DE3042080A1

DE3042080A1 - Vorrichtung zum gleichzeitigen messen mehrerer bestandteile fuer ein durchflusssystem

Info

Publication number: DE3042080A1
Application number: DE19803042080
Authority: DE
Inventors: Tsutomu Shizuoka Hirata; Kunio Mishima Shizuoka Matsumoto; Hiroyuki Mizuguchi
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1979-11-09
Filing date: 1980-11-07
Publication date: 1981-05-21
Also published as: FR2469707A1; GB2063479B; DK475080A; FR2469707B1; GB2063479A

Description

Vorrichtung zum gleichzeitigen Messen mehrerer Bestandteile für ein Durchfluß sy stern

Die Erfindung betrifft eine in einem Durchflußsystern kontinuierlichen Durchflusses einsetzbare Vorrichtung, mit der gleichzeitig mehrere Bestandteile in einer Probe gemessen werden können

In den vergangenen Jahren sind Enzymanalyseverfahren entwickelt worden, in denen unter Verwendung von Enzymen quantitative Analysen der in einer Probe enthaltenen Bestandteile vorgenommen werden. Solche Enzym-Analyseverfahren haben jedoch den Nachteil, daß sie unwirtschaftlich sind, weil teure Enzyme und sonstige Hilfsmittel in großer Menge verbraucht werden, der Betrieb umständlich ist und die Messung lange dauert. Darüber hinaus sind die Enzyme nicht stabil.

Zur Verbesserung dieser Situation ist vorgeschlagen worden, immobilisierte Enzyme, insbesondere eine sogenannte Enzymelektrode zu verwenden, d.h. ein Verfahren anzuwenden, bei dem ein immobilisiertes Enzym in Kombination mit einer elektrochemischen Messung verwendet wird. Ein Meßverfahren, bei dem eine Enzymelektrode verwendet wird, hat viele Vorteile, denn der Betrieb ist zweckmäßig, es werden geringe Mengen an Hilfsmitteln, wie Reagentien benötigt, die Meßzeit ist verkürzt und insbesondere ist der Verbrauch an Enzymen deutlich geringer. Es sind schon viele Enzymelektroden bekannt.

Beachtung finden die Enzymelektroden vor allen Dingen in der klinischen Chemie und auf anderen Gebieten, wenn es um die Analyse der Bestandteile von Fermentationsflüssigkeiten, wie Kulturfluiden und Rohstoffen, erzeugten Stoffen oder Nahrungsmittelprodukten geht.

Ferner sind Enzymelektroden schon im sogenannten Überwachungssystem für Flüssigkeitsbestandteile eingesetzt worden, wenn die Bestandteile in der Probe einer Dialyseflüssigkeit, der

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Körperflüssigkeit eines Lebewesens, die mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran oder einer Hohlfaser zubereitet wird, kontinuierlich gemessen werden. Anwendungsfälle in der Praxis sind z.B. die überwachung einer künstlichen Bauspeicheldrüse zum Messen von Blutzucker oder die überwachung einer künstlichen Niere ("Fermentation and Industry", Bd. 35, Nr. 11, S.. 42

Bei den verschiedenen obengenannten Meßverfahren ist jedoch zum Messen eines Bestandteils jeweils ein Test nötig, weil die Probe zum Messen den Meßbedingungen angepaßt wird. Wenn z.B. die Bestandteile im Blutserum gemessen werden, ist eine ziemlich große Menge an Blutserum nötig und die Messung dauert ziemlich lange, weil die einzelnen Posten getrennt gemessen werden müssen. Dieser Gesichtspunkt stellt einen bedeutenden Nachteil für die Möglichkeiten und den Noteinsatz bei der Probenentnahme insbesondere auf dem Gebiet der klinischen Chemie und Fermentation dar.

Gemäß der Erfindung ist jedoch ein Verfahren entwickelt worden, bei dem zur Analyse einer Vielzahl von Bestandteilen einer Probe die einzelnen Bestandteile bei Benutzung einer sehr geringen Probenmenge und darüber hinaus in kurzer Zeit und gleichzeitig gemessen werden können. Im Gegensatz zu bekannten Verfahren, bei denen z.B. eine große Menge Blutserum nötig ist, weil pro Test nur jeweils ein Bestandteil des Blutserums gemessen wird, ist erfindungsgemäß eine Analyse mehrerer Posten entsprechend einer Vielzahl von Komponenten bei Verwendung einer sehr geringen Menge Blutserum möglich.

Zunächst wurde von den Erfindern eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Messen einer Vielzahl von Posten und ein entsprechendes Verfahren entwickelt, die für chargenweisen Betrieb geeignet sind und aus einer Vielzahl von Elektroden bestehen, welche in einem Reaktionssystem angeordnet sind. Zusätzlich wurde eine Meßvorrichtung zur Automatisierung des Betriebs vorgeschlagen (Japanische Patentanmeldung 140 449/ 79).

*> (DE-OS 29 38 737)130021/0842

ORIGINAL

Ferner haben die Erfinder ein Meßverfahren zum gleichzeitigen Messen mehrerer Bestandteile für ein Durchfluß sy stein, d.h. eine Anlage mit kontinuierlicher Strömung geschaffen. Diese besteht als in Reaktionsgefäßen ablaufender Prozeß aus einer Vielzahl von Durchflußkü>etten oder Strömungszellen mit immobilisierten Enzymsäulen und Meßelektroden.'Bei diesem in Reaktionsgefäßen ablaufenden Verfahren treten jedoch starke Schwankungen der Sauerstoff- und Wasserstoffperoxidkonzentrationen und dgl. im System auf, wenn das dafür eingesetzte Enzym in Form einer Oxidase benutzt wird. Konzentrationsschwankungen an Sauerstoff oder Wasserstoffperoxid und dgl. im System haben starke Auswirkungen. Die gleichzeitige Messung mehrerer Bestandteile in einem Durchflußsystem ist jedoch mit verschiedenen Mitteln ermöglicht worden, z.B. mit einem Verfahren, welches eine Messung vorsieht, tun den wirksamen Unterschied in den Sauerstoff- und Wasserstoffperoxidschwankungen in der voraufgehenden Durchflußküvette und der nachfolgenden Durchflußküvette zu erhalten, ein Verfahren, gemäß dem sich die Konzentration an aufgelöstem Sauerstoff so weit erholt, daß die Schwankung der vorhergehenden Meßküvette die der folgenden Meßküvette nicht beeinträchtigt, und ein Verfahren zum Verdünnen des Wasserstoffperoxids. All diese Verfahren sind jedoch als exaktes quantitatives Meßverfahren noch nicht zufriedenstellend.

Ferner haben die Erfinder das gleichzeitige Messen mehrerer Bestandteile in einem Durchflußsystern gründlich untersucht und dabei festgestellt, daß bei Anordnung mehrerer Reaktionszelleneinheiten in einem Durchflußsystem mit Enzymelektroden, die immobilisierte Enzyme aufweisen, einschließlich verschiedener immobilisierter Oxidasen, die durch Beschichtung oder in ähnlicher Weise aufgebracht sind, die Konzentrationsschwankungen jedes Bestandteils, die auf einer Sauerstoffumsetzung bei der Aufzehrung dieses Bestandteiles durch eine Enzymreaktion beruhen, z.B. Sauerstoff oder der erzeugte Bestandteil, wie Wasserstoffperoxid usw. nicht zu den genannten

*) (Japanische Patentanmeldung 90 979 / 79)

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Mängeln_ wie der großen Schwankung im System führen, wie im Fall des in Beaktionsgefäßen ablaufenden Verfahrens mit den daraus resultierenden Einwirkungen auf das nachfolgende System. Im Verhältnis zwischen dem Enzym und dem aufgelösten Sauerstoff nimmt der im immobilisierten Enzym diffundierte, aufgelöste Sauerstoff an der Enzymreaktion teil. Der aufgelöste Sauerstoff wird an der Oberfläche von Funktionselektroden, z.B. aus Platin, Silber, Rhodium usw., an denen die Enzyme angebracht sind, unmittelbar reduziert. Die Abnahme an Sauerstoff ist sehr gering und nur auf die Nachbarschaft des immobilisierten Enzyms beschränkt und bewirkt keine Schwankung in der Sauerstoffkonzentration im System. Selbst wenn eine sehr geringe Schwankung auftritt, kann sie gemessen werden, weil dieser Wert in eine elektrische Schwankung übersetzt wird. Den Erfindern ist es damit gelungen, eine Meßvorrichtung zu schaffen, mit der mehrere Bestandteile gleichzeitig und wirksam in einem Durchflußsystem gemessen werden können, in welchem eine Vielzahl von fieaktionszelleneinheiten angeordnet ist. Ferner hat sich gezeigt, daß im Fall eines Bestandteils, der durch eine Enzymreaktion erzeugt wird, welche gleichzeitig mit einer Sauerstoff abnähme einhergeht, z.B. Wasserstoffperoxid/, eine sehr geringe Schwankung nur in der Nachbarschaft des immobilisierten Enzyms auftritt. Diese Schwankung ist meßbar. Außerdem beeinträchtigt diese Schwankung nicht die in der nachfolgenden BeaktionsZelleneinheit durchgeführte Messung. Es kann also eine gleichzeitige Messung verschiedener Posten an Bestandteilen wie diesem Wasserstoffperoxid durchgeführt werden.

Die Erfindung beruht auf den oben beschriebenen Erkenntnissen und bezieht sich auf eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Messen mehrerer Bestandteile in einem Durchflußsystern, die eine Vielzahl von Reaktionszelleneinheiten aufweist, welche hintereinander angeordnet sind und aus mindestens mehr als einer Enzymelektrode bestehen, die durch Anbringen immobilisierter Enzyme an der Funktionselektrode hergestellt ist.

Eine Vorrichtung zum gleichzeitigen Messenmshrerer Bestand-

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teile für ein . Durchflußsystern, die eine Vielzahl von hintereinander angeordneten Heaktionszelleneanheiten aufweist, welche aus Enzymelektroden bestehen, bei denen immobilisierte Enzyme an mindestens mehr als zwei Punktionselektroden angebracht sind, ermöglicht zufriedenstellende Messungen indem nur in der Nähe des immobilisierten Enzyms durch eine sehr geringe Sauerstoffmenge hervorgerufene Schwankungen gemessen werden, die keinen Einfluß auf die Sauerstoffkonzentration im System haben, und diese SauerstoffSchwankungen in elektrische Schwankungen umgewandelt werden.

Im folgenden ist die Erfindung mit weiteren vorteilhaften Einzelheiten anhand schematisch dargestellter Ausführungsbeispiele näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 ein Schema einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum

gleichzeitigen Messen mehrerer Bestandteile} Fig. 2 die Reaktionszelleneinheit der Vorrichtung gemäß Fig.

ij

Fig. 3 "bis 5 mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzielte Meßergebnisse;

Fig. 6 ein Schema einer Vorrichtung für ein in Reaktionsgefäßen ablaufendes Verfahren, bei dem immobilisierte Enzynisäulen vorgesehen sind;

Fig. 7 bis 9 die mit der Vorrichtung gemäß Fig. 6 erzielten Meßergebnisse;

Fig.10 und 11 den Aufbau einer Enzymelektrode sowie des Grundelektrodenteils;

Fig. 12 den Aufbau einer bekannten Enzymelektrode.

Mit der Vorrichtung zum gleichzeitigen Messen mehrerer Bestandteile gemäß der Erfindung können beispielsweise folgende Stoffe untersucht werden: Körperflüssigkeit eines Lebewesens, einschließlich Blut, wie Blutserum oder Blutplasma und Urin, aus Kulturen erhaltene Fermentationsflüssigkeit sowie Nahrungsmittel. Zu den Bestandteilen in der Probe, die gemessen werden können, gehören Körperflüssigkeitsbestandteile für klinische

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Diagnosen, Bestandteile von Grundnährstoffen und dergleichen, Mikroorganismen in Kulturen und Rohstoffkomponenten in Nahrungsmitteln. Hierbei handelt es sich z.B. um Glucose, Saccharose, Lactose, Milchsäure, Cholesterin, Cholesterinester, Triglycerid, Phospholipid, Stärke, Protein, Glycerin, Brenztraubensäure, Kreatinin, Kreatin, Aminosäuren, Monoamine, Diamine usw.

Als Enzyme, die zum Messen der oben erwähnten Bestandteile benutzt werden, eignen sich Oxidaseformen von Enzymen, die aus den zu messenden Bestandteilen oder deren Reaktionsprodukten als Substrat bestehen, so kann z.B. Glucoseoxidase im Fall vcn Glucose, Milchsäureoxidase im Fall von Milchsäure, Cholesterinoxidase im Fall von Cholesterin, Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase im Fall von Cholisterinestern, Lipase oder Lipoproteinlipase und Glycerinoxidase oder Glycerokinase, ATP₁ L-oC-Glycerinphosphorsäureoxidase im Fall von Triglycerid, Cholesterinoxidase im Fall von Cholin, Phospholipase D oder Phospholipase C, Alkaliphosphatase und Cholinoxidase im Fall von Phospholipiden, Glycerinoxidase oder Glycerokinase, ATP, L-cc -Glycerinphosphorsäureoxidase im Fall von Glycerin, Urikase im Fall von Harnsäure, Brenztraubensäureoxidase im Fall von Brenztraubensäure, Kreatininase, Kreatinase und Sarkosinoxidase im Fall von Kreatin, Aminosäureoxidase im Fall von Aminosäuren und Aminoxidase im Fall von Aminen verwendet werden. Entsprechend den zu messenden Bestandteilen werden verschiedene Enzyme ausgewählt, kombiniert und benutzt.

Als immobilisierte Enzyme zur erfindungsgemäßen Verwendunng eignet sich jedes einzelne der oben genannten Enzyme oder eine Kombination derselben. Die immobilisierten Enzyme können durch verschiedene Immobilisierungsverfahren erhalten werden, z.B. 1.) Einschluß und Immobilisierung mit Acrylamid, 2.) Immobilisierung durch Mischen mit unlöslichem Protein und Vernetzen des Gemisches, 3·) Immobilisieren durch Einschluß oder gleichwertiges Koppeln an Kollagen usw., 4.) Immobilisieren durch

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Adsorption oder gleichwertiges Koppeln an einen porösen, polymeren Stoff und 5.) Immobilisieren durch Verwendung eines lichthärtenden Harzes. Normalerweise werden die immobilisierten Enzyme in Form dünner Filme oder als Fasern verwendet und entsprechend der für die Messung benutzten Elektrode weite rve rar be i te t .

Wenn der zu messende Bestandteil das Substrat ist, kann als Elektrode jeder beliebige Werkstoff Verwendung finden, der zum Messen eines Bestandteils, welcher durch Enzymreaktion aufgezehrt oder erzeugt wird, geeignet ist. So wird als Sauerstoffelektrode zum Einfangen von Sauerstoff zweckmäßigerweise eine Clarke- oder eine Galvani-Elektrode verwendet, während als Wasserstoffperoxidelektrode zum Einfangen von Wasserstoffperoxid z.B. eine Ammoniakelektrode und dgl. verwendet wird. Als Funktionselektrode wird eine Elektrode bezeichnet, die beim Erfassen einer Schwankung der Bestandteile eine elektrische Schwankung abgibt.

Hinsichtlich der Enzymelektrode bestehen keine besonderen Einschränkungen. Zweckmäßigerweise wird jedoch eine Enzymelektrode verwendet, bei der zum Messen ein immobilisiertes Enzym an der Elektrode angebracht ist. Hierzu kann folgendes Verfahren angewendet werden. Z.B. ist eine Enzymelektrode verwendbar, bei der die Grundelektrode mit einer dünnen Membran aus immobilisiertem Enzym am wahrnehmenden Teil, der die Funktionselektrode darstellt, befestigt ist. Es kann auch die dünne Membran als wahrnehmender Teil bzw. als Meßfühler ausgebildet sein oder der wahrnehmende Teil, an dem die dünne Membran angebracht ist, wird mit einer Nylonnetzmembran oder einer Dialysemembran umgeben, die mittels eines O-Ringes befestigt ist. Sehr zweckmäßig ist auch eine .einfach berührende (one-touch type) Enzymelektrode, wobei zunächst eine netzartige Membran an dem zur Befestigung am wahrnehmenden Teil der Grundelektrode dienenden O-Ring angebracht wird, wobei ein Aufbau vorbereitet wird, bei dem ein immobili-

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siertes Enzym im O-Ring angebracht wird, an dem die netzartige Membran z.B. befestigt ist_; und diese Konstruktion in den wahrnehmenden Teil der Grundelektrode zur Benutzung eingesetzt wird.

Als O-Ring zum Befestigen der Enzymelektrode an der Punktionselektrode der Grundelektrode wird im allgemeinen ein ringförmiger, elastischer O-Ring, z.B. aus natürlichem oder synthetischem Kautschuk oder Silikonkautschuk verwendet. Es besteht keine besondere Einschränkung hinsichtlich des Durchmessers dieses O-Ringes, vorausgesetzt daß er an der Punktionselektrode anbringbar ist. Meistens wird zum Befestigen vorzugsweise ein O-Ring benutzt, dessen Durchmesser etwas kleiner ist als der der Punktionselektrode.

Als netzartige Membran zum Befestigen am O-Ring eignet sich eine Membran, die die Enzymreaktion des immobilisierten Enzyms nicht verhindert und das immobilisierte Enzym halten kan:a₍ und die außerdem so elastisch ist, daß das immobilisierte Enzym eng am wahrnehmenden Teil haften kann» Meistens wird eine Membran in Form eines Nylonnetzes mit einem. Zwischenraum von 0,1 - 0,2 mm und in gestrecktem Zustand von ca. 1 mm verwendet.

Eine solche Enzymelektrode ist in Fig. 10 und 11 gezeigt. Wie aus den Figuren hervorgeht, ist ein O-Ring 16 und eine Nylonnetzmembran 19 vorgesehen, die durch Auftrag eines Epoxyklebers auf den Umfang des O-Ringes vereinigt werden. Der überstehende Teil der Membran kann dann abgeschnitten werden, oder es kann eine Nylonnetzmembran verwendet werden, die schon im voraus entsprechend dem Durchmesser des O-Ringes zugeschnitten wurde. Um die Haftverbindung zwischen der Netzmembran und dem O-Ring zu verstärken,wird ein weiterer O-Ring 16 an der anderen Seite der Nylonnetzmembran 19 auf ähnliche Weise wie schon erwähnt angebracht, so daß die Nylonnetzmembran sich zwischen zwei O-Ringen eingeklebt befindet. An dieser Anordnung kann ein immobilisiertes Enzym 18 angebracht werden. Wenr.

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das immobilisierte Enzym 18 als membranartiges Material vorliegt, läßt es sich leicht in den O-Ring 16 einlegen, vorausgesetzt, daß die Membran mitkleinerem Durchmesser als der 0-Ring 16 ausgebildet ist. Hiermit ist ein Aufbau für die Enzymelektrode erhalten. Es können Anordnungen verschiedener Größe und unterschiedlicher Innendurchmesser entsprechend dem Durchmesser des O-Binges vorgesehen werden, von denen dann ein Aufbau ausgewählt wird, der dem Durchmesser der Punktionselektrode 14 der Grundelektrode 31 entspricht. Eine Enzymelektrode kann durch Anbringen eines solchen Aufbaus an der Punktionselektrode der Grundelektrode, wie einer Sauerstoffelektrode, erhalten werden, die "mit-einer wasserstoffperpxiddurchlässigen Teflon-(Wz)-Membran oder einer wasserstoffperoxiddurchlässigen PoIycarbonatmembran 17 bedeckt ist, welche mit einem 0-Ring 16 befestigt ist.

Zu Vergleichszwecken ist eine bekannte Enzymelektrode in Fig. 12 gezeigt.

Fig. 12 zeigt in einer Skizze eine handelsübliche Enzymelektrode (für die Zuckeranalyse, hergestellt von YSI Inc.) mit einem O-Ring I¹, einer Polycarbonatmembran 2¹, einer immobilisierten Membran V, einer Grundelektrode 5¹» einer Funktionselektrode 6¹ und einer Celluloseacetatmembran 7'. Diese Elektrode ist wie folgt aufgebaut. In der Grundelektrode 5¹ ist ein Hohlraum an einem Ende vorgesehen, in den nacheinander am wahrnehmenden Teil 6¹ des Hohlraums die Celluloseacetatmembran 7', die immobilisierte Enzymmembran V und die Polycarbonatmembran 2' eingesetzt sind. Der 0-Ring 1', der gleichfalls in den Hohlraum eingesetzt ist, sichert die genannten Bauelemente.

Jede entsprechend hergestellte Elektrode eignet sich für den Aufbau solcher Enzymelektroden, und es gibt keine Einschränkung hinsichtlich des Aufbaus, vorausgesetzt daß die Messungen möglich sind.

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Eine solche Enzymelektrode wird in der BeaktionsZeileneinheit angeordnet, die aus Durchflußzellen bzw. -küvetten besteht und ein Fassungsvermögen für die Reaktion von z.B. 0,05 - 0,5 ml hat. Eine Reaktionszelleneinheit besteht aus mindestens mehr als, einer Funktionselektrode, an der das immobilisierte Enzym angebracht ist. Entsprechend der Kapazität der Reaktionszelle und der zu messenden Bestandteile kann eine Enzymelektrode mit entsprechend angebrachten immobilisierten Enzymen an der Funktionselektrode verwendet werden. Es kann auch eine Vielzahl von Reaktionszelleneinheiten der genannten Art hintereinander angeordnet sein. In diesem Fall ist der· Abstand zwischen den einzelnen Reaktionszelleneinheiten vorzugsweise größer als 10 mm. Da dieser Abstand in der wahrgenommenen elektrischen Schwankung einen Zeitunterschied von mehr als etwa einigen Sekunden zwischen den einzelnen Reaktionszelleneinheiten hervorruft, ist ein wirksamer Einsatz für elektrische Messungen möglich. Zufriedenstellende Messungen können auch in jeder Reaktionszelleneinheit durchgeführt werden, wenn 2-20 Reaktionszelleneinheiten vorgesehen sind.

Eine quantitative Analyse auf der Basis der Enzymreaktion ist durch Messen der elektrischen Schwankungen an den Enzymelektroden möglich. Hierzu kann jedes bekannte Verfahren angewendet werden, z.B. ein Verfahren, für das der Stromschwankungswert entscheidend ist, ein Verfahren, für das der Endpunkt entscheidend ist, ein Verfahren, für das die Anfangsgeschwindigkeit entscheidend ist, sowie ein Verfahren, für das die Beschleunigung entscheidend ist. Wenn eine Elektrode mit langsamem Ansprechvermögen vorgesehen ist, ist ein Differenzierverfahren wie das mit der Anfangsgeschwindigkeit arbeitende Verfahren wünschenswert, um ein rasches Ansprechen zu erzielen. Wenn andererseits eine Elektrode mit raschem Ansprechvermögen.verwendet wird, wird ein Differenzausgabeverfahren bevorzugt, bei dem eine elektrische Schwankung nach Erreichen eines stabilen Zustandes in der Analyse festgestellt wird, denn wenn ein Differenzierverfahren angewandt wird, besteht die Gefahr, daß wegen des aufgewühlten Zustandes und dgl. in die Analyse Fehler ein-

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treten.

Anhand der Zeichnungen soll ein Ausführungsbeispiel der Erfindung näher erläutert werden.

Fig. 1 zeigt eine zur Verwirklichung der Erfindung geeignete Vorrichtung, d.h. ein kontinuierliches Strömungssystem bzw. ein Durchfluß sy s tem, in welchem Enzymelektroden 1 - 3 in Durchflußzellen oder -küvetten 4-6 angeordnet sind und eine Vielzahl von Reaktionszelleneinheiten, die Enzymelektroden enthalten, in Reihe kombiniert sind. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist ferner ein ?ufferlösungsbehälter 7» eine Verdrängerpumpe 8, ein Injektor 9 und ein Thermostat 10 sowie ein Umsetzer 11 für elektrische Schwankungen von jederder Enzymelektroden vorgesehen. Die Vorrichtung arbeitet außerdem mit einem Aufzeichnungsgerät 12 und einem Drucker 13·

Als Reaktionszelleneinheit ist eine Kombination aus einer Enzyraelektrode mit einer Durchflußküvette gemäß Fig. 2 vorgesehen. Wie Fig. 2 zeigt, ist eine Enzymelektrode, die aus einer Funktionselektrode I^ (Kathode) zum Feststellen der Schwankung bei einer Enzymreaktion, und einer Gegenelektrode 15 (Anode) besteht, ein O-Ring 16, eine Teflon-Membran 17 als sauerstoffdurchlässige Membran zum Feststellen des SauerstoffVerbrauchs in einer Enzymreaktion, ein immobilisiertes Enzym 18 und ein Nylonnetz 19 zum Abstützen des immobilisierten Enzyms mit Hilfe einer ersten Elektrodenstütze 23 und einer zweiten Elektrodenstütze 24 mit einer Durchflußküvette 22 kombiniert, die ein Reaktionsgefäß 20 aufweist. Ferner ist in der Durchflußküvette ein Strömungsweg 21 ausgebildet, durch den die Probe und die Pufferlösung in das Reaktionsgefäß und aus dem Reaktionsgefäß transportiert werden.

Diese Bauelemente der Reaktionszelle sind so angeordnet, daß keine gegenseitige Pufferwirkung auftritt. Ihre Anzahl ist in gewisser Weise durch die Bedingungen, wie den Diffusionszustand der Probe im Reaktionssystem beeinflußt, beträgt jedoch üblich-

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erweise 2-20 und vorzugsweise ca„ 2 - 10. Sie können über die Strömungswege so aneinander angeschlossen sein, daß ein Zwischenraum von mehr als ca. 10 mm zwischen den Mitten der einzelnen Reaktionszellen bleibt. Der Durchmesser des Strcmungsweges beträgt üblicherweise 0,1-1 mm.

Wenn bei diesem Ausführungsbeispiel der Sauerstoff als bei der Enzymreaktion aufgezehrter Bestandteil festgestellt werden soll, kann eine Polypropylenmembran statt der Teflon-Membran als sauerstoffdurchlässige Membran vorgesehen sein. Wenn das Wasserstoffperoxid als die erzeugte Komponente festgestellt werden soll, ist keine Membran oder in manchen Fällen eine wasserstoffperoxiddurchlässige Membran, z.B. eine Cellulosetriacetatmembran oder eine Polycarbonatmembran vorgesehen.

Bei einer Vorrichtung zum gleichzeitigen Messen mehrerer Bestandteile für ein Durchflußsystem gemäß der obigen Beschreibung wird eine Probe durch den Injektor eingeführt und fließt mit gleichbleibender Geschwindigkeit. In jeder Beaktionszelleneinheit wird der zu messende Bestandteil festgestellt, das Meßergebnis in eine Schwankung ;an jeder Enzymelektrode umgewandelt, die über den Umsetzer am Aufzeichnungsgerät und am Drucker abgelesen werden kann. Diese Vorgänge können von Hand durchgeführt werden oder automatisch unter elektrischer Steue-ru*¹¹?' wobei die elektrische Schwankung in einem Mikrorechner festgehalten wird. Die Verdrängerpumpe wird für die Zufuhr und das Abziehen der Pufferlösung benutzt. Die gespeicherten Signale werden mit Hilfe eines auf Null eingestellten Schaltkreises, einer Differenzialausgabeschaltung oder einer Differenzierschaltung festgestellt und aufgezeichnet.

Unter Verwendung der Meßvorrichtung gemäß der Erfindung wurden mehrere Bestandteile festgestellt und gemessen. Bei dieser Messung wurde eine 0,1 N Phosphorsäurelösung als Puffer (pH-Wert 7»5) benutzt. Diese Lösung wurde mit langsamer Geschwindigkeit von 2 ml/min mittels einer Verdrängerpumpe gefördert. Die Enzymelektrode bestand aus immobilisierten Enzymen in Forn

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von Cholinoxidase, Glucose bzw. Milchsäureoxidase, die jeweils an den einzelnen Durchflußküvetten angebracht waren (in Fi'Z. 1 isc ir.iz 1 die Enzymeiektrocie aus Oholinoxidase, Kit 2 1.3 Enzymelektrode aus Gluooseoxidase und mit 3 die Enzymelektrode aus Milchsäureoxidase bezeichnet). Diese Elektroden waren unter Freilassung eines Zwischenraumes von 10 mm in Reihe geschaltet. Außerdem wurde zum Vergleich eine Enzymelektrode an das Ende angeschlossen, um die Schwankung des aufgelösten Sau~ erstoffs im Reaktionssystem zu messen. Jedes immobilisierte System wurde gemäß dem Verfahren der britischen Patentschrift 215 001 hergestellt, wonach die Enzymelektrode an einer Aminogruppen aufweisenden Polyacrylnitrilmembran befestigt wird. Zur Herstellung der Enzymelektrode wurde diese Membran in Stücke mit einer Größe von ca. 5 x 5 mm (ca. 0,7 - 0,8 mg) geschnitten. Es handelte sich in jedem Fall um ein immobilisiertes Enzym mit einer Cholinoxidaseaktivität von 35 U/g, einer Glucoseoxidaseaktivität von 23 U/g bzw. einer Milchsäureoxidase von 32 U/g. Die Membranetücke wurden am wahrnehmenden Teil der Enzymelektrode mit Hilfe eines O-Ringes in der Reihenfolge Teflon-Membran, immobilisiertes Enzym und Nylonnetz angebracht. Das System wurde auf 37° C gehalten und als Probe 5 jol einer gemischten Lösung injiziert, die Cholinchlorid (100 mg/dl), Glucose (500 mg/dl) und DL-Milchsäure (20 mg/dl) enthielt.

Wie Fig. 3 zeigt, wurde nach dem Einspritzen der Probe zunächst Cholin (COD in Fig. 3), dann Glucose (GOD in Fig. 3) und schließlich Milchsäure (LOX in Fig. 3) in jeder Reaktionszelleneinheit gemessen. Damit war bekannt, daß in jeder Reaktionszelleneinheit zufriedenstellende Reaktionen auftraten. Es wurde außerdem ein Spitzenwert der Abnahmerate an aufgelöstem Sauerstoff nach 10 Sekunden in der ersten Reaktionszelleneinheit bzw. nach 30 Sekunden in der dritten ReaktionsZelleneinheit festgestellt. Bei der zum Vergleich vorbereiteten Sauerstoffelektrode zeigte sich fast keine Abnahmerate an aufgelöstem Sauerstoff. Damit war klar, daß die Abnahme an aufgelöstem Sauerstoff bei der Messung in jeder Reaktionszelleneinheit keinen

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Einfluß im System hatte. So konnten die zu messenden. Bestandteile gleichzeitig in einem Durchflußsystem zufriedenstellend gemessen werden.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung wurde als Probe eine Cholinchlorid (100 mg/dl) und DL-Milchsäure (20 ml/ dl) enthaltende gemischte Lösung in einer Menge von 5/il injiziert. Dann wurde die Wirkung von aufgelöstem Sauerstoff auf die aus Glucoseoxidase bestehende Enzymelektrode und zum Vergleich auf die Sauerstoffelektrode sowie auf die aus Cholinoxidase bestehende Enzymelektrode und die aus Milchsäureoxidase bestehende Enzymelektrode untersucht.

Wie Fig. 4 zeigt, wurde nach dem Einspritzen der Probe zunächst Cholin (COD in Pig. ^) dann überhaupt keine Glucose (GOD in Fig. k) und schließlich Milchsäure (LOX in Fig. 4) für jede Reaktionszelleneinheit gemessen und zusätzlich festgestellt, dai3 keine Schwankung an aufgelöstem Sauerstoff im System vorlag, wie die Sauerstoffelektrode bewies. Die Abnahme an aufgelöstem Sauerstoff aufgrund der Cholinoxidase hatte keine Auswirkung auf die aus Glucoseoxidase bestehende Enzymelektrode, und die Abnahme an aufgelöstem Sauerstoff aufgrund der Cholinoxidase und der Milchsäureoxidase hatte keinerlei Wirkung im System. Die Messung wurde also zufriedenstellend durchgeführt.

Anhand der oben beschriebenen Beobachtungen ist klar, daß bei der Messung eine sehr geringe Menge an aufgelöstem Sauerstoff in der Nachbarschaft des immobilisierten Enzyms der entsprechenden Enzymelektrode abnahm, und daß diese sehr geringe Menge praktisch keine Wirkung auf die Abnahme an aufgelöstem Sauerstoff im System hatte.

In ähnlicher Woise wie oben beschrieben wurde eine Vorrichtung mit zwei Elektroden vorbereitet, in der eine aus Glucoseoxidase bestehende Enzymelektrode mit einer aus Milchsäureoxidase bestehenden Enzymelektrode verbunden wurde. In diese Vorrich-

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tung wurden 5/Ul einer gemischten Lösung aus Glucose mit unterschiedlichen Konzentrationen (100 - 500 mg/dl) und DL-Milchsäure mit konstanter Konzentration (10 mg/dl) eingefüllt und die gemessene Schwankung der Milchsäure mit der Schwankung der Glucosekonzentration verglichen.

Wie Fig. 5 zeigt, wurde Glucose (GOD in Fig. 5) entsprechend jeder Konzentration gemessen und zusätzlich Milchsäure (LOX in Fig. 5) im Feststellungszeitpunkt nahezu ebenso wie die Glucose zufriedenstellend gemessen.

Im Vergleich hierzu soll eine Messung unter Verwendung von Reaktionsgefäßen in einem Durchflußsystem mit immobilisierten Enzymsäulen beschrieben werden.

Zunächst wurde für das Reaktionsgefäßverfahren eine Vorrichtung gemäß Fig. 6 geschaffen. Diese Vorrichtung weist, wie Fig. 6 zeigt, .immobilisierte Enzymsäulen 25 und 26 auf (25 ist eine immobilisierte Enzymsäule aus Glucoseoxidase und 26 eine itnmobilisiette Enzymsäule aus Cholinoxidase). Die Abmessungen der immobilisierten Enzymsäulen betragen je 2,8 mm φ χ 20 mm. Die Enzymsäulen sind an Durchflußküvetten 29 bzw. 30 angeschlossen. Mit jeder Durchflußküvette ist eine Enzymelektrode 2? bzw. 28 verbunden. Ferner besteht eine Verbindung zu einem Pufferlösungsbehälter 7» einer Verdrängerpumpe 8 und einem Injektor 9·

In diese Vorrichtung wurden 10^1 einer nur Glucose (100 mg/dl) enthaltenden Probe injiziert. Die Glucose rief eine Umsetzung in der immobilisierten Enzymsäule aus Glucoseoxidase hervor, welche zu einer Abnahme des zu messenden aufgelösten Sauerstoffs führte. Glucose wurde durch Feststellen mit Hilfe einer Sauerstoffelektrode (GOD in Fig. 7) gemessen. Allerdings beeinträchtigte die Schwankung des aufgelösten Sauerstoffs die Sauerstoffelektrode der immobilisierten Enzymsäule aus Cholinoxidase, und das festgestellte Ergebnis war so, als ob ein Cholinbestandteil vorhanden wäre (COD in Fig. 7)«

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Als nächstes wurde in diese Vorrichtung, die mit einem im Reaktionsgefäß ablaufenden Verfahren arbeitet, Cholinchlorid (20 mg/dl, kO mg/dl, 80 mg/dl) injiziert. In diesem Fall erfolgte keine Enzymreaktion in der immobilisierten Enzymsäule aus Glucoseoxidase. Folglich wurde, wie Fig. 8 zeigt, der Cholinbestandteil zufriedenstellend wahrgenommen.

Wenn andererseits 10 /al einer gemischten Lösung aus Glucose (100 mg/dl) und Cholinchlorid (20 mg/dl, 4-0 mg/dl, 80 mg/dl) in die Vorrichtung injiziert wurde, konnte Glucose zufriedenstellend festgestellt werden, wie Fig. 9 zeigt (GOD in Fig. 9). Allerdings war der Meßwert des Cholinbestandteils (COD in Fig. 9) höher als der in Fig. 8 gezeigte, weil die Glucose eine Auswirkung auf die Schwankung des aufgelösten Sauerstoffs hatte.

HÜeses Phänomen macht deutlich, daß ein Verfahren, bei dem eine eine Vielzahl von Bestandteilen enthaltende Probe in einem Reaktortyp-Prozeß gemessen; wird, für ein Meßsystem ungeeignet ist, weil es nicht möglich ist,eine Eichkurve herzustellen und die Messung !vorzunehmen.

Während also der Reaktortyp-Prozeß unter Verwendung immobilisierter Enzymsäulen, wie schon gesagt, zum gleichzeitigen Messen mehrerer Bestandteile in einem Durchflußsystem ungeeignet ist, hat die erfindungsgemäße Vorrichtung den Vorteil, daß sie das gleichzeitige Messen einer Vielzahl von in einer Probe enthaltenen Bestandteilen in kontinuierlicher Strömung im Durchflußsystem ermöglicht.

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Claims

Vorrichtung zum gleichzeitigen Messen mehrerer Bestandteile für ein Durchflußsystem

Priorität:

Japan Nr. 145796/79 vom 9.11.1979 Japan Nr. 172167/79 vom 29.12.1979

Patentansprüche

1. Vorrichtung zum gleichzeitigen Messen mehrerer Bestandteile für ein System mit kontinuierlichem Durchfluß, gekennzeichnet durch eine Vielzahl von in Reihe angeordneten Reaktionszelleneinheiten, die aus Enzymelektroden bestehen, bei denen immobilisierte Enzyme an mindestens mehr als zwei Punktionselektroden (14) angebracht sind.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet , daid bei der Reihenanordnung der Reaktionszelleneinheiten ein Abstand von mehr als 10 mm zwischen den einzelnen Einheiten eingehalten ist.

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3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2,

dadurch gekennzeichnet , .daß eine Anzahl von-2 bis 20 Reaktionszelleneinheiten vorgesehen ist.

k. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß eine netzartige Membran mit einem O-Ring (16) verbunden ist, der zum Einsetzen einer Enzymelektrode in die Funktionselektrode (14) der Grundelektrode (3D dient, und daß im O-Ring ein immobilisiertes Enzym (18) angeordnet ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4,

dadurch gekennzeichnet , daß zwei O-Ringe (16) eine Doppelschicht bilden, und daß eine netzartige Membran so mit den O-Ringen verbunden ist, daß sie zwischen den Schichten gehalten ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 4 oder 5»

dadurch gekennzeichnet , daß das immobilisierte Enzym ein membranartiges Material oder ein fasriges Material aus immobilisiertem Enzym ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6,

dadurch gekennzeichnet , daß der Durchmesser dos membranartigen Materials aus immobilisiertem Enzym-kleiner .ist als der Innendurchmesser des O-Ringes (16).

130021/0842