PT83378B

PT83378B - Sensor do tipo electrodo de enzima

Info

Publication number: PT83378B
Application number: PT83378A
Authority: PT
Original assignee: Ici Plc
Priority date: 1985-09-16
Filing date: 1986-09-16
Publication date: 1993-05-31
Also published as: DK169882B1; DE3684394D1; FI91023B; AU605111B2; ZA867038B; GR862368B; EP0216577A3; ES2002348A6; IE71918B1; EP0216577B1; PT83378A; FI863738A0; NZ217598A; ATE73842T1; DK444086A; CA1244085A; US5437973A; IE862471L; JPS6267442A; DK444086D0

Description

A presente invenção refere-se a um sensor do tipo e lectrodo de enzima compreendendo uma membrana melhorada e a um processo analítico utilizando o sensor.

Os eléctrodos de enzima sao cada vez mais utilizados em laboratórios médicos e outros particularmente para a determinação de produtos tais como glucose e ureia em espécimes de sangue e outros fluidos fisiológicos. Descrevem-se tais eléctrodos em muitas publicações nomeadamente num artigo por Clark e Lyons (Armais of the New York Academy of Science, 102, 29-45, 1962) e Patentes US 3539455 e 397274 de Clark e Newman respectivamente.

Utilizam-se geralmente eléctrodos de enzima para determinar produtos que não são em si próprios electroquimicamente activos mas que na presença de enzimas adequadas tomam parte em reacções que produzem espécies que podem ser facilmente detecta das pelos eléctrodos.

D.

Nos eléctrodos de temente localizadas dentro de ι mo do electrodo subjacente.

enzimas, as enzimas estão frequen materiais poliméricos muito próxi

Tem-se desenvolvido uma investigação considerável para melhorar as propriedades de membranas para utilização nos eléctrodos de enzima e têm sido descritas muitas membranas para este fim. Um exemplo de um tipo de membrana que se utiliza muitas vezes é a membrana laminada descrita por Newman na Patente US 3979274. Esta membrana compreende uma primeira camada interio:? de um material essencialmente homogéneo, por exemplo acetato de celulose, que pode evitar a passagem de materiais de baixo peso molecular que provavelmente interfiriam com o sinal da enzima, uma camada aderente préxima da própria enzima (com ou sem tais outros materiais que podem ser misturados com ela), e uma segun da camada (neste caso uma camada exterior) de uma película suporte porosa que pode evitar a passagem de elementos celulares e coloidais.

A determinação da glucose pode ser tomada como um £ xemplo da determinação de um material por um electrodo de enzima. Na presença do enzima glucose oxidase ocorre a reacção seguinte:

glucose

Glucose + 0_? ------- ácido glucónico + EL 0_? oxidase ^{ά ά} peróxido de hidrogénio produzido nesta reacção passa através da primeira camada de uma membrana tal como a da patente US 3979274 e pode determinar-se usando o electrodo. De,s de que o peróxido de hidrogénio produzido seja dependente da glucose presente num espécime, pode determinar-se a concentração da glucose usando um sensor adequadamente calibrado.

Até agora uma serie de dificuldades limitaram a uti lidade dos eléctrodos de enzima e restringiram a escala da sua utilização nas análises de rotina de, por exemplo amostras de sangue. Entre estas dificuldades é significativa a linearidade limitada da resposta dos eléctrodos a compostos para análise tais como glucose ou lactato que sao substratos para as reacções catalizadas por enzima. A resposta só é linear para uma gama limitada de baixas concentrações dos compostos para análise e por •i consequência as concentrações dos materiais a determinar devem

ser baixas e em geral devem usar-se amostras diluídas nas espéci mes para análises que utilizam eléctrodos de enzima. Nem sempre é praticável fazer amostras diluídas para análises de rotina fo ra do laboratório e será impossível para controles invasivos.

De acordo com a presente invenção proporciona-se um sensor do tipo eléctrodo de enzima para a determinação de um com posto para análise, sendo o composto referido convertível na pre sença de um enzima numa espécie que se pode detectar por um sensor, que é constituído por um electrodo e uma membrana permeável a líquidos e solutos colocados entre o electrodo e um espécime contendo o composto para análise, sendo a referida membrana cons tituída por uma camada contendo um ou mais enzimas e uma camada de material colocada entre a camada contendo a enzima e o espécime, caracterizado por a referida camada de material conter uma á rea através da qual o composto para análise pode passar, formada por um material poroso de permeabilidade restrita tendo uma poro sidade não superior a 5%

Além disso de acordo com a invenção proporciona-se um processo para determinar um composto para análise numa espécime quando o espécime contacta com a camada exterior de uma membrana, permeável a líquidos e solutos e compreendendo uma ou mais enzimas, na presença dos quais o composto para análise é convertível em espécies detectáveis por um sensor que incorpora a membrana, e uma ou mais camadas de material, e medindo a resposta do sensor às espécies, caracterizado por a camada na membrana en tre a enzima e o espécime conter uma área, através da qual o com posto para análise pode passar, formada por um material poroso de permeabilidade restrita tendo uma porosidade não superior a 5%.

A área formada de um material poroso tendo uma porosi dade que não é superior a 5$ permite que a camada que a contem não tenha uma permeabilidade restrita. De preferência toda ou a maior porção da área eficaz desta camada é formada de material com uma porosidade que não é maior que 5%.

Na sua forma mais simples a membrana no sensor da invenção consiste na camada contendo enzima e na camada de permea- 3 -

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bilidade restrita. A camada de permeabilidade restrita é a camada exterior nesta forma simples da membrana e é contactada direc tamente pelo espécime no processo da invenção para determinar um composto para análise.

Contudo prefere-se que a membrana seja uma membrana laminada do tipo descrito na Patente US 3979274. Tal membrana con. preende uma primeira camada interior de material colocado entre a camada contendo enzima e o electrodo, a camada contendo enzima e uma segunda camada de material do outro lado da camada contendo enzima cuja segunda camada é a camada que possui permeabilida de restrita.

Daqui em diante na presente memória o sensor da inven ção que e descrito conterá uma membrana laminada do tipo de membrana descrita na Patente US 3979274 tendo uma primeira e uma se gunda camadas, sendo a segunda camada, a camada que contem material de permeabilidade restrita.

Deverá entender-se que as membranas no sensor da invenção podem conter mais do que duas camadas de material em adição à camada contendo enzima. Por exemplo a segunda camada, i.é a de permeabilidade restrita, não e necessariamente a camada mais exterior da membrana, dicionais de material, i.é a segunda camada ou camada me. Contudo muitas vezes a e a sua face exterior será contactada pelo espécime.

Poderá haver uma camada ou camadas a terceira, quarta etc. camada, entre de permeabilidade restrita e segunda camada será a camada ο espéci exterior

Em geral o material poroso de permeabilidade utilizado na segunda camada será um material polimérico dem usar-se outros materiais adequados. Assim a segunda pode ser formada por vidro ou um metal com os poros abertos por laser.

restrita mas pocamada

De preferência a segunda camada de material é formada de material que possui uma porosidade não superior a 2%, Pre ferem-se porosidades muito baixas, por exemplo compreendidas en tre 0,005$ e 0,5$ ou 0,001$.

A percentagem de porosidade é o produto da área do p£

ro X a densidade do poro Σ 100. Materiais porosos mais auequados de percentagem de porosidade baixa terão poros de diâmetro médio inferior a 0,03 microns, de preferência entre 0,01 e 0,03 microns. Contudo materiais com poros de diâmetro médio superior a 0,03 microns podem usar-se com sucesso se a densidade do poro fôr reduzida. Assim podem utilizar-se materiais com diâmetros de poro médios até 0,2 microns. Exemplos de tamanhos de po o e de densidades de poro classificadas para materiais de baixas porosi dades adequadas são os seguintes:

------------------------------------------------------. Tamanho de poro i	--- ——----Γ Densidade de poro ,	Porosidade
classificado i	classificada 1	calculada $
0.1 :	3 x 10⁸ ;	2.3
0.05 !	6 x 10° ;	1.1
0.03 ;	β x 10⁸ ;	0.42
0.01 ;	6 x 10 i	0.047
0.01 ; 1 1 1	1 X 10° \| s i 1	0.008

Outros parâmetros de material que podem ser manipula dos para produzir material de permeabilidade restrita adequadamente para a segunda camada de material poroso incluem tortuosi, dade do poro. A espessura da segunda camada também influencia a permeabilidade.

No sensor de acordo com a invenção a segunda camada da membrana actua como uma barreira ã difusão e evita ou restringe a passagem de compostos de alto peso molecular e proporciona for ça à membrana suficiente para a tomar susceptível de conservar a sua forma e de manter contacto adequado com o electrodo.

Materiais porosos adequados para a segunda camada incluem policarbonatos porosos, poliuretanos e celulose modificada particularmente nitrato de celulose, acetato de celulose e celulose regenerada·

Materiais adequados também incluem materiais com por- 5 çães de peso molecular de 20.000 ou menos.

Para assegurar respostas rápidas do electrodo a espessura da segunda camada é de preferência inferior a 20 microns, especialmente compreendida entre 1 e 10 microns. Materiais especialmente adequados à segunda camada têm poros do diâme tro médio compreendidos entre 0,015 e 0,025 microns.

sensor da invenção pode ter uma membrana destacável ou pode ser um sensor disponível com uma membrana aderente. Materiais utilizados na formação de eléctrodos adequados para os sensores incluem metais inertes e/ou carbono.

Quando o sensor incorpora uma membrana laminada do tipo descrito na Patente US 3979274, a primeira camada que está colocada entre a camada de enzima e o electrodo, é desejavelmen te formada de metacrilato de polimetilo, poliuretano, acetato de celulose ou outro material poroso que restringirá ou evitará a passagem de compostos de interferência electroactivos tais como ácido ascérbico e tirosina.

De preferência a primeira camada tem uma espessura compreendida entre 0,2 microns e 1,0 microns.

enzima presente no sensor da invenção pode estar localizado na membrana de qualquer modo adequado.

De preferência numa membrana laminada está presente entre a primeira e a segunda camadas de material poroso e forma a ligação entre elas. Nesta situação, e também geralmente, o en zima é de preferência imobilizado misturando com um material que proporciona a ocorrência de rectoculaçao, Um material muito ade, quado para este fim έ o glutaraldeído; poteínas tais como albumina e outros materiais podem também estar incluídos. Para faci litar a obtenção de leituras rápidas estáveis do sensor e prefe rível que a camada contendo enzima seja delgada, i.é não superi or a 5 microns de espessura.

enzima a ser usado no sensor da invenção dependerá do composto para análise cuja concentração é a determinar.Se

o composto a analisar é glucose então o enzima será por exe&plo glucose oxidase. Outros enzimas que podem estar presentes incluem uricase e lactato oxidase para determinação de ácido úrico e ácido láctico respectivamente. Sistemas de enzimas compreendendo dois ou mais enzimas também podem estar presentes.

Uma membrana laminada para uso no sensor da invenção para a determinação de glucose pode ser preparada por um método incluindo os passos seguintesí

1. Dissolve-se 1 mg de glucose oxidase em 50 pl de albumina (100 mg/ml):

2. Mistura-se 3 /il de uma solução de glutaraldeído 12,5$ com ju.1 da mistura enzima/albumina numa lâmina de vidro para microscópio,

3. Aplica-se l/il da mistura produzida no passo anterior a uma

O face de uma película de policarbonato de 1 cm tendo uma poro sidade não superior a 5$ e poros com um diâmetro médio inferior a 0,03 microns.

4. A outra face da camada de enzima é coberta imediatamente com uma película de acetato de celulose delgada e a membrana lami nada resultante é segura durante 3 minutos entre 2 lâminas de vidro. Após remoção das lâminas de vidro, a membrana laminada produzida pela sequência de passos referida pode ser aplicada a um electrodo de platina para formar o sensor da invenção, es tando a película de acetato de celulose muito próximo do ele£ trodo e formando a primeira camada.

A utilização do processo da invenção proporciona a vantagem de um acréscimo na gama de concentrações sobre a qual um gráfico de concentração em função da resposta do sensor é li near.

Com processos convencionais extende-se somente a linearidade até aproximadamente uma concentração de 3 m mol por li tro de glucose.

Usando o processo da invenção aumenta-se a linearida de e a gama extende-se para concentrações de glucose de 50 m mol por litro e mesmo mais elevadas. Para concentrações mais eleva- 7 L*wⁱ_'iáS?:'3£a5._1GF ·νI

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Iwèj das consegue-se isto através de restrição de substrato da camada de enzima e por conseguinte com alguma perda de sensibilidade. Assim a gama cobre as concentrações de glucose previstas em amostras de sangue por meio das quais os níveis de glucose do san gue podem ser determinados mais facilmente.

Esta e uma vantagem considerável em situações em que grande número de determinações deve ser feito regularmente e com uma preparação mínima de amostras. A linearidade também se exten de aplicando à segunda camada da membrana um meio compreendendo um organo-silano com grupos reactivos como descrito no nosso Pedido de Patente Europeia N.fi 86303907.9. Pode aplicar-se este tratamento à segunda camada da membrana no sensor da presente in vençao para produzir um efeito combinado e linearidade melhorada adicional.

Ilustra-se a presente invenção pela Figura 1 dos desenhos anexos.

Na figura 1, a referência numérica 1 é a segunda cama da da membrana formada por uma película de policarbonato com uma porosidade de 0,42$, 2 é uma camada de enzima de glucose oxidase dissolvida em albumina e misturada com glutaraldeído, 3 é a primeira camada formada por acetato de celulose, 4 é o electrodo de trabalho de platina e 5 e o electrodo de referência de prata. 1, 2 e 3 juntos formam uma membrana laminada. 0 electrodo de trabalho de platina 4 aotua como um ânodo enquanto o electrodo de referência de prata actua como cátodo. Coloca-se a membrana sobre o electrodo pressionando para baixo com um anel de perspex sobre a camada exterior 1 em direcção às bordas exteriores em 6.

Ilustra-se a utilização do sensor, indicada na Figura

1, nos exemplos:

Exemplo 1

Misturou-se uma solução aquosa contendo 30 mg/ml de enzima glucose oxidase (E.C.U.3.4) e 200 mg/ml de albumina com um volume de uma solução contendo 50 ug/ml de glutaraldeído. Expôs-se 1 cm de uma película de policarbonato Nuclepore (diâme tro médio de poro =0,05 microns) a 5 /NL de soluções misturadas — 8 —

para impregnar a película com o enzima. Neste exemplo a película actua como um suporte para o enzima e não tem efeito na linearidade da resposta do sensor.

Oolocou-se a película impregnada de enzima sobre os eléctrodos de trabalho e de referência do sensor (a qual tinha sido previamente misturada com o tambão fosfato 0,067 M contendo cloreto de sódio 50 m mol por litro a pH 7,4 para assegurar o contacto electrolítico entre os eléctrodos de trabalho e de re ferência). Colocou-se a película a ser estudada como segunda cama da sobre a película impregnada de enzima. 0 topo do parafuso de ajuste do corpo do electrodo foi então posicionado e esticado exercendo uma tensão desprezável na membrana laminada resultante. Desde que a película superior (a película a ser testada como a segunda camada) possa ser substituída por outras películas, era possível utilizar a mesma camada de enzima para diferentes segun das camadas.

Neste exemplo as películas testadas como segunda camada foram os seguintes:

1) Uma película de policarbonato Nuclepore, de diâmetro de po ro médio de 0,05 microns, adicional:

2) Uma membrana de policarbonato Nuclepore, de diâmetro de poro médio de 0,015 micron; e

3) Uma película de celulose regenerada feita por Schleicher e Schull (RC52) tendo um diâmetro de poro medio de 0,01 microns.

Com a película 1) a linearidade do sensor foi 7 m mol por litro. Apresentam-se os resultados com as películas 2) e 3) nas Figuras 2 e 3 respectivamente dos desenhos em anexo que são gráficos de densidade de corrente em (ordenadas) em função da concentração da glucose em m mol por litro (abcissas). Estes indicam que, utilizando películas 2) e 3) como segunda camada, o sensor apresenta muito maior linearidade - maior do que 20 m mol por litro para 2) e pelo menos 50 m mol por litro para 3).

. 0 tempo de resposta (90$) para 3) foi de 7 minutos.

* Exemplo 2 «ιιιιιμιμιμνμιΜμηνμμ·····

Repetiu-se o Exemplo 1 com o enzima lactato oxidase (E.C.1.1.3.2.). As películas testadas com as segundas camadas foram descritas como 1) e 2) no Exemplo 1, tendo diâmetros de poro médios de 0,05 microns e 0,015 microns respectivamente.

Com a película 1) a linearidade do sensor foi de

0,2 m mol por litro. 0 resultado com a película 2) está apresen tado na Figura 4 dos desenhos em anexo que é um gráfico de densidade de corrente em^iA (ordenada) em função da concentração de glucose em m mol por litro (abcissa). Mais uma vez a linearidade utilizando a película de poros menores como segunda camada é mui to maior do que quando se utiliza a película de poros maiores. Neste exemplo consegue-se uma linearidade de pelo menos 4 m mol por litro com a película 2), sendo o tempo de resposta de 1-2 minutos.

Exemplo 3

Utilizou-se o método do Exemplo 1 para testar como segunda camada uma película de celulose regenerada feita por Schleicher e Schull (RC52) tendo um tamanho de poro designado compreendido entre 0,005 e 0,010yam. Indica-se o resultado na Figura 5 que é um gráfico de densidade de corrente ja. A (ordenada) em função da concentração da glucose em m mole por litro (abcissa). Este indica que a resposta do sensor é linear sobre uma gama substancial de concentrações.

Exemplo 4

Utilizou-se o método do Exemplo 1 para testar como segunda camada uma película de acetato de celulose feita por Schleicher e Schull (AC 62) tendo um tamanho de poro designado compreendido entre 0,005 e 0,01 ^im. Indioa-se o resultado na Fi gura 6 que é um gráfico de densidade de corrente em ρ A (ordena da) em função da concentração de glucose em m mol por litro (ab cissa). Isto indica que a resposta é linear sobre uma gama subs tancial de concentrações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lâ -

Sensor do tipo electrodo-enzima para a determinação de um composto para analise, sendo o referido composto para anã lise convertível na presença de um enzima em espécies que podem ser detectadas pelo sensor, o qual compreende um electrodo e uma membrana permeável a líquidos e solutos colocados entre o electrodo e um espécime contendo o composto para análise, compre endendo a referida membrana uma camada contendo um ou mais enzi mas e uma camada de material colocada entre a camada enzima e o espécime, caracterizado por a camada de material conter uma área através da qual o composto para análise pode passar, formada de um material poroso de permeabilidade restrita tendo uma porosidade que não é superior a 5$.

- 2& -

Sensor de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender uma membrana laminada possuindo uma camada contendo enzima situada entre uma primeira camada de material e uma segunda camada de material, estando a primeira camada entre a camada contendo enzima e um electrodo no sensor.

-3^ -

Sensor de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por a primeira camada da membrana ser formada por metaerilato de polimetilo, acetato de celulose ou poliuretano.

-4â -

Sensor de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 3 caracterizado por o material poroso de permeabilidade res trita ser formado por policarbonato ou celulose modificada.

-5ã -

Sensor de acordo com qualquer das reivindicações de * 1 a 4 caracterizado por o material poroso de permeabilidade res • trita formar a área total eficaz da camada que o contem.

11 — 6â

Sensor de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 5 caracterizado por o material poroso de permeabilidade res trita possuir poros de diâmetro médio inferior a 0,03 microns.

- 7^â -

Sensor de acordo com a reivindicação 6 caracteriza do por os poros terem um diâmetro médio compreendido entre 0,01 e 0,03 microns.

- 8ê -

Sensor de acordo com qualquer das reivindicações de 1 a 7 caracterizado por o material poroso de permeabilidade rej3 trita ter uma porosidade não superior a 2$.

- 9a .

Sensor de acordo com a reivindicação 8 caracterizado por a porosidade estar compreendida entre 0,005$ e 0,5$.

A requerente declara que o primeiro pedido desta pa tente foi depositado no Reino Unido em 16 de Setembro de 1985, sob o N.s 8522834.