FI70725C

FI70725C - Elektrokemisk maetanordning foersedd med en enzymelektrod

Info

Publication number: FI70725C
Application number: FI802561A
Authority: FI
Inventors: Shuichi Suzuki; Masuo Aizawa; Masao Koyama; Yuichi Sato; Junji Koezuka
Original assignee: Tokyo Shibaura Electric Co
Priority date: 1979-08-14
Filing date: 1980-08-14
Publication date: 1986-10-06
Also published as: EP0025110A3; EP0025110A2; FI802561A; JPS6129667B2; FI70725B; DE3063679D1; EP0025110B1; US4388166A; JPS5627643A

Description

l^T] γμ Μ1, KUULUTUSJULKA.SU 7 Π 7 0 ς

ψ&Βφ [β] (11) UTLÄGGNINGSSKRIFT /U/^D

c («> ^rr^r1 :::"rrH

^ ^ (51) Kv.lk.*/lnt.CI.* C 12 Μ 1/00 £^Q|^|| PINLAND (21) Patenttlh»kemus — Patenansöknlng 802561 (22) Hakemlspllvi— Ansökningsdag 1 4.08.80 (FI) (23) Alkupilvi — Glltlghetsdag 1 4.08 .8 0 (41) Tullut fulklseksi — Blivlt offentllg 15*02.81

Patentti· ja rekisterihallitus Nihtiviktipanon ja kuul.julkaisun pvm.— 2A o6 86

Patent· oeh registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och utl.akrlften publicerad (86) Kv. hakemus — Int. ansökan (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begird prloritet 1 4.08.79 Japan i-Japan(JP) 102761/79 (71) Tokyo Shibaura Denki Kabushiki Kaisha, 72 Horikawa-cho, Saiwai-ku,

Kawasaki-shi, Japani-Japan(JP) (72) Shuichi Suzuki, Tokyo, Hasuo Aizawa, Tokyo, Masao Koyama, Yokohama--shi, Yuichi Sato, Kanagawa-ken, Junji Koezuka, Yokohama-shi, Japani-Japan(JP) (74) Oy Koister Ab (54) Entsyymielektrodi1 la varustettu sähkökemiallinen mittalaite -Elektrokemisk mätanordning försedd med en enzymelektrod Tämä keksintö kohdistuu sähkökemialliseen mittalaitteeseen varustettuna parannetulla entsyymielektrodilla.

Ennestään tunnetaan useita sähkökemiallisia mittalaitteita varustettuina entsyymielektrodilla nesteen sisältämien orgaanisten aineosien pitoisuuksien helppoa määrittämistä varten. Tällaista sähkökemiallista mittalaitetta ei käytetä pelkästään orgaanisten aineosien analyysiin vaan myös lääketieteellisissä diagnooseissa ja hoidoissa, biokemiassa ja ravintoaineteollisuudessa.

US-patentti 3 539 455 (Clark), US-patentti 3 948 745 (Guilbault et ai), US-patentti 4 005 002 (Racine et ai) ja US-patentit 3 979 274 ja 4 073 713 (Newman) kohdistuvat sähkökemiallisiin mittalaitteisiin ja/tai niissä käytettyihin entsyymielektrodeihin.

Tavanomaisessa sähkökemiallisessa mittalaitteessa käytetty entsyymielektrodi muodostuu galvaanisessa kennossa käytetystä tai 7 0 7 2 5 polarograafisesta elektrodista, mainitun elektrodin herkistetylle pinnalle levitetystä entsyymimembräänistä ja eräissä tapauksissa, mainitun entsyymimembraanin peittävästä puoliläpäisevästä membräänistä. Tavanomaisen puoliläpäisevän membräänin huokosrakenne on symmetrinen ja on se muodostettu esimerkiksi regeneroidusta selluloosasta tai polykarbonaatista.

Alan aikaisemmissa sähkökemiallisissa mittalaitteissa puoli-läpäisevällä membraanilla varustettu entsyymielektrodi sallii tosin stabiilin mittauksen mutta vaatii pitkän mittausajan hitaan vasteen vuoksi. Toisaalta entsyymielektrodin, jossa ei käytetä puoliläpäisevää membraania, vaste on nopea, mutta sen epäkohtana on, että mittauksiin liittyy kohinaa, joka aiheuttaa merkittäviä muutoksia mitattuihin arvoihin. Riippumatta siitä käytetäänkö puoli-läpäisevää membraania vai ei, tunnettujen entsyymielektrodien epäkohtana on se, että niiden stabiliteetti kärsii pitkäaikaisessa käytössä. Toisin sanoen, vaikka ne ovat stabiileja käytettäessä kirkkaissa vesiliuoksissa, kuten glukoosin vesiliuoksessa, alan aikaisemmilla entsyymielektrodeilla on se epäkohta, että mitattaessa orgaanisen aineen, kuten glukoosin, pitoisuutta nesteessä kuten veressä, seerumissa tai virtsassa,tällaisen nesteen sisältämä suurimolekyylinen materiaali, kuten proteiini, pyrkii havaittavasti saostumaan entsyymielektrodille, mikä aiheuttaa mainitun entsyymi-elektrodin herkkyyden, vastenopeuden ja kestävyyden nopean heikkenemisen ja siten vaaditaan entsyymielektrodin usein tapahtuva pesu tai korvaaminen.

Siten esiintyy tarve, ei vain kemiallisia analyysejä varten vaan myös lääketieteellistä hoitoa ja diagnoosia varten, sähkökemiallisen mittalaitteen kehittämiseksi, joka on varustettu entsyy-mielektrodilla, jonka avulla voidaan suorittaa, nopea, helppo ja stabiili mittaus.

Keksinnön kohteena on täten sähkökemiallinen mittalaite varustettuna parannetulla entsyymielektrodilla, jonka herkkyys ja vastenopeus ovat kasvaneet, jonka kohina on vähäinen ja joka on stabiili pitkäaikaisessa käytössä.

Keksintö koskee sähkökemiallista mittalaitetta, joka on varustettu entsyymielektrodilla, joka käsittää elektrodin, jonka vieressä on suodatinmembraani, joka läpäisee määritettävän aineen, mutta ei läpäise ainetta, jonka hiukkaskoko on suurempi kuin määri- 3 70725 tettävän aineen hiukkakoko; suodatinmembraanille sovitetun erillisen imraobilisoidun entsyymin membraanin ja immobilisoidun entsyymin mem-braanille asennetun epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin, jolloin määritettävässä nesteessä oleva orgaaninen aineosa määritetään käyttäen hyväksi immobilisoidun entsyymin membraanissa olevan entsyymin reaktiota.

Keksinnön mukaiselle mittalaitteelle on tunnusomaista, että epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani muodostuu oleellisesti ohuesta puoliläpäisevästä ulkokerroksesta, jonka paksuus on pienempi kuin 1^um ja joka joutuu kesketukseen määritettävän nesteen kanssa, ja paksusta huokoisesta sisäkerroksesta, jolloin epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin paksuus on 10-50^um ja jolloin vähintään 80% aineesta, jonka molekyylipaino on 20 000, ei läpäise epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania, ja vähintään 70% aineesta, jonka molekyylipaino on 1 000, läpäisee membraanin.

Epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani voi olla yhtenäistä materiaalia, jossa ohuen puoliläpäisevän kerroksen pieniläpimittaiset huokoset ovat paksun huokoisen kerroksen karkeiden huokosten vieressä mainitun epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin paksuus-suunnassa. On myös mahdollista valmistaa erikseen mainittu huokoinen kerros ja puoliläpäisevä kerros ja sijoittaa mainittu huokoinen kerros mainitulle puoliläpäisevälle kerrokselle siten, että mainittu puoliläpäisevä kerros on ulkopuolella.

Tässä keksinnössä käytettynä epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani on edullisesti sellainen, että se on läpäisemätön vähintään 80%:lie materiaalia, jonka molekyylipaino on 20 000 ja läpäisee vähintään 70% materiaalista, jonka molekyylipaino on 1 000. Useampien suurimolekyylisten häiritsevien materiaalien, kuten proteiinin, jota saostuu entsyymielektrodille heikentäen sen ominaisuuksia tai estäen itse kiinteän entsyymielektrodin aktiviteetin, molekyylipaino on suurempi kuin 20 000. Epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani torjuu nämä häiritsevät materiaalit. Vain pienen molekyylipainon omaavat materiaalit, kuten glukoosi, joiden pitoisuus on mitattava, pystyvät siirtymään mainitun epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin lävitse. Täten mittaukseen käytettäessä mainittua epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania liittyy vähemmän häiriöitä, ei havaita muutoksia saaduista tuloksista ja taataan stabiili suuri tarkkuus. Epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin paksun huokoisen kerroksen huokoset ovat huomattavasti suurempia kuin ohuen puoliläpäisevän kerroksen huokoset. Täten materiaali, jonka pitoisuus on määrittävä, tunkeutuu nopeasti 70725 huokoisen kerroksen lävitse, mikä takaa erittäin suuren herkkyyden ja vastenopeuden entsyymielektrodille kokonaisuudessaan. Tämän keksinnön etuna on se, että on mahdollista pienentää entsyy-mielektrodissa esiintyvää kohinaa puolesta kahdenteenkymmenenteen osaan siitä kohinasta, joka liittyy tavanomaiseen entsyymielektro-diin, jossa ei käytetä edellämainittua epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania ja mittaus voidaan suorittaa paljon pienemmillä nesteen orgaanisten aineosien pitoisuuksilla kuin aikaisemmin on ollut mahdollista. Tämän keksinnön mukaista sähkökemiallista mittalaitetta käytettäessä entsyymielektrodilla esiintyvä kohina on alunperin niin pieni, että on tarpeetonta pyrkiä vähentämään tätä kohinaa erikoisesti vahvistinta käyttämällä, kuten on laita tavanomaisessa sähkökemiallisessa mittalaitteessa, jonka entsyymielektro-dissa ei ole edellämainittua epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania. Täten keksinnön mukaisen sähkökemiallisen mittalaitteen käyttö on huomattavasti yksinkertaisempaa harvempien osien käytön vuoksi ja on sen luotettavuus parempi.

Lisäksi suoritettaessa mittauksia orgaanisten materiaalien jäännösten pitoisuuksien suhteen, esimerkiksi verestä tai jätevesistä, jotka sisältävät proteiinia, jonka molekyylipaino on tuhansista useisiin miljooniin, edelläesitetyn eäpsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin suojaama entsyymielektrodi estyy joutumasta suoraan kosketukseen näin suuren molekyylipainon omaavan materiaalin kanssa, mikä saastuttaisi tai tuhoaisi entsyymielektrodin.

Täten keksinnön mukaisessa sähkökemiallisessa mittalaitteessa estetään tehokkaasti ominaisuuksien heikkeneminen, mikä aiheutuisi esimerkiksi suurimolekyylisen materiaalin saostumisesta. Keksinnön mukaisen mittalaitteen etuna on se, että stabiili mittaus voidaan suorittaa herkkyyden ja vasteen huononematta ja myös oleellisesti kohinan estämättä; entsyymielektrodin herkistetty osa voidaan suojata tehokkaasti vaurioilta, joita voi aiheutua mainitun herkistetyn kohdan koskettaessa joitain mekaanista osaa mittauksen aikana; myös jos tapahtuu vaurioitumista tällaisen kosketuksen vuoksi, esiteltävää sähkökemiallista mittalaitetta voidaan käyttää uudestaan yksinkertaisesti korvaamalla asymmetrinen puoliläpäisevä membraani ja jos esiteltävän sähkökemiallisen mittalaitteen ominaisuuksissa pyrkii tapahtumaan ominaisuuksien heikkenemistä lyhyen ajan kuluttua entsyymielektrodin tai mainitulle herkistetylle kohdalle asennetun immobilisoidun entsyymin membraanin kuivumisen vuoksi, voidaan tällainen 5 70725 kuivuminen estää epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin vettä pidättävän ominaisuuden avulla.

Syy siihen miksi kohina pienenee tämän keksinnön mukaisessa sähkökemiallisessa mittalaitteessa ei ole täysin selvä. Kuitenkin oletetaan, että käytettäessä tämän keksinnön mukaista epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania estetään mitattavan kohteen epäsäännöllinen diffuusio nesteen lävitse sitä sekoitettaessa, jolloin mitattava kohde liikkuu tasaisesti kohti entsyymielektrodia.

Kuviot IA, IB, 1C ja ID ovat läpileikkauskuvia eri entsyymi-elektrodeista, joita käytetään tämän keksinnön mukaisessa sähkökemiallisessa mittalaitteessa.

Kuvio 2 on lohkokaavio keksinnön mukaisesta sähkökemiallisesta mittalaitteesta.

Kuviossa 3 on esitetty graafisesti keksinnön mukaisessa entsyymielektrodissa käytetyn epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin läpäisykyky ja kuviossa 4on esitetty graafisesti esiteltävän keksinnön mukaisen entsyymielektrodin ja alan aikaisemnan entsyymielektrodin pitkäaikaiset stabiilisuudet.

Entsyymielektrodin 10 elektrodiosa (esimerkiksi happielektrodi) käsittää oleellisesti, kuten kuviossa IA on esitetty, eristävästä materiaalista kuten lasista tai muovista valmistetun elektrodisy-linterin 1, katodin 2, anodin 3, elektrodisylinteriin 1 täytetyn elektrolyytin 4 siten, että elektrolyytti täyttää katodin 2 ja anodin 3 sekä suodatinraembraanin 5 välisen tilan suodatinmembräänin sijaitessa lähellä katodia 2 ja muodostaessa herkistetyn tason.

Sekä katodi 2 että anodi 3 on kytketty virtamittauspiiriin (ei-esi-tetty) johtimien 8a ja 8b avulla.Happielektrodi on herkistetty hapen suhteen (havaittava aine), jota kuluu tai kehittyy entsyymin reaktiossa. Tämän keksinnön mukaisessa toteutuksessa elektrodiosa voi olla galvaanista tyyppiä, jonka katodi on valmistettu jalometallista kuten platinasta tai kullasta ja jonka anodi 3 on valmistettu alumiinista tai lyijystä. On kuitenkin mahdollista käyttää polarograafista elektrodiosaa, jonka anodi on valmistettu hopea/ hopeakloridista ja jonka katodi on valmistettu platinasta tai kullasta. Kuvio IA esittää happielektrodina toimivaa elektrodiosaa. Kuitenkin mainitun elektrodiosan voi muodostaa tarvittaeesa vety-peroksidielektrodi vetyperoksidin havaitsemiseksi, hiilidioksidi- 6 70725 elektrodi hiilidioksidin havaitsemiseksi, vetyionielektrodi vety-ionin havaitsemiseksi tai jokin muu tunnettu elektrodi syaani-ionin, jodi-ionin, ammoniakin ja yksiarvoisen ionin havaitsemiseksi.

Kuvioissa IB, 1C ja ID on esitetty muunnoksia tässä keksinnössä käytetystä entsyymielektrodista 10. Kuvioiden IB ja 1C toteutuksissa käytetään O-rengasta 11 ja immobilisoidun entsyymin membraani 6 sekä epäsymmetrinen puoliläpäisevä kerros 7 on tehty irroitettaviksi. Kuvion IB 0- rengas H toimii samanaikaisesti tiivistyskappaleena entsyymielektrodin 10 kiinnittämiseksi paikalleen. Kuvion ID toteutuksessa käytetään kumitiivistettä 11'. Uloin päätyosa 1' on tehty irroitettavaksi kiinnittämällä se kierteiden avulla elektrodi-sylinteriin 1. Ulomman päätyosan 1' irroittaminen helpottaa immobilisoidun entsyymin membraanin 6 ja epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraaTiin 7 vaihtoa.

Suodinosa 5 läpäisee tutkittavaa materiaalia ja on läpäisemätön materiaalin suhteen, jonka molekyylipaino tai osaskoko on suurempi kuin tutkittavan materiaalin. Erilaisia suodinmembraaneja on ennestään esitetty US-patenteissa 3 539 455 ja 3 979 274 ja alan asiantuntijat voivat valita niitä helposti. Jos elek<fcrodiosa muodostuu happielektrodista, on mahdollista käyttää materiaalia, joka ei läpäise vettä eikä elektrolyyttiä, mutta joka läpäisee happikaasua, kuten tetrafluorietyleeniä, fluorietyleeniporpyleeniä ja polyetylee-niä. Jos elektrodiosan muodostaa vetyperoksidielektrodi, on mahdollista käyttää esimerkiksi selluloosa-asetaattia, silikonikumia ja metyleenimetakrylaattia. Suodinmembraanin 5 paksuus on edullisesti 6-12 mikrometriä. Jos suodinmembraani 5 on liian paksu, saadun sähkökemiallisen mittalaitteen vasteaika on pitkä. Toisaalta liian ohut suodatin heikentää mekaanista lujuutta. Suodatinmembraani 5 on kiinnitetty elektrodisylinteriin 1 lähelle katodia 2 elektrolyytin 4 ollessa sijoitetun mainitun suodatinmembraanin 5 ja katodin 2 väliin.

Immobilisoidun enstyymin membraani 6 on kalvomaista materiaalia, joka käytetään entsyymin immobilisoimiseksi alustalle kemiallisesti tai fysikaalisesti entsyymin poisvirtauksen estämiseksi. Alan asiantuntijat tuntevat ennestään tällaisia kiinteitä entsyymiemebraaneja ja on niitä esitetty US-patenteissa 3 539 455 ja 3 948 745 eikä niitä esitetä tässä yhteydessä. Mainitun entsyymimembraa-

II

> 70725 nin 6 rakenteen täytyy kuitenkin olla vähintäin sellainen, että entsyymireaktioon tarvittavat materiaalit, kuten happi ja glukoosi, voivat siirtyä mainitussa membräänissä tai sillä olevalle entsyymille.

Mitattava orgaaninen aineosa hajoaa tässä keksinnössä käytetyn entsyymireaktion vaikutuksesta, jolloin, muodostuu tai kuluu tutkittavaa materiaalia, kuten happea, vetyperoksidia, vetyä ja vastaavaa ainetta. Jos elektrodiosan muodostaa esimerkiksi happielektrodi, on mahdollista käyttää entsyymeinä esimerkiksi alkoholioksidaasia, glukoosioksidaasia, laktaattioksidaasia, galaktoosioksidaasia, alde-hydioksidaasia, pyruvaattioksidaasia, askorbaattioksidaasia ja kata-laasia.

Epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani 7 muodostuu ohuesta puolipäisevästä kalvosta ja paksusta, suurihuokosisesta huokoisesta kerroksesta. Paksu huokoinen kerros on yhteydessä immobilisoidun entsyymin membraanin 6 ja ohut puoliläpäisevä kalvo ulkopuolella on alttiina kosketukselle nesteen kanssa, jonka orgaanisen aineen pitoisuus on mitattava. Ohut puoliläpäisevä kalvo on edullisesti mahdollisimman ohut. Nykyisen tekniikan avulla mainittu puoliläpäisevä kalvo voidaan ohentaa muutaman sadan ängström-yksikön paksuiseksi. Mitä paksumpi puoliläpäisevä kerros on, sitä pienempi on se nopeus, jolla orgaaninen aine, kuten glukoosi, joka on mitattava, läpäisee mainitun kerroksen ja vastaavasti sitä pitempi on aika, joka vaaditaan vastaavan sähkökemiallisen mittalaitteen mittausta varten. Täten mainitun puoliläpäisevän kerroksen paksuus on pienempi kuin 1^um ja edullisesti muodostuneiden huokosten läpimitat ovat pienempiä kuin 0,5^um.

Toisaalta paksu huokoinen kerros, jonka huokoset ovat suuria, sallii orgaanisen materiaalin, kuten glukoosin, helpon diffuusion. Tämä huokoinen kerros voidaan siten tehdä verrattain paksuksi mekaanisen lujuuden saamiseksi epäsymmetriseen puoliläpäisevään membraa-niin ja mitattavan nesteen sekoituksesta aiheutuvan vaikutuksen vähentämiseksi, esimerkiksi kohinan vähentämiseksi. Jos kuitenkin huokoinen kerros on tehty liian paksuksi, on saadun sähkökemiallisen mittalaitteen vaste hidas. Siten epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin paksuus kokonaisuudessaan on 10 - 50 ^um edullisesti 25 - 35 ^um. Lisäksi paksu huokoinen kerros tulisi valmistaa siten, että huokosten läpimitat ovat 0,1-5 mikrometriä.

s 70725

Epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani valmistetaan esimerkiksi selluloosan johdannaisista, kuten selluloosa-asetaatista, sel-luloosabutylaatista, ja selluloosapropionaatista; polyvinyylialkoho-lin johdannaisista, kuten polyvinyylialkoholista, polyvinyyliase-taalista ja polyvinyylibentsaalista; polyakrylonitriilistä; polyamidista; polyimidistä; akrylonitriili-vinyylikloridikopolymeeristä; polyvinyylikloridista ja polysulfonista.

Epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin valmistusmenetelmä on yleisesti tunnettu ja on sitä esitelty seuraavassa kirjallisuudessa: Serop Manjikian, "Desalination Membranes from Organic Casting Solutions", I & EC Product Reserch and Development, Vol. 6, Nro 1, March (1967), sivut 23-32; ja G.J.Gittens et al., Desalination, 12 (1973), sivut 315-332, Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam.

Epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani on mahdollista valmistaa kahdesta kerroksesta, joista toisen huokoset ovat pieniä ja toisen suuria. Esiteltävä epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani voidaan valmistaa levittämällä orgaanista valuliuosta huokoiselle alustalle, jonka huokoset ovat suurikokoisia. Tässä tapauksessa epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani, jossa on kaksi kerrosta, voidaan valmistaa yhdestä materiaalista tai eri materiaaleista.

Kuten kuvioissa IB, 1C ja ID on esitetty immobilisoidun entsyymin membraani 6 ja epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani 7 ovat irroitettavasti kiinnitetyt elektrodiosaan tiivistyskappaleen 9 kuten 0-renkaan tai kumitiivisteen avulla. Täten rakennettu entsyy-mielektrodi 10 on yhdistetty, kuten kuviossa 2 on esitetty, näyttölaitteeseen 12 vahvistimen tai erottelupiirin 11 avulla. Näyttölaite 12 voi olla näyttöputki, mittari tai piirturi.

Entsyymielektrodi 10 upotetaan mittauskennoon 13, joka on täytetty nesteellä 14, jonka orgaanisten aineiden sisältö on määrättävä. Mittaus suoritetaan sekoittamalla nestettä 14 esimerkiksi magneettisekoittimen 15 avulla.

Tämän keksinnön mukaista sähkökemiallista mittalaitetta voidaan käyttää valitsemalla sopivasti entsyymi ja elektrodiosa nesteen sisältämien orgaanisten aineosien, esimerkiksi glukoosin, galaktoo-sin, sukroosin, virtsahapon, kolesteraalin, aminohapon, nukleiinihapon, alkoholin, virtsan, penisilliinin, NADHrn ja vitamiinin, se- 9 70725 lektiivisessä kvantitatiivisessa analyysissä. Keksinnön mukainen sähkökemiallinen mittalaite on tehokas erikoisesti sokeritaudin diagnoosissa ja hoidossa analysoitaessa glukoosin pitoisuus veressä tai virtsassa.Keksintöä esitellään tarkemmin seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1 Käytettiin kuvion 1 mukaista happielektrodia, joka muodostui pla-tinakatodista 2, lyijyanodista 3, KOH-elektrolyytistä 4 ja teflonia (kauppanimi tetrafluorietyleenille, valmistaa E.I.Dupont de Nemours and Co, Inc., America) olevasta membraanista 5, jonka paksuus oli 12 miktranetriä. Iitin obilisoidun glukoosioksidaasin membraani 6 oli asennettu mainitulle teflon-mambraanille 5. Lisäksi selluloosadiasetaattia oleva epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani 7, jonka paksuus oli 30 mikrometriä, oli asetettu mainitun kiinteän glukoosioksidaasi membraanin 6 ulkopinnalle siten, että mainitun membraanin 7 ohut puoliläpäisevä kerrososa oli uloimpana. Mainittu membraani 7 oli kiinnitetty paikalleen 0-renkaan 9 avulla. Selluloosadiasetaattia olevan epäsymmetrisen puoliläpäisevä membraanin läpäisykyky oli seu- o raava, kun ultrasuodatus suoritettiin 2 kp/cm olevassa paineessa: 1-2 % PVK K - 90:lle (molekyylipaino 360 000), 1-2 % albumiinille (molekyylipaino noin 70 000), 99-100 % glukoosille (molekyylipaino 18 0).

-4

Glukoosin pitoisuus (2 x 10 M) veressä mitattiin sähkökemiallisen mittalaitteen avulla, joka oli varustettu edelläesitetyllä entsyymielektrodilla. Mittaus suoritettiin 37°C lämpötilassa ja mittauskennossa olevaa verta sekoitettiin nopeudella 4Q0 kierrosta minuutissa.

Vertailun vuoksi suoritettiin kolme vertailumittausta käyttäen sähkökemiallista mittalaitetta, jossa entsyymielektrodi oli tavanomaista tyyppiä. Vertailukokeessa 1 käytetty entsyymielektrodi oli tyyppiä, jossa ei ollut selluloosadiasetaattia olevaa epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania 7, jollainen kuului esimerkissä 1 käytettyyn entsyymielektrodiin. Vertailukokeessa 2 käytetty entsyymi-elektrodi oli tyyppiä, jossa teflonimembräänillä, jonka paksuus oli 36 mikrometriä, korvattiin teflonimembraani 5, jonka paksuus oli 12 mikrometriä ja jota käytettiin vertailukokeessa 1 kohinan alentamiseksi. Vertailukokeessa 3 käytetty entsyymielektrodi oli 10 70725 tyyppiä, jossa käytettiin 5 mikrometrin paksuista polykarbonaatti-membraania tämän keksinnön mukaisen epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin 7 asemasta. Polykarbonaattimembraania huokosten keskimääräinen läpimitta oli 0,03 mikrometriä ja sen läpäisykyky oli seu-raava suoritettaessa ultrasuodatus 2 kp/cm olevalla paineella: 1-2 % PVK k 90:lie, 4 % albumiinille, 98 % glukoosille. Veren glu-koosipitoisuuden mittaustulokset on esitetty seuraavassa taulukossa 1.

11 707 2 5 I—Γ ^ A I μ,ΐ ΓΓ'ΤΤ~ " ! I 9 o > ή x ε i O 0) Cfl d, (fl (d 3 m I SH 3 (N -H HO Φ 3 φ

ro | j< Ή in o μ o φ o 0) >; -P ,X

H μ i-H «. Φ a .* I NilUH

• 1 S Φ I O φ I :0 o >1 (0 -H :r0 +J CD O I a dl Diil -V a g -n m ; h a .-H -ne +jc <* <D * g o >i c 3 sh-hoc > 0(0 -O :(0 <1)-o 0)000) - __________o In __XL.C 3__X .X CN .UI_,___ +) -5 i c h id ,¾ Φ -h · I I tn m •H (00) :(0 (0 0)0)

; i 0) g 3$5 -o 3 > k -H

0 (0 roö φ · 3 3 3

Sh o CN a H Λ K) 0) a -P C -H -H -P (0 ι .X 3 r~ o sh Q 57 >ι03Φ>ϋ)3ϋ) (N ι·Η·γΗ I MU d) ϊ I .1 , >iC>-H(0H<;-PO)

g μ O OQ) ^ ,μ ^ C ^ ¢) H H 4) O H H

• o) ln ia i-hc-hS ^-ucoj-p-pgo +J do 0) a g m ,0 a 3 Φ M 0) 0) 4) -H 3 > sh o a οβηρε-ΡΛ; φαη-η^ο^μ o)i - g -o i cad s>(di:>H4J(d > > o 3 o μ ff S Ä -1-------5-—1-1-

I 0) I · 3 -H

i I (0 -H C 3 >1 1 m ff-L > g n g -p h I a jj ·ϊ^ 0) <—i c (0 1 g C X (d H H Id Ή O 0) (0 $ -Γ-Ι 3 0) -H -H <0 SH »H -H ^ ¥· 4-)>0)U) -X 3 r-H H H S . H 0) 0) -H (0 0) 0) 1- ‘H -H rH - Φ 00 rg r ? >, 3 .C +> a g Sh I oqj ‘ ·Η (3 in C >1 Φ :3 +> 3 3 3 . o) 00 1 a r> o m φ ,χ a > a a a w +J Οφ σ> g I 0) Sh I Φ 0 3 d) 3 0) sh r- a o 3 ^ "d § 10 :¾ Sh C a > -X a a a φ *g *0 - d § ,H d φ φ 3 3 0 a 0 > 0¾ OS d) 5 K a > K a g > 1 kh Γ-Ϊ _ __ -- -n - --.- .. — . - . —-—-----

3 I . I O

(0 a C X 3 O

E-Ι I I 0-iHSh Id 0) 4J o O O a g > ·η3 CH fi sh o)sh h 2 φΟ)φ Λ! 3 ,Χ 3 φ φ O 0) a rH ·Η 0) t— ·γΗ·η oh a a co 3 o >0 Λη,ι; E Sh rH g >H do :0 «e <-s >iR >ι3 <d • 0) I ο) -Μ-* λ: a) 4) id c g Μ φ O rH φ -PC ACH->:(0-P4J(d -H d) a rH oa >lC-H S 0) > φ^Λ! 0) » ε - g :3 0)3 φ 3 a Φ a a W 03 O 3 « G .X Ä > Φ C ε 3 a rr I I I I 3 •rH -rH 0 -rH o -rH I T7 0 10 oh a φ H-) *h > (0 4) XH 3 Ό -P3a:3 fi MHN (OH Ο Λ Φ 0) 3 4-)3 3-naOrH 3 0) 3 0) φ 0) C H (I) 4) μ 0) -H 3 Ο φ λ;—' 3 0) >H 44φ·Ηϋ)φΟ) μ Λ* 0) a Λί T3 -HOP HJ^ I >1 a 3 0) J* μ a a 3 o a 3 3 <ö 3 z z > a h-) o 3 φ ε > 3 Ο Φ a 3 φοο c—% :3 HD O 3 > 3 ΟΌ) a a m -P Λ 3 -X 0) ο) μ OJ< 3 3 Η ο) ^ X 0) 3h-»3 -Η >ι Φ

Sn 3 a 3 3 0 3 Ο φ +J a a Ο :3 Φ W έ 0iwn4) > X X_ U) g (7»-P a 0) a c a φ I · ε a 3 a 0) 0) z d o) +J g o 3¾1 -p o) +j o) a 0 3 1 a ·· a 3 μ X 0) 0 3 U Ο Φ 3 a a -p o X ao ao x a r- φ o o I oa oh ε a (Λ c h1 _____ 12 7072 5

Taulukko 1 osoittaa, että esimerkissä 1, jossa käytettiin tämän keksinnön mukaista entsyymielektrodia, saatiin nopea vaste ja kohinataso oli erittäin pieni, vähemmän kuin 0,01 mikroampee-ria. Lisäksi esimerkissä 1 virranvoimakkuus muuttui selvästi glu-koosipitoisuuden mukaan ja S/N-suhde oli suurempi kuin 68 osoittaen erittäin tarkkaa mittausta. Tämän keksinnön mukaisen sähkökemiallisen mittalaitteen on havaittu edelleen pystyvän mittaamaan luotettavasti jopa pienempiä glukoosipitoisuuksia kuin 3 x 10 ^M. Kuten taulukosta 1 voidaan havaita, immobilisoitu entsyymielektrodia voidaan käyttää kauemmin kuin 100 vuorokautta ilman uusimista. Edelleen havaittiin, että vaikka glukoosipitoisuus ihmisen veressä ja seerumissa mitattiin enemmän kuin 1000 kertaa, tämän keksinnön mukaisen entsyymielektrodin herkkyys ja vastenopeus alenivat vain vähän ja esimerkiksi seerumiproteiini saastutti sitä vain vähän. Keksinnön mukaisessa entsyymielektrodissa käytetty epäsymmetrinen puoliläpäisevä irembraani ei tukkeutunut haitallisten materiaalien, kuten seerumiproteiinin vaikutuksesta, jolloin elektrodin puhdistaminen on helppoa. Esiteltävän epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin paksun huokoisen kerrososan sisältämä suuri vesimäärä estää immo-bilisoidun entsyymimembraanin kuivumisen jopa poistettaessa entsyy-mielektrodi nesteestä. Edelläesitetyt näkökohdat tukevat tämän keksinnön mukaisen enstyymielektrodin hyvän kestävyyden ja stabiili-suuden saavuttamista.

Toisaalta vertailukokeessa 1, jossa iranofoilisoidun entsyymin membraa-nia ei oltu päällystetty tällaisella epäsymmetrisellä puoliläpäisevällä membraanilla, jota keksinnössä käytetään, saatiin pieni S/N-suhde ja erittäin huono mittaustarkkuus. Vertailukokeen 1 entsyymi-elektrodiin liittyi huomattavaa kohinaa,jolloin pienempiä kuin 3x10 olevia glukoosipitoisuuksia ei voida mitata. Vertailukokeessa 2 kohinan esiintyminen aleni oleellisesti samalle tasolle kuin esimerkissä 1 havaittu kohina, mutta vasteen muodostuminen kesti 50-70 sekuntia, joka on enemmän kuin viisinkertainen esimerkissä 1 saavutettuun aikaan verrattuna. Sekä vertailukokeessa 1 että 2 kuvattu immobilisoitu entsyymielektrodi rikkoontui 4-15 vuorokauden käytön jälkeen.

Vertailukokeessa 3 irrmobolisoidun entsyymin membraani oli päällystetty ohuella (5mikrometrin) polykarbonaattikerroksella ja vasteaika oli oleellisesti yhtä lyhyt ja mittaukseen liittyi oleellisesti yhtä vähän kohinaa kuin esimerkissä 1. Vertailukokeessa 3 saatu sig- 11 i3 70725 naalivoimakkuus oli kuitenkin huomattavasti pienempi kuin esimerkissä 1 mitattuna samalla glukoosipitoisuudella ja siten S/N-suhde oli vastaavasti pieni, mikä tarkoittaa huonoa mittaustarkkuutta. Vertailikokeessa 3 kestävyys oli sellainen, että imrobilisoidun entsyymin membraania voidaan korvaamatta käyttää 50-60 vuorokautta eikä sen herkkyys ja vastenopeus laskeneet kuin vasta noin 200 käyttökerran jälkeen. Syyn, miksi vertailukokeessa 3 kestävyys ja stabiilisuus olivat huomattavasti huononmat kuin esimerkissä 1, oletetaan johtuvan siitä, että polykarbonaattikerros ei ollut epäsymmetristä puoli-läpäisevää tyyppiä.

Esimerkit 2-5 Näissä esimerkeissä elektrodiosa ja epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani asennettiin toisin kuin esimerkissä 1.Esimerkissä 2 käytettiin samaa happielektrodia kuin esimerkissä 1. Esimerkissä 3 käytettiin vetyelektrodia. Esimerkissä 4 käytettiin hiilidioksidi-elektrodia. Käytettiin kolmea lajia epäsymmetrisiä puoliläpäiseviä membraaneja: A (polysulfonimembraani); B (selluloosa-asetaatti-membraani valmistettuna säätämällä liuottimen haihtumisaika 15 sekuntiin); ja C (selluloosa-asetaattimembraani valmistettuna säätämällä liuottimen haihtumisaika 30 sekuntiin). Membraania A käytettiin esimerkissä 3, membraania B esimerkissä 4 ja membraania C sekä esimerkissä 2 että esimerkissä 5. Vastaavien membraanien A, B ja C läpäisevyydet on esitetty kuviossa 3, jossa on lisäksi esitetty vertailun vuoksi läpäisykyky polykarbonaattimembraanille D, jonka paksuus oli 5 mikrometriä ja keskimääräinen huokosläpimitta 0,03 8 2 mikrometriä (huokostiheys: 6 x 10 huokosta/cnr) ja myös vertailuna polykarbonaattimembraanille E, jonka paksuus oli 5 mikrometriä ja keskimääräinen huokosläpimitta 0,05 mikrometriä (huokostiheys: 8 2 6 x 10 huokosta/cm ). Viiden membraanin A, B, C, D ja E läpäisykyvyt määritettiin seuraavien aineiden 0,1-%:sille vesiliuoksille: glukoosi (mp 180), PEG 1000 (mp 1000), PEG 2000 (mp 2000), PEG 6000 (mp 2000), PEG 6000 (mp 7500), PEG 20 000 (mp 20 000) härän albumiini (mp 67 000) ja PVK K 90 (mp 360 000) suorittaen ultrasuodatuk-sen paineella 4 kp/cm^ ja mainittujen liuosten keskimääräisen virtausnopeuden ollessa säädetyn arvoon 0,4-1 m/s. Määritys suoritettiin seuraavan kaavan avulla: membraania läpäisevän nesteen pitoisuus x 100/alkuperäisen nesteen pitoisuus.

14 70725

Seuraavassa taulukossa 2 on esitetty entsyymielektrodien materiaalit ja kestokyvyt sekä mitatut orgaaniset materiaalit.

Kaikissa esimerkeissä 2-5 epäsymmetrisellä puoliläpäisevällä membraanilla päällystetyn entsyymielektrodin vasteaika oli vain 1-5 sekuntia pitempi kuin elektrodin, jossa ei käytetty epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania ja lisäksi sitä voitiin käyttää erittäin stabiilina pitkän aikaa.

I I , 70725 I I I in Ο ·Η I -H :(0 o g >1 ί I C tn o >, x tn -H (0 cn rH >, λ: 3 :0

tn (0 <D tn p (D -P

Op « C -P φ ft -PC

Ln -Η οό +» ·Η C -C 0 >1 -H

-Ö Ai E -P 3 (D C :<0 C <0 •h o 3 cd u <d a: c <d -p a: Ai tn

Ai P Ή S -P ·Η -H -P <D ϋ) X -P Cn-H ·η >iC ΦΌ tn φ -pc··· ρ X tn c ·η :(0 ·ρ o to c η ·η y u

O) <D :<0 (0 ro tl) Ji E (S M > o -HgPO

E r-ι (D (0 (OO gid-p-p -H g > r* •H <D -P Ό P O (0 (0 -P Ai :(0 C Λ 0) tn i c-h jq a: ft Φ p φ λ: Φ ro 3 o i H <n -h tn E 3 o tn Φ h -ri h p oo m

O ·Η X <D H H) 3 Ai <D <D (0 CO Ai Ή (N

(n «o a o

E

(0 'T -H (0 'V x

•H Ö -H ·Η PO O

X p P C Dj (0 (0

Ai -P 3 (0 -H Oj C rH C-H

ρ Ai to c to -h -—i -h i—i (1)(1) :(0 P (0 .£ 3 (0 3 (0 d-π a> .q ro ro a: E x s

pq) -PdPtnd E

tnjl CQ)PO-P(0(1) (00) M! <n -H E g p S tn g tn O ·Η -H QJ -H (0 (0 (0 (0 u « tn a > co > co > f h— -----------—σ-------------

I P I

n (0 +) l >1 on -h (0 a: C tn :ro •H Ό <D -H < (1) -H -H O X (0 O a: o p G to HP oj: tn X Ai P 3(0 -H C--H 0> -P Pk! tl) (0 :i0 tn X Ρ -P (0C -H -H H >1 P ft tn ·

G <D Ai :(0 P (0 3(0 E Ή c O tn · U

H dtll (D Λ (0 (0 Ai g >1·Η :(0 p ·η (1) AiO

3 ·Η -H -P g P tn E >ι.·(0 g (D :ro P t'- <0 cn 0) o φ n P m il incnErHG-P>o

^ mi ή ε ε P 6 tn -P O) O (0 -P I

+ -H -H d) -H (0 (0 CPCOOlDOin ___E__E tn a > co > a 3 Φ ftp p (n (n

I III I

• 0) O P -H I (0 ·Η :i0 :(0 tn -P -r-ι Q) E q) 3 :(0 :f0 on c a: tn -h a: >i -p Ai tn ro -p

•H >1 O Φ in :(0 >i (0 cn tn c -P

•h -ö -P p -h (o u -h tnotntn(0(0tno)>i (0 Ai O -Ρ P O <0 -h tno-Ptn>^H>itn:(0*tn

Λ P 0) tl Ä o Ή -H o <l)OC -H >i ·· x X UI

u -P -P X -H C C P ΛΗΦΟΟβϋίΡ p ··

cd Ai cn i :ro tn ro (0 cd -pi o -p cd ac i c>u ε <D >1 C <D Ai (0 3 -P poppp-opin (0 O

-H Ή -HO -POP p tn (DotD-P-H3<Dcr> (ÖOI-~

tnai-H-HC-P-Q Λ <D -pen Ai (0 CD ,C Ό -n- m H I :(0 (p -H -H g E Ή >, (0 φ > ft H H I I

(N :ifl Φ -H O <D 0) O :<0(0(0rH(0O(0>i OO in

O Οι-p M P E a M M Oj-P (DE C πΗ > <N (N

e :(0 I 0) >

(0 I (0 e <D

cn -P (0 -h cn

O CP P -H

•H 110 -P :(0-H -H I

Ό E (D Dj C I -H

O :(0 0) E :(0(0 (0 O

P <Dg g.—i ro (0 encO

-P -P -H >,·Η p -H >1 -P

Ai C E tn -—IE p rH p (D -H S WOE I) (0 <D !

rH -H >1 -H Qj 3 (D -P C > I -P

M « tn e w OjE (0 (Otn ! o -------L- E >1 tn I tn :(0 'Ai O 3 >1-P i 3

P -P >1 -P

I -P -P > (0 3 >iAi -h :i0 tn (0

>ί 0) a: P tn E

tn -h +) cn <d O

-P (D I 3 <D (0 3

e -H -h EH M -p E

w ε 3 16 70725

Suoritettiin kokeita pitkäaikaisen stabiilisuuden suhteen esimerkin 1 mukaiselle entsyymielektrodille ja vertailukokeen 1 entsyy-mielektrodille, jossa ei käytetty epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania ja tulokset on esitetty kuviossa 4.

Kokeet suoritettiin seuraavasti: Entsyymielektrodin näytteitä säilytettiin puskuriliuoksessa, jonka pH-arvo oli 7,7, 23-28°C:ssa. Mittaukset suoritettiin glukoosin kiinteillä pitoisuuksilla mitattavassa liuoksessa, esimerkiksi veressä, 37°C:ssa useiden vuorokausien aikana. Määritys suoritettiin suhteessa^ ΙΤ/ΛΙο, jossa Δ Io on ensimmäisenä päivänä mitattu virranvoimakkuus ja Δ IT on peräkkäisinä päivinä mitattu virranvoimakkuus. Kuviossa 4 esitetyt pisteet tarkoittavat vastaavasti 5-15 mittauksen keskiarvoja. Tämän keksinnön mukaista entsyymielektrodia käytettiin kauemmin kuin 100 vuorokautta korvaamatta epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania ja mitattujen arvojen vaihtelut olivat erittäin vähäiset. Tästä poiketen, entsyy-mielektrodi, jossa ei käytetty epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania, osoitti jyrkän laskun mitatussa virrassa Alt. Viidentenätoista käyttöpäivänä immobilisoidun entsyymin membraani itse rikkoontui eikä mittauksia voitu suorittaa.

Tämän keksinnön mukaista sähkökemiallista mittalaitetta, jonka herkkyys ja vaste ovat merkii tävästi parantuneet, voidaan käyttää orgaanisten aineiden, kuten glukoosin, galaktoosin, sukroosin, virtsahapon, kolesterolin, aminohapon, nukleiinihapon, alkoholin, virtsan, penisilliinin, NADHrn ja vitamiinin, joita sisältyy mitattavaan nesteeseen, esimerkiksi vereen, selektiivistä kvantitatiivista analyysiä varten. Esiteltävä sähkökemiallinen mittalaite on erikoisen sopiva sokeritaudin lääketieteelliseen diagnoosin ja hoitoa varten analysoitaessa veren tai virtsan sisältämän glukoosin pitoisuutta.

Claims

17 70725

1. Sähkökemiallinen mittalaite/ joka on varustettu entsyymi-elektrodilla, joka käsittää elektrodin , jonka vieressä on suodatin-membraani, joka läpäisee määritettävän aineen, mutta ei läpäise ainetta, jonka hiukkaskoko on suurempi kuin määritettävän aineen hiukkaskoko; suodatinmembraanille sovitetun erillisen immobilisoidun entsyymin membraanin ja immobilisoidun entsyymin membraanille asennetun epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin jolloin määritettävässä nesteessä oleva orgaaninen aineosa määritetään käyttäen hyväksi immobilisoidun entsyymin membraanissa olevan entsyymin reaktiota, tunnettu siitä, että epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani muodostuu oleellisesti ohuesta puoliläpäisevästä ulkokerroksesta, jonka paksuus on pienempi kuin 1^um ja joka joutuu kosketukseen määritettävän nesteen kanssa, ja paksusta huokoisesta sisäkerroksesta jolloin epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin paksuus on 10-50^um ja jolloin vähintään 80% aineesta, jonka molekyylipaino on 20 000, ei läpäise epäsymmetristä puoliläpäisevää membraania, ja vähintään 70% aineesta, jonka molekyylipaino on 1000, läpäisee membraanin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani on yhdistelmä-materiaalia, jossa ohuen puoliläpäisevän kerroksen pienet huokoset sijatsevat paksun huokoisen kerroksen karkeiden huokosten vieressä epäsymmetrisen puoliläpäisevän membraanin paksuuden suunnassa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että epäsymmetrinen puoliläpäisevä membraani on muodostettu laminoimalla erillinen paksu huokoinen kerros, jonka huokoset ovat karkeita, erillisen ohuen puoliläpäisevän kerroksen kanssa, jonka huokoset ovat pieniä siten, että jälkimmäinen kerros on suunnattu ulospäin. ie 70725

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että elektrodi on happielektrodi, joka oleellisesti käsittää elektrodisylinterin, elektrodisylinterissä olevan katodin ja anodin, katodin ja anodin välisessä tilassa olevan elektrolyytin ja lähelle katodia sijoitetun suodatinmembraanin, joka muodostaa elektrodin herkistetyn tason.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen laite, tunnettu siitä, että immobilisoidun entsyymin membraani on muodostettu saostamalla fysikaalisesti tai kemiallisesti glukoosioksidaasia alustalle. 70725 19