DE69322968T2

DE69322968T2 - Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen Überwachung eines Anolytpegels

Info

Publication number: DE69322968T2
Application number: DE69322968T
Authority: DE
Inventors: Fransiscus Josephus Nl-9203 Cc Drachten Schmidt; Adelbert Josef Martinus Nl-9718 Kt Groningen Schoonen; Klaas-Jan Cornelis Nl-9722 Eg Groningen Wientjes
Original assignee: Rijksuniversiteit Groningen; Siemens Elema AB
Current assignee: Rijksuniversiteit Groningen; Siemens Elema AB
Priority date: 1993-10-22
Filing date: 1993-10-22
Publication date: 1999-07-08
Anticipated expiration: 2013-10-23
Also published as: JPH07255708A; EP0649628A1; US5615671A; DE69322968D1; EP0649628B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren zum kontinuierlichen Messen der Konzentration eines Analyten in Gewebe. Sie bezieht sich auch auf Vorrichtungen, die solche Messungen durchführen und durch Verabreichung eines Wirkstoffs reagieren.
In der Medizin, sowohl in der Human- als auch in der Veterinärmedizin, ist die Konzentration (der Spiegel) bestimmter Substanzen in Blut und/oder Gewebe ein sehr wichtiges Kriterium für die Diagnose und/oder die Behandlung.
Die interessierenden Substanzen (nachfolgend als Analyten bezeichnet) können ganz unterschiedlicher Natur sein. Sie können Zwischenprodukte oder Endprodukte im Metabolismus, Hormone oder Hormonvorstufen, Antikörper oder Antigene, Pathogene, Arzneimittel, usw. sein.
In einer Reihe von Fällen wird es wichtig sein, eine kontinuierliche Untersuchung der Konzentrationen eines Analyten in Blut und/oder Gewebe aufrecht zuhalten.
Der Analyt, der bis dato der vorderste Gegenstand bei kontinuierlichen Messungen war, ist Glucose bei Patienten, die an Diabetes mellitus leiden.
Obgleich die Erfindung detaillierter unter Verwendung von Glucose als Modellsystem erläutert wird, wird sie in keiner Weise in ihrer Verwendung nur auf diese Art der Messung beschränkt.
Verfahren und Vorrichtungen zum kontinuierlichen Messen von Glucose-Konzentrationen in (subkutanem) Gewebe sind bekannt.
Es wurde auch vorgeschlagen, eine solche Meßvorrichtung mit einer tragbaren Insulinpumpe zu verbinden, die dann auf Änderungen der Glucose-Konzentration im Blut und/oder Gewebe reagieren.
Allgemein ausgedrückt, diese Methoden und Vorrichtungen werden für Patienten verwendet, für die die klassischen Methoden des Injizierens von Insulin ein- oder zweimal am Tag keine zufriedenstellende Regulierung der Glucose(-Blut-)Konzentration liefern können.
Wenn allerdings eine patientenfreundliche Vorrichtung zum Messen von Analyten wie z. B. Glucose und Dosieren einer Substanz wie z. B. Insulin als Reaktion auf Veränderungen der Analyt-Konzentration konstruiert werden könnte, könnte die Verwendung von solchen Vorrichtungen weitaus ausgedehnter sein als nur bei dieser besonderen Patientengruppe.
Verschiedene Forschungsgruppen sind bei der Planung von Glucose-Sensoren involviert. Eine dieser Forschungsgruppen ist die Gruppe von Shichiri vom "First Department of Medicine" an der Universität von Osaka, Japan. Diese Gruppe war bei der Entwicklung eines Glucose-Sensors, der fähig ist, die Glucose-Konzentration in subkutanem Gewebe über 3 Tage zu messen, erfolgreich [siehe Diabetologia 24 (1983) 179-184; Biomed. Biochim. Acta 43 (1984), 561-568, Diabetes Care 9 (1986) 298-301]. Der kleine Glucose-Sensor des Nadeltyps besteht aus einer Platin-Elektrode, die mit immobilisiertem Enzym Glucoseoxidase überzogen ist. Bei der Reaktion von Glucose mit Sauerstoff in Gegenwart des Enzyms wird H&sub2;O&sub2; freigesetzt, das durch diese Elektrode gemessen werden kann und mit der vorhandenen Glucose-Menge in Wechselwirkung steht.
In vitro liefert die Elektrode in einer Glucose-Lösung mit 5,5 mmol/l einen Strom von 1,2 ± 0,4 nA. Der Strom ist bezüglich der Glucose-Konzentrationen linear und die Zeit, die zur Erreichung von 90% des Plateauwertes erforderlich ist, ist 16,2 ± 6,2 s.
Zunächst wurden subkutane Messungen an Hunden durchgeführt, wobei die Reaktion im Vergleich zur direkten Messung im Blut eine Verzögerung von 5 bis 15 min zeigte. Die Empfindlichkeit der Elektrode nimmt nach 96 h Messung schrittweise auf 57,4 ± 7% des Anfangswertes ab. Dieser Signalverlust, hauptsächlich wegen des raschen Abbaus des Enzyms, zeigt an, daß der subkutan eingebaute Sensor mindestens alle 3 Tage ersetzt werden muß.
Schließlich entwickelte Shichiri ein komplett tragbares künstliches endokrines Pankreas (12 · 15 · 6 cm, 400 g), das aus einem Sensor, einem Mikrocomputer, der die erforderliche Infusionsrate von Insulin bestimmt, und einem dualen Spritzensteuerungssystem besteht. Diese Apparatur ist fähig, drei Tage lang die Blutglucose-Konzentration in Hunden ohne Pankreas zu steuern. Shichiri begann dann, Messungen im subkutanen Gewebe von Diabetikern durchzuführen. Die subkutan gemessenen Glucose-Werte sind im Durchschnitt 10% niedriger als die im Blut, allerdings gibt es im Bereich zwischen 60 und 400 mg/dl Glucose eine gute Korrelation zwischen den zwei Werten. Danach wurden Patienten, die an Diabetes litten, mit dem vollständigen künstlichen Pankreas ausgestattet, wobei ein selbstentwickelter subkutaner Insulin- Infusionsalgorithums angewendet wurde. Es wird nur ein typischer Patient genannt, in dem die Glucose für zwei Tage mit dem Sensor gesteuert wurde.
Eine weitere Forschungsgruppe wird von M. Kessler im Institut für Physiologie und Kardiologie der Universität von Erlangen- Nürnberg geleitet. Der Glucose-Sensor, den sie entwickelten [Hepatogastroenterol. 31 (1984) 285-288] arbeitet ebenfalls durch enzymatische Umwandlung von Glucose mit Hilfe von Glucoseoxidase, anschließende Messung des resultierenden H&sub2;O&sub2; unter Verwendung einer Elektrode mit einer Goldanode, die mit drei Membranen überzogen ist. Eine Dialyse-Membran, die für Glucose, Gase und anorganische Ionen durchlässig, für größere Moleküle z. B. Proteine, aber undurchlässig ist, dient als Selektor. In der nächsten Schicht befindet sich eine Enzym- Membran, die als eine Art Reaktionsraum fungiert. Darin enthalten ist das immobilisierte Enzym Glucoseoxidase. Eine abschießende lipophile Membran mit darin eingearbeiteten Protonenträgermolekülen ist der Goldanode am nächsten. In Gegenwart des Enzyms reagiert die Glucose, die durch die Dialyse-Membran diffundiert, mit Sauerstoff und bildet auf diese Weise H&sub2;O&sub2;. Das H&sub2;O&sub2; wird an der Goldanode oxidiert, so daß zwei Protonen gebildet werden. Diese werden durch die Protonenträger eliminiert. Mit diesem Sensor führte Kessler Messungen im Peritoneum von anästhesierten Ratten durch. Er fand eine gute Korrelation zwischen den im Peritoneum gemessenen Glucosewerten und den tatsächlichen Blutglucosewerten. Abmessungen der Elektrode werden nicht genannt, allerdings ist bisher noch keine Elektrode erhältlich, die für eine Implantation in Menschen geeignet ist.
A. Müller und P. Abel vom Zentralinstitut für die Diabetes "Gerhardt Katsch" von Karlsberg (GDR) (Prof. U. Fischer) haben ebenfalls einen verfügbaren Glucoseoxidase/H&sub2;O&sub2;-Sensor entwickelt [Biomed. Biochim. Acta 43 (1984) 577-584: Biomed. Biochim. Acta 45 (1986) 769-777]. Wieder ist das immobilisierte Enzym an der Elektroden (Pt)-Oberfläche befestigt. Die Elektrode ist jeweils durch eine hydrophobe und eine hydrophile Membran als Selektor für die Glucose überzogen. Nach einem anfänglichen instabilen Zeitraum von 24 h liefert diese Elektrode ein stabiles Signal, d. h. einen Strom von 0,02 bis 6,8 nA, der von der Glucose-Konzentration abhängt. Sie ist 7 cm lang und hat einen Durchmesser von 2 bis 4 mm. Die Elektrode wurde 6 Hunden implantiert, dann wurde die Glucose gemessen. Das Verhältnis zwischen den Glucose-Konzentrationen in Blut und Gewebe variierte zwischen 33 und 70%. Neben dieser großen Schwankung tritt häufig Versagen auf, so daß eine gute Eichung nicht möglich ist.
Alle bisher diskutierten Glucose-Sensoren, die bereits das experimentelle in vivo-Stadium erreicht haben, basieren auf einem System mit immobilisiertem Enzym Glucoseoxidase auf einer Elektrode. Dies hat den Vorteil, daß die Elektrode miniaturisiert werden kann und leicht als ganzes implantiert werden kann. Allerdings besteht ein wichtiger Nachteil darin, daß die Enzymstabilität unter diesen Bedingungen begrenzt ist und daß folglich ein häufiger Ersatz der Elektrode (3 bis 4 Tage) notwendig ist. Eine weitere Anforderung in der Technik der Immobilisierung besteht darin, daß jede Elektrode individuell geeicht werden muß und daß einige Stunden am Tag notwendig sind, bevor die Elektrode ein stabiles Signal geben kann.
In der WO-A-89/02720 ist eine Vorrichtung offenbart, die ähnlich wie die Vorrichtungen der Erfindung keine implantierte Elektrode verwendet, sondern ein Implantat aus einer Hohlfaser verwendet, welche zur Mikrodialyse geeignet ist.
Allerdings benötigt diese Vorrichtung einen Behälter für Perfusionsflüssigkeit und einen Behälter für Flüssigkeiten, die durch die Hohlfaser gegangen sind. Mit anderen Worten, es gibt keinen geschlossenen Kreislauf und beide Behälter müssen oft ausgetauscht werden. Eine entsprechende Vorrichtung ist in EP-A-0 134 758 offenbart.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum kontinuierlichen Messen der Konzentration eines Analyten in Gewebe, wie es in Anspruch 1 definiert ist, und eine Vorrichtung, wie sie in Anspruch 13 definiert ist, bereit.
Dies macht das Nachweissystem zu einem dynamischen geschlossenen Kreissystem; daher kann dieses Verfahren über einen längeren Zeitraum als die Verfahren des Standes der Technik ohne die Notwendigkeit, Behälter zu ersetzen, durchgeführt werden.
Um einen (Glucose-) Sensor auf der Basis von Mikrodialyse in einem geschlossenen Kreislauf zu schaffen, ist es absolut notwendig, den gesamten Analyten (Glucose) (über 95%) im Dialysat zu entfernen oder zu eliminieren, bevor es wieder in den Körper-Mikrodialyse-Kreislauf eintritt, um einen Analayten-Akkumulation (von Glucose) innerhalb des Meßkreislaufs zu vermeiden. Daher muß eine, den Analyten (Glucose) eliminierende Vorrichtung, die im folgenden Glucose-Eliminator (GE) genannt wird, entweder vor oder nach der Meßzelle in den Dialysekreislauf integriert werden.
Es ist auch sehr wichtig, daß das Makromolekül (üblicherweise nicht-menschlichen Ursprungs) nicht in bedeutenden Mengen in der Perfusionsflüssigkeit vorhanden ist. Es wurde gezeigt, daß obgleich die Porengröße der in diesen Verfahren verwendeten Hohlfasern beschriebenermaßen für solche Makromoleküle zu klein ist, immer ein Leckverlust an Makromolekülen auftritt. Daher wären die Vorrichtung und/oder das Verfahren, die in WO-A-89/02720 offenbart sind, zum Aufbau eines geschlossenen Kreislaufs nicht geeignet, da die Makromoleküle in das Gewebe ausströmen würden und allergische Reaktionen, Entzündung und/oder Überempfindlichkeit für die Makromoleküle auftreten würden.
In den Verfahren der vorliegenden Erfindung sind die Makromoleküle durch eine zweite Hohlfaser, die für den Analyten, nicht aber für die Makromoleküle permeabel ist, von der Perfusionsflüssigkeit getrennt.
Die Perfusionsflüssigkeit ist durch eine erste Hohlfaser von dem Gewebe getrennt. Wenn einige Makromoleküle aus einer oder beiden Hohlfasern austreten, dann ist die Menge der Makromoleküle, die mit dem Gewebe in Kontakt kommen, wahrscheinlich immer noch zu gering, um zu ernsten Problemen zu führen.
Um selbst ein kleines Risiko einer Körperreaktion auf die Makromoleküle auszuschließen, ist es bevorzugt, daß ein Filter für solche Makromoleküle in dem Flüssigkeitskreislauf vorhanden ist; in einer Reihe von Fällen (z. B. für Glucoseoxidase) ist ein Aktivkohlefilter ein geeignetes Filter.
In vielen Fällen kann das Makromolekül, das zur Reaktion mit und dadurch zum Nachweis des Analyten verwendet wird, ein Enzym sein, für das der Analyt ein Substrat ist. Dies ist bevorzugt, da ein Enzym eine große Menge an Umwandlungen durchführen kann und daher die Kapazität zum Nachweis eines Analyten über einen langen Zeitraum ausreichend sein wird. Wenn Antikörper oder andere Reagenzien verwendet werden, werden sie üblicherweise nur ein paar Analytenmoleküle pro Makromolekül binden und haben so eine weitaus begrenztere Kapazität. Wenn Analyten nachzuweisen sind, die nur in Spurenmengen vorliegen, kann dies für einen ausreichend langen Zeitraum ausreichen. Im Fall von Glucose-Messungen ist ein Enzym bevorzugt.
Ein geeignetes Enzym, das Glucose als Substrat verwendet, ist Glucoseoxidase.
Glucose und Sauerstoff reagieren unter dem Einfluß von Glucoseoxidase (GOD) gemäß dem folgenden Schema. Man kann entweder die verbleibende Menge an Sauerstoff oder die produzierte Menge an H&sub2;O&sub2; messen.
Glucose +O&sub2; Glucon-δ-Lacton +H&sub2;O&sub2;
Zur kontinuierlichen Messung in vivo hat dieses Verfahren einige Nachteile:
1. Die O&sub2;-Konzentration in der zu messenden Flüssigkeit (gesättigt in Wasser oder Körperflüssigkeit) ist nicht ausreichend. Bei Glucose-Konzentrationen von 100 mg/dl oder mehr, ist die O&sub2;-Konzentration bereits 0, und Glucose ist nicht länger meßbar. Daher sollte die Glucose-Konzentration, die an der enzymatischen Reaktion beteiligt ist, hinsichtlich der O&sub2;-Konzentration beschränkt werden.
2. Das Enzym GOD wird während der Messung, speziell durch die Anwesenheit von Wasserstoffperoxid, das in der Reaktion gebildet wird, abgebaut.
3. H&sub2;O&sub2; diffundiert leicht in den Körper, was Entzündungsreaktionen verursacht. Selbst das Enzym GOD diffundiert durch wenige große Poren, die unvermeidlich bei den im Moment verfügbaren Ultrafiltrationsmembranen vorliegen, in den Körper.
Die Verwendung eines Mikrodialysesystems kann die oben genannten Probleme verhindern oder umgehen:
1. Eine Verdünnung der Glucose-Konzentration im Körper wird in einfacher Weise erreicht, indem kurze Hohlfasern für die Sonde ausgewählt werden oder indem die Perfusionsgeschwindigkeit angepaßt wird.
2. Ein Enzymüberschuß, der abgebautes Enzym ersetzen kann, wird in einfacher Weise in das Mikrodialysesystem eingeführt. Z. B.: es kann eine weit höhere Konzentration an aufgelöstem Enzym angewendet werden; aber auch Verfahren, die das Enzym in kontrollierter Weise dosieren, können nützlich sein, um die Sensorlebenszeit deutlich zu verlängern.
3. Eine Diffusion von H&sub2;O&sub2; und/oder Enzym in den Körper kann unter Verwendung des Mikrodialysesystems als Grenzfläche zwischen dem Körper und der Messung verhindert werden, wobei die "Hohlfaser"-Sonde im Körper nur von einer körperverträgliche Flüssigkeit perfundiert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, die verwendete Sauerstoffmenge, vorzugsweise unter Verwendung einer Elektrode zu messen. Dies hat den Vorteil, daß an die Qualität des verwendeten Enzyms weniger strenge Anforderungen gestellt werden müssen. Wenn der Glucose-Sensor auf einer Messung der resultierenden Menge an Wasserstoffperoxid basieren würde, könnte Spuren des Enzyms Katalase, das den Abbau von Wasserstoffperoxid katalysiert, die Genauigkeit der Messung nachteilig beeinflussen. Ein zweites Problem, das mit einer Messung der resultierenden Menge an Wasserstoffperoxid verbunden ist, besteht darin, daß die Dialyseflüssigkeit, die das gebildete H&sub2;O&sub2; enthält, unmittelbar mit der Elektrode in Kontakt gebracht werden muß, was dazu führt, daß andere Substanzen in der Dialyseflüssigkeit einen störenden Effekt auf die Messung haben. Dieser zuletzt genannte Nachteil könnte möglicherweise durch Verwendung spezieller Membranen, z. B. spezieller Celluloseester-Membranen verhindert werden, aber eine vollkommene Trennung von Dialyseflüssigkeit und Elektrode, die nur zuläßt, daß Wasserstoffperoxid durchgeht, ist kaum zu erreichen. Wenn allerdings die verwendete Sauerstoffmenge gemessen wird, kann die Dialyseflüssigkeit von der Elektrode mittels einer Membran, die nur für Gase durchlässig ist, z. B. eine Teflon-Membran, völlig getrennt gehalten werden und die Messung kann in einem wohl definierten Elektrolyten, z. B. einem Kaliumphosphat-Puffer mit 1/15 M K&sub2;HPO&sub4; durchgeführt werden.
In diesem Zusammenhang ist es gemäß der Erfindung bevorzugt, daß eine Meßzelle verwendet wird, die eine Arbeitselektrode, einen Elektrolytenraum, der mit dem Elektrolyten gefüllt ist, und eine Bezugselektrode umfaßt, und daß die Perfusionsflüssigkeit über eine Strömungskammer, die in einem Strömungselement angeordnet ist, an der der Meßzelle vorbeigeleitet wird, wobei die Strömungskammer einen Einlaß für die aus der ersten Hohlfaser kommende Perfusionsflüssigkeit und einen Auslaß für die Perfusionsflüssigkeit zur Zurückführung zu der ersten Hohlfaser hat und durch eine für Sauerstoffgas durchlässige Membran von der Meßzelle abgetrennt ist. Bezüglich der Meßzelle ist es bevorzugt, daß eine Arbeitselektrode aus einem Edelmetall, z. B. Gold, Silber und vorzugsweise Platin, und eine Bezugselektrode aus Silber verwendet werden, der verwendete Elektrolyt ein Kaliumphosphatpuffer, vorzugsweise 1/15 M K&sub2;HPO&sub4; ist, die verwendete Membran, die für · Sauerstoffgas durchlässig ist, eine hydrophobe Membran, vorzugsweise eine Teflon-Membran ist, und eine Spannung, die bezüglich der Bezugselektrode negativ ist, von etwa 0,6 V an die Arbeitselektrode angelegt wird.
Vorzugsweise sollte der Enzymreaktor, der einen Überschuß Glucoseoxidase und Katalase enthält, die gesamte Glucose, die in dem Dialysat vorliegt, umwandeln, bevor sie die Sauerstoffelektrode passiert (und als Eliminator arbeiten). In diesem Fall verhindert das Meßprinzip automatisch eine Glucose-Akkumulation. Aus Gründen einer Erhöhung des Zeitintervalls und der Verzögerung ist allerdings der Enzymreaktor in der Größe limitiert und wird wahrscheinlich nicht ausreichen, um die gesamte Glucose zu eliminieren.
Der Reaktor umfaßt einen nicht-gasdurchlässigen Schlauch (z. B. Polyethylen: Innendurchmesser 0,35 mm), durch welchen eine semipermeable Membran, vorzugsweise regenerierte Cellulose (Außendurchmesser 200 um; MWCO = 9000 Dalton) geführt wird. Um die Membran befindet sich die Enzymlösung. Glucose diffundiert aus dem interluminalen Raum in die Enzymschicht und wird durch das Enzym Glucoseoxidase umgewandelt. Eine resultierende Abnahme der Sauerstoffkonzentration spiegelt sich im Dialysat wieder und wird danach mit der Sauerstoffelektrode gemessen. Um eine rasche Messung zu garantieren, sollte der Durchmesser des Enzymreaktors so klein wie möglich sein, um so eine rasche Wiedergabe der verringerten Sauerstoffkonzentration in dem interluminalen Raum der Dialysefaser zu unterstützen.
Ein vergleichbarer Aufbau kann als Glucose-Eliminator verwendet werden, um in den Mikrodialysekreislauf integriert zu werden, vorzugsweise zwischen der Meßzelle (Sauerstoffelektrode) und der Pumpe.
Glucoseoxidase oder ein beliebiges anderes Enzym, das Glucose umwandelt (z. B. Glucose-Dehydrogenase), kann in einen solchen Eliminator eingebaut werden. Äußerer und innerer Durchmesser wie auch Typ der Membranen, die in einem solchen Eliminator eingesetzt werden, sind weniger wichtig als in dem Enzymreaktor, der die Messung liefert.
Mehrere Cellulose-Membranen können zu einem Enzymfach verklebt werden, um die Glucose innerhalb des Eliminators reagieren zu lassen. Die Enzym-Lösung sollte vorzugsweise Katalase enthalten, um das in der Glucoseoxidase-Reaktion gebildeten Wasserstoffperoxid zu eliminieren.
Der Glucose-Eliminator auf Enzymbasis, kann Glucoseoxidase und Katalase in Lösung enthalten; allerdings können auch andere Wege einer Enzymimmobilisierung angewendet werden, z. B. Anbringen des Enzyms in einem Gel oder Immobilisieren desselben an der Innenwand eines Schlauchs. Die Kontaktzeit der Perfusionsflüssigkeit mit dem Enzym (Reaktor) sollte lang genug sein, um sicherzustellen, daß die gesamte Glucose eliminiert wird. Daher können die Abmessungen des Glucoseeliminators in Länge und Durchmesser in großem Umfang variieren.
Ein geeigneter Glucose-Eliminator umfaßt einen Teflonschlauch (Innendurchmesser 0,96 mm, Länge 80 mm), durch den vier Cellulose-Fasern geführt werden. Ein Überschuß an Glucoseoxidase und Katalase (> 40000 U/ml) werden in Salzlösung (0,9% NaCl in Wasser), die die Cellulose- Membranen umgibt, aufgelöst. Da der Eliminator nicht zur Bereitstellung einer Messung bestimmt ist, werden vorzugsweise sauerstoffdurchlässige Schläuche für den Aufbau verwendet, da für die enzymatische Reaktion ausreichend Sauerstoff benötigt wird.
Andere Enzyme wie Glucosedehydrogenase können in dem Eliminator verwendet werden, vorausgesetzt, daß alle Co- Faktoren und andere Reagenzien, die notwendig sind, ebenfalls vorhanden sind.
Weitere Wege der Eliminierung von Glucose können angewendet werden, um die Glucose im Dialysat zu entfernen. Die Anwendung von Wärmeabbau, beispielsweise durch einen Tauchsieder, ist ein mögliches Verfahren, wenn auch energieaufwendig. Ein weiterer Weg des Verbrauchens der Dialysatglucose ist die Verwendung von Mikroorganismen. Verschiedene Typen von Mikroorganismen sind als selektive Verbraucher von Zuckern bekannt, so daß ein Einbau in einen Glucose-Eliminator möglich sein könnte. Wenn eine in vivo- Anwendung angestrebt wird, sollten allerdings zusätzliche Sicherheitsmaßnahmen durchgeführt werden, wenn Mikroorganismen involviert sind.
Eine weitere Strategie zur Eliminierung von Glucose im Mikrodialyse-Kreislauf ist die Verwendung von spezifischen chemischen Reagenzien, um Glucose zu adorbieren oder direkt mit Glucose zu reagieren. Nachteil dieses Typs von Eliminierungsverfahren ist die Tatsache, daß es eine Grenze für ihre Funktion gibt. Die Adsorptionskapazität ist limitiert und hängt von der Glucosemenge ab, die vorhanden ist. Dasselbe gilt für nicht-enzymatische chemische Reaktionen. Wenn allerdings eine überschüssige Menge einer selektiven Glucose eliminierenden chemischen Substanz in eine Vorrichtung integriert werden kann, könnte ein solcher Aufbau geeignet sein.
Die Hohlfasern, die für eine Mikrodialyse verwendet werden, müssen für den Analyten (Glucose) permeabel sein.
Vorzugsweise wird eine Faser aus verseiftem Celluloseester mit einem Molekulargewichts-Grenzwert von etwa 10 kD verwendet. Allerdings sind auch andere Typen von Materialien verwendbar, z. B. Hohlfasern aus Polysulfon und Acryl- Copolymer (Amicon). Die bevorzugte Cellulosefaser ist allerdings stärker und flexiebler und kann einfacher in den Körper eingesetzt werden als die dickere und empfindlichere Amicon-Faser.
Was die Größen angeht, ist es bevorzugt, daß eine Hohlfaser verwendet wird, die einen inneren Durchmesser von 100 bis 500 um, vorzugsweise 120 bis 200 um, einen äußeren Durchmesser von 130 bis 550 um, vorzugsweise 150 bis 250 um hat und die 0,1 bis 3 cm, vorzugsweise 0,5 bis 2,5 cm lang ist.
Auch die Natur der Schläuche, die zu und von der ersten Hohlfaser führen und ansonsten als Verbindungen zwischen verschiedenen Elementen der Vorrichtungen vorliegen, ist nicht kritisch, vorausgesetzt, daß sie luftdicht sind. Bevorzugt sind Polyethylen-Schläuche. Was ihre Größen angeht, so ist es bevorzugt, daß die luftdichten Zuführungs- und Entnahmeschläuche einen inneren Durchmesser von 0,2 bis 0,6 mm, vorzugsweise von 0,25 bis 0,35 mm und einen äußeren Durchmesser von 0,4 bis 1,0 mm, vorzugsweise von 0,6 bis 0,8 mm haben.
Die Länge des luftdichten Entnahmeschlauches zwischen der Hohlfaser und dem Reaktor muß vorzugsweise möglichst klein sein, um so eine schnelle Reaktion zu ermöglichen. Es ist bevorzugt, daß der luftdichte Entnahmeschlauch zwischen der Hohlfaser und dem Reaktor 1 bis 10 cm, vorzugsweise 1 bis 5 cm in der Länge ist.
Für das Meßelement ist es in Verbindung mit einer hohen Genauigkeit des Glucose-Sensors bevorzugt, daß eine Strömungskammer verwendet wird, die für den Perfusionsflüssigkeitseinlaß und -auslaß solche Abmessungen, Gestalt und Position hat, daß im wesentlichen kein toter Raum auftritt. Die freigelegte Oberfläche der Arbeitselektrode, die durch die für Sauerstoff (oder H&sub2;O&sub2;) permeable Membran von der Perfusionsflüssigkeit getrennt ist, kann quer zur Strömungsrichtung der Perfusionsflüssigkeit sein oder kann in einer Linie mit der Perfusionsflüssigkeitseinlaßöffung liegen, wobei der Abstand zwischen der Einlaßöffnung und der freigelegten Oberfläche der Arbeitselektrode vorzugsweise weniger als 5 mm und am günstigsten weniger als 1 mm ist.
Außerdem stellt die Erfindung ein künstliches Pankreas bereit, das zusätzlich zu den bereits beschriebenen Vorrichtungen ein steuerbares Injektionssystem zum Einführen von Wirkstoffen, wie z. B. Insulin, in den Organismus; ein Berechnungs- und Steuerungssystem zur Berechnung der Glucose- Konzentration in dem subkutanen Gewebe auf der Basis der Meßwerte der Meßzelle und einer dazugehörigen Eichkurve mit Hilfe eines Algorithmus, dessen charakteristische und relevante Parameter in einem mathematischen Modell enthalten sind, Bestimmen der Menge des Wirkstoffs, der zuzuführen ist, und Steuern des steuerbaren Injektionssystems in einer Weise, daß die Glucose-(Analyt)-Konzentration im Gewebe und/oder im Blut innerhalb vorher festgesetzter Werte bleibt, umfaßt. Vorzugsweise hat die Rechnereinheit auch eine Alarmfunktion für den Fall extremer Glucose-Konzentrationen im Körper und im Fall von Versagen. Die Recheneinheit kann auch das zweite Task zum Überwachen der Kurve der Speicherkonzentration und Insulinzuführung haben, das dieselbe im lokalen Speicher speichert und auf Befehl eines äußeren Systems zu anderen Datenverarbeitungssystemen transportiert.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen und mit Hilfe einer Beschreibung von durchgeführten Experimenten erläutert.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 stellt ein Kohlefilter dar, das in den Verfahren und den Vorrichtungen gemäß der Erfindung verwendet werden kann. Die Aktivkohle befindet sich in einem Polyethylenschlauch, der mit Polyacrylnitril-Fasern ausgestattet ist. An beiden Enden ist das Filter durch luftdichte Polyethylenschläuche mit einem weiteren Element der Vorrichtung verbunden.
Fig. 2 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur Messung von Glucose-Konzentrationen, wobei die Sonde die Hohlfaser, die zur Mikrodialyse subkutan implantiert wird, darstellt, die Probe mit dem Rest der Vorrichtung in einer Weise verbunden ist, daß sie in einfacher Weise abgetrennt und wieder angeschlossen werden kann, so daß, wenn das Enzym oder das Filter oder der Eliminator ersetzt werden muß, keine erneute Implantation notwendig ist. In der Figur geben die Pfeile die Strömungsrichtung der Perfusionsflüssigkeit an. Stromabwärts von der Sonde, durch einen luftdichten Schlauch damit verbunden, ist der Enzymreaktor, in dem das Enzym durch eine für Glucose, nicht aber für Glucosidase durchlässige Membran von der Perfusionsflüssigkeit getrennt ist. Stromabwärts vom Enzymreaktor wird der im Reaktor produzierte Sauerstoff durch eine Sauerstoffelektrode gemessen, die elektrisch mit einem signalproduzierenden System außerhalb des Kreislaufs verbunden ist. Von der Elektrode wird die Perfusionsflüssigkeit durch den Glucose-Eliminator geführt, der eine Anzahl von Fasern enthält, durch welche die Flüssigkeit geführt wird und die für Glucose, nicht aber für Glucosidase permeabel sind. Diese Fasern umschließt eine Kammer, in der sich Glucoseoxidase befindet. Stromabwärts vom Eliminator ist eine Pumpe angeordnet und stromabwärts von der Pumpe befindet sich das Kohlefilter gemäß Fig. 1. Die Perfusionsflüssigkeit wird von dem Filter zu der Sonde geführt.
Die Fig. 3 und die Fig. 3a geben den Output einer tragbaren Vorrichtung gemäß Fig. 2 an, wenn diese einer gesunden Person implantiert ist. In der graphischen Darstellung stellt die Kurve die Glucose-Konzentrationen, die durch die Vorrichtung gemessen wurden, dar; die ausgefüllten Quadrate sind Glucose-Konzentrationen, die unter Anwendung von Standardverfahren im Blut gemessen wurden. Im unteren Teil des Diagramms geben die nicht-ausgefüllten Quadrate die für die Glucose-Konzentrationen relevanten Ereignisse an. Die Messungen wurden mit einer Vorrichtung bis zu 6 Tagen durchgeführt.

BEISPIELE

IN VITRO-EXPERIMENTE

Wenn der Glucose-Sensor in vitro verwendet wird, ist es von großer Wichtigkeit, daß keine Glucoseoxidase (GOD)- Enzymmoleküle in den Körper diffundieren können, da GOD wegen der H&sub2;O&sub2;-Produktion eine immunoallergische Reaktion auslösen und eine lokale Reizung verursachen kann. Obgleich die Enzym- Lösung mit Hilfe einer Membran aus regenerierter Cellulose von der Perfusionsflüssigkeit getrennt gehalten wird, ist es einigen GOD-Molekülen möglich, in die Perfusionsflüssigkeit einzutreten. Dies ist möglich, weil jede Membran einige sogenannte "pin-holes" hat; dies sind sehr große Poren, durch welche GOD-Moleküle in die Perfusionsflüssigkeit ausströmen können. Durch den Einbau eines "Kohlefilters" in das Strömungssystem ist es möglich, die GOD-Moleküle aus der Perfusionsflüssigkeit zu entfernen. Vorzugsweise ist dieses Kohlenstoffilter zwischen der Pumpe und der Dialysesonde angeordnet. Auf diese Weise dämpft das Kohlefilter auch den Pumpstoß und schafft auf diese Weise eine konstantere Perfusionsströmung.
Das Kohlefilter [Fig. 1] besteht aus einem Polyethylenschlauch (innerer Durchmesser 3 mm, Länge 5 cm), indem sich ein Bündel aus drei Polyacrylnitril-Fasern befindet. Er ist mit etwa 50 mg Aktivkohle ausgestattet. Wegen dieses zusätzlichen Filtrationsschrittes bleibt die Perfusionsflüssigkeit länger in dem Kohlefilter. Dies ermöglicht es, daß die Kohle die GOD-Moleküle wirksamer adsorbiert. Die Kapazität des Kohlefilters kann durch Erhöhen der Menge an Kohlenstoff gesteigert werden.
Um zu bestimmen, wieviel GOD durch die Aktivkohle entfernt werden könnte, führten wir die folgenden Experimente durch. Um das Vorliegen von GOD zu zeigen, verwendeten wird Perid®- Sticks, die mit Glucose imprägniert waren. Diese Sticks wechseln die Farbe nach Blau/Grün, wenn GOD-Moleküle in der Testflüssigkeit vorhanden sind. Es ist möglich, eine GOD- Enzymkonzentration von 0,025 Einheiten GOD/ml nachzuweisen.
Unser erstes Experiment wurde durchgeführt, um zu zeigen, daß Kohlenstoff tatsächlich GOD-Moleküle adsorbiert. In diesem Experiment verwendeten wir Kohlefilter, wie sie oben beschrieben sind, allerdings mit der Ausnahme hinsichtlich des Bündels aus Polyacrylnitril-Fasern. Wir perfundierten diese Kohlefilter mit einer GOD-Lösung von 30 Einheit GOD/ml bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,6 ml/h. Wir untersuchten das Perfusat jede Stunde auf GOD-Moleküle. Nach 2 1/2 Tagen wurden die GOD-Moleküle in dem Perfusat festgestellt. Wir schlossen daraus, daß Aktivkohle tatsächlich die GOD-Enzyme adsorbiert, daß die Adsorptionsmenge von der Aktivkohlekonzentration und der GOD- Konzentration in der perfundierten GOD-Lösung und der Zeit, die diese GOD-Moleküle im Kohlefilter vorliegen, abhängt.
In unserem zweiten Experiment bestimmten wir, wie viele GOD- Einheiten durch 1 mg Aktivkohle adsorbiert werden. Kohlefilter mit einer bekannte Aktivkohlemenge wurden mit einer Lösung einer bekannten Konzentration an GOD perfundiert. In diesen Filtern wurden keine Polyacrylnitril- Fasern verwendet. Alle Stunde wurde eine Probe entnommen und auf die Anwesenheit von GOD-Molekülen untersucht. Dann wurde die Konzentration an GOD, die durch 1 mg Kohle adsorbiert worden war, errechnet. Es scheint, daß durchschnittlich 1,8 bis 0,2 Einheiten GOD von 1 mg Aktivkohle adsorbiert werden.
Wenn der Glucose-Sensor in vivo oder in vitro verwendet wird, wird die Perfusionsflüssigkeit regelmäßig auf GOD-Moleküle untersucht. Es wird eine Perfusionsprobe vor und nach Passieren des Kohlefilters entnommen. In der Praxis arbeiten die Kohlefilter sehr wohl über einen Zeitraum von mindestens einem Monat; selbst wenn GOD-Moleküle vor dem Passieren des Kohlefilters in der Probe vorliegen, werden stromabwärts vom Filter keine GOD-Moleküle in der Probe nachgewiesen. Die Lebensdauer der Kohlefilter kann durch Verwendung einer größeren Kohlemenge und der Anwendung eines Bündels aus Polyacrylnitril-Fasern erhöht werden. Wir haben gezeigt, daß auf diese Weise die Reinigung der Perfusionsflüssigkeit erzielt werden kann und daß die Gefahr eines GOD-Leckens in den Körper verhindert werden kann.

IN VIVO-EXPERIMENTE

Wir führten dieses neue Mikrodialysesystem mit geschlossenem Kreislauf in neun ambulanten in vivo-Experimenten an gesunden Freiwilligen durch. Die mittlere Dauer dieser in vivo- Versuche war etwa 3 Tage. Das längste in vivo-Experiment dauerte 6 Tage. Diese Experimente wurden so durchgeführt, daß die Freiwilligem ihrem täglichen Leben nachgehen konnten, während sie das Sensorsystem trugen.
Die Glucose-Sensoren [Fig. 2], die in diesen in vivo- Experimenten verwendet wurden, wurden in vitro geeicht. Die Glucose-Konzentration im subkutanen Gewebe ist etwa 45 ± 9% des Blutwertes. Mit den bei der in vitro-Eichung gefunden Daten kann die Glucose-Konzentration im Blut zu jedem beliebigen Moment errechnet werden.
Die Glucose-Sonde des Glucose-Sensors wird subkutan im abdominalen Fettgewebe mit Hilfe eines 16-Katheters plaziert und mit einem Pflaster fixiert. Die Behälter mit dem Strömungssystem und dem tragbaren Datenverarbeitungsgerät werden in einem Gürtel um die Taille der Person getragen. Die Personen wurden gebeten, ihre Blutzucker-Konzentration regelmäßig mit Hilfe eines handelsüblichen tragbaren Blutzuckermeßgeräts zu messen. Diese Werte sind Angaben für die Blutzuckerkonzentrationen der Personen und werden mit den Sensormessungen verglichen. Die Person notiert auch, was er oder sie ist und was er oder sie tut, so weit es relevant ist. Diese Daten werden in einem Diagramm aufgetragen, um das Funktionieren des Sensors zu prüfen. Wir wurden niemals bei einer der Personen mit einer Entzündungsreaktion an der Sensorimplantationsstelle konfrontiert.

Claims

1. Verfahren zum kontinuierlichen Messen der Konzentration eines Analyten in einem lebenden Gewebe mittels einer tragbaren Vorrichtung, die mit einer ersten Hohlfaser Verbunden ist und die in das Gewebe implantiert wurde, wobei die Vorrichtung einen Reaktor umfaßt, der einen Behälter beinhaltet, der makromolekulare Reaktanten zum Nachweisen des Analyten und ein damit gekoppeltes Signalerzeugungssystem umfaßt, wobei die erste Hohlfaser eine Porengröße aufweist, die zwischen der Größe des Adalyten und der Größe der makromolekularen Reaktanten liegt, und der Reaktor eine zweite Hohlfaser umfaßt, die eine Porengröße aufweist, die zwischen der Größe des Analyten und der Größe der makromolekularen Reaktanten liegt, wobei sich die Hohlfaser in dem Behälter befindet, wobei das Verfahren umfaßt:

- Leiten einer Lösung, die mit dem Gewebe verträglich ist, aus dar ersten Hohlfaser, die durch den Reaktor hindurch mit der Lösung perfundiert wurde;

- Leiten der Perfusionsflüssigkeit aus dem Reaktor in einen Eliminator für den Analyten, wobei wenigstens 95% des restlichen Analyten aus der Perfusionsflüssigkeit entfernt werden; sowie

- Wiedereinführen der Perfusionsflüssigkeit in die erste Hohlfaser.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei zwischen dem Reaktor und dem Punkt des Wiedereinführens der Flüssigkeit in die erste Hohlfaser ein Filter in den Strom der Perfusionsflüssigkeit eingesetzt ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Filter ein Aktivkohlefilter ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Eliminator ein Enzym umfaßt, für das der Analyt ein Substrat ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei der Reaktor ein Enzym umfaßt, für das der Analyt ein Substrat ist.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-5, wobei es sich bei dem Analyten um Glucose handelt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei Glucose mit einer Glucose-Oxidase umgesetzt wird, so daß ein nachweisbares Signal entsteht.

8. Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das für den Nachweis verwendete nachweisbare Signal eine abnehmende Menge an O&sub2; in der Perfusionsflüssigkeit ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die abnehmende Menge an Sauerstoff mit einer Meßzelle gemessen wird, die eine Arbeitselektrode, einen mit Elektrolyt gefüllten Elektrolytraum und eine Bezugselektrode umfaßt, wobei die Perfusionsflüssigkeit an der Meßzelle vorbeigeleitet wird, von der sie durch eine sauerstoffdurchlässige Membran getrennt ist.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei eine Arbeitselektrode aus einem Edelmetall und eine Bezugselektrode aus Silber verwendet werden.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 6-10, wobei der nicht umgesetzte Analyt im Eliminator durch Umsetzung mit Glucose-Oxidase entfernt wird.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der Eliminator Katalase umfaßt.

13. Vorrichtung, die einen Flüssigkeitskreislauf umfaßt, um kontinuierlich die Konzentration eines Analyten in lebendem Gewebe zu messen, umfassend:

- einen Reaktor, der einen Behälter beinhaltet, wobei der Behälter mit wenigstens einem makromolekularen Reaktanten für den Analyten versehen ist;

- eine erste Hohlfaser, die eine Porengröße aufweist, die zwischen der Größe des Analyten und der Größe des wenigstens einen makromolekularen Reaktanten liegt, wobei die Hohlfaser mit einer Perfusionsflüssigkeit, die mit des Gewebe verträglich ist, gefüllt ist und vor dem Reaktor angeschlossen ist, wobei der Reaktor eine zweite Hohlfaser umfaßt, die eine Porengröße aufweist, die zwischen der Größe des Analyten und der Größe des wenigstens einen makromolekularen Reaktanten liegt, wobei sich die zweite Hohlfaser in dem Behälter befindet, wobei der Reaktor mit einem Signalerzeugungssystem in Verbindung steht, das eines der Reaktionsprodukte der Reaktion zwischen Analyt und Reaktant nachweist und ein Signal liefert;

- einen Eliminator für nicht umgesetzten Analyten, der sich hinter dem Reaktor befindet; und

- eine Pumpeinrichtung zum Zirkulieren der Perfusionsflüssigkeit.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, wobei hinter dem Reaktor ein Filter in den Flüssigkeitskreislauf eingesetzt ist.

15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, wobei das Filter ein Aktivkohlefilter ist.

16. Vorrichtung gemäß Anspruch 13-15, wobei das Signalerzeugungssystem eine Edelmetall-Arbeitselektrode und eine Silber-Bezugselektrode in einer Elektrolytlösung umfaßt, wobei es sich bei der Elektrolytlösung um einen Kaliumphosphatpuffer handelt, zum Messen der Abnahme der Sauerstoffmenge in der Perfusionsflüssigkeit, wobei das Signalerzeugungssystem über eine für Sauerstoffgas durchlässige Membran mit der Perfusionsflüssigkeit in Kontakt steht.

17. Vorrichtung gemäß Anspruch 13, 14, 15 oder 16, wobei es sich bei einem der makromolekularen Reaktanten um Glucose-Oxidase und bei dem Analyten um Glucose handelt.

Vorrichtung gemäß Anspruch 17, wobei das Signalerzeugungssystem mit einem Dosierungsinstrument zum Verabreichen von Glucose gekoppelt ist, das auf den gemessenen Wert des Signals anspricht.

19. Vorrichtung gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei das Signalerzeugungssystem mit einem Dosierungsinstrument zum Verabreichen von Insulin gekoppelt ist, das auf den gemessenen Wert des Signals anspricht.

20. Künstliche Bauchspeicheldrüse, die die Vorrichtung gemäß Anspruch 17 umfaßt, die mit einem Dosierungsinstrument zum Verabreichen von Glucose und einem bosierungsinstrument zum Verabreichen von Insulin gekoppelt ist.