JP3499767B2 - ヒスタミン計測用微小電極およびヒスタミン計測用センサ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、培養細胞や食品、
脳脊髄液など多くの物質を含む測定対象から微量の試料
を採取し、それは連続的に定量分析するための微少量オ
ンラインバイオセンサにヒスタミン計測用微小電極およ
びヒスタミン計測用センサ関する。

【０００２】

【従来の技術】ヒスタミンは生体アミンの一種で消化液
の分泌やアレルギ反応に関係するのみならず、脳内の伝
達物質として働く分子である。また、このヒスタミン
は、魚介類や食肉中のヒスチジンが微生物と反応するこ
とにより生じるため、食品中の濃度を迅速に測定する方
法が求められている。

【０００３】ヒスタミンの測定法は、食品中のヒスタミ
ンについて北米食品薬品局（ＦＤＡ）より１９８２年に
蛍光法による測定を定めている。

【０００４】この蛍光法による測定は、ヒスタミンとク
ロマトグラフィの誘導体化試薬としても良く使用されて
いる蛍光試薬であるＯ（オルト）−フタルアルデヒドと
の反応により蛍光物質を合成し、その蛍光強度より濃度
をもとめるものである。しかしながら、蛍光法による測
定は妨害物質の影響を受けやすく、前もって妨害物質を
除去する必要があり、また、蛍光試薬が必要であるなど
の問題があり、試薬の反応時に正確な時間と温度の制御
が必要である。

【０００５】一方、液体クロマトグラフィによるヒスタ
ミンの定量も数多く報告されている。例えば、出願者の
内の一人は脳などの生体組織に含まれるヒスタミンとメ
チルヒスタミンの濃度を高速液体クロマトグラフィによ
り感度良く検出している（K.Alam,M.Sasaki,T.Watanabe
and K.Maeyama, Analytical Biochemistry, 229巻，26
-24 頁，1995年）。

【０００６】この液体クロマトグラフィによる方法で
は、カラムによって数種類のアミンを分解した後、ジア
ミン酸化酵素を固定化された酵素カラムによりヒスタミ
ンを酸化して過酸化水素を発生させ、これを蛍光試薬で
あるルミノールとフェリシアン化カリウムを混合して化
学発光を起こし、発光強度から定量を行っている。

【０００７】液体クロマトグラフィ法では極めて低い検
出限界（即ち高感度）が得られるが、分離プロセスのみ
で１０分以上の時間がかかるため、汎用性、迅速性に劣
る。また、細胞からのヒスタミンの放出挙動など、より
短い時間分解能が必要な場合には使用が難しい。

【０００８】一方、近年になって、酵素反応と電気化学
検出器あるいは酸素センサを組み合わせることによりヒ
スタミンを検出する方法およびモノアミン酸化酵素膜を
修飾した酸素電極を用いて溶存酸素の変化によりヒスタ
ミンを定量する方法が提案されている（I.Karube et a
l,Enzyme Microb.Technl., 2 巻,117-120頁, 1980
年）。

【０００９】また、さらには被測定液にヒスタミン酸化
酵素を混合し、被測定液の酸素消費量を測定することに
よりヒスタミンを迅速に定量する方法が提案されている
（寄藤他、特開平5-236952号公報、大橋他、特開平10-
174599号公報）。

【００１０】しかしながら、前者の方法では、大橋らに
より（大橋他、特開平10- 174599号公報）修飾膜の作製
法や反応温度により特性が変動することなど多くの問題
点が指摘されている。一方、後者では被測定液に含まれ
るヒスタミン全量を酵素反応により酸化するため、化学
量論関係が成立し、測定精度が高い。しかしながら、被
測定液に高価な酵素を添加するため費用がかかること、
近年、医学生理学の測定で要求されている細胞レベルへ
のヒスタミンの測定などマイクロリットル、ナノリット
ルレベルの微少量試量の測定では測定系の酸素濃度をコ
ントロールするのが困難であり、ヒスタミン濃度が低い
場合、酸素のわずかな減少量を測定する必要があり、酵
素反応生成物を測定する方式のほうが低濃度での定量性
に優れるなどの問題があった。

【００１１】一方、酵素反応生成物を測定する方法とし
て、ジアミン酸化酵素を修飾した白金電極を利用するア
ンペロメトリックなセンサも報告されている（例えば、
S.Tombelli et al,Anal.Chim. Acta,358(3),pp277-284,
1998年）。この酵素反応生成物を測定する方法では、酸
素濃度が基質濃度より充分大きい場合、酸素反応生成物
である過酸化水素を再現性良く測定できる。特にヒスタ
ミン濃度が低い場合、酸素消費量が少ないため、試料内
の酸素濃度を調整する必要がなく、酸素減少量を測定す
る方法に比べて簡便である。また、センサも容易に微小
化できる。

【００１２】しかしながら、過酸化水素を酸化して測定
を行う白金電極の電位を５００ｍＶ以上（銀／塩化銀電
極に対して）にする必要があり、試料中に共存し電気化
学的に酸化されやすいビタミンＣ、尿酸などの妨害を受
けやすい問題点があった。また、ジアミン酸化酵素は多
くのジアミン類と反応するため、ヒスタミンを選択性良
く測定することができなかった。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記課題に
鑑みてなされたもので、試料中のヒスタミン濃度を測定
するためのセンサであって、簡便で、微少量の試料に適
応でき、かつ低い濃度まで高感度に、選択性良く測定す
ることのできるヒスタミン計測用微小電極およびヒスタ
ミン計測用センサを提供することを目的とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】前述した目的を達成する
ために、本発明のうちで請求項１記載の発明は、ヒスタ
ミン酸化酵素とその基質との反応生成物である過酸化水
素とを電極反応を介して還元する性質を有する物質を含
む膜が形成されている電極であり、前記前記電極はアニ
オン性の高分子からなる最上層が形成されることを要旨
とする。

【００１５】請求項１記載の本発明では、水溶液中のヒ
スタミンを測定するための、ヒスタミン酸化酵素とその
基質との反応生成物である過酸化水素とを電極反応を介
して還元する性質を有する物質が少なくとも含まれる膜
により形成（より具体的には修飾）されている電極であ
り、この電極にはアニオン性の高分子からなる最上層が
形成されていることを特徴とするヒスタミンセンサであ
る。ヒスタミンをヒスタミン酸化酵素により選択的に酸
化し、生成した過酸化水素を電極反応を介することによ
り低い電位で還元して測定することにより課題を解決し
たものである。この方法により、特に低濃度のヒスタミ
ンを測定する場合は試料中の酸素濃度の影響が小さく、
かつ試料に含まれる電気化学的に活性な妨害物質の影響
を抑えた測定が可能となる。

【００１６】前述した目的を達成するために、本発明の
うちで請求項２記載の発明は、ヒスタミン酸化酵素とそ
の基質との反応生成物である過酸化水素とを電極反応を
介して還元する性質を有する物質を含む膜が形成されて
いる電極であり、前記膜は、膜内にＬ−アスコルビン酸
酸化酵素を含むことを要旨とする。

【００１７】また、請求項３記載の発明は、請求項１ま
たは２に記載された前記電極上に形成される膜は、ヒス
タミン酸化酵素を含む上層膜と反応生成物である過酸化
水素を電極反応を介して還元する性質を有する物質を含
む下層膜との２層構造であることを要旨とする。

【００１８】さらに、請求項４記載の発明は、請求項１
または２に記載された前記過酸化水素を電極反応を介し
て還元する性質を有する膜は、ペルオキシターゼ系の酵
素を含むことを要旨とする。

【００１９】また、前述した目的を達成するために、本
発明のうちで請求項５記載の発明は、ヒスタミン酸化酵
素とその基質との反応生成物である過酸化水素とを電極
反応を介して還元する性質を有する物質を含む膜が形成
されているヒスタミン計測用微小電極が、フローセルあ
るいは絶縁性基板を加工した微小流路内に形成され、か
つ参照電極と対向電極が集積されており、前記微小流路
の電極より上流側にＬ−アスコルビン酸酸化酵素を含む
膜が固定化されていることを要旨とする。

【００２０】

【００２１】

【００２２】

【００２３】

【００２４】

【発明の実施の形態】以下、図面を用いて本発明のヒス
タミン計測用微小電極およびヒスタミン計測用センサに
係る一実施の形態について説明する。

【００２５】図１は、本発明に係るヒスタミン計測用微
小電極の基本的な構造図である。本発明に係るヒスタミ
ン計測用センサに用いるヒスタミン計測用微小電極の製
造工程について説明する。

【００２６】まず、ヒスタミン計測用微小電極の材料と
して、図１に示すような薄膜電極１１（図１（ａ）、
（ｂ）を参照）あるいは、棒状の電極１２（図１（ｃ）
を参照）を用いる。薄膜電極の作製は、例えば基板上に
ホトリソグラフィとスパッタ、蒸着、ＣＶＤ（ケミカル
ベーパ デポジション）などの薄膜形成法、必要に応
じてエッチング法を利用することにより容易に行うこが
できる。

【００２７】この電極１１の上には過酸化水素を還元し
電極から電子を受け取る性質を有する膜１３を形成す
る。具体的には例えば導電性高分子に過酸化水素を還元
するペルオキシターゼを複合した膜などが利用可能であ
る。さらに上層には少なくともヒスタミン酸化酵素を含
む膜１４を形成する。一方、上層膜を用いずヒスタミン
酸化酵素を膜１３に複合化することにより一層の修飾膜
１６で、ヒスタミンの酸化と生成物の検出を行うことも
できる。

【００２８】さらに、試料溶液にＬ−アスコルビン酸を
含む場合は膜中に、さらにＬ−アスコルビン酸酸化酵素
を複合するか、あるいは、最上層にアニオン性の高分子
膜１５を修飾し膜の静電的な反発作用により妨害物質の
影響を除くことができる。

【００２９】導電性高分子膜としては、ポリピロールや
その誘導体、ポリアニリンやその誘導体が挙げられる。
これらの膜はペルオキシターゼ、あるいはペルオキシタ
ーゼとヒスタミン酸化酵素とそれぞれの高分子のモノマ
を塩化カリウムなどの電解質と共に溶解させた水溶液に
センサ用の電極を参照電極、対向電極と共に浸した後、
各電極をポテンシオスタットの対応する端子に繋ぎ、セ
ンサ用の電極に電位を印加することにより光を取り込ん
だ膜を形成することができる。あるいはペルオキシター
ゼを含むポリビニルフェロセン膜やオスミウムポリビニ
ルピリジン膜などの酸化還元性の高分子も使用すること
ができる。

【００３０】また２層膜を修飾することによりヒスタミ
ン計測用センサを形成する場合は、ヒスタミン酸化酵素
を牛血清アルブミンとグルタルアルデヒド、コラーゲン
ゲル、光架橋性ポリビニルアルコール等の膜に化学的結
合を形成させるか、あるいは包摂することにより上層膜
を形成する。最上層へ修飾するアニオン性の膜としては
ナフィオン等をあげることができる。

【００３１】図２にヒスタミン計測用センサを用いてヒ
スタミンを測定する際の反応式を示す。ヒスタミンはヒ
スタミン酸化酵素により（式１）に示されるように酸化
され１分子のヒスタミンから１分子の過酸化水素を生成
する。生成した過酸化水素はペルオキシターゼにより還
元されるが、その際にペルオキシターゼ自身は酸化体と
なり、電極はペルオキシターゼの電子移動を仲介する膜
を酸化する（式２）。膜が電極により還元される（式
３）。ヒスタミンの量と、電極より供給される電子の量
は比例するために電極を流れる還元電流値によりヒスタ
ミンを定量することができる。ペルオキシターゼの膜を
介した還元反応は、銀／塩化銀電極に対して０ｍＶ以下
の低い電位（具体的には、−１００ｍＶ〜０ｍＶ、好ま
しくは−５０ｍＶ）を行うことができる。このため、肥
満細胞や脳神経細胞のヒスタミンを計測する際に共存す
る電気化学的に活性なビタミンＣが電極で直接酸化され
ない電位で測定を行うことができ、高い選択性を実現す
ることができる。

【００３２】一方、ペルオキシターゼが過酸化水素を還
元する際に、多量のＬ−アスコルビン酸が存在すると、
酸化状態にあるペルオキシターゼがＬ−アスコルビン酸
により還元される（R.Maidan and A.Heller, Anal. Che
m.,64,2889-2896,1992）。このためヒスタミンが酸化さ
れて生成する過酸化水素の量が一定の場合でもＬ−アス
コルビン酸の膜内濃度が増加すると電極上で観測される
還元電流は減少する。この反応は、センサの最上部にナ
フィオンなどのアニオン性の膜（図１）をコーティング
することにより防ぐことにより防ぐことができる。

【００３３】

【実施例】次に、実施形態１について説明する。

【００３４】上記実施の形態において説明した本願発明
のヒスタミン計測用センサを用いて次のような実験を行
った。

【００３５】直径５０ミクロン以下、ここでは直径７ミ
クロンの炭素繊維を先端を細くしたガラスキャピラリに
入れ先端５０ミクロンの部分をガラスより出るように固
定した。この炭素繊維のガラス管内の末端は、エポキシ
封入前にリード線と接続した。その後、ガラス管内にエ
ポキシ樹脂を流し込み先端部分以外の炭素繊維を封入し
て炭素繊維微小電極を得た。

【００３６】次に、小型容器に４０００ユニット／Ｌの
ヒスタミン酸化酵素、８００００ユニット／Ｌの西洋ワ
サビペルオキシターゼ０．０５Ｍの塩化カリウム、０．
０５Ｍのピロールを含む水溶液を入れ、炭素微小電極を
銀／塩化銀参照電極、白金対向電極と共に溶液に浸漬し
たしポテンシオスタットＢＡＳ１００Ｂ（バイオアナリ
ティカルシステム社製）の作用電極に炭素繊維微小電
極、他の電極をそれぞれ、参照、対向電極端子に接続
し、銀／塩化銀電極に対して１Ｖの電位を２０秒間、印
加してポリピロール／酵素複合膜が修飾された電極を得
た。

【００３７】さらに、この電極をアニオン性高分子であ
るナフィオンを３％含む溶液（アルドリッチ社製）に一
瞬浸漬した後、乾燥し、ヒスタミン計測用センサを作製
した。

【００３８】このヒスタミン計測用センサをｐＨ７のリ
ン酸緩衝生理食塩水に入れ、ポテンシオスタットＬＣ４
Ｃ（バイオアナリティカルシステム社製）に参照、対向
電極と共に接続した。電極の電位を参照電極に対して−
７０ｍＶに設定し、溶液をスターラにて撹拌しながら、
溶液濃度が１μＭになるように１ｍＭのヒスタミン水溶
液を加えると、１００ｐＡに還元電流が観測された。

【００３９】一方、モノアミンであるメチルヒスタミン
を１μＭになるように加えると信号は１０ｐＡ程度であ
った。さらに、ジアミン類であるプトレシンやカダベリ
ンなどのジアミンでは１ｐＡ以下で、大きな選択性が得
られた。ヒスタミン濃度を減らすと０．１μＭ以下でも
信号が観測された。また、ヒスタミンの替りに溶液濃度
が１０μＭになるようにビタミンＣを加えても信号の変
化は殆ど見られなかった。

【００４０】一方、ヒスタミン濃度１μＭの時、溶液中
に酸素バブルを１分間行って、測定を行っても電流値の
増加は３％未満であった。ヒスタミン濃度が１０μＭで
はその影響は１０％に増加した。

【００４１】これらの結果により、本実施形態１のヒス
タミン計測用センサは、酸素センサをベースにした従来
のヒスタミンセンサと異なり、特にヒスタミン濃度が低
いときは酸素濃度を調整する必要がなく測定を行うこと
ができる利点を有していることが確認された。

【００４２】（比較例）比較例としてヒスタミン酸化酵
素の代わりにジアミン酸化酵素を固定化したセンサを用
いて測定を行った。ヒスタミン１μＭに対して８ｐＡの
応答が得られたものの、プトレシンやカダベリンなどの
ジアミンでも反応が起こりヒスタミンと同程度の信号が
得られた。

【００４３】一方、白金のワイヤ上に直接ヒスタミン酸
化酵素を修飾するセンサを作製した。金属の中では白金
は過酸化水素を比較的低い電位で酸化することが知られ
ているが、安定した信号を得るには５００ｍＶ程度の電
位の印加が必要である。センサを銀／塩化銀参照電極と
共に被測定溶液に浸し、５００ｍＶの電位を印加した。
溶液濃度が１μＭになるようにヒスタミンを加えると
９．５ｐＡの酸化電流が観測された。

【００４４】しかしながら、濃度が１０μＭになるよう
にビタミンＣを加えると５０ｐＡ以上の電流値となり、
選択的な測定が困難であった。一方、このセンサの最上
部にナフィオン膜をコーティングして１０μＭになるよ
うにビタミンＣを加えても、２ｐＡ程度の電流が観測さ
れ、Ｌ−アスコルビン酸の電極反応を完全には抑えるこ
とができなかった。

【００４５】次に、実施形態２について説明する。

【００４６】図３は、本発明によるヒスタミン計測用セ
ンサの一実施形態によるセンサの構造を示す。なお図３
において、符号３１は電極基板、３２は微小流路を形成
した基板、３３はヒューズドシリカキャピラリ、３４は
微小流路、３５はカーボン薄膜電極、３６は参照電極、
３７は対向電極、３８はヒスタミン酸化酵素とＬ−アス
コルビン酸酸化酵素を含む膜、３９は西洋ワサビペルオ
キシターゼ（ＨＲＰ）を含むオスミウムポリビニルピリ
ジン誘導体膜、４０は銀薄膜を示す。

【００４７】図３において、キャピラリより連続的に採
取されたヒスタミンはオスミウムポリビニルピリジン誘
導体膜を修飾した作用電極からその上流にかけて修飾さ
れているヒスタミン酸化酵素膜により酸化され、生成し
た過酸化水素はＨＲＰを含むオスミウムポリビニルピリ
ジン膜により還元される。

【００４８】ヒスタミン計測用センサは２枚の微小矩形
流路を有するガラス基板と酵素などにより修飾された薄
膜電極を有する基板を張り合わせて作製している。この
ヒスタミン計測用センサの作製工程を以下に示す。

【００４９】まず、矩形流路を有する基板では、スライ
ドガラスをダイシングソー（ディスコ社製）を用いて角
幅１０ｍｍ，長さ２６ｍｍに切断し、その長さ方法に平
行に中央部に幅４００μｍ、深さ５０μｍの流路を同じ
くダイシングソーにより形成した、次に、流路の両端の
みを端から５ｍｍの長さだけ４００μｍの深さに流路を
掘り下げ、ヒューズドシリカキャピラリ（サイズ、外径
３７５μｍ、内径７５μｍ：ＧＬサイエンス社製）を埋
め込み接着剤により固定する。

【００５０】次に、薄膜電極を有する基板は、まず３イ
ンチの石英ウエハを用い、熱ＣＶＤ法により炭素薄膜
（膜厚：１００ｎｍ）を形成した。ＣＶＤ法は、石英基
板をガラス管内において１０００度Ｃに加熱し、出発物
質としてフタロシアニンを用い、４００度Ｃで昇華、ウ
エハ上で熱分解させる方法を用いた。

【００５１】炭素膜が形成されたウエハ上にシリコン系
ドライエッチング（ＲＩＥ）用フォトレジスト（ＮＴＴ
−ＡＴ社製）をスピナ（ミカサ社製）により４０００回
転で塗布した。

【００５２】その後、電極パタンが描かれたフォトマス
クをウエハに重ね、マスクアライナＰＬＡ−５０１（キ
ャノン社製）を用いて３電極のパタンを露光した。露光
後、アルカリ現像液中で現像を行い、水洗、乾燥してレ
ジストパタンを形成した。現像後のウエハでは電極パタ
ンの部分のみがレジストパタンに覆われているので、こ
のレジスト付き基板を反応性イオンエッチング装置（Ｄ
ＥＭ−４５１，アネルバ製）に入れ、レジストパタンを
マスクにして酸素プラズマによりレジストに覆われてい
ない部分の炭素膜を除去した。

【００５３】その後、アセトン中で、レジストを剥離し
電極がパタンを得た。電極はサンプリング用のキャピラ
リーが接続されている側から作用電極、参照電極、対向
電極として用いた。作用電極上にはＨＲＰを含むオスミ
ウムポリビニルピリジン誘導体膜（バイオアナリティカ
ル システムズ（Bioanalytical systems)社製をキャス
トし膜を形成した。乾燥後、その上にヒスタミン酸化酵
素とＬ−アスコルビン酸酸化酵素（シグマ社製）を牛血
清アルブミンと混合し、グルタルアルデヒドで架橋した
酵素膜を修飾した。また、参照電極用基板上には参照物
質として銀ペーストを薄くコートした。

【００５４】その後、キャピラリを接続した矩形流路が
形成された基板と酵素／高分子修飾薄膜電極が形成され
た基板を両方の流路が向かい合うように押しあて位置併
せ後、光硬化性の接着剤を周りから浸み込ませた。接着
剤が浸みこんだ後、高圧水銀ランプを用いて光を照射
し、基板を接着した。

【００５５】作製したヒスタミン計測用センサを図４に
示すようにシリンジポンプに接続した。またポテンシオ
スタットの端子はそれぞれヒスタミン計測用センサの作
用、参照、対向の各電極パッドの部分に接続した。測定
はシリンジポンプを用いてサンプリング用のキャピラリ
から溶液を吸引しながら、作用電極に−５０ｍＶの電位
を印加して行った。流速４μｌ／ｍｉｎで溶液を吸引
し、試量として１μＭのヒスタミンを吸引すると６ｎＡ
の還元電流が観測された。

【００５６】一方、同一濃度のメチルヒスタミンを測定
すると０．６ｎＡの還元電流が観測された。また、ジア
ミンであるプトレシンやカダベリンを加えると応答は数
百分の１で高い選択性が得られた。

【００５７】図５にヒスタミン濃度と電流の関係を示
す。図のように低い濃度範囲でも濃度と電流値の直線関
係が得られた。また、ヒスタミンの濃度を５０ｎＭまで
減らしても測定を行うことができ、低い検出限界を達成
することができた。また、流速８μ１／ｍｉｎで測定を
行うと、試料導入開始後、約２０秒以内に定常状態に達
し、これまで提案されているヒスタミンの酵素反応に伴
う酸素消費を測定する方法に比較し応答性に優れている
ことが確認された。応答性は流速を上げると、さらに向
上させることができた。

【００５８】ヒスタミン計測用センサをマニピュレータ
に接続し、顕微鏡観察下に培養したラットＲＢＬ−２Ｈ
３セルのコロニ（直径１００μｍ以下）にヒスタミン計
測用センサのサンプリングキャピラリ先端を１μｍまで
近接させた。ＲＢＬ−２Ｈ３セルは、あらかじめ１０時
間まえに培養液中にイムノグロブリンＥ（ＩｇＥ）を加
えて置いたものを使用した。

【００５９】細胞近傍液を流速１μｌ／ｍｉｎで吸引し
ながら、細胞を牛血清アルブミンにジニトリフェノール
を結合させたもの（ＢＳＡ−ＤＮＰ）を加えると、図６
に示すように、還元電流が増加し僅かな量の細胞試料か
らのヒスタミンの放出をリアルタイムに近い形で高感度
に測定することができた。

【００６０】次に、実施形態３について説明する。

【００６１】図７は、本発明に係るヒスタミン計測用セ
ンサの一実施形態によるセンサの構造を示す。図中、７
１はガラス基板、７２は作用電極、７３は酵素などの修
飾膜、７４は銀ペーストをコートした参照電極、７５は
対向電極、７６は絶縁膜である。

【００６２】ガラスウエハ上にフォトレジストを１μｍ
の厚みにスピンコートし、９０度Ｃで９０秒間、熱処理
を行った。フォトマスクを重ねてマスクアライナ（キャ
ノン社製）で露光後、アルカリ水溶液中で現像、水洗し
てレジストパタンを形成した。パタンを形成したウエハ
は、スパッタ蒸着装置（日本シード社製）に入れ、チタ
ン、金薄膜を順に形成した。チタンと金の膜厚がそれぞ
れ５０ｎｍと１０００ｎｍとした。金／チタン薄膜形成
後、レジスト膜をアセトン中で超音波処理して剥離し、
金／チタン薄膜電極を形成した。

【００６３】薄膜電極は３本の電極より構成され、それ
ぞれ作用電極（酵素修飾電極）、参照電極、対向電極と
して用いた。作用電極は２ｍｍ×２ｍｍ角、参照電極は
１ｍｍ×１ｍｍ角、対向電極は２ｍｍ×３ｍｍ角とし、
それ以外の部分はリードを接続する部分を除いて絶縁膜
により覆った。

【００６４】参照電極上には銀ペーストを薄くコート
し、銀を参照物質とした。また作用電極上には実施形態
２と同様な方法によりＨＲＰを含むオスミウムポリビニ
ルピリジン誘導体膜とヒスタミン酸化酵素膜を形成し
た。さらにその上にナフィオン膜をスピンコートした。

【００６５】作製したセンサ基板の各電極端子をポテン
シオスタットＬＣ４Ｃに接続し、リン酸化緩衝溶液を入
れたビーカに浸してスターラで攪拌しながら、溶液濃度
が１μＭになるように、ヒスタミンを加えると１４ｎＡ
の還元電流が観測された。また、上述した実施形態２と
同様にジアミンであるプトレシンやカダベリンに対して
高い選択性が得られた。

【００６６】また、試料溶液を加えた後、３０秒以内に
定常値が得られヒスタミン計測用センサは速い応答性を
示すことが分かった。

【００６７】以上、説明したように本実施形態によるヒ
スタミン計測用センサは、 １．試料より不純物などを分離すること無く、直接ヒス
タミンの測定を行うことができる。

【００６８】２．ヒスタミンが低濃度の場合に酸素濃度
の調整を行わなくても、信号の値は変化しない。

【００６９】３．細胞から放出されるヒスタミンなどの
マイクロリットル以下の微少量試量の測定にも精度良く
使用することができる。

【００７０】４．極めて感度が高く、５０ｎＭの高感度
（０．０１ｍｇ／１０００ｇ）以下の検出限界が得られ
る。

【００７１】５．応答性が極めて速く、ヒスタミン計測
用微小電極およびセンサの微小化が可能となり、これに
より３０秒以下で応答を得ることができる。

【００７２】などの特徴を有しており、従来、ヒスタミ
ン計測用センサの有力な応用分野とされてきた食肉、鮮
魚等の食品検査のみならず、細胞計測など医学や生理学
分野のヒスタミン計測用センサとしても応用の可能性が
ある。

【００７３】

【発明の効果】以上、説明したように本発明のヒスタミ
ン計測用微小電極およびヒスタミン計測用センサによれ
ば、試料中のヒスタミン濃度を測定する際に、簡便で、
微少量の試料に適応でき、かつ低いヒスタミン濃度まで
高感度に、選択性良く測定することかできる等の効果を
奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係るヒスタミン計測用微小電極の一実
施形態の基本的な構造を示す図である。

【図２】本発明に係るセンサにおけるヒスタミンの検出
原理を説明するための図である。

【図３】本発明の実施形態２におけるフロー型のセンサ
の構造を示す図である。

【図４】実施形態２におけるフロー型のセンサを用いた
実験系を示す図である。

【図５】実施形態２におけるセンサを用いてヒスタミン
標準溶液を測定したときのヒスタミン濃度と還元電流値
をプロットした図表である。

【図６】実施形態２におけるセンサを用いて測定した細
胞から放出されるヒスタミンをリアルタイム計測した結
果を示す図表である。

【図７】実施形態３におけるセンサの構造を示す図であ
る。

【符号の説明】

１１ 薄膜電極 １２ 棒状の電極 １３ 還元膜（少なくとも電極反応を介して過酸化水素
を還元する性質を有する膜） １４ ヒスタミン酸化酵素を含む膜 １５ 最上層にアニオン性の高分子膜 １６ 還元膜にヒスタミン酸化酵素を複合した膜 ３１ 電極基板 ３２ 微小流路を形成した基板 ３３ ヒューズドシリカキャピラリ ３４ 微小流路 ３５ カーボン薄膜電極 ３６ 参照電極 ３７ 対向電極 ３８ ヒスタミン酸化酵素とＬ−アスコルビン酸酸化酵
素を含む膜 ３９ 西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）を含むオ
スミウムポリビニルピリジン誘導体膜 ４０ 銀薄膜 ４１ 実施形態２におけるヒスタミンセンサ ４２ マニピュレータ ４３ 顕微鏡 ４４ 培養細胞 ４５ シャーレ ４６ ポテンシオスタット ４７ シリンジポンプ ７１ ガラス基板 ７２ 作用電極 ７３ 酵素などの修飾膜 ７４ 銀ペーストをコートした参照電極 ７５ 対向電極 ７６ 絶縁膜

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 栗田 僚二 東京都武蔵野市御殿山一丁目１番３号 エヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロ ジ株式会社内 (72)発明者 前山 一隆 愛媛県松山市湯の山３丁目１番地７ (72)発明者 谷澤 克行 大阪府豊能郡豊能町希望ケ丘２−30−２ (56)参考文献 特開 平10−38844（ＪＰ，Ａ) 特開 平５−236952（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 27/26 - 27/49 C12Q 1/00 - 3/00 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒスタミン酸化酵素とその基質との反応
   生成物である過酸化水素とを電極反応を介して還元する
   性質を有する物質を含む膜が形成されている電極であ
   り、前記電極にはアニオン性の高分子からなる最上層が
   形成されることを特徴とするヒスタミン計測用微小電
   極。
2. 【請求項２】 ヒスタミン酸化酵素とその基質との反応
   生成物である過酸化水素とを電極反応を介して還元する
   性質を有する物質を含む膜が形成されている電極であ
   り、前記膜は、膜内にＬ−アスコルビン酸酸化酵素を含
   むことを特徴とするヒスタミン計測用微小電極。
3. 【請求項３】 前記電極上に形成される膜は、ヒスタミ
   ン酸化酵素を含む上層膜と反応生成物である過酸化水素
   を電極反応を介して還元する性質を有する物質を含む下
   層膜との２層構造であることを特徴とする請求項１また
   は２記載のヒスタミン計測用微小電極。
4. 【請求項４】 前記過酸化水素を電極反応を介して還元
   する性質を有する膜は、ペルオキシターゼ系の酵素を含
   むことを特徴とする請求項１または２記載のヒスタミン
   計測用微小電極。
5. 【請求項５】 ヒスタミン酸化酵素とその基質との反応
   生成物である過酸化水素とを電極反応を介して還元する
   性質を有する物質を含む膜が形成されているヒスタミン
   計測用微小電極が、フローセルあるいは絶縁性基板を加
   工した微小流路内に形成され、かつ参照電極と対向電極
   が集積されており、前記微小流路の電極より上流側にＬ
   −アスコルビン酸酸化酵素を含む膜が固定化されている
   ことを特徴とするヒスタミン計測用センサ。