DD297713A5

DD297713A5 - Enzymmembran zur bestimmung hoher substratkonzentrationen mit enzymsensoren

Info

Publication number: DD297713A5
Application number: DD34376690A
Authority: DD
Inventors: Frieder Scheller; Juergen Nentwig; Dorothea Pfeiffer; Peter Abel
Original assignee: Akademie Der Wissenschaften Der Ddr,Dd
Priority date: 1990-08-31
Filing date: 1990-08-31
Publication date: 1992-01-16
Also published as: DE4104776C2; DE4104776A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Enzymmembran zur Bestimmung hoher Konzentrationen von Substraten von Oxidasen, z. B. Glucose und Lactat, mittels Enzymoptoden oder Enzymelektroden. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, den nutzbaren Meszbereich von Enzymsensoren auf die Metabolitkonzentrationen in unverduennten physiologischen Medien, z. B. Blut, Plasma, Speichel, Schweisz oder Urin, sowohl von gesunden als auch von stoffwechselgestoerten Patienten zu erweitern. Dies erfolgt erfindungsgemaesz dadurch, dasz die Enzymschicht auf den Sauerstoff- bzw. H2O2-anzeigenden Optoden oder elektrochemischen Sensoren mit einer oder mehreren mikrostrukturierten Schichten zur Meszprobe hin abgedeckt wird. Diese Schichten besitzen einen Anteil von 0,1-10% von Gebieten hoher Substratdurchlaessigkeit und ist auf dem gesamten Querschnitt fuer das Kosubstrat Sauerstoff hoch permeabel. Die Gebiete hoher Substratdurchlaessigkeit sind entweder Poren in sonst substratimpermeablen Membranen, z. B. aus Polyterephthalat, Polyestersulfonat sowie Polycarbonat, oder sie besitzen eine lokal hoehere Permeabilitaet fuer das Substrat, z. B. auf Grund einer erniedrigten Schichtdicke oder von Mikrokanaelen.{Enzymmembran, modifiziert; Medien, physiologisch; Blut; Urin; Enzymelektroden; Enzymoptoden}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Enzymmembran zur Bestimmung hoher Konzentrationen von Substraten der Oxidasen, insbesondere hoher Glucose- und Lactatkonzentrationen und ist besonders zur Messung in unverdünnten physiologischen Medien in der medizinischen Meßtechnik geeignet.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Verwendung von Enzymelektroden zur Bestimmung hoher Substratkonzentrationen ist durch die Diffusion des Sauerstoffes limitiert.

Dicke Deckschichten, die ein genügend großes Sauerstoffangebot im Vorgleich zum Substrat (Glucose, Lactat) für Enzymreaktionen bieten (DD 131414), verlängern die Ansprechzeit und gegebenenfalls damit auch die Einwirkzeit für Störsubstanzen. Die technische Lösung DD 227 029 setzt eine genaue Präparation des Membransystems über den Elektroden voraus, um reproduzierbare Bedingungen zu erhalten. Ebenfalls ist die Herstellung der Öffnung in der substratimpermeablen Schicht aufwendig und wenig reproduzierbar.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung ist, eine Enzymmembran zu finden, die in Verbindung mit Enzymoptoden oder Enzymeloktroden den nutzbaren Meßbereich für Substrate der Oxidasen auf die Konzentrationen in unverdünnten biologischen Flüssigkeiten, ζ. Β. Blut, Plasma, Speichel, Schweiß oder Urin, sowohl bei gesunden als auch bei stoffwechselgestörten Patienten zu erweitern. Erfindungsgemäß wird über der Enzymschicht eine für Sauerstoff hochpermeable Deckmembran angeordnet, die Mikrobereiche hoher Substratdurchlässigkeit besitzt. Die gleichmäßige Verteilung dieser Bereiche über die Deckmembran ermöglicht eine einfache Anordnung über dem Transduktorensystem. Eine exakte Justage über einer zentrierten Elektrode ist nicht notwendig. Eine gute Erweiterung des Meßbereiches zu höheren Substratkonzentrationen ist möglich, wenn diese Bereiche 0,1 bis 10,0% der Fläche der Deckmembran besitzen.

Es zeigte sich, daß unter den erfindungsgemäßen Anwendungsbedingungen die Mikrokanäle oder Poren, insbesondere bei der Verwendung von Polyesterphthalat, Polyestersulfonat oder Polycarbonat, nicht verstopfen und eine gute Reproduzierbarkeit vorliegt.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Enzymmembran erwies sich als besonders vorteilhaft, wenn die Enzymschicht aus Polyurethan besteht.

Ausführungsbelspifjle Beispiel 1 Herstellung einer Glucoseoxidase-Membran zur Glucosebestimmung In unverdünntem Humanserum

2 μΙ einer 5%igen Glucoseoxidase (GOD)-Suspension in Aceton, die eine Aktivität von 5U GOD beinhalten, werden auf eine 20 um dicke Cellulosemembran getropft und im ungetrockneten Zustand mit einer Kapillarporenmembran aus Polyterephthalat vollständig bedeckt sowie mit einer zweiten Cellulosemembran, die mit der Enzymunterlage identisch ist, abgedeckt. Die RoTrac Kapillarporenmembran (Kernforschungsinstitut Rossendorf) besitzt bei einer Porengröße von 0,05 pm eine Porendichts von 4 x 10⁹P/cm² und eine Dicke von 10μηι. Mit der so hergestellten Sandwich-Enzymmembran wird eine Pt-Ag/ AgCI-Elektrode, die auf +60OmV polarisiert ist, gekoppelt. Anschließend wird der Glucosesensor mit der Kapillarporenmembran zur Lösungsseite hin mit einer Durchflußzelle in ein kontinuierliches Fließsystem mit amperometrischem Detektor gebracht. In den Carrier-Strom (0,06M Phosphatpuffer, pH7,0,1 ml/min) werden mit einem pneumatischen Injektionsventil und einer Frequenz von 100/h jeweils 25μΙ von 5,10,15 und 20mmol/l Glucoselösung injiziert und eine Kalibrationskurve mittels Bandschreiber aufgenommen. Mit der Injektion von 25μΙ unverdünntem und unbehandeltem Patientenserum kann dessen Glucosekonzentration im Meßbereich von 3 bis 30mmol/l innerhalb 10sec ermittelt werden.

Beispiel 2 Herstellung einer LOD-Membran zur Lactatanalyse bei der Milchsäurefermentation

2 μΙ einer 5%!gen acetonischen Lactatoxidase (Pseudomonas sp.(-Suspension, die 2,5U LOD beinhalten, werden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 auf eine Polyäthylenm«mbran getropft und unmittelbar danach mit 3 übereinander angeordneten Kapillarporenmembranen vollständig bedeckt. Die durch Abdeckung mit einer Cellulosemembran entstehende Sandwich-Membran wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 in ein kontinuierliches Fließsystem gebracht. Die Pt-Ag/AgCI-Elektrode ist auf -60OmV polarisiert, und als Carrierlösung dient 0,06M Phosphatpuffer, pH7,0. Durch die Injektion von jeweils 50μΙ 0,20,30,40,50 und 60mmol Lactal/I wird die Eichkurve erstellt. 50μΙ unbehandelter Fermentationslösung werden zur Analyse der Lactatkonzentration benötigt. 10sec. nach Injektion der zu analysierenden Probe 'iegt das Ergebnis vor. Auswertbare Werte wurden bis zu Lactatkonzentrationen von 50mmol/l erhalten.

Claims

1. Enzymmembran zur Bestimmung hoher Substratkonzentrationen mit Enzymsensoren, bestehend aus einer Schicht mit Enzymen zum Umsatz der Substrate von Oxidasen mit Sauerstoff und einer für Sauerstoff hochpermeablen Deckmembran, die gegebenenfalls durch zwei Dialysemembranen eingeschlossen sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckmembran über die Enzymschicht auf der den zur Meßlösung gewandten Seite angeordnet ist und eine inhomogene Durchlässigkeit für Substrate besitzt, wobei die Gebiete hoher Durchlässigkeit für Substrate mikroskopisch klein und gleichmäßig in der Deckmembranfläche verteilt sind.

2. Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gebiete hoher Substratdurchlässigkeit 0,1 bis 10,0% der Deckmembranfläche bilden.

3. Enzymmembran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gebiete hoher Substratdurchlässigkeit Mikrokanäle oder Poren in einer substratimpermeablen Deckmembran sind.

4. Enzymmembran nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die substratimpermeable Deckmembran aus Polyesterphthalat, Polyestersulfonat, Polyurethan oder Polycarbonat besteht.

5. Enzymmembran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gebiete hoher Substratdurchlässigkeit Gebiete verringerter Schichtdicke der Deckmembran sind.

6. Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckmembran aus einer oder mehreren Schichten bosteht.

7. Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht aus Polyurethan und darin homogen verteilten Enzympartikeln besteht.