DD297713A5 - ENZYME MEMBRANE FOR DETERMINING HIGH SUBSTRATE CONCENTRATIONS WITH ENZYME SENSORS - Google Patents

ENZYME MEMBRANE FOR DETERMINING HIGH SUBSTRATE CONCENTRATIONS WITH ENZYME SENSORS Download PDF

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DD297713A5 DD34376690A DD34376690A DD297713A5 DD 297713 A5 DD297713 A5 DD 297713A5 DD 34376690 A DD34376690 A DD 34376690A DD 34376690 A DD34376690 A DD 34376690A DD 297713 A5 DD297713 A5 DD 297713A5
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Frieder Scheller
Juergen Nentwig
Dorothea Pfeiffer
Peter Abel
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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Enzymmembran zur Bestimmung hoher Konzentrationen von Substraten von Oxidasen, z. B. Glucose und Lactat, mittels Enzymoptoden oder Enzymelektroden. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, den nutzbaren Meszbereich von Enzymsensoren auf die Metabolitkonzentrationen in unverduennten physiologischen Medien, z. B. Blut, Plasma, Speichel, Schweisz oder Urin, sowohl von gesunden als auch von stoffwechselgestoerten Patienten zu erweitern. Dies erfolgt erfindungsgemaesz dadurch, dasz die Enzymschicht auf den Sauerstoff- bzw. H2O2-anzeigenden Optoden oder elektrochemischen Sensoren mit einer oder mehreren mikrostrukturierten Schichten zur Meszprobe hin abgedeckt wird. Diese Schichten besitzen einen Anteil von 0,1-10% von Gebieten hoher Substratdurchlaessigkeit und ist auf dem gesamten Querschnitt fuer das Kosubstrat Sauerstoff hoch permeabel. Die Gebiete hoher Substratdurchlaessigkeit sind entweder Poren in sonst substratimpermeablen Membranen, z. B. aus Polyterephthalat, Polyestersulfonat sowie Polycarbonat, oder sie besitzen eine lokal hoehere Permeabilitaet fuer das Substrat, z. B. auf Grund einer erniedrigten Schichtdicke oder von Mikrokanaelen.{Enzymmembran, modifiziert; Medien, physiologisch; Blut; Urin; Enzymelektroden; Enzymoptoden}The invention relates to an enzyme membrane for the determination of high concentrations of substrates of oxidases, eg. As glucose and lactate, by means of enzyme or enzyme electrodes. The object of the invention is the useful Meszbereich of enzyme sensors on the metabolite concentrations in undiluted physiological media, eg. As blood, plasma, saliva, Schweisz or urine, to expand both healthy and metabolic-disordered patients. This is done according to the invention by covering the enzyme layer on the oxygen or H2O2-indicating optodes or electrochemical sensors with one or more microstructured layers for the sample. These layers have a content of 0.1-10% of regions of high substrate permeability and are highly permeable over the entire cross-section for the cosubstrate oxygen. The regions of high substrate permeability are either pores in otherwise substrate-impermeable membranes, e.g. As polyterephthalate, polyester sulfonate and polycarbonate, or they have a locally higher permeability for the substrate, eg. Due to a reduced layer thickness or micro-channels. {Enzyme membrane, modified; Media, physiological; Blood; Urine; Enzyme electrodes; Enzymoptoden}

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft eine Enzymmembran zur Bestimmung hoher Konzentrationen von Substraten der Oxidasen, insbesondere hoher Glucose- und Lactatkonzentrationen und ist besonders zur Messung in unverdünnten physiologischen Medien in der medizinischen Meßtechnik geeignet.The invention relates to an enzyme membrane for the determination of high concentrations of substrates of the oxidases, in particular high glucose and lactate concentrations and is particularly suitable for measurement in undiluted physiological media in medical measurement technology.

Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art

Die Verwendung von Enzymelektroden zur Bestimmung hoher Substratkonzentrationen ist durch die Diffusion des Sauerstoffes limitiert.The use of enzyme electrodes to determine high substrate concentrations is limited by the diffusion of oxygen.

Dicke Deckschichten, die ein genügend großes Sauerstoffangebot im Vorgleich zum Substrat (Glucose, Lactat) für Enzymreaktionen bieten (DD 131414), verlängern die Ansprechzeit und gegebenenfalls damit auch die Einwirkzeit für Störsubstanzen. Die technische Lösung DD 227 029 setzt eine genaue Präparation des Membransystems über den Elektroden voraus, um reproduzierbare Bedingungen zu erhalten. Ebenfalls ist die Herstellung der Öffnung in der substratimpermeablen Schicht aufwendig und wenig reproduzierbar.Thick cover layers, which provide a sufficiently large supply of oxygen in preference to the substrate (glucose, lactate) for enzyme reactions (DD 131414), extend the response time and optionally also the exposure time for interfering substances. The technical solution DD 227 029 requires an accurate preparation of the membrane system over the electrodes in order to obtain reproducible conditions. Also, the production of the opening in the substrate-impermeable layer is complicated and not very reproducible.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die Aufgabe der Erfindung ist, eine Enzymmembran zu finden, die in Verbindung mit Enzymoptoden oder Enzymeloktroden den nutzbaren Meßbereich für Substrate der Oxidasen auf die Konzentrationen in unverdünnten biologischen Flüssigkeiten, ζ. Β. Blut, Plasma, Speichel, Schweiß oder Urin, sowohl bei gesunden als auch bei stoffwechselgestörten Patienten zu erweitern. Erfindungsgemäß wird über der Enzymschicht eine für Sauerstoff hochpermeable Deckmembran angeordnet, die Mikrobereiche hoher Substratdurchlässigkeit besitzt. Die gleichmäßige Verteilung dieser Bereiche über die Deckmembran ermöglicht eine einfache Anordnung über dem Transduktorensystem. Eine exakte Justage über einer zentrierten Elektrode ist nicht notwendig. Eine gute Erweiterung des Meßbereiches zu höheren Substratkonzentrationen ist möglich, wenn diese Bereiche 0,1 bis 10,0% der Fläche der Deckmembran besitzen.The object of the invention is to find an enzyme membrane which, in conjunction with enzyme optics or enzyme electrodes, the usable measuring range for substrates of the oxidases on the concentrations in undiluted biological fluids, ζ. Β. To expand blood, plasma, saliva, sweat or urine, both in healthy and metabolic disorders patients. According to the invention, a cover membrane which is highly permeable to oxygen and has micro regions of high substrate permeability is arranged above the enzyme layer. The even distribution of these areas over the cover membrane allows a simple arrangement above the transductor system. An exact adjustment over a centered electrode is not necessary. A good extension of the measuring range to higher substrate concentrations is possible if these areas have 0.1 to 10.0% of the surface of the cover membrane.

Es zeigte sich, daß unter den erfindungsgemäßen Anwendungsbedingungen die Mikrokanäle oder Poren, insbesondere bei der Verwendung von Polyesterphthalat, Polyestersulfonat oder Polycarbonat, nicht verstopfen und eine gute Reproduzierbarkeit vorliegt.It has been found that under the conditions of the invention, the microchannels or pores, especially when using polyester phthalate, polyester sulfonate or polycarbonate, do not clog and good reproducibility is present.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Enzymmembran erwies sich als besonders vorteilhaft, wenn die Enzymschicht aus Polyurethan besteht.The preparation of the enzyme membrane according to the invention proved to be particularly advantageous when the enzyme layer consists of polyurethane.

AusführungsbelspifjleAusführungsbelspifjle Beispiel 1example 1 Herstellung einer Glucoseoxidase-Membran zur Glucosebestimmung In unverdünntem HumanserumPreparation of a glucose oxidase membrane for glucose determination in undiluted human serum

2 μΙ einer 5%igen Glucoseoxidase (GOD)-Suspension in Aceton, die eine Aktivität von 5U GOD beinhalten, werden auf eine 20 um dicke Cellulosemembran getropft und im ungetrockneten Zustand mit einer Kapillarporenmembran aus Polyterephthalat vollständig bedeckt sowie mit einer zweiten Cellulosemembran, die mit der Enzymunterlage identisch ist, abgedeckt. Die RoTrac Kapillarporenmembran (Kernforschungsinstitut Rossendorf) besitzt bei einer Porengröße von 0,05 pm eine Porendichts von 4 x 109P/cm2 und eine Dicke von 10μηι. Mit der so hergestellten Sandwich-Enzymmembran wird eine Pt-Ag/ AgCI-Elektrode, die auf +60OmV polarisiert ist, gekoppelt. Anschließend wird der Glucosesensor mit der Kapillarporenmembran zur Lösungsseite hin mit einer Durchflußzelle in ein kontinuierliches Fließsystem mit amperometrischem Detektor gebracht. In den Carrier-Strom (0,06M Phosphatpuffer, pH7,0,1 ml/min) werden mit einem pneumatischen Injektionsventil und einer Frequenz von 100/h jeweils 25μΙ von 5,10,15 und 20mmol/l Glucoselösung injiziert und eine Kalibrationskurve mittels Bandschreiber aufgenommen. Mit der Injektion von 25μΙ unverdünntem und unbehandeltem Patientenserum kann dessen Glucosekonzentration im Meßbereich von 3 bis 30mmol/l innerhalb 10sec ermittelt werden.2 μΙ of a 5% glucose oxidase (GOD) suspension in acetone containing an activity of 5U GOD are dropped onto a 20 μm thick cellulose membrane and completely covered in the undried state with a polyterephthalate capillary pore membrane and with a second cellulose membrane containing the enzyme pad is identical, covered. The RoTrac capillary pore membrane (Rossendorf nuclear research institute) has a pore size of 0.05 μm and a pore density of 4 × 10 9 P / cm 2 and a thickness of 10 μm. With the sandwich enzyme membrane thus prepared, a Pt-Ag / AgCl electrode polarized to +60 ohms is coupled. Subsequently, the glucose sensor with the capillary pore membrane is brought to the solution side with a flow cell in a continuous flow system with amperometric detector. In the carrier stream (0.06M phosphate buffer, pH 7.0 ml / min) are injected with a pneumatic injection valve and a frequency of 100 / h each 25μΙ of 5,10,15 and 20mmol / l glucose solution and a calibration curve using Tape recorder recorded. With the injection of 25μΙ undiluted and untreated patient serum, its glucose concentration in the measuring range of 3 to 30 mmol / l can be determined within 10 seconds.

Beispiel 2Example 2 Herstellung einer LOD-Membran zur Lactatanalyse bei der MilchsäurefermentationProduction of a LOD membrane for lactate analysis in lactic acid fermentation

2 μΙ einer 5%!gen acetonischen Lactatoxidase (Pseudomonas sp.(-Suspension, die 2,5U LOD beinhalten, werden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 auf eine Polyäthylenm«mbran getropft und unmittelbar danach mit 3 übereinander angeordneten Kapillarporenmembranen vollständig bedeckt. Die durch Abdeckung mit einer Cellulosemembran entstehende Sandwich-Membran wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 in ein kontinuierliches Fließsystem gebracht. Die Pt-Ag/AgCI-Elektrode ist auf -60OmV polarisiert, und als Carrierlösung dient 0,06M Phosphatpuffer, pH7,0. Durch die Injektion von jeweils 50μΙ 0,20,30,40,50 und 60mmol Lactal/I wird die Eichkurve erstellt. 50μΙ unbehandelter Fermentationslösung werden zur Analyse der Lactatkonzentration benötigt. 10sec. nach Injektion der zu analysierenden Probe 'iegt das Ergebnis vor. Auswertbare Werte wurden bis zu Lactatkonzentrationen von 50mmol/l erhalten.2 μΙ of a 5% acetone lactic acid oxidase (Pseudomonas sp. Suspension containing 2.5U LOD are dropped onto a polyethylene membrane in the same way as in Example 1 and immediately thereafter completely covered with 3 capillary pore membranes arranged one above the other A sandwich membrane formed by covering with a cellulosic membrane is placed in a continuous flow system in the same manner as in Example 1. The Pt-Ag / AgCl electrode is polarized to -60 ohms and the carrier solution is 0.06M phosphate buffer, pH 7.0. The calibration curve is prepared by injecting 50μΙ 0,20,30,40,50 and 60mmol lactal / I. 50μΙ of untreated fermentation solution is needed to analyze the lactate concentration, 10sec after injection of the sample to be analyzed das the result is predictable Values were obtained up to lactate concentrations of 50 mmol / L.

Claims (7)

1. Enzymmembran zur Bestimmung hoher Substratkonzentrationen mit Enzymsensoren, bestehend aus einer Schicht mit Enzymen zum Umsatz der Substrate von Oxidasen mit Sauerstoff und einer für Sauerstoff hochpermeablen Deckmembran, die gegebenenfalls durch zwei Dialysemembranen eingeschlossen sind, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckmembran über die Enzymschicht auf der den zur Meßlösung gewandten Seite angeordnet ist und eine inhomogene Durchlässigkeit für Substrate besitzt, wobei die Gebiete hoher Durchlässigkeit für Substrate mikroskopisch klein und gleichmäßig in der Deckmembranfläche verteilt sind.1. Enzyme membrane for the determination of high substrate concentrations with enzyme sensors, consisting of a layer of enzymes for the conversion of the substrates of oxidases with oxygen and a highly oxygen-permeable cover membrane, which are optionally enclosed by two dialysis membranes, characterized in that the cover membrane on the enzyme layer on the the side facing the measuring solution is arranged and has an inhomogeneous permeability for substrates, wherein the areas of high permeability for substrates are microscopically small and evenly distributed in the cover membrane surface. 2. Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gebiete hoher Substratdurchlässigkeit 0,1 bis 10,0% der Deckmembranfläche bilden.2. Enzyme membrane according to claim 1, characterized in that the areas of high substrate permeability form 0.1 to 10.0% of the cover membrane surface. 3. Enzymmembran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gebiete hoher Substratdurchlässigkeit Mikrokanäle oder Poren in einer substratimpermeablen Deckmembran sind.3. Enzyme membrane according to claim 2, characterized in that the areas of high substrate permeability are microchannels or pores in a substrate-impermeable cover membrane. 4. Enzymmembran nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die substratimpermeable Deckmembran aus Polyesterphthalat, Polyestersulfonat, Polyurethan oder Polycarbonat besteht.4. Enzyme membrane according to claim 3, characterized in that the substrate-impermeable cover membrane consists of polyester phthalate, polyester sulfonate, polyurethane or polycarbonate. 5. Enzymmembran nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gebiete hoher Substratdurchlässigkeit Gebiete verringerter Schichtdicke der Deckmembran sind.5. Enzyme membrane according to claim 2, characterized in that the areas of high substrate permeability are areas of reduced thickness of the cover membrane. 6. Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Deckmembran aus einer oder mehreren Schichten bosteht.6. Enzyme membrane according to claim 1, characterized in that the cover membrane bosteht from one or more layers. 7. Enzymmembran nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymschicht aus Polyurethan und darin homogen verteilten Enzympartikeln besteht.7. Enzyme membrane according to claim 1, characterized in that the enzyme layer consists of polyurethane and homogeneously distributed enzyme particles therein.
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