DE4104776A1

DE4104776A1 - Sandwich-enzymmembran fuer enzymelektroden und -optoden zur bestimmung von substraten, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE4104776A1
Application number: DE19914104776
Authority: DE
Inventors: Frieder Prof Dr Scheller; Juergen Nentwig; Dorothea Dr Pfeiffer; Peter Dr Abel
Original assignee: INST MOLEKULARBIOLOGIE AK
Current assignee: BST BIO SENSOR TECHNOLOGIE GMBH, 13156 BERLIN, DE
Priority date: 1990-08-31
Filing date: 1991-02-13
Publication date: 1992-03-05
Anticipated expiration: 2011-02-14
Also published as: DD297713A5; DE4104776C2

Description

Die Erfindung betrifft eine Sandwich-Enzymmembran zur Bestimmung hoher Konzentrationen von Substraten der Oxidasen, insbesondere hoher Glucose-, Lactat- und Harnsäurekonzentrationen, und ist besonders zur Messung in unverdünnten physiologischen Medien in der medizinischen Meßtechnik geeignet, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.

Die Verwendung von Enzymelektroden zur Bestimmung hoher Substratkonzentrationen ist durch die Diffusion des Sauerstoffes limitiert.

Dicke Deckschichten, die ein genügend großes Sauerstoffangebot im Vergleich zum Substrat (Glucose, Lactat) für Enzymreaktionen bieten (DD 1 31 414), verlängern die Ansprechzeit und gegebenenfalls damit auch die Einwirkzeit für Störsubstanzen. Die technische Lösung DD 2 27 029 setzt eine genaue Präparation des Membransystems über den Elektroden voraus, um reproduzierbare Bedingungen zu erhalten. Ebenfalls ist die Herstellung der Öffnung in der substratimpermeablen Schicht aufwendig und wenig reproduzierbar.

Die Aufgabe der Erfindung ist, eine Enzymmembran zu finden, die in Verbindung mit Enzymoptoden oder Enzymelektroden den nutzbaren Meßbereich für Substrate oder Oxidasen auf die Konzentrationen in unverdünnten biologischen Flüssigkeiten, z. B. Blut, Plasma, Speichel, Schweiß oder Urin, sowohl bei gesunden als auch bei stoffwechselgestörten Patienten zu erweitern. Die Erfindung wird gemäß der Ansprüche 1, 8 und 11 realisiert, die entsprechenden Unteransprüche 2 bis 7, 9 und 10 sind vorteilhafte Ausführungen.

Die gleichmäßige Verteilung von Mikrobereichen hoher Substratdurchlässigkeit in einer mikrostrukturierten Membran ermöglicht eine einfache Anordnung über dem Transduktorensystem. Eine exakte Justage über einer zentrierten Elektrode ist nicht notwendig. Eine Erweiterung des Meßbereiches zu höheren Substratkonzentrationen wird erreicht, wenn diese Bereiche 0,1 bis 10,0% der Fläche der Membran besitzen.

Es zeigte sich, daß unter den erfindungsgemäßen Anwendungsbedingungen die Mikrokanäle oder Poren, insbesondere bei der Verwendung von Polyesterphthalat, Polyestersulfonat oder Polycarbonat, nicht verstopfen und eine gute Reproduzierbarkeit vorliegt.

Mit dieser Membran ist es möglich, Messungen mit unverdünnten Flüssigkeiten mit Substratkonzentrationen bis zu 50 mmol/l innerhalb kurzer Ansprechzeiten durchzuführen. Bevorzugt werden Glukose, Laktat und Harnsäure bestimmt, wobei als Enzyme üblicherweise Glukoseoxidase, Laktatoxidase oder Ureatoxidase eingesetzt werden. Die Erfindung wird an Beispielen näher erläutert:

Beispiel 1 Herstellung einer Glucoseoxidase-Membran zur Glucosebestimmung in unverdünntem Humanserum

2 µl einer 5%igen Polyurethanlösung in Aceton, die eine Aktivität von 5 U Glucoseoxidase (GOD) beinhalten, werden auf eine 20 µm dicke Cellulosemembran getropft, suspendiert und im angetrockneten Zustand mit einer Kapillarporenmembran aus Polyterephthalat vollständig bedeckt sowie mit einer zweiten Cellulosemembran, die mit der Enzymunterlage identisch ist, abgedeckt.

Die RoTrac Kapillarporenmembran (Kernforschungsinstitut Rossendorf) besitzt bei einer Porengröße von 0,05 µm eine Porendichte von 4×10⁹ P/cm² und eine Dicke von 10 µm. Mit der so hergestellten Sandwich-Enzymmembran wird eine Pt-Ag/AgCl- Elektrode, die auf +600 mV polarisiert ist, gekoppelt. Anschließend wird der Glucosesensor mit der Kapillarporenmembran zur Lösungsseite hin mit einer Durchflußzelle in ein kontinuierliches Fließsystem mit amperometrischem Detektor gebracht.

In den Carrier-Strom (0,06 M Phosphatpuffer, pH 7,0, 1 ml/min) werden mit einem pneumatischen Injektionsventil und einer Frequenz von 100/h jeweils 25 µl von 5, 10, 15 und 20 mmol/l Glucoselösung injiziert und eine Kalibrationskurve mittels Bandschreiber aufgenommen. Mit der Injektion von 25 µl unverdünntem und unbehandeltem Patientenserum kann dessen Glucosekonzentration im Meßbereich von 3 bis 30 mmol/l innerhalb 10 sec ermittelt werden.

Beispiel 2 Herstellung einer LOD-Membran zur Lactatanalyse bei der Milchsäurefermentation

2 µl einer 5%igen acetonischen Polyurethanlösung, die 2,5 U Lactatoxidase (Pseudomonas sp.) suspendiert beinhalten, werden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 auf eine Polyäthylenmembran getropft und unmittelbar danach mit 3 übereinander angeordneten Kapillarporenmembranen vollständig bedeckt. Die durch Abdeckung mit einer Cellulosemembran entstehende Sandwich- Membran wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 in ein kontinuierliches Fließsystem gebracht. Die Pt-Ag/AgCl-Elektrode ist auf -600 mV polarisiert, und als Carrierlösung dient 0,06 M Phosphatpuffer, pH 7,0.

Durch die Injektion von jeweils 50 µl 0, 20, 30, 40, 50 und 60 mmol Lactat/l wird die Eichkurve erstellt. 50 µl unbehandelter Fermentationslösung werden zur Analyse der Lactatkonzentration benötigt. 10 sec nach Injektion der zu analysierenden Probe liegt das Ergebnis vor. Auswertbare Werte wurden bis zur Lactatkonzentrationen von 50 mmol/l erhalten.

Claims

1. Sandwich-Enzymmembran für Enzymelektroden oder -optoden zur Bestimmung von Substraten, gekennzeichnet durch

- eine Enzymschicht, die mit
- einer zur Meßlösung gewandten, gleichmäßig mikrostrukturierten Membran, die eine inhomogene Durchlässigkeit für die Substrate besitzt oder mit mehreren solchen Membranen abgedeckt und die gegebenenfalls
- zwischen Dialysemembranen angeordnet ist.

2. Sandwich-Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht aus Polyurethan und darin verteilten Enzympartikeln besteht.

3. Sandwich-Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gleichmäßig mikrostrukturierte Membran eine substratimpermeable Polyterephthalat-, Polyestersulfonat-, Polyurethan- oder Polycarbonatmembran mit Gebieten hoher Substratdurchlässigkeit, wie Mikrokanäle oder Poren ist.

4. Sandwich-Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gleichmäßig mikrostrukturierte Membran eine für die Substrate permeable Membran mit Gebieten hoher Substratdurchlässigkeit ist, die durch Gebiete verringerter Schichtdicke oder Mikrokanäle gegeben sind.

5. Sandwich-Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dialysemembran aus Cellulose, Celluloseacetat oder Nylon besteht.

6. Sandwich-Enzymmembran nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Gebiete hoher Substratdurchlässigkeit 0,1 bis 10% der mikrostrukturierten Membranfläche ausmachen.

7. Sandwich-Enzymmembran nach Anspruch 1, 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrostrukturierte Membran eine Kapillarporenmembran mit einer Porendichte zwischen 1 und 50×10⁹ P/cm² und einer Dicke zwischen 5 und 15 µm ist.

8. Verfahren zur Herstellung einer Sandwichmembran für Enzymelektroden oder -optoden zur Bestimmung von Substraten durch Auftragen einer Enzymschicht zwischen Dialysemembranen, dadurch gekennzeichnet, daß im ungetrockneten Zustand eine oder mehrere gleichmäßig mikrostrukturierte, die Enzymschicht vollständig bedeckende Membranen aufgetragen werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die gleichmäßig mikrostrukturierte Membran eine substratimpermeable Polyterephthyl-, Polyestersulfonat-, Polyurethan- oder Polycarbonatmembran mit Gebieten hoher Substratdurchlässigkeit, wie Mikrokanäle oder Poren oder eine für die Substrate permeable Membran mit Gebieten hoher Substratdurchlässigkeit, die durch Gebiete verringerter Schichtdicke oder Mikrokanäle gebildet werden, ist, wobei die Gebiete hoher Substratdurchlässigkeit 0,1 bis 10% der Membranfläche ausmachen.

10. Verfahren nach Anspruch 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die mikrostrukturierte Membran eine Kapillarporenmembran mit einer Porendicke zwischen 1 und 50×10⁹ P/cm² und einer Dicke zwischen 5 und 15 µm ist.

11. Verwendung der Sandwich-Enzymmembran nach Anspruch 1 bis 10 zur Bestimmung von Substraten, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit der mikrostrukturierten Membran zur Lösungsseite hin eingesetzt sind.