen durch VSV, Influenza A (WSN-Stamm) und HSV-1 erzeugt wurden. Influenza A ist ein Minusstrang-RNA-Virus, das beim Menschen Grippe verursacht. HSV-1 ist ein DNA-Virus, daß beim Menschen eine Herpesinfektion bewirkt. Acyclovir kann verwendet werden, um HSV-1 zu hemmen, und Amantadin kann verwendet werden, um Influenza A zu hemmen.

Beispiel 21

Bei vielen Typen von Säugerzellen erzeugt eine konfluente Monoschicht (äquivalent zu etwa 10&sup7; Zellen/ml) gewöhnlich Versäuerungsgeschwindigkeiten innerhalb eines Faktors von zwei bis 100 uV/s. Bei 59 mV pro pH und einer Pufferkapazität des Mediums von 1 mM entspricht dies einer berechneten Nettogeschwindigkeit der H&spplus;-Produktion von 1 10&sup8;/s für eine typische Zelle. Die metabolischen Quellen dieser Protonen hängen von den Nährstoffen in dem Kulturmedium und den in den Zellen aktiven Stoffwechselwegen ab. Ein Einblick in diese Dinge kann unter Verwendung biochemischer Hilfsmessungen und spezifischer Stoffwechselgifte gewonnen werden.
Der Sauerstoffverbrauch wurde in einer getrennten Perfusionsvorrichtung gemessen, die mit einer Clark-Sauerstoffelektrode ausgestattet war. Die Entfernung von Sauerstoff aus den Medien durch eine Monoschicht der Mäuse-Fibroblasten-L-Zellinie wurde unter Bedingungen eines konstanten Flusses im ausfließenden Strom gemessen. Die Lactaterzeugung wurde ebenfalls gemessen, wobei ein spektrophotometrischer enzymatischer Assay auf der Basis der Reduktion von NAD&spplus; verwendet wurde. Wenn Kulturmedium als Badmedium verwendet wurde, wurde gefunden, daß die Geschwindigkeiten des Sauerstoffverbrauchs (der ungefähr der CO&sub2;-Erzeugung entspricht) und der Lactaterzeugung pro Zelle ungefähr gleich 3,1 (±0,3) 10&sup7;/s war. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Zellen in einer ausgewogenen Salzlösung mit 5 mM Glucose als einziger Kohlenstoffquelle getestet wurden.
Das Stoffwechselgift Carbonylcyanidchlorphenylhydrazon (CCCP) ist ein Atmungsentkoppler, von dem gezeigt wurde, daß er die Sauerstoffaufnahme durch Mitochondrien stimuliert. Figur 42 zeigt die Wirkung von 20 uM CCCP auf die nichthaftende makrophagenartige Mäuse-Zellinie P388D1, die in geätzten Vertiefungen festgehalten wurde. Die Stimulierung erfolgt unverzüglich, schneller als es der Auflösung der Vorrichtung entspricht. Sie ist reversibel, mit einer Erholungszeit von etwa 20 min nach dem Entfernen des Entkopplers. Dosis-Wirkungs-Experimente zeigen eine maximale Stimulierung der Versäuerungsgeschwindigkeit in der Nähe von 2-5 uM CCCP. Der Mechanismus ist vermutlich eine Kombination von erhöhter CO&sub2;-Erzeugung und der Stimulierung der Glycolyse, um die Homöostase aufrechtzuerhalten.

Beispiel 22

Normale Human-Keratinocyten erfordern den Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF) für eine Vermehrung ohne Differenzierung. Keratinocyten (von Clonetics, Inc.) wurden 24 Stunden vor dem Experiment in Abwesenheit von EGF kultiviert. Für das Experiment wurden die Keratinocyten in vier Fließkammern gebracht, und die alternierende Stop-Flow-Sequenz wurde mit Medium, das kein EGF enthielt, eingeleitet. Zu dem in Figur 43 durch den Pfeil gekennzeichneten Zeitpunkt wurden die mediumhaltigen Spritzen an allen vier Fließkammern ausgewechselt. Das zweite Medium enthielt 5 ng/ml Mäuse-EGF oder 1,25 ug/ml eines neutralisierenden polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus-EGF-IgC oder beides. Ein Kontrolldurchlauf ohne EGF oder IgC wurde ebenfalls durchgeführt. Die Zugabe von EGF führte zu einem metabolischen Ausbruch bei den Keratinocyten, der durch Einschluß des Anti-EGF-Antikörpers neutralisiert wurde. Eine Zugabe des Anti-EGF-Antikörpers allein hatte keine Wirkung.
Diese Experimente, deren Ergebnisse in Figur 43 gezeigt sind, zeigen, daß das Mikrophysiometer in der Lage ist, einige Ligand- Rezeptor-Wechselwirkungen in lebenden Zellen funktionell nachzuweisen.
In einem getrennten Experiment enthielt das Wachstumsmedium für die normalen Human-Epidermis-Keratinocyten 10 ng/ml Mäuse-EGF, eine Substanz, von der man fand, daß sie auf Keratinocyten mitogen wirkt. Figur 44 zeigt, daß nach 24stündigem EGF-Entzug innerhalb von 5 min nach der Einführung von 50 ng/ml EGF zu Keratinocyten in dem Silicium-Mikrophysiometer ein Anstieg der Stoffwechselrate zu erkennen ist. Beim Maximum der Reaktion, in 15 min, hat sich die Stoffwechselrate beinahe verdoppelt; in weiteren 15 Minuten ist sie auf eine stetig ansteigende Grundlinie abgefallen. Ein paralleles Kontrollexperiment mit einem scheinbaren Austausch von EGF-freiem Medium, das ebenfalls in Figur 44 abgebildet ist, zeigt keines dieser zweiphasigen Verhalten. Es zeigt die gleiche ansteigende Grundlinie, die wahrscheinlich eine Kombination von Zellvermehrung und Anpassung an die Umgebungsbedingungen in der Fließkammer anzeigt.
Eine Stimulierung der Versäuerungsgeschwindigkeit war bis hinunter auf 0,1 ng/ml EGF zu beobachten. In einem Kontrollexperiment wurde die Stimulierung durch einen monoklonalen Antikörper gegen EGF, von dem man weiß, daß er die Rezeptorbindung blockiert, unterbunden. Diese Experimente zeigen die Fähigkeit des Biosensors, eine zelluläre Reaktion auf die Ligand-Rezeptor-Bindung innerhalb von Minuten nachzuweisen.
Die Wirkungen von EGF auf Keratinocyten verhalten sich eng parallel zu denen, die zuvor für Mäuse- und Human-Fibroblasten berichtet wurden, bei denen gezeigt wurde, daß eine Stimulierung mit EGF zu einer raschen Erhöhung der Glycolysegeschwindigkeit führt. Die Geschwindigkeitserhöhung wurde einer erhöhten 6-Phosphofructo-1-Kinase-Aktivität als Ergebnis erhöhter Konzentrationen von Fructose-2,6-biphosphat, einem starken Stimulator des Enzyms, zugeschrieben. Es wurde auch gezeigt, daß Fructose-2,6- biphosphat eine Rolle bei der Stimulierung der Glycolyse in Fibroblasten durch Serum, Insulin und Phorbolester spielt. Eine Modulation von Glycolysegeschwindigkeiten als Reaktion auf hormonelle Aktivierung wurde für andere Zelltypen, einschließlich Muskel- und Leberzellen, berichtet, was die Messung von Stoffwechselaktivität als Mittel zum Nachweisen einer hormonellen Stimulierung unterstützt.

Beispiel 23

Die cytotoxischen Wirkungen von Chemotherapeutika auf Tumorzelllinien werden gewöhnlich durch Assays bestimmt, die Proliferation nachweisen. Unter Verwendung eines bereits charakterisierten Zellsystems haben wir in dem Silicium-Mikrophysiometer Cytotoxizitäts-Assays durchgeführt. MES-SA ist eine Human-Uterus-Sarkom- Linie, die gegenüber Doxorubicin und Vincristin empfindlich ist. Die Dx5-Linie, die aus MES-SA durch Selektion mit Doxorobicin abgeleitet wurde, ist dank der erhöhten Aktivität des P-Glycoprotein-Transporters, der Multimedikamentresistenz verleiht, gegen Doxorubicin und Vincristin resistent.
Experimente unter Verwendung des Silicium-Mikrophysiometers reproduzieren diese Ergebnisse. Bei therapeutischen Dosen von Doxorubicin (1 uM) wird die unterschiedliche Cytotoxizität in den beiden Linien aufrechterhalten. Wie in Figur 45 gezeigt, sind verminderte Versäuerungsgeschwindigkeiten bei MES-SA nach 15 Stunden zu erkennen, bei Dx5 jedoch nach 50 Stunden noch nicht. Bei hohen Dosen (100 uM) der Medikamente treten ähnliche, aber raschere Ergebnisse auf: Cytotoxizität von Doxorubicin ist bei MES-SA nach 0,5 Stunden und bei Dx5 nach 2,5 Stunden erkennbar. Die in Figur 46 gezeigten Ergebnisse für 100 uM Vincristin betragen 5 bzw. 10 Stunden.
Dieses System erfordert relativ wenige Zellen und kein erweitertes Zellwachstum. Diese Faktoren plus die Fähigkeit, wiederholte Messungen an derselben Gruppe von Zellen durchzuführen, legen weitere Anwendungen bei Cytotoxizitätstests nahe.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis einer Wirkung eines zellbeeinflussenden Mittels auf lebende Zellen, umfassend:

(a) Bereitstellen lebender Zellen, die in einer Mikrofließkammer zurückgehalten werden, welche für den kontinuierlichen oder portionsweisen Durchfluß von Lösungen oder Suspensionen, die das zellbeeinflussende Mittel enthalten, in innigem Kontakt mit den Zellen angepaßt ist, so daß die Menge des mit den Zellen in Kontakt stehenden zellbeeinflussenden Mittels gesteuert werden kann;

(b) Hindurchfließenlassen einer Lösung oder Suspension, die das zellbeeinflussende Mittel enthält, so daß es in innigen Kontakt mit den lebenden Zellen gerät und dadurch eine zellvermittelte extrazelluläre Wirkung erzeugt, wobei diese zellvermittelte extrazelluläre Wirkung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus pH, Redoxpotential, Zelloberflächenpotential und transzellulärem Potential besteht; sowie

(c) Messen der Wirkung des zellbeeinflussenden Mittels mit einer Vorrichtung zum Nachweis der Wirkung, die sich innerhalb der Mikrofließkammer befindet.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die lebenden Zellen an einer Oberfläche der Mikrofließkammer befestigt werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die lebenden Zellen an einer Membran oder einem Mikroträger innerhalb der Mikrofließkammer befestigt werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei die Zellen durch spontane oder natürliche Haftung haften.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die lebenden Zellen in Vertiefungen in der Mikrofließkammer zurückgehalten werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die Zellen mittels eines biologisch verträglichen Haftmittels so befestigt werden, daß sie sich wieder entfernen lassen.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei es sich bei dem Haftmittel um Agarose handelt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zellen mittels einer für das zellbeeinflussende Mittel durchlässigen Membran in einem Kompartiment in der Mikrofließkammer zurückgehalten werden.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-8, wobei die Vorrichtung zum Nachweis der Wirkung des zellbeeinflussenden Mittels eine Silicium-Halbleiterelektrode in Kontakt mit den lebenden Zellen oder in unmittelbarer Nachbarschaft derselben umfaßt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die lebenden Zellen an der Oberfläche der Silicium-Halbleiterelektrode befestigt werden.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-10, wobei die Lösung oder Suspension teilweise entgast wird, bevor sie in innigen Kontakt mit den Zellen gerät.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 9-11, wobei die Wirkung des zellbeeinflussenden Mittels an mehreren Stellen auf der Silicium-Halbleiterelektrode gemessen wird.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei man die Lösung oder Suspension kontinuierlich in innigem Kontakt mit den Zellen durchfließen läßt.

14. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei der pH-Wert der Lösung oder Suspension an mehreren Stellen in der Mikrofließkammer gemessen wird.

15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei man die Lösung oder Suspension portionsweise in innigem Kontakt mit den Zellen durchfließen läßt.

16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei es sich bei der gemessenen Wirkung um den pH-Wert handelt.

17. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei der pH-Wert der Lösung oder Suspension gemessen wird, wenn der Durchfluß angehalten wurde.

18. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei es sich bei der gemessenen Wirkung um das Redoxpotential handelt.

19. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei es sich bei dem zellbeeinflussenden Mittel um ein Medikament, Hormon, Virus, Toxin oder immunologisches Reagens handelt.

20. Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Identifizierung von Mikroben, wobei die Mikrofließkammer Vorrichtungen zum Abfangen zu identifizierender Mikroben auf oder in der Kammer aufweist und wobei man in Schritt (b) eine vorherbestimmte Gruppe von Lösungen und/oder Suspensionen, die jeweils einen oder mehrere Bestandteile enthalten, die bei Kontakt mit der zu identifizierenden Mikrobe zu einer Reaktion der Mikrobe führen, die für die getestete Mikrobe charakteristisch ist, nacheinander durchfließen läßt, umfassend den Schritt des Vergleichens der gemessenen Mikrobenreaktion auf die vorherbestimmte Gruppe von Lösungen und/oder Suspensionen mit der Reaktion bekannter Bakterien, wodurch die zu identifizierenden Bakterien identifiziert werden.

21. Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Durchmustern auf die Gegenwart oder Aktivität eines Medikaments hin, wobei das zellbeeinflussende Mittel ein Medikament ist.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das Medikament ein Antibiotikum ist.

23. Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei das Medikament ein Antivirusmittel ist und die lebenden Zellen mit einem Virus infiziert sind.

24. Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis einer toxischen Substanz, wobei das zellbeeinflussende Mittel eine toxische Substanz ist.

25. Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Nachweis interzellulärer Reaktionen, wobei in Schritt (a) eine erste und zweite Gruppe lebender Zellen bereitgestellt wird, wobei wenigstens die zweite Gruppe lebender Zellen in der Mikrofließkammer zurückgehalten wird und wobei in Schritt (b) die erste Gruppe lebender Zellen mit einem ersten zellbeeinflussenden Mittel in Kontakt gebracht wird, wodurch bewirkt wird, daß die erste Gruppe lebender Zellen ein zweites zellbeeinflussendes Mittel hervorbringt, dessen Wirkung in Schritt (c) nachgewiesen wird.

26. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die erste und die zweite Gruppe lebender Zellen zu demselben Typ lebender Zellen gehören.

27. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei die erste und die zweite Gruppe lebender Zellen zu verschiedenen Typen lebender Zellen gehören.

28. Vorrichtung zum Nachweis einer Wirkung eines zellbeeinflussenden Mittels auf lebende Zellen, umfassend:

(a) eine Mikrofließkammer mit mehreren inneren Oberflächen, wobei eine der inneren Oberflächen ein Boden ist, wobei die Mikrofließkammer so angepaßt ist, daß lebende Zellen darin zurückgehalten werden können, wobei die Mikrofließkammer weiterhin für den kontinuierlichen oder portionsweisen Durchfluß von Lösungen oder Suspensionen, die das zellbeeinflussende Mittel enthalten, in innigem Kontakt mit den Zellen angepaßt ist, so daß die Menge des mit den Zellen in Kontakt stehenden zellbeeinflussenden Mittels gesteuert werden kann;

(b) Vorrichtung zum Zurückhalten lebender Zellen in der Mikrofließkammer;

(c) Vorrichtung zum Durchleiten einer Lösung oder Suspension, die das zellbeeinflussende Mittel enthält, so daß es in innigen Kontakt mit den in der Mikrofließkammer zurückgehaltenen lebenden Zellen gerät und dadurch eine zellvermittelte extrazelluläre Wirkung erzeugt, wobei diese zellvermittelte extrazelluläre Wirkung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus pH, Redoxpotential, Zelloberflächenpotential und transzellulärem Potential besteht; sowie

(d) Vorrichtung zum Messen der Wirkung des zellbeeinflussenden Mittels, wobei sich die Vorrichtung innerhalb der Mikrofließkammer befindet.

29. Vorrichtung gemäß Anspruch 28, wobei die Vorrichtung zum Zurückhalten lebender Zellen in der Mikrofließkammer mehrere Vertiefungen im Boden der Kammer umfaßt.

30. Vorrichtung gemäß Anspruch 29, wobei die Vorrichtung zum Nachweis der Wirkung eines zellbeeinflussenden Mittels eine siliciumhaltige Halbleiterelektrode umfaßt, wobei die Elektrode wenigstens einen Teil des Bodens der Mikrofließkammer bildet und wenigstens ein Teil der Vertiefungen zum Zurückhalten lebender Zellen durch die siliciumhaltige Halbleiterelektrode definiert ist.

31. Vorrichtung gemäß Anspruch 28, wobei die Vorrichtung zum Zurückhalten lebender Zellen in der Mikrofließkammer ein biologisch verträgliches Haftmittel umfaßt, das in der Lage ist, die lebenden Zellen an einer Oberfläche der Mikrofließkammer zu befestigen.

32. Vorrichtung gemäß Anspruch 31, wobei es sich bei dem biologisch verträglichen Haftmittel um Agarose handelt.

33. Vorrichtung gemäß Anspruch 28, wobei die Vorrichtung zum Zurückhalten lebender Zellen in der Mikrofließkammer einen abgeteilten Bereich in einer Oberfläche der Mikrofließkammer und eine für das zellbeeinflussende Mittel durchlässige Membran umfaßt, wobei die durchlässige Membran so angeordnet ist, daß sie den abgeteilten Bereich abdeckt und die lebenden Zellen darin zurückhält.

34. Vorrichtung gemäß Anspruch 28, wobei die Vorrichtung zum Nachweis der Wirkung des zellbeeinflussenden Mittels eine siliciumhaltige Halbleiterelektrode in Kontakt mit den lebenden Zellen oder in unmittelbarer Nachbarschaft derselben umfaßt.

35. Vorrichtung gemäß Anspruch 28, wobei die Vorrichtung zum Zurückhalten lebender Zellen in der Mikrofließkammer eine Membran oder einen Mikroträger, woran die lebenden Zellen befestigt sind, umfaßt.