PT88183B

PT88183B - Sensor do tipo electrodo de enzima e processo para realizar analises utilizando esse sensor

Info

Publication number: PT88183B
Application number: PT88183A
Authority: PT
Inventors: Pankaj Madganlal Vadgama
Original assignee: Ici Plc; Lian Xiang Tang
Priority date: 1987-08-04
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1994-09-30
Also published as: FI91331B; AU2035588A; DE3853029T2; NO883441D0; EP0302661B1; EP0302661A1; GB8718430D0; DK170656B1; FI91331C; PT88183A; ES2070852T3; US4919767A; IL87263A; AU608875B2; DK433588A; DE3853029D1; FI883622A; NO302846B1; ATE118543T1; IL87263A0

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 88 183

REQUERENTE' IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC, britânica, com sede em Imperial Chemical House, Millbank, London SW1P, Inglaterra e de LI AN XIANG TANG, chinês, com domicílio em Department of Clinicai Biochemistry, The Medicai School, University of Newcastle-upon-Tyne, Newcastle-upon-Tyne NE2 4HH, Inglaterra

EPÍGRAFE: SENSOR DO TIPO ELECTRODO DE ENZIMA E PROCESSO PARA REALIZAR ANÁLISES UTILIZANDO ESSE SENSOR

INVENTORES: Pankaj Maganlal Vadgama e Lian Xiang Tang

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

Grã-Bretanha em 4 de Agosto de 1987, sob o N°. 8718430.

INP1. MOO. 113 R F 18732 $ Ζ ί 'ί $

Descrição referente à patente de invenção de IMPERIAL CHEMICAL IN DUSTRIES PLC, britânica, industrial e comercial, com sede em Imperial Chemical House, Millbank, London SW1P, Inglaterra e de LIAN XIANG TANG, chinês, investigador, com domicílio em De partment of Clinicai Biochemistry, The Medicai School, Univer sity of Newcastle-upon-Tyne, New castle-upon-Tyne NE2 4HH, Ingla terra (inventores: Pankaj Magan lai Vadgma e Lian Xiang Tang, re sidentes na Inglaterra), para SENSOR DO TIPO ELECTRODO DE ENZIMA E PROCESSO PARA REALIZAR ANÁLISES UTILIZANDO ESSE SENSOR'

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a um sen sor do tipo eléctrodo de enzima compreendendo uma membrana aperfeiçoada e a um processo analítico que utiliza este sensor.

Os eléctrodos de enzimas são cada vez mais utilizados em laboratórios médicos e outros, particularmente na determinação de substâncias tais como a glucose e a ureia em espécimes de sangue e de outros fluídos fisiológicos. Tais eléctrodos são descritos em muitas publicações, especialmente num artigo de (Fig. 1, pãg. 1) e nas Patentes Norte Americanas 3539455 e 3979274 de Clark e Newman, respectivamente. Os eléctro

N.

dos de enzima são geralmente utilizados para determinar materiai; que não são electroquímicamente activos, mas que, na presença de enzimas adequados tomam parte nas reacções que produzem espécies que podem ser facilmente detectadas pelos eléctrodos. Nos eléctrodos de enzimas, os enzimas localizam-se frequentemente dentro de substâncias polímêricas muito próximas do eléctrodo subjacente.

Tem-se efectuado um considerável esforço de pesquisa com o objectivo de aperfeiçoar as propriedades de membranas para utilização em eléctrodos de enzimas e, para e£ te fim, foram jã divulgadas muitas membranas. Um exemplo de um tipo de membrana que é frequentemente utilizado é a membrana laminada, divulgada por Newman na Patente Norte Americana 3979274. Esta membrana compreende uma primeira camada ou camada interior de um material praticamente homogéneo, por exemplo acetato de ce lulose, a qual pode evitar a passagem de materiais de baixo peso molecular capazes de interferirem com o sinal enzimãtico, uma ca mada aderente fechada do próprio enzima (com ou sem outros materiais que podem ser misturados com ele), e uma segunda camada (neste caso uma camada interior) de uma película de suporte poro sa que pode evitar a passagem de elementos celulares e coloidais

A determinação da glucose pode ser da da a título de exemplo da determinação de uma substância por um eléctrodo de enzima. IAS seguintes reacções dão-se na presença da oxidase de glucose de enzima:

glucose

Glucose +0₂ - acido glucõnico + H₂O₂ oxidase perôxido de hidrogénio produzido nesta reacção passa através da primeira camada de uma membrana, tal como a da Patente Norte Americana 3979274 e pode ser determi. nada utilizando-se o eléctrodo. Dado que c perôxido de hidrogénio produzido depende da glucose presente num espécime, a concen tração de glicose pode ser determinada utilizando-se um sensor calibrado adequado.

Até â data, uma série de dificuldades limitou a utilidade dos eléctrodos de enzima e restringiu a esca

la da sua utilização em análises de rotina, por exemplo de amostras sanguíneas. Importante entre estas dificuldades ê a linear i_ dade limitada da resposta dos eléctrodos às substâncias a analisar, tais como glucose ou lactato que são substractos para as re acções catalizadas por enzimas. A resposta é linear apenas ao longo de uma gama limitada de baixas concentrações das substâncias a analisar e portanto as concentrações dos materiais a serem determinados devem ser baixas e as amostras geralmente dilu£ das devem ser utilizadas em espécimes para analise utilizando-se eléctrodos de enzimas. Não é sempre praticável fazerem-se amostras diluídas para análises de rotina fora do laboratório e seria impossível para monitorização invasora.

No nosso Pedido de Patente Europeia publicado N9. 216577, nós descrevemos e reivindicamos um sensor para a determinação de uma substância a analisar possuindo uma membrana entre o seu eléctrodo e um espécime da substância a ana lisar. Preferivelmente, a membrana é uma membrana tal como a da Patente Norte Americana 3979274. Contudo, na membrana do sensor do pedido de Patente Europeia N9. 216577 existe uma camada de ma terial de permeabilidade restrita entre a camada contendo os enzimas e o espécime, cuja camada de permeabilidade restrita contêm uma ãrea, através da qual a substância a analisar possa passar, constituída por um material poroso de permeabilidade restri ta possuindo uma porosidade que não é superior a 5%.

De acordo com a presente invenção, pre porcionamos um sensor do tipo eléctrodo de enzimas para a determinação de uma substância a analisar, em que a substância a analisar é convertível na presença de um enzima numa espécie que po de ser detectada pelo sensor, o qual compreende um eléctrodo e uma membrana permeável aos líquidos e solutos, posicionada entre o eléctrodo e um espécime contendo a substância a analisar, compreendendo a membrana uma camada que contém um ou mais enzimas e uma camada de material posicionada entre a camada que contém os enzimas e o espécime. 0 sensor é caracterizado por a camada de material conter uma ãrea através da qual a substância a analisar pode passar, feita de um material poroso que foi tratado com um líquido para tapar total ou parcialmente os seus poros, formando

deste modo uma membrana líquida suportada.

Ainda de acordo com a invenção, proporcionamos um processo para determinação de uma substância a analisar num espécime, o qual compreende o contacto do espécime com a camada exterior de uma membrana, permeável aos líquidos e aos solutos, que compreende um ou mais enzimas, na presença dos quais a substância a analisar é convertivel numa espécie detectã vel por um sensor que incorpora a membrana, e uma ou mais camadas de material, e a medição da resposta do sensor à espécie, ca racterizado por uma camada dentro da membrana entre o enzima e o espécime conter uma área, através da qual a substância a analisar pode passar, feita de um material poroso que foi tratado com um líquido para tapar total ou parcialmente os seus poros, formando deste modo uma membrana líquida suportada.

O líquido tem volatibilidade limitada e não é significativamente solúvel em ãgua, de modo que a perda do líquido a partir da membrana através da evaporação e/ou disso lução ê reduzida e portanto a estabilidade da membrana líquida é aumentada. O líquido ê, num certo grau, um solvente para a substância a analisar, de modo que a mesma possa passar através do líquido que se encontra na membrana líquida para alcançar o enzjí ma.

A frase líquido de volatibilidade li. mitada inclui sistemas em que um líquido volátil é suspenso sob um outro líquido que possui volatibilidade limitada, embora tais sistemas tenham utilidade limitada nos sensores da invenção. Pre ferivelmente, o liquido de volatibilidade limitada ou é um não-solvente para a espécie de interferência tal como ãcido ascórbi^ co que aumentará os sinais que interferem com aqueles da substân cia a analisar, ou ê um solvente apenas num grau limitado para com as espécies de interferência.

O líquido pode estar na forma de uma solução. 0 liquido pode compreender um líquido ou um éster de ãcido gordo. A camada tratada com o líquido pode ser formada por mergulho de uma membrana num líquido adequado, particularmente soluções de lípidos, por exemplo n-butanol ou n-decano ou misturas como solventes. Os líquidos preferidos para os tratamentos

com líquidos são miristato de isopropilo (MIP) e lecitina. Estes lipidos quando utilizados nas concentrações de aproximadamente 0,5 mM deixarão passar o catecol e a glucose através dos mesmos, mas são substancialmente impermeáveis às espécies de interferência, tais como ácido ascõrbico, ãcido úrico, peróxido de hidrogê nio e paracetamol.

Uma técnica adequada para formação da camada tratada consiste em mergulhar a membrana no liquido, por exemplo numa solução de lipidos durante um curto período de tempo, por exemplo 2 a 4 minutos. Após este período, a membrana é removida utilizando-se um tecido, antes de ser fixada ao eléctro do. Descobrimos que a membrana tratada com o líquido é bastante estável ao longo do tempo.

O sensor da invenção é selectivo rela tivamente às substâncias a analisar e dã uma resposta que é linear ao longo de um intervalo semelhante ao do nosso Pedido de Patente Europeia N9. 216577 jã publicado. É possível alcançar ejs te grau equivalente de linearidade utilizando-se membranas com camadas de permeabilidade restrita que possuem maiores poros e maiores porosidades do que a das membranas do Pedido de Patente Europeia N9. 216577.

O tratamento da área proporciona a ca mada com permeabilidade restrita. Preferivelmente, trata-se toda ou uma grande parte da área eficaz desta camada.

Na sua forma mais simples, a membrana no sensor da invenção é constituída pela camada que contêm o enzima e pela camada tratada. A camada tratada ê a camada exterior nesta forma somples de membrana e é contactada directamente pelo espécime no processo da invenção para determinação de uma substância a analisar.

No entanto, a membrana pode ser uma membrana laminada do tipo da divulgada na Patente Norte Americana 3979274. Uma tal membrana compreende uma primeira camada ou camada interior de material, posicionada entre a camada que contém o enzima e o eléctrodo, a camada que contém o enzima e uma segunda camada de material no outro lado da camada que contém o enzima, em que a segunda camada é a camada tratada.

A seguir, na presente descrição, o sensor da invenção descrito compreenderá uma membrana laminada do tipo da membrana descrita na Patente Norte Americana 3979274 que possui uma primeira e uma segunda camada, em que a camada tratada é a segunda camada.

Deve ficar claro que as membranas do sensor da invenção podem conter mais do que duas camadas de mate rial para além da camada que contém o enzima. Por exemplo, a segunda camada, isto é a camada tratada não é necessariamente a ca mada exterior da membrana. Podem existir uma ou mais camadas de material, i.e. três, quatro, ou mais camadas, entre a segunda ca mada, ou seja a camada tratada, e o espécime. No entanto, a segunda camada será frequentemente a camada exterior e a sua face exterior estarã em contacto com o espécime.

Geralmente, o material poroso da cama da tratada será um material polimérico, mas podem-se utilizar ou tros materiais adequados. Assim, a camada tratada pode ser feita de vidro poroso, de um metal, por exemplo um metal sinterizado possuindo poros cortados por laser, ou de cerâmicas causticadas porosas e sinterizadas tais como aluminas.

Convenientemente, a camada de material tratada ê feita de um material com uma porosidade entre 0,05 e 20%.

A dimensão dos poros é escolhida de forma que o líquido de volatibilidade limitada encha total ou parcialmente os poros para formar uma membrana liquida suportada. Os diâmetros médios dos poros podem ser inferiores a 5 pm e são preferivelmente iguais ou inferiores a 3 pm. Por exemplo, os diâ metros médios dos poros podem situar-se entre 3 pm e 0,05 jum, par ticularmente para o caso em que o líquido compreende miristato de isopropilo e a camada é feita de um policarbonato.

O sensor da invenção pode ter uma mem brana separável ou pode ser um sensor descartável com uma membra na aderente. Os materiais utilizados na formação de elêctrodos adequados para os sensores podem ser metais inertes e/ou carbono.

Quando o sensor compreende uma membra na laminada do tipo da divulgada na Patente Norte Americana

39Ί92Ί4, a primeira camada que deve ficar entre a camada de enzi mas e o eléctrodo ê convenientemente feita de polimetil-metacrilato, poliuretano, acetato de celulose ou de um outro material poroso que restringe ou evita a passagem dos compostos interferentes electroactivos tais como o ãcido ascõrbico e a tirosina. Convenientemente, a primeira camada tem uma espessura que varia entre 0,1 microns e 1,0 microns. Preferivelmente, a membrana con tém uma camada feita de uma poliarilsulfona ou uma poliarilcetona, conforme estã descrito no nosso Pedido de Patente Europeia jã publicada N9. 225094.

Materiais porosos adequados para a se gunda camada podem ser policarbonatos, poliuretanos, e celulose modificada, particularmente nitrato de celulose, acetato de celu lose e celulose regenerada.

O enzima presente no sensor da invenção pode estar localizado na membrana de qualquer maneira adequa da. Preferivelmente, numa membrana laminada, estã presente entre a primeira e a segunda camada de material e constitui a ligação entre elas. Nesta situação, e também geralmente, o enzima é preferivelmente imobilizado num gel. Um material muito adequado para este fim é o glutaraldeldo; as proteínas tais como albumina e outros materiais podem também estar incluídos. A fim de facilitar a obtenção de leituras estãveis rãpidas do sensor, prefere-se que a camada que contém o enzima seja de espessura reduzida, i.e. que não seja superior a 5 microns de espessura.

O enzima a utilizar no sensor da invenção dependerã da substância a analisar cuja concentração se pretende determinar. Se a substância a analisar for a glucose, o enzima deve ser por exemplo oxidase de glucose. Outros enzimas que pode estar presentes incluem a uricase e a oxidase de lactato para determinação do ãcido urico e do ãcido lãctico, respecti vamente. Sistemas de enzimas compreendendo dois ou mais enzimas podem estar também presentes.

Uma membrana laminada para utilização no sensor da invenção para determinação da glucose pode ser preparada por um método que compreende as seguintes etapas:

1. Uma película de policarbonato poroso com uma porosidade infe7

rior a 20% e com poros de diâmetro inferior a 10 pm e preferi^ velmente inferior a 5 pm ê mergulhada em miristato de isopropilo em n-butanol durante 3 minutos para tratar o mesmo. Quan do removido da solução, o excesso de líquido ê removido das películas utilizando-se um tecido;

2. 1 mg de oxidase de glucose é dissolvido em 50 )il de (100 mg/ /ml) de albumina;

3. 3 pl de uma solução de glutaraldeido a 12,5% são misturados com 3 pi de uma mistura de enzima/albumina sobre uma lâmina de vidro de microscópio;

4. 1 jul da mistura produzida na etapa anterior ê aplicado a uma face do policarbonato de 1 cm produzido na etapa 1;

5. A outra superfície da camada de enzima ê coberta imediatamente com uma película de acetato de celulose fina e a membrana laminada resultante é fixada durante 3 minutos entre lâminas de vidro;

6. A membrana é aplicada a um eléctrodo de platina para constituir o sensor da invenção, em que a película de acetato de ce lulose está próximo do eléctrodo e forma a primeira camada.

A utilização do processo da invenção proporciona a vantagem de um aumento da gama de concentração relativamente à qual um gráfico de concentração vèrsus resposta do sensor apresenta uma curva linear. Com os processos convencionais, a linearidade estendeu-se genericamente apenas até aproximadamente uma concentração de 3 mmoles por litro de glucose. Uti lizando-se o processo da invenção, a linearidade é aumentada e o gama estende-se a concentrações de glucose de 50 mmoles por litro e superiores. Isto ê alcançado através da restrição da entra da de substracto para dentro da camada do enzima e portanto com alguma perda de sensibilidade. Deste modo, a gama cobre as concentrações de glucose que podem ser antecipadas em amostras sanguíneas, permitindo deste modo determinar-se mais rapidamente os níveis de glucose do sangue. Isto é uma vantagem considerável em situações em que se devem fazer regularmente grandes numeros de determinações com uma preparação da amostra mínima. A linearidade é também aumentada por aplicação à segunda camada da membrana de um meio compreendendo um organo-silano possuindo grupos reac8 tivos, conforme descrito no nosso Pedido de Patente Europeia N<?. 204468 já publicada. Este tratamento pode ser aplicado ã segunda camada da membrana no sensor da presente invenção para produzir um efeito combinado e uma linearidade ainda maior.

A invenção ê ilustrada pela Figura 1 dos desenhos anexos.

Na Fig. 1, o número de referência (1) corresponde à segunda camada da membrana formada a partir de uma película de policarbonato tratada com uma solução a 30% de mirijs tato de isopropilo (MIP), o (2) é a camada de enzima de oxidase de glucose dissolvido em albumina e misturado com glutaraldeido o (3) ê a primeira camada formada a partir de acetato de celulose., o (4) é o eléctrodo de platina de trabalho e o (5) ê o eléc trodo de referência de prata (1), (2) e (3) em conjunto formam uma membrana laminada. 0 eléctrodo de platina (4) de trabalho funciona como ânodo, enquanto que o eléctrodo de referência de prata (5) funciona como cátodo. A membrana ê fixada ao eléctrodo por meio de um anel de perspex que faz pressão para baixo sobre a camada exterior (1) em direcção aos seus bordos exteriores em (6).

A utilização do sensor mostrado na F_i gura 1 ê ilustrada no seguinte exemplo:

EXEMPLO

Efectuaram-se experiências utilizando -se sensores com membranas preparadas conforme descrito atrãs. A segunda camada ou a camada exterior das membranas utilizadas foram formadas a partir de uma película de policarbonato tratada por imersão em soluções de lípidos em n-butanol, n-decano e misturas destes solventes. Os lípidos utilizados foram a lecitina e miristato de isopropilo. Estas membranas tratadas mostraram ser rapidamente permeáveis ao catecol, mas apenas permeáveis com dif culdade às espécies tais como peróxido de hidrogénio, ãcido ascõrbico, paracetamol e piroglucinol (as concentrações das espécies utilizadas foram de 0,5 mM). Isto é ilustrado no seguinte quadro que mostra a redução da intensidade do sinal observado pa ra cada um dos espécimes interferentes, quando membranas de poli carbonato com dimensões de poros de 0,8 pm e 0,2 pm são tratadas com MIP.

ESPÉCIES	Redução da intensidade de Sinal(%)
Dimensão de poros de 0,8 pm	Dimensão de poros de 0,2 pm
Peróxido de Hidrogénio	86,3	98,5
Ãcido Ascórbico	94,65	100
Ãcido Orico	91,31
Paracetamol	56	82
Piroglucinol	66,6	95

As membranas tratadas mostraram-se permeáveis à glucose, embora a magnitude da resposta registada pelo sensor tenha sido reduzida. Descobriu-se que a gama de linearidade das respostas obtidas numa série de experiências com diferentes concentrações de glucose aumentou nas membranas trata das.

Isto é ilustrado pelos gráficos das Figuras 2 a 10 dos desenhos, nos quais a intensidade da resposta estã expressa em função da concentração de glucose (mM). As membranas tratadas referidas são membranas de policarbonato tratadas com MIP.

Conforme mostrado na Figura 2, a resposta (em unidades arbitrárias) obtida com membranas tratadas com MIP (curva A) é linear até pelo menos 50 mM, em contraste com a resposta (curva B) obtida com a membrana não tratada.

As Figuras 3 a 10 ilustram ainda o re sultado mostrado na Figura 2 e também o efeito da dimensão dos poros sobre a linearidade da resposta. Na Figura 3, a curva B é a resposta obtida com uma membrana não tratada possuindo uma dimensão de poros de 2 pm, e a curva A é a resposta obtida com uma membrana tratada com MIP. A linearidade é assim aumentada com as membranas tratadas.

A Figura 4 mostra a resposta obtida com membranas com uma dimensão de poros de 0,2 pm. A membrana

não tratada proporciona uma resposta linear apenas até uma concentração exactamente acima de mM de glucose (ver curva B), enquanto que a membrana tratada (curva A) proporciona uma resposta linear até pelo menos uma concentração de 10 mM.

'Ctonforme ê mostrado nas Figuras 5 e 6 a resposta obtida com uma membrana não tratada possuindo uma dimensão de poros de 0,05 pm é linear até aproximadamente uma concentração de 4 mM de glucose (Figura 5), enquanto que a membrana tratada proporciona uma resposta linear até pelo menos 60 mM de glucose (Figura 6).

A resposta observada com membranas tendo uma dimensão de poros de 0,8 pm é mostrada nas Fig. 7 e 8. Conforme é mostrada na Fig. 7, a membrana não tratada proporciona uma resposta linear apenas até uma concentração de 2 mM de glucose (curva B). Contudo, uma membrana tratada com MIP proporciona uma resposta linear até uma concentração de cerca de 20 mM de glucose (ver curva A nas Figuras 7 e 8).

Igualmente, observou-se um aumento da linearidade da resposta com uma dimensão de poros de 0,015 pm, quando tratados com MIP - ver a Figura 9 (membrana não tratada) e Figura 10 (membrana tratada).

As experiências referidas anteriormen te ilustram que a gama de linearidade é aumentada com membranas tratadas. Também se observou que o limite superior de concentração da gama pode variar com a concentração do liquido. Por exemplo, uma membrana de policarbonato não tratada (dimensão de poros de 0,2 pm) proporciona uma resposta linear até exactamente acima de 2 mM de glucose, enquanto que a membrana tratada com 100% de MIP foi linear até 30 mM de glucose e uma membrana trata da com 90% de MIP/10% de n-decanol foi linear até pelo menos 60 mM de glucose.

As experiências também mostraram que as membranas tratadas com oleato de metilo e linoleato de metilo de ésteres de ácidos gordos aumentaram a linearidade da resposta de uma maneira semelhante à das membranas tratadas com MIP. As membranas tratadas com lecitina também se comportaram de uma maneira similar às tratadas com MIP.

Claims

R Ε IVINDICAgÕES

- lâ Sensor do tipo eléctrodo de enzima para a determinação de uma substância a analisar, a qual é convertivel na presença de um enzima numa espécie que pode ser detectada pelo sensor que compreende um eléctrodo e uma membrana permeável aos líquidos e aos solutos posicionada entre o eléctrodo e um espécime contendo a substância a analisar, em que a membrana compreende uma camada que contém um ou mais enzi_ mas e uma camada de material posicionada entre a camada que con tém os enzimas e o espécime, caracterizado por a camada de mate rial conter uma área através da qual a substância a analisar po de passar, sob a forma de uma membrana líquida formada por um material poroso que foi tratado de maneira a que os seus poros fiquem total ou parcialmente cheios com um líquido que possui a capacidade de deixar a substância a analisar e de rejeitar as outras espécies na substância a analisar.

- 2â SEnsor de acordo com a reivindica ção 1, caracterizado por incorporar uma membrana laminada que compreende uma camada que contém um enzima, posicionada entre uma primeira camada de material e uma segunda camada de material, em que a primeira camada de material está entre a camada que contém os enzimas e um eléctrodo no sensor, e em que a segunda camada é a camada tratada.

- 3â Sensor de acordo com a reivindicaçãc

- 12 2, caracterizado por a primeira camada de material ser constituí, da por polimetilmetacrilato, poliuretano ou acetato de celulose.

Sensor de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado por a camada tratada ser constituí, da por um policarbonato, por um poliuretano ou por uma celulose modificada.

- 5- Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a camada tratada ser fei. ta de um material com uma porosidade que varia entre 0,05 e 20%.

Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o diâmetro médio dos poros ser inferior a 5 pm.

Sensor de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o diâmetro médio dos poros variar entre 3 pm e 0,05 jjm.

Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o líquido compreender um lípido.

- 9- Sensor de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o líquido compreender miristato de isopropi. lo.

Sensor de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o líquido compreender lecitina.

- 11- Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o líquido compreender um éster de um ácido gordo.

- 12- Sensor de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o líquido compreender oleato de metilo ou linoleato de metilo.

13S

Sensor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a membrana conter uma camada constituída a partir de uma poliarilsulfona ou uma poliacrilcetona.

14â

Processo para a determinação de uma substância a analisar que esteja contida dentro dum espécime, compreendendo o contacto do espécime com a camada exterior de uma membrana, permeável nos líquidos e solutos e contendo um ou mais enzimas, na presença dos quais a substância a analisar é convertivel numa espécie detectável por um sensor que incorpora a membrana, e uma ou mais camadas de material, e a medição da resposta do sensor à espécie, caracterizado por a camada na mem brana entre o enzima e o espécime conter uma área, através da qual a substância a analisar pode passar, sob a forma de uma membrana líquida constituída por um material poroso que foi tra tado de maneira a que os seus poros fiquem total ou parcialmente cheios com um líquido que possui a capacidade de deixar passar a substância a analisar e de rejeitar as outras espécies na substância a analisar.

Os requerentes declaram que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na Grã-Bretanha em 4 de Agosto de 1987, sob o NQ. 8718430.