FI91331C - Sensori - Google Patents

Description

91331 i

Sensori Tåmå keksintd koskee entsyymielektrodityyppia ole-vaa sensoria, joka kåsittåa parannetun kalvon, ja sensorin 5 analyyttistå kåyttdmenetelmaa.

Entsyyinielektrodien kayttd lisååntyy jatkuvasti laaketieteellisissa ja muissa laboratorioissa nimenomaan esimerkiksi glukoosin ja virtsan maarittamiseksi veresta ja muista fysiologisista nesteista koostuvista naytteista.

10 Tallaisia elektrodeja selostetaan inonissa julkaisuissa, nimenomaan Clarkin ja Lyonsin julkaisemassa artikkelissa (Anals of the New York Academy of Science, 102, 29-45, 1962) ja vastaavasti Clarkille ja Newmanille myonnetyisså US-patenteissa 3 539 455 ja 3 979 274. Entsyymielektrodeja 15 kåytetåan yleisesti tutkittaessa sellaisia materiaaleja, jotka eivat ole itse sahkdkemiallisesti aktiivisia, mutta jotka sopiviin entsyymeihin liittyen ottavat osaa reakti-oihin, jotka synnyttåvat lajeja, jotka on helppo ilmaista elektrodeilla. Entsyymielektrodeissa entsyymit ovat usein 20 polymeerimateriaaleissa IShella alla olevaa elektrodia.

Huomattava maarå tutkimuksia on tehty entsyymielektrodeissa kaytettavien kalvojen ominaisuuksien paran-tamiseksi ja tahan tarkoitukseen onkin julkistettu monia kalvoja. Eras esimerkki usein kåytettavåsta kalvotyypista 25 on Newmanin US-patentissa 3 979 274 julkistama laminoitu kalvo. Tama kalvo kåsittaå ensimmaisen, toisin sanoen si-sakerroksen, joka on paaasiassa homogeenista materiaalia, esimerkiksi selluloosa-asetaattia, joka pystyy estamaån pienen molekyylipainon omaavien materiaalien sekaantumisen 30 entsyymisignaaliin, edellista kerrosta låhella olevan var-sinaisen entsyymikerroksen (jossa on tai ei ole muita sellaisia materiaaleja, jotka voivat sekoittua siihen) ja toisen kerroksen (tassM tapauksessa ulkokerros), joka on huokoista tukikalvoa ja voi estaa huokoisten ja kolloidis-35 ten elementtien låpimenon.

2

Glukoosin mååråaminen voidaan ottaa esimerkkina materiaalianalyysistå, joka tapahtuu entsyymielektrodilla. Entsyymiglukoosioksidaasin ollessa kysymyksessa tapahtuu seuraava reaktio: 5 glukoosi glukoosi + 02 -^ glukonihappo + Η2θ2.

oksidaasi 10 Tåsså reaktiossa muodostunut vetyperoksidi menee kalvon ensimmaisen kerroksen lapi US-patentissa 3 979 274 esite-tylla tavalla ja voidaan maåråtå elektrodia kayttåmållå. Koska syntynyt vetyperoksidi riippuu naytteesså olevasta glukoosista, glukoosikonsentraatio voidaan maaråta sopi-15 valla tavalla kalibroidulla sensorilla.

Tåhan mennesså monet vaikeudet ovat rajoittaneet entsyymielektrodeilla saatavaa etua ja niiden kayttoaluet-ta rutiinianalyysissa, esimerkiksi verinåytteisså. Merkit-tavaa naissa vaikeuksissa on se rajoitettu lineaarisuus, 20 joka liittyy elektrodien reagointiin esimerkiksi glu-koosiin tai laktaattiin, jotka ovat entsyymikatalysoitujen reaktioiden substraatteja. Vastaus on lineaarinen vain analysoitavien aineiden alhaisten konsentraatioiden rajoi-tetulla alueella, ja tSman vuoksi analysoitavien materiaa-25 lien konsentraatioiden on oltava alhaisia ja nåytteenotos-sa on kaytettava yleenså laimennettuja naytteita entsyymielektrodeilla suoritettavassa analyysisså. Aina ei ole kuitenkaan edullista valmistaa laimennettuja naytteita rutiinianalyysia vårten laboratorion ulkopuolella ja se on 30 mahdotonta invasiivista ohjausta vårten.

Tåman keksinnon tekijoiden julkaistussa EP-patent-tihakemuksessa nro 216 577 julkistetaan patenttivaatimuk-sineen sensori, joka on tarkoitettu analysoitavan aineen maarittamiseen ja jossa on kalvo siina olevan elektrodin 35 ja analysoitavan nåytteen valissa. Kalvo vastaa mieluimmin 91331 3 US-patentissa 3 979 274 julkistettua kalvoa. EP-patentti-hakemuksessa nro 216 577 julkistetun sensorin kalvossa on entsyymiå sisaltavån kerroksen ja nåytteen valissa kuiten-kin rajoitettu, låpåisevåå materiaalia oleva kerros, jossa 5 on alue, jonka låpi analysoitava aine voi mennå ja joka on muodostettu huokoisesta, enintaan 5 % huokoisuusasteen omaavasta ja lapaisevyydeltaan rajoitetusta materiaalista.

Kasiteltavån keksinnon mukaan on kehitetty entsyy-mielektrodityyppinen sensori analysoitavan aineen måårit-10 tåmiseksi mainitun anlysoitavan aineen ollessa muutetta-vissa entsyymin avulla sellaiseksi lajiksi, joka voidaan ilmaista sensorilla, jossa on elektrodi ja kalvo, joka låpaisee nesteita ja liuotteita ja joka on sijoitettu elektrodin 4 ja analysoitavan aineen sisaltåvan nåytteen 15 valiin, mainitun kalvon kasittaesså ensimmåisen kerroksen 3, joka sisaltåå ainakin yhtå entsyymia 2, ja toisen kerroksen 1, joka on pantu entsyymin sisaltavan kerroksen ja naytteen valiin, jolle sensorille on tunnusomaista, etta mainittu toinen kerros 1 kasittaa alueen, joka on huokoi-20 sesta materiaalista muodostettu nestemainen membraani, joka on kasitelty sen huokosten tayttåmiseksi kokonaan tai osittain nesteella, jonka låpi analysoitava aine mutta eivat naytteen muut aineosat voi mennå.

Keksinnon mukaan on nåytteestå analysoitavan aineen 25 måårittåmiseksi kehitetty myos menetelmå, jossa nåyte pannaan kosketukseen kalvon ulkokerroksen kanssa, joka låpåi-see nesteitå ja liuotteita ja kåsittåå yhden tai useampia enstyymejå, joiden avulla analysoitava aine voidaan muut-taa sensorilla ilmaistavaksi lajiksi, sensorin kåsittåessa 30 kalvon ja yhden tai useampia materiaalikerroksia, ja mita-taan mainittua lajia koskeva sensorin antama vastaus jolle menetelmålle on tunnusomaista, ettå kalvossa entsyymin ja nåytteen vålisså oleva kerros kåsittåå sellaisen alueen, joka on huokoisesta materiaalista muodostettu nestemåinen 35 membraani, joka on kåsitelty sen huokosten tåyttåmiseksi 4 kokonaan tai osittain nesteellå, jonka lapi analysoitava aine mutta eivåt nåytteen muut aineosat voi mennå.

Nesteellå on rajoitettu haihtuvuus eika se liukene sanottavasti veteen, joten nestehavio kalvon kautta haih-5 tumalla ja/tai liuottaroalla våhenee, mistå johtuen neste-kalvon stabiliteetti kasvaa. Neste toimii jossain måårin liuottimena analysoitavalle aineelle, niin ettå se voi menna nestekalvossa olevan nesteen lapi ja paåsta entsyy-miin.

10 Termi "rajoitetun haihtuvuuden omaava neste" koskee jarjestelmiå, joissa haihtuva neste pidetaan toisen sel-laisen nesteen alla, jolla on rajoitettu haihtuvuus, vaik-ka tallaisilla jårjestelmillå onkin rajoitettu kaytto kek-sinnon mukaisissa sensoreissa. Rajoitetun haihtuvuuden 15 omaava neste ei ole interferoivalle lajille, esimerkiksi askorbiinihapolle tarkoitettu liuotin, joka synnyttaa sig-naaleja, jotka interferoivat analysoitavasta aineesta tu-levien signaalien kanssa, eika se ole myoskaan liuotin, joka on tarkoitettu tållaiselle interferoivalle lajille, 20 edes rajoitetussa måarin.

Neste voi olla liuosta. Neste voi sisåltaå jonkin lipidin tai rasvahappoesterin. Nesteellå kåsitelty kerros voidaan muodostaa kastamalla kalvo johonkin sopivaan nes-teeseen, nimenomaan lipidiliuoksiin, esimerkkinå n-butano-25 li tai n-dekaani tai seokset liuottimina. Nestekåsittelyi-tå vårten suositeltavia lipidejå ovat isopropyylimyri-staatti (IPM) ja lesitiini. Kun nåitå lipidejå kåytetåån noin 0,5 mM:n konsentraatioissa, pyrokatekiini ja glukoosi voivat mennå niiden låpi, mutta ne ovat melko låpåisemåt-30 tomiå, kun kyseesså on interferoiva laji kuten askorbiini-happo, virtsahappo, vetyperoksidi ja parasetamoli.

Sopiva menetelmå kåsitellyn kerroksen muodostami-seksi on, ettå kalvo kastetaan nesteeseen, esimerkiksi lipidiliuokseen lyhyeksi ajaksi, esimerkiksi 2-4 minuutik-35 si. Tåmån jålkeen tåmå kalvo poistetaan kankaalla ennen 91331 5 kalvon kiinnittåmistå elektrodiin. On tunnettu, etta nes-teella kasitelty kalvo on roelko stabiili aikaan nåhden.

Keksinnon mukainen sensori on selektiivinen analy-soitaviin aineisiin nåhden ja antaa vastauksen, joka on 5 lineaarinen sellaisella alueella, joka vastaa edella mai-nitussa julkaistussa EP-patenttihakemuksessa nro 216 577 esitettyå. Silla voidaan saada vastaavanlainen lineaari-suusaste kayttåmållå kalvoja, joissa on låpaisevyydeltaan rajoitetut kerrokset, joissa on suurempia huokosia ja/tai 10 suurempia huokoisuuksia kuin EP-patenttihakemuksessa nro 216 577 esitetyissa kalvoissa.

Kasitelty alue saa aikaan siihen liittyvån kerrok-sen rajoitetun låpåisevyyden. Mieluimmin koko alue tai suurin osa taman kerroksen tehollisesta alueesta on kåsi-15 telty.

Yksinkertaisimmassa muodossaan kasiteltavån keksinnon mukaisen sensorin kalvo kasittaa entsyyroiå sisaltavan kerroksen ja kasitellyn kerroksen. Kasitelty kerros on ulompi kerros tassa yksinkertaisessa kalvomuodossa ja kos-20 kettaa suoraan naytteeseen keksinnon mukaisessa analysoin- timenetelmassa.

On kuitenkin mahdollista, etta kalvo on laminoitu kalvo ja vastaa esimerkiksi US-patentissa 3 979 274 jul-kistettua. Tallainen kalvo kasittaa ensimmaisen, toisin 25 sanoen sisemman materiaalikerroksen, joka on sijoitettu entsyymin sisaltavan kerroksen ja elektrodin valiin, ent-syymin sisaltavan kerroksen ja toisen materiaalikerroksen entsyymin sisaltavan kerroksen toisella puolella, jolloin tama toinen kerros on kasitelty kerros.

30 Nain olien tassa selityksessa seuraavassa selostet- tava keksinndn mukainen sensori kasittaa laminoidun kalvon, joka vastaa tyypiltåan US-patentissa 3 979 274 esi-merkkina esitettyå ja kasittaa ensimmaisen ja toisen kerroksen kasitellyn kerroksen ollessa talloin toinen kerros.

6

On huomattava, etta keksinnon mukaisen sensorin kalvot voivat entsyyinikerroksen lisaksi sisaltåa enemmån kuin kaksi materiaalikerrosta. Esimerkiksi toinen kerros, toisin sanoen kasitelty kerros, ei ole vålttåmåttå kalvon 5 ulompi kerros. Toisen kerroksen, siis kåsitellyn kerroksen ja nåytteen vålissa voi olla lisåmateriaalikerros tai li-såmateriaalikerroksia, toisin sanoen kolmas kerros, neljas kerros, ja niin edelleen. Usein toinen kerros on kuitenkin ulompi kerros, ja nayte koskettaa sen ulkopintaan.

10 Yleensa kasitellyn kerroksen huokoinen materiaali on polymeerimateriaalia, mutta myos muita sopivia materi-aaleja voidaan kayttåå. Kasitelty kerros voidaan muodostaa siis huokoisesta lasista, metallista, esimerkiksi sintra-tusta metallista, jossa on laserilla leikattuja huokosia, 15 tai huokoisista, etsatuista ja sintratuista keramiikkama-teriaaleista kuten aluminiumoksidista.

Kasitelty materiaalikerros muodostetaan mieluimmin sellaisesta materiaalista, jonka huokoisuus on 0,05-20 %. Huokoskoko valitaan niin, etta rajoitetun haihtuvuuden 20 omaava neste tayttåå huokosen kokonaan tai osittain, jol-loin muodostuu tuettu nestekalvo. Huokosten keskihal-kaisijat voivat olla alle 5 μπ», mutta mieluimmin ne ovat kuitenkin 3 μια tai sita pienempia. Huokosten keskihal-kaisijat voivat olla mieluimmin 3 μτα - 0,05 μια, nimenomaan 25 silloin, kun neste kasittaå isopropyylimyristaattia ja kerros on muodostettu polykarbonaatista.

Keksinnon mukaisessa sensorissa voi olla irrotet-tava kalvo, tai se voi olla kertakåyttoinen sensori, jossa on siihen kiinteasti liittyva kalvo. Inertit metallit ja/ 30 tai hiili ovat sopivia materiaaleja sensorien elektrodien valmistusta vårten.

Kun sensori kasittaå US-patentissa 3 979 274 jul-kistettua tyyppiå olevan laminoidun kalvon, ensimmainen kerros, joka tulee entsyymikerroksen ja elektrodin våliin, 35 tehdåån mieluimmin polymetyyli-metakrylaatista, polyure- 91331 7 taanista, selluloosa-asetaatista tai jostakin muusta sellaisesta huokoisesta materiaalista, joka rajoittaa tai estaå interferoivien sahkoaktiivisten aineiden kuten as-korbiinihapon ja tyrosiinin låpimenon. Ensimmåisen kerrok-5 sen vahvuus on mieluimmin 0,1 - 1,0 mikronia. Kalvo sisål-taa mieluimmin kerroksen, joka on muodostettu polyaryy-lisulfonista tai polyaryyliketonista kuten tåmån keksinnon tekijoiden EP-patenttihakemuksessa nro 225 094 esitetaan.

Sopivia huokoisia materiaaleja toista kerrosta var-10 ten ovat huokoiset polykarbonaatit, polyuretaanit ja muun-nettu selluloosa, nimenomaan selluloosanitraatti, sellu-loosa-asetaatti ja regeneroitu selluloosa.

Keksinnon mukaisessa sensorissa oleva entsyymi voi-daan panna kalvoon millå tahansa tåhan sopivalla tavalla.

15 Laminoidussa kalvossa entsyymi on mieluimmin ensimmaisen ja toisen materiaalikerroksen valissa ja muodostaa niiden valisen liitoksen. Tassa tilanteessa ja myos yleisesti entsyymi on mieluimmin sijoitettu liikkumattomaksi geelii-n. Erittain hyvin sopiva materiaali tahan tarkoitukseen on 20 glutaarialdehydi; proteiineja kuten albumiinia ja myos muita materiaaleja voidaan kåyttåå. Jotta sensorista saa-taisiin helpommin nopeat, stabiilit lukemat, entsyymia sisaltåvån kerroksen tulisi olla ohut, enintaan 5 mikronin vahvuinen.

25 Keksinnon mukaisessa sensorissa kaytettava entsyymi riippuu analysoitavasta aineesta, jonka konsentraatio on maaråttavå. Jos analysoitava aine on glukoosia, entsyymi on esimerkiksi glukoosioksidaasia. Muita mahdollisia ent-syymeja ovat urikaasi ja laktaattioksidaasi, joilla maa-30 ratåan vastaavasti virtsahappo ja maitohappo. Lisaksi voidaan kåyttaa sellaisia entsyymijarjestelmia, joissa on kaksi tai useampia entsyymeja.

Laminoitu kalvo, jota kaytetaan keksinnon mukaisessa sensorissa glukoosin måarittamiseen, voidaan valmistaa 35 seuraavat toimenpiteet kasittavalla menetelmalla: δ 1. Huokoinen polykarbonaattikalvo, jonka huokoisuus on alle 20 % ja huokosten halkaisija alle 10 μιη ja mie-luimmin alle 5 μιη, kastetaan n-butanolissa olevaan isopro-pyylimyristaattiin 3 minuutin ajaksi sen kasittelemiseksi.

5 Liuoksesta poistettuna liika neste poistetaan kalvosta kankaalla.

2. 1 mg glukoosioksidaasia liuotetaan 50 ^l:aan (100 mg/ml) albumiinia.

3. 3μ1 12,5-%:ista glutaarialdehydiliuosta sekoite-10 taan lasimikroskooppilevylla 3 μΙΐΆΆη entsyymi-albumiini- seosta.

4. 1 μΐ edellisesså toimenpiteessa valmistettua seosta pannaan toimenpiteessa 1 valmistettuun 1 cm2:n po-lykarbonaatin toiseen pintaan.

15 5. Entsyymikerroksen toinen pinta peitetaan heti ohuella selluloosa-asetaattikalvolla ja nSin saatua lami-noitua kalvoa puristetaan 3 minuuttia lasilevyjen valissa.

6. Kalvo pannaan platinaelektrodiin keksinnon mu-kaisen sensorin muodostamiseksi selluloosa-asetaattikalvon 20 ollessa lahinna elektrodia ja muodostaessa ensimmaisen kerroksen.

Keksinnon mukaisen menetelman etuna on se suurentu-nut konsentraatioalue, jossa konsentraatiota esittava kåy-ra on sensorin vastaukseen nåhden lineaarinen. Tavanomai-25 silla menetelmillå lineaarisuus oli yleensa vain noin 3 mmoolia/1 glukoosin tapauksessa. Keksinnon mukaista mene-telmåå kåytettaessa lineaarisuus lisåantyy ja alue ulottuu 50 mmolia/1 oleviin glukoosikonsentraatioihin ja jopa suu-rempiin konsentraatioihin. Tåhan påastaan rajoittamalla 30 substraatin påasyå entsyyraikerrokseen, jolloin herkkyys laskee vahan. Nain olien alue peittaS ne glukoosikonsent-raatiot, joita voidaan odottaa olevan verinåytteissa, jolloin veren glukoosiarvot on helpompi maåratå. Tama onkin huomattava etu niissa tilanteissa, joissa lukuisia maari-35 tyksia on suoritettava såannollisesti ja valmistettujen 9 91331 nåytteiden mååra on minimaalinen. Lineaarisuutta lisåtaan myos panemalla kalvon toiseen kerrokseen sellaista ainet-ta, joka sisaltåå jonkin orgaanisen silaanin, jonka reak-tiiviset ryhmåt vastaavat tåman keksinnon tekijoiden EP-5 patenttihakemuksessa nro 204 468 julkistettuja. Tamå kasittely voidaan suorittaa kalvon toiseen kerrokseen ka-siteltåvan keksinnon mukaisessa sensorissa yhteisvaikutuk-sen saamiseksi aikaan ja lineaarisuuden parantamiseksi.

Keksintoa havainnollistaa oheisten piirustusten ku- 10 vio 1.

Kuviossa 1 viitenumero 1 tarkoittaa kalvon toista kerrosta, joka on muodostettu polykarbonaattikalvosta, joka on kasitelty 30-%:isella isopropyylimyristaattiliuok-sella (IPM), viitenumero 2 tarkoittaa glukoosioksidaasi-15 entsyymikerrosta, joka on liuotettu albumiiniin ja johon on sekoitettu glutaarialdehydiå, viitenumero 3 tarkoittaa ensimmaista kerrosta, joka on muodostettu selluloosa-ase-taatista, viitenumero 4 tarkoittaa platinasta tehtya tyo-elektrodia ja viitenumero 5 taas hopeareferenssielektro-20 dia. Kerrokset 1, 2 ja 3 muodostavat yhdessa laminoidun kalvon. Platinatyoelektrodi 4 toimii anodina, ja hopeare-ferenssielektrodi 5 toimii taas katodina. Kalvo pysyy pai-kallaan elektrodissa pleksirenkaan avulla, joka puristaa ulomman kerroksen 1 sen ulkoreunoja vasten kohdassa 6.

25 Kuviossa 1 esitetyn sensorin kåytto esitetaan seu- raavassa esimerkissa.

Esimerkki

Kokeet suoritettiin kayttamalla sensoreita, joiden kalvot oli valmistettu edella selostetulla tavalla. Kal-30 vojen toiset eli ulommat kerrokset tehtiin polykarbonaattikalvosta, joka oli kasitelty kastamalla se n-butanolis-• sa, n-dekaanissa ja nåiden liuottimien seoksissa oleviin lipidiliuoksiin. Lipideinå kaytettiin lesitiinia ja iso-propyylimyristaattia. Nain kasiteltyjen kalvojen todettiin 35 lapaisevan helposti pyrokatekiinia, mutta taas melko hei- 10 kosti sellaisia aineita kuten vetyperoksidia, askor-biinihappoa, parasetamolia ja piroglusinolia (nåiden kåy-tetyt konsentraatiot olivat 0,5 mM) . Tåmå esitetåån seu-raavassa taulukossa, joka esittåå signaalikoon pienenty-5 mistå jokaisen interferoivan lajin kohdalla, kun polykar-bonaattikalvot, joiden huokoskoot olivat 0,8 μιη ja 0,2 μιη, kasiteltiin IPM:llå.

Signaalikoon pienentvminen _ 10 Laii Huokoskoko 0.8 uro Huokoskoko 0.2 uro

Vetyperoksidi 86,3 98,5

Askorbiinihappo 94,65 100

Virtsahappo 91,31

Parasetamoli 56 82 15 Piroglusinoli 66,6 95

Kasitellyt kalvot lapåisivat glukoosia, vaikka sensor in rekisteroimån vastauksen suuruus pieneni. Todettiin, etta erilaisilla glukoosikonsentraatioilla suoritetuissa 20 kokeissa saatujen vastausten lineaarisuusalue kasvoi kåsi-tellyissa kalvoissa.

Tålnå esitetåån piirustusten kuvioiden 2-10 kåyril-lå, jolloin vastauksen suuruutta verrataan glukoosikonsen-traatioon (mM). Puheena olevat kåsitellyt kalvot olivat 25 IPMrllå kåsiteltyjå polykarbonaattikalvoja.

Kuten kuviossa 2 esitetåån, IPMrllå (kåyrå A) kå-sitellyillå kalvoilla saatu vastaus (mielivaltaisina yk-sikkdinå) on lineaarinen ainakin 50 mM asti, siis påinvas-toin kuin kåsittelemåttomållå kalvolla saatu vastaus (kåy-30 rå B).

Kuviot 3-10 havainnollistavat vielå kuviossa 2 esi-tettyå tulosta ja huokoskoon vaikutusta vastauksen line-aarisuuteen. Kuviossa 3 kåyrå B esittåå vastausta, joka on saatu kåsittelemåttomållå kalvolla, jonka huokoskoko on 2 35 μιη, ja kåyrå A esittåå taas IPM:llå kåsitellyllå kalvolla 91331 11 saatua vastausta. Kasitellyn kalvon lineaarisuus siis kas-vaa.

Kuvio 4 esittaå vastausta, joka on saatu kalvoilla, joiden huokoskoko on 0,2 /xm. Kasittelematon kalvo antaa 5 lineaarisen vastauksen vain sellaiseen konsentraatioon asti, jossa on vahan yli 2 mM glukoosia (katso kayraa B); sen sijaan kasitelty kalvo (kayra A) antaa lineaarisen vastauksen ainakin 10 mM konsentraatioon saakka.

Kuvioiden 5 ja 6 esittamalla tavalla kåsittelemåt-10 tomalla kalvolla, jonka huokoskoko on 0,05 μπι, saatu vastaus on lineaarinen suunnilleen sellaiseen konsentraatioon saakka, jossa on 4 mM glukoosia (kuvio 5), kun taas kasitelty kalvo antaa lineaarisen vastauksen ainakin 60 mM glukoosiin asti (kuvio 6).

15 Kuvioissa 7 ja 8 esitetaan vastaus, joka on saatu kalvoilla, joiden huokoskoko oli 0,8 μιη. Kuten kuviossa 7 esitetaan, kasittelematon kalvo antaa lineaarisen vastauksen vain 2 mM glukoosikonsentraatioon asti (kayra B) . Kuitenkin IPM:lla kasitelty kalvo antaa lineaarisen vas-20 tauksen noin 20 mM glukoosikonsentraatioon asti (katso kayraa A, kuviot 7 ja 8).

Vastaavasti vastauksen lineaarisuuden lisays todet-tiin huokoskoon ollessa 0,015 μτα, kun kalvo oli kasitelty IPM:lla - katso kuviota 9 (kasittelematon kalvo) ja ku-25 viota 10 (kasitelty kalvo).

Edellå selostetut kokeet osoittavat, ettå lineaa-risuusalue kasvaa kasiteltyjå kalvoja kaytettaesså. Lisåk-si todettiin, etta alueen ylakonsentraatioraja voi vaih-della nesteen konsentraatiosta riippuen. Esimerkiksi ka-3 0 sittelematon polykarbonaattikalvo (huokoskoko 0,2 μια) an-toi lineaarisen vastauksen juuri våhan yli 2 mM glukoosiin asti, sen sijaan 100-%isella IPM:lla kasitelty kalvo oli lineaarinen 30 mM glukoosiin asti ja 90 % IMP/10 % n-de-kanoliseoksella kasitelty kalvo oli lineaarinen ainakin 60 35 mM glukoosiin asti.

12

Lisaksi suoritetut kokeet osoittavat, ettå rasva-happoesterimetyylioleaatilla ja -metyylilinoleaatilla kå-sitellyt kalvot lisåsivat vastauksen lineaarisuutta IPM:aa vastaavalla tavalla. Lesitiinillå kåsitellyt kalvot kayt-5 tåytyivat myos samalla tavalla kuin IPMtllå kåsitellyt kalvot.

Claims (14)

91331

1. Entsyymielektrodityyppinen sensori analysoitavan aineen måårittåmiseksi mainitun analysoitavan aineen ol- 5 lessa muutettavissa entsyymin avulla sellaiseksi lajiksi, joka voidaan ilmaista sensorilla, jossa on elektrodi ja kalvo, joka låpåisee nesteitå ja liuotteita, ja joka on sijoitettu elektrodin (4) ja analysoitavan aineen sisåltå-van naytteen våliin, mainitun kalvon kåsittåesså ensimmåi-10 sen kerroksen (3), joka sisaltaa ainakin yhta entsyymiå (2) ja toisen kerroksen (1), joka on pantu entsyymin si-saltavan kerroksen ja naytteen våliin, tunnettu siita, ettå mainittu toinen kerros (1) kåsittåå alueen, joka on huokoisesta materiaalista muodostunut nestemåinen 15 membraani, joka on kasitelty sen huokosten tåyttamiseksi kokonaan tai osittain nesteellå, jonka lapi analysoitava aine mutta eivat naytteen muut aineosat voi menna.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen sensori, tunnettu siita, ettå se kasittaa laminoidun kalvon, jos- 20 sa on entsyymin sisaltava kerros ensimmaisen materiaali-kerroksen ja toisen materiaalikerroksen valiin sijoitettu-na, ensimmaisen materiaalikerroksen ollessa entsyymin si-såltavån kerroksen ja sensorissa olevan elektrodin vålissa ja toisen kerroksen ollessa kasitelty kerros.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen sensori, tun nettu siita, etta ensimmåinen materiaalikerros koos-tuu polymetyylimetakrylaatista, polyuretaanista tai sellu-loosa-asetaatista.

4. Patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukainen sensori, 30 tunnettu siita, ettå kasitelty kerros koostuu po- lykarbonaatista, polyuretaanista tai muunnetusta sellu-loosasta.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen sensori, tunnettu siita, ettå kåsitelty kerros koos- 35 tuu sellaisesta materiaalista, jonka huokoisuus on 0,05 - 20 %.

6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen sen-sori, tunnettu siita, etta huokosten keskihalkai-sija on alle 5 μιη.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen sensori, t u n -5 n e t t u siita, etta huokosten keskihalkaisija on 3 - 0,05 Mm.

8. Jonkin edella olevan patenttivaatimuksen mukainen sensori, tunnettu siita, etta neste on jokin lipidi.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen sensori, tun nettu siita, etta neste on isopropyylimyristaattia.

10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen sensori, tunnettu siita, etta neste on lesitiinia.

11. Jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen 15 sensori, tunnettu siita, etta neste on jokin ras- vahapon esteri.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen sensori, tunnettu siita, etta neste on metyylioleaattia tai metyylilinoleaattia.

13. Jonkin edella olevan patenttivaatimuksen mukai nen sensori, tunnettu siita, etta kalvo sisaltåa kerroksen, joka on muodostettu polyaryylisulfonista tai polyaryyliketonista.

14. Naytteessa olevan analysoitavan aineen maari-25 tysmenetelma, jossa nayte pannaan kosketukseen kalvon ul-kokerroksen kanssa, joka låpaisee nesteitå ja liuotteita ja kasittaa yhden tai useampia entsyymeja, joiden avulla analysoitava aine voidaan muuttaa sensorilla ilmaistavaksi lajiksi, sensorin kasittaessa kalvon ja yhden tai useampia 30 materiaalikerroksia, ja mitataan mainittua lajia koskeva, sensorin antama vastaus, tunnettu siita, etta kalvossa entsyymin ja nåytteen valissa oleva kerros kasittaa sellaisen alueen, joka on huokoisesta materiaalista muodostettu nestemåinen membraani, joka on kasitelty sen 35 huokosten tayttamiseksi kokonaan tai osittain nesteellå, jonka lapi analysoitava aine mutta eivat nåytteen muut aineosat voi mennå. 91331