FI91023B - Sensori - Google Patents

Description

91023

Sensori Tämä keksintö koskee entsyymielektrodityyppistä sensoria (anturia), joka käsittää parannetun kalvon, sekä 5 analyyttistä menetelmää sensorin käyttämiseksi.

Entsyymielektrodeja käytetään kasvavassa määrässä lääketieteellisissä ja muissa laboratorioissa erityisesti sellaisten materiaalien, kuten glukoosin ja urean määrittämiseen verinäytteissä ja muissa fysiologisissa nesteis-10 sä. Tällaisia elektrodeja selostetaan monissa julkaisuissa, varsinkin Clark'in ja Lyons'in artikkelissa (Annals of the New York Academy of Science, 102, 29 - 45, 1962) sekä vastaavasti Clark'in ja Newman'in nimiin myönnetyissä US-patenteissa nro 3 539 455 ja 3 979 274. Entsyymielektrode-15 ja käytetään yleensä materiaalien määritykseen, jotka itse eivät ole sähkökemiallisesti aktiivisia, mutta jotka sopivien entsyymien läsnäollessa osallistuvat reaktioihin, jotka tuottavat lajeja, jotka voidaan helposti todeta elektrodien avulla. Entsyymielektrode!ssa entsyymit si-20 jaitsevat usein polymeerisen materiaalin sisässä hyvin lähellä alla olevaa elektrodia.

Huomattava määrä tutkimuksia on suoritettu tarkoituksella parantaa entsyymielektrodeissa käytettäväksi tarkoitettujen kalvojen ominaisuuksia ja monia kalvoja on 25 esitetty tähän tarkoitukseen. Eräs esimerkki kalvotyypis-tä, jota usein käytetään, on Newman'in US-patentissa 3 979 274 esittämä laminoitu kalvo. Tämä kalvo käsittää ensimmäisen eli sisemmän kerroksen oleellisesti homogeenista ainetta, esimerkiksi selluloosa-asetaattia, joka 30 kykenee estämään pienimolekyylipainoisten materiaalien läpikulun, jotka todennäköisesti häiritsevät entsyymisig-naalia, aivan vieressä olevan kerroksen itse entsyymiä (joko yhdessä muiden sellaisten aineiden kanssa, joita voidaan sekoittaa sen kanssa, tai ilman näitä), sekä toi-35 sen kerroksen (tässä tapauksessa ulomman kerroksen) huo- 2 koista kantajakalvoa, joka kykenee estämään solumaisten ja kolloidisten osasten läpikulun.

Glukoosin määritys voidaan ottaa esimerkiksi ent-syymielektrodin avulla suoritetusta materiaalin määrityk-5 sestä. Glukoosioksidaasientsyymin läsnäollessa tapahtuu seuraava reaktio: glukoosi- glukoosi +09 -—-> glukonihappo +H909.

10 oksidaasi z * Tässä reaktiossa syntynyt vetyperoksidi kulkee sellaisen kalvon, kuten esim. US-patentissa 3 979 274 esitetyn kalvon, ensimmäisen kerroksen läpi ja voidaan määrittää elek-15 trodia käyttämällä. Koska syntynyt vetyperoksidi on riippuvainen näytteessä läsnä olevasta glukoosista, voidaan glukoosin konsentraatio määrittää käyttämällä sopivasti kalibroitua sensoria.

Tähän päivään mennessä ovat monet vaikeudet rajoit-20 taneet entsyymielektrodien hyväksikäyttöä ja supistaneet niiden käyttöasteikkoa, esim. värinäytteiden rutiiniana-lyyseissä. Merkittävää näiden vaikeuksien joukossa on elektrodien vasteen rajoitettu lineaarisuus analysoitavien aineiden, kuten glukoosin tai laktaatin osalta, jotka ovat 25 substraatteja entsyymin katalysoimille reaktioille. Vaste on lineaarinen vain analysoitavien aineiden alhaisten kon-sentraatioiden rajoitetulla alueella ja sen vuoksi määritettävien materiaalien konsentraatioiden tulee olla alhaiset ja yleensä täytyy käyttää laimennettuja näytteitä näy-30 te-erissä, jotka on tarkoitettu analysoitaviksi käyttämällä entsyymielektrodeja. Aina ei ole mahdollista valmistaa laimeita näytteitä rutiinianalyysejä varten laboratorion ulkopuolella ja se saattaisi olla mahdotonta tehokkaan tarkkailun kannalta.

35 Keksinnön kohteena on entsyymi-elektrodityyppinen sensori analysoitavan aineen määrittämiseksi, joka analy- il 3 91023 soitava aine on muutettavissa entsyymin läsnäollessa sellaiseksi lajiksi, joka voidaan todeta sensorin avulla, joka sensori käsittää elektrodin ja nesteitä ja liuenneita aineita läpäisevän kalvon sovitettuna elektrodin ja analy-5 soitavaa ainetta sisältävän näytteen väliin, mainitun kalvon käsittäessä yhtä tai useampia entsyymejä sisältävän kerroksen sekä ainekerroksen, joka on sijoitettu entsyymiä sisältävän kerroksen ja näytteen väliin. Sensoreille on tunnusomaista, että mainittu ainekerros sisältää alueen, 10 jonka läpi analysoitava aine pystyy kulkemaan ja joka on muodostettu huokoisesta materiaalista, jonka läpäisevyys on rajoitettu ja jonka huokoisuus on alueella 0,001 - 0,5 % ja jonka keskimääräinen huokoshalkaisija ei ole suurempi kuin 0,025 pm.

15 Keksinnön kohteena on lisäksi menetelmä näytteessä olevan analysoitavan aineen määrittämiseksi saattamalla näyte kosketukseen kalvon ulomman kerroksen kanssa, joka kalvo on nesteitä ja liuenneita aineita läpäisevä ja sisältää yhtä tai useampia entsyymejä, joiden läsnäollessa 20 analysoitava aine on muutettavissa sellaiseksi lajiksi, joka on kalvon sisältävän sensorin avulla todettavissa, sekä yksi tai useampia ainekerroksia, ja mittaamalla sensorin vaste kyseiseen lajiin. Menetelmälle on tunnusomaista, että kalvon entsyymin ja näytteen välissä oleva kerros 25 sisältää alueen, jonka läpi analysoitava aine pystyy kulkemaan, muodostettuna läpäisykyvyltään rajoitetusta huokoisesta aineesta, jonka huokoisuus on alueella 0,001 -0,5 % ja jonka keskimääräinen huokoshalkaisija ei ole suurempi kuin 0,025 pm.

30 Huokoisesta materiaalista muodostettu alue aikaan saa sen, että sen sisältävällä kerroksella on rajoitettu läpäisykyky. Tämän kerroksen tehokas alue on edullisesti kokonaan tai pääosaltaan muodostettu materiaalista, jonka huokoisuus on 0,001 - 0,5 %.

35 Keksinnön mukaisessa sensorissa oleva kalvo koostuu yksinkertaisimmassa muodossaan entsyymiä sisältävästä ker- 4 roksesta ja kerroksesta, jonka läpäisykyky on rajoitettu. Läpäisykyvyltään rajoitettu kerros on ulompana kerroksena tässä kalvon yksinkertaisimmassa muodossa ja se on suoraan kosketuksessa näytteen kanssa keksinnön mukaisessa mene-5 telmässä analysoitavan aineen määrittämiseksi.

On kuitenkin edullista, että kalvo on sitä laminoi-tua kalvotyyppiä, josta US-patentissa esitetty kalvo on esimerkki. Tällainen kalvo käsittää ensimmäisen eli sisemmän ainekerroksen sovitettuna entsyymiä sisältävän kerrok-10 sen ja elektrodin väliin, entsyymiä sisältävän kerroksen ja toisen ainekerroksen entsyymiä sisältävän kerroksen toisella puolella, joka toinen kerros on se kerros, jonka läpäisykyky on rajoitettu.

Jäljempänä tässä selityksessä sisältää keksinnön 15 mukainen sensori, jota selostetaan, sitä tyyppiä olevan laminoidun kalvon, josta US-patentissa 3 979 274 kuvattu kalvo on esimerkkinä, ja kalvossa on ensimmäinen ja toinen kerros, jolloin se kerros, joka sisältää huokoista materiaalia, jonka läpäisykyky on rajoitettu, on toisena ker-20 roksena.

On ymmärrettävä, että keksinnön mukaisessa sensorissa olevat kalvot voivat sisältää enemmän kuin kaksi ainekerrosta entsyymiä sisältävän kerroksen lisäksi. Esimerkiksi toinen kerros, so. läpäisykyvyltään rajoitettu 25 kerros, ei välttämättä ole kalvon uloin kerros. Siinä voi olla lisäksi ainekerros tai ainekerroksia, so. kolmas, neljäs jne, kerros toisen kerroksen eli läpäisykyvyltään rajoitetun kerroksen ja näytteen välissä. Usein kuitenkin toinen kerros on ulompi kerros ja sen ulompi pinta on kos-30 ketuksessa näytteen kanssa.

Yleensä toisessa kerroksessa käytetty, läpäisykyvyltään rajoitettu huokoinen aine on polymeeristä materiaalia, mutta muitakin sopivia aineita voidaan käyttää. Niinpä toinen kerros voidaan muodostaa lasista tai metal-35 lista, joissa on laser-säteillä leikattuja huokosia.

I! 5 91023

Prosentuaalinen huokoisuus on huokospinta-alan x ja huokostiheyden tulo kerrottuna sadalla. Esimerkkejä huokosten nimelliskoosta ja huokosten nimellistiheydestä aineille, joilla on sopivat alhaiset huokoisuudet, ovat seu-5 raavat:

Huokosen nimellis- Huokosten nimellis- Laskettu huokoi- koko (pm)_tiheys (huokosia/cm2) suus %:na_ 0,01 6 x 108 0,047 0,01 1 x 10® 0,008 10 Muita materiaalin parametrejä, joita voidaan käsitellä materiaalin saamiseksi, jolla on sopivasti rajoitettu läpäisykyky, toista, huokoista materiaalia olevaa kerrosta varten on huokosten mutkittelvuus. Toisen kerroksen paksuus vaikuttaa myös läpäisykykyyn.

15 Keksinnön mukaisessa sensorissa toimii kalvon toi nen kerros diffuusiovallina ja estää suurimolekyylipai-noisten yhdisteiden läpikulun tai estää niiden läpikulkua ja antaa kalvolle riittävästi lujuutta, niin että se kykenee säilyttämään muotonsa ja säilyttämään sopivan koske-20 tuksen elektrodin kanssa. Sopivia huokoisia materiaaleja toista kerrosta varten ovat huokoiset polykarbonaatit, polyuretaanit sekä modifioitu selluloosa, erityisesti selluloosani traatti, selluloosa-asetaatti ja regeneroitu selluloosa.

25 Sopivat materiaalit käsittävät myös materiaaleja, joiden "leikkeiden" molekyylipaino on 20 000 tai pienempi. Nopean elektrodivasteen takaamiseksi on toisen kerroksen paksuus edullisesti pienempi kuin 20 pm, erityisesti välillä 1 - 10 pm. Erityisen sopivilla materiaaleilla toista 30 kerrosta varten on keskimääräinen huokoshalkaisija välillä 0,015 pm - 0,025 pm.

Keksinnön mukaisessa sensorissa voi olla irtokalvo tai se voi olla kertakäyttösensori siihen liittyvine kal-voineen. Sensoreihin sopivien elektrodien muodostuksessa 35 käytettyjä materiaaleja ovat inertit metallit ja/tai hii li.

6

Jos anturiin sisältyy US-patentissa 3 979 274 esitettyä tyyppiä oleva laminoitu kalvo, niin ensimmäinen kerros, joka on tarkoitettu sijoitettavaksi entsyymiker-roksen ja elektrodin väliin, muodostetaan sopivasti poly-5 metyyli-metakrylaatista, polyuretaanista, selluloosa-ase-taatista tai muusta huokoisesta materiaalista, joka rajoittaa sähköisesti aktiivisten, häiritsevästi vaikuttavien yhdisteiden, kuten askorbiinihapon ja tyrosiinin läpikulkua tai estää sen. Ensimmäisen kerroksen paksuus on 10 sopivasti välillä 0,2 pm - 1,0 pm.

Keksinnön mukaisessa sensorissa oleva entsyymi voidaan sijoittaa kalvoon millä sopivalla tavalla tahansa. Laminoidussa kalvossa se on edullisesti huokoisen materiaalin ensimmäisen ja toisen kerroksen välissä ja muodos-15 taa niiden välisen sidoksen. Tässä sijainnissa, ja myöskin yleensä, entsyymi on tehty edullisesti liikkumattomaksi sekoittamalla aineen kanssa, joka aikaansaa ristikyt-keytymisen. Eräs hyvin sopiva aine tähän tarkoitukseen on glutaarialdehydi; proteiineja, kuten albumiinia ja muita 20 materiaaleja voidaan myös sisällyttää. Sensorista saatujen nopeiden stabiilien lukemien saamisen helpottamiseksi on edullista, että entsyymiä sisältävä kerros on ohut, so. ei paksumpi kuin 5 pm.

Keksinnön mukaisessa sensorissa käytettävä entsyy-25 mi riippuu analysoitavasta aineesta, jonka konsentraatio on määritettävä. Jos analysoitava aine on glukoosi, niin tällöin entsyymi on esimerkiksi glukoosioksidaasi. Muita entsyymejä, joita voi olla läsnä, ovat urikaasi ja lak-taattioksidaasi vastaavasti virtsahapon ja maitohapon mää-30 rittämiseksi. Entsyymijärjestelmiä, jotka käsittävät kaksi tai useampia entsyymejä, voi myös olla läsnä.

Keksinnön mukaisessa sensorissa glukoosin määrittämistä silmälläpitäen käytettävälaminoitu kalvo voidaan valmistaa menetelmällä, joka käsittää seuraavat vaiheet: 35 1. 1 mg glukoosioksidaasia liuotetaan 50 pl:aan (100 mg/ml) albumiinia, li 7 91023 2. 3/μ1 12,5-% glutaarialdehydiliuosta sekoitetaan mikroskoopin objektilasilla 3 μ1:η kanssa entsyymi/albumiini-seosta, 3. 1 μΐ edellisessä vaiheessa valmistettua seosta pannaan 5 1 cm2:n suuruisen polykarbonaattikalvon toiselle puolelle, jonka kalvon huokoisuus ei ole suurempi kuin 5 % ja jonka huokosten keskimääräinen halkaisija on alle 0,03 pm.

4. Entsyymikerroksen toinen pinta peitetään välittömästi ohuella selluloosa-asetaattikalvolla ja saatua laminoitua 10 kalvoa puristetaan 3 minuutin ajan objektilasien välissä. Objektilasien poistamisen jälkeen voidaan edellä esitetyn vaihesarjan avulla valmistettu laminoitu kalvo asettaa platinaelektrodille keksinnön mukaisen sensorin muodostamiseksi, jolloin selluloosa-asetaattikalvo on lähinnä 15 elektrodia ja muodostaa ensimmäisen kerroksen.

Keksinnön mukaisen menetelmän käyttäminen tuottaa etuna sen konsentraatioalueen suurenemisen, jolla alueella diagrammi, joka esittää konsentraatiota sensorin vastauksen funktiona, on lineaarinen. Tavanomaisia menetel-20 miä käytettäessä lineaarisuus ulottui yleensä vain enintään suunnilleen glukoosin konsentraatioon 3 mmol litraa kohti. Keksinnön mukaista menetelmää käyttäen lineaarisuus suurenee ja alue ulottuu glukoosin konsentraatioihin, jotka ovat 50 mmol litraa kohti ja vieläkin korkeampia. Kor-25 keammilla konsentraatioilla tämä saavutetaan rajoittamalla substraatin tunkeutumista entsyymikerrokseen ja menettämällä tämän vuoksi jonkin verran herkkyyttä. Tällöin alue peittää ne glukoosin konsentraatiot, joita voidaan odottaa olevan verinäytteissä tehden sen vuoksi veren glukoosipi-30 toisuuksien määrittämisen helpommaksi. Tämä on huomattava etu tilanteissa, joissa täytyy tehdä vakituisesti suuri joukko määrityksiä ja mahdollisimman vähäisellä näytteiden käsittelyllä. Lineaarisuus laajenee myös lisättäessä kalvon toiseen kerrokseen väliainetta, joka käsittää organo-35 silaania, jossa on reaktiivisia ryhmiä, kuten hakijan vireillä olevassa Eurooppa-patehttihakemuksessa EPO nro 8 8633907.9 on esitetty. Tämä käsittely voidaan kohdistaa esillä olevan keksinnön mukaisessa sensorissa olevan kalvon toiseen kerrokseen yhdistelmävaikutuksen ja edelleen parantuneen lineaarisuuden aikaansaamiseksi.

5 Keksintöä valaistaan oheisten piirustusten kuvion 1 avulla.

Kuviossa 1 viitenumero 1 tarkoittaa kalvon toista kerrosta, joka on muodostettu polykarbonaattikalvosta, jonka huokoisuus on 0,42 %, 2 tarkoittaa kerrosta, joka 10 sisältää glukoosioksidaasientsyymiä liuotettuna albumiiniin ja sekoitettuna glutaarialdehydin kanssa, 3 tarkoittaa selluloosa-asetaatista muodostettua ensimmäistä kerrosta, 4 tarkoittaa platinasta valmistettua koe-elektrodia ja 5 tarkoittaa hopeista vertailuelektrodia. 1, 2 ja 3 15 muodostavat yhdessä laminoidun kalvon. Platinainen koe-elektrodi 4 toimii anodina, kun taas hopeinen vertailu-elektrodi 5 toimii katodina. Kalvon pitää paikoillaan elektrodilla pleksilasirengas, joka puristaa alaspäin ulompaa kerrosta 1 sen ulkoreunoja vastaan kohdissa 6.

20 Kuviossa 1 esitetyn sensorin käyttöä valaistaan seuraavien esimerkkien avulla:

Esimerkki 1

Vesiliuos, joka sisälsi 30 mg/ml glukoosioksidaasientsyymiä (E.C.1.1.3.4) ja 200 mg/ml albumiinia, sekoitet-25 tiin yhtäsuuren tilavuuden kanssa liuosta, joka sisälsi 50 pg/ml glutaarialdehydiä. 1 cm2:n suuruinen pala "NUCLEPO-RE"-polykarbonaattikalvoa (keskimääräinen huokoshalkaisija = 0,05 pm) altistettiin 5 piille liuosseosta tarkoituksella kyllästää kalvo entsyymillä. Tässä tapauksessa kalvo 30 toimii entsyymin kantajana ja sillä ei ole mitään vaikutusta anturista saadun vasteen lineaarisuuteen.

Entsyymillä kyllästetty kalvo pantiin sensorin koe-ja vertailuelektrodien päälle (jotka oli etukäteen kostutettu 0,067 M fosfaattipuskurilla, joka sisälsi 50 mmol 35 litraa kohti natriumkloridia, pH-arvo 7,4, elektrolyyttisen yhteyden takaamiseksi koe- ja vertailuelektrodien vä-

II

9 91023

Iillä). Toisena kerroksena oleva tutkittava kalvo pantiin entsyymillä kyllästetyn kalvon päälle. Elektrodirungon ruuviasennusosa pantiin sen jälkeen paikoilleen ja kiristettiin kohdistamalla heikkoa jännitystä muodostettuun 5 laminoituun kalvoon. Sen jälkeen kalvoa testattiin. Koska ylempi kalvo (testattava kalvo toisena kerroksena) voidaan korvata muilla kalvoilla, oli mahdollista käyttää samaa tuettua entsyymikerrosta useille erilaisille toisille kerroksille).

10 Tässä esimerkissä toisena kerroksena testatut kal vot olivat seuraavanlaiset: (1) "NUCLEPORE"-polykarbonaattilisäkalvo, jonka keskimääräinen huokoshalkaisija on 0,05 pm, (2) "NUCLEPORE”-polykarbonaattikalvo, jonka keskimääräinen 15 huokoshalkaisija on 0,015 pm; ja (3) Toiminimen Schleicher and Schull valmistaa regeneroitua selluloosaa olevaa kalvoa (RC52), jonka keskimääräinen huokoshalkaisija on 0,01 pm.

Käytettäessä kalvoa (1) oli sensorin lineaarisuus 20 7 mmol litraa kohti. Kalvoilla (2) ja (3) saadut tulokset on esitetty vastaavasti oheisten piirustusten kuviossa 2 ja 3, joissa diagrammit esittävät pA-suureina ilmoitettuja virrantiheyksiä (ordinaatat) mmolreissä litraa kohti ilmoitetun glukoosikonsentraation (abskissat) funktiona.

25 Nämä tulokset osoittavat, että käyttämällä kalvoja (2) ja (3) toisena kerroksena, sensori osoittaa paljon suurempaa lineaarisuutta - suurempaa kuin 20 mmol litraa kohti kerrokselle (2) ja ainakin 50 mmol litraa kohti kerrokselle (3). Vasteaika (98 %) kerrokselle (2) oli 30 - 60 sekuntia 30 ja kerrokselle (3) 20 minuuttia. Vasteaika (90 %) kerrokselle (3) oli 7 minuuttia.

Esimerkki 2

Esimerkki 1 toistettiin käyttämällä laktaattioksi-daasientsyymiä (E.C.1.1.3.2). Toisena kerroksena testatut 35 kalvot olivat sellaiset kuin esimerkissä 1 kohdissa (1) ja 10 (2) on esitetty, jolloin niiden keskimääräiset huokoshal-kaisijat olivat vastaavasti 0,05 pm ja 0,015 pm.

Kalvoa (1) käytettäessä sensorin lineaarisuus oli 0,2 mmol litraa kohti. Kalvolla (2) saatu tulos on esi-5 tetty oheisten piirustusten kuviossa 4, joka esittää pA-suureena ilmoitetun virrantiheyden (ordinaatta) diagrammia mmol:eissa litraa kohti ilmoitetun glukoosin konsentraa-tion (abskissa) funktiona. Jälleen lineaarisuus, käyttämällä pienempihuokoista kalvoa toisena kerroksena, on suu-10 rempi kuin käytettäessä suurempihuokoista kalvoa. Tässä tapauksessa saavutetaan lineaarisuus vähintään arvolla 4 mmol litraa kohti kalvolla (2), jolloin vasteaika on 1 -2 minuuttia.

Esimerkki 3 15 Esimerkin 1 menetelmää käytettiin testattaessa toi sena kerroksena toiminimen Schleicher and Schull valmistamaa, regeneroitua selluloosaa olevaa kalvoa (RC52), jonka nimellinen huokoskoko oli välillä 0,005 - 0,010 pm. Tulos on esitetty kuviossa 5, joka esittää suureena pA ilmoite-20 tun virrantiheyden (ordinaatta) diagrammia mmol:ssa litraa kohti (abskissa) ilmoitetun glukoosikonsentraation funktiona. Tämä osoittaa, että sensorin vaste on lineaarinen huomattavan konsentraatioalueen yli.

Esimerkki 4 25 Esimerkin 1 menetelmää käytettiin testattaessa toi sena kerroksena toiminimen Schleicher and Schull valmistamaa selluloosa-asetaattikalvoa (AC62), jonka nimellinen huokoskoko on välillä 0,005 - 0,01 pm. Tulos on esitetty kuviossa 6, joka esittää pA-suureena ilmoitetun virranti-30 heyden (ordinaatta) diagrammia mmol:ssa ilmoitetun glukoosikonsentraation (abskissa) funktiona. Tämä osoittaa, että vaste on lineaarinen huomattavan konsentraatioalueen yli.

tl

Claims (8)

11 91023

1. Entsyymi-elektrodityyppinen sensori analysoitavan aineen määrittämiseksi, joka analysoitava aine on 5 muutettavissa entsyymin läsnäollessa sellaiseksi lajiksi, joka voidaan todeta sensorin avulla, joka sensori käsittää elektrodin ja nesteitä ja liuenneita aineita läpäisevän kalvon sovitettuna elektrodin ja analysoitavaa ainetta sisältävän näytteen väliin, mainitun kalvon käsittäessä 10 yhtä tai useampia entsyymejä sisältävän kerroksen sekä ainekerroksen, joka on sijoitettu entsyymiä sisältävän kerroksen ja näytteen väliin, tunnettu siitä, että mainittu ainekerros sisältää alueen, jonka läpi analysoitava aine pystyy kulkemaan ja joka on muodostettu huokoi-15 sesta materiaalista, jonka läpäisevyys on rajoitettu ja jonka huokoisuus on alueella 0,001 - 0,5 % ja jonka keskimääräinen huokoshalkaisija ei ole suurempi kuin 0,025 pm.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen sensori, tunnettu siitä, että se sisältää laminoidun kalvon, joka 20 käsittää entsyymiä sisältävän kerroksen sijoitettuna ensimmäisen ainekerroksen ja toisen ainekerroksen väliin, ensimmäisen kerroksen ollessa entsyymiä sisältävän kerroksen ja elektrodin välissä sensorissa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen sensori, t u n-25 n e t t u siitä, että kalvon ensimmäinen kerros on muodostettu polymetyylimetakrylaatista, selluloosa-asetaatis-ta tai polyuretaanista.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen sensori, tunnettu siitä, että läpäisykyvyltään rajoi- 30 tettu huokoinen aine on muodostettu polykarbonaatista tai modifioidusta selluloosasta.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen sensori, tunnettu siitä, että läpäisykyvyltään rajoitettu huokoinen aine muodostaa sitä sisältävän kerrok- 35 sen koko tehokkaan alueen. 12

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen sensori, tunnettu siitä, että läpäisykyvyltään rajoitetun huokoisen aineen huokosten keskimääräinen halkaisija on alueella 0,01 - 0,025 pm.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen sen sori, tunnettu siitä, että läpäisykyvyltään rajoitetun huokoisen aineen huokoisuus on alueella 0,005 -0,025 %.

8. Menetelmä näytteessä olevan analysoitavan ai-10 neen määrittämiseksi saattamalla näyte kosketukseen kalvon ulomman kerroksen kanssa, joka kalvo on nesteitä ja liuenneita aineita läpäisevä ja sisältää yhtä tai useampia entsyymejä, joiden läsnäollessa analysoitava aine on muutettavissa sellaiseksi lajiksi, joka on kalvon sisältävän 15 sensorin avulla todettavissa, sekä yksi tai useampia aine-kerroksia, ja mittaamalla sensorin vaste kyseiseen lajiin, tunnettu siitä, että kalvon entsyymin ja näytteen välissä oleva kerros sisältää alueen, jonka läpi analysoitava aine pystyy kulkemaan, muodostettuna läpäisykyvyltään 20 rajoitetusta huokoisesta aineesta, jonka huokoisuus on alueella 0,001 - 0,5 % ja jonka keskimääräinen huokoshal-kaisija ei ole suurempi kuin 0,025 pm. li 91023 13