CN106501341B - 基于纳米孔膜-磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器的制备方法 - Google Patents

基于纳米孔膜-磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于纳米孔膜/磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器的制备方法。本发明利用氧化铝纳米多孔膜为核心传感芯片，使用3‑(2,3‑环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPMS)处理氧化铝纳米多孔膜，直接固定组胺抗体，再用质量浓度为1％牛血清蛋白的PBS缓冲液封闭。表面羧基化Fe3O4磁性纳米颗粒通过EDC/NHS固定抗体，富集样品中组胺到经生物功能化处理的氧化铝纳米多孔膜内，阻塞纳米孔，利用电化学阻抗分析方法对其进行检测。本发明可实现组胺的快速检测，传感器检测灵敏度高，检测下限低，特异性强。

Description

基于纳米孔膜-磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器的制备 方法
(一)技术领域
本发明涉及一种基于纳米孔膜-磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器的制备方法。
(二)背景技术
新鲜的海产品，如秋刀鱼、鲭鱼、金枪鱼等含有丰富的组氨酸。而存放时间过长的海产品容易腐败变质滋生细菌，使组氨酸去羰基形成组胺等生物胺。人体食用变质的海鲜，摄入过量的组胺，可能使人神经系统和心血管系统损伤。因此，组胺毒性是影响食品安全和公共健康的一个重要问题。
防止组胺中毒的主要挑战在于很难从海产品表面判断组胺积累。一旦鱼肉中产生组胺，组胺有很好的热稳定性，通过加热和延长加热时间很难去除。因此，需要发展各种检测技术对组胺进行检测。传统的组胺检测方法有气相色谱分析，反相高效液相色谱，毛细管电泳分析，铜螯合试验等。这些方法操作复杂、步骤繁多、耗时，并不适合简单、快速的组胺检测。
近年来，生物传感器趋向于微型化、集成化、智能化方向发展，在快速检测领域有广阔的应用前景。电化学传感器由于其灵敏度高，无标记，分析时间短等优势受到人们的重视。现已发展的方法包括以合成的分子印迹聚合物(Molecularly imprinted polymer,MIP)作为受体，选择最佳pH 值，与组胺结合，利用阻抗法检测肠流体中的组胺，参照文献1：Peeters, M.；Troost,F.J.；Mingels,R.H.G.；Welsch,T.；van Grinsven,B.；Vranken, T.；Ingebrandt,S.；Thoelen,R.；Cleij,T.J.；Wagner，P.Impedimetric Detection ofHistamine in Bowel Fluids Using Synthetic Receptors with pH-Optimized BindingCharacteristics.Anal.Chem.2013，85，1475–1483. 即皮特斯·马洛斯等.利用合成受体的最优pH结合特性组抗法检测肠流体中的组胺.Analytical Chemistry 2013，85，1475–1483。该方法具有较好的特异性、选择性、成本低，但传感性能有pH依赖特性。另一种传感检测方法是基于新型分子印迹溶胶凝胶聚合物石英晶体微天平传感器用于快速检测食品中组胺，操作简单、易于小型化和定量精确等优点，但传感特性易受电极影响，参照文献2：Dai,J.；Zhang,Y.；Pan,M.；Kong, L.；Wang,S.，Development and Application of QuartzCrystal Microbalance Sensor based on Novel Molecularly Imprinted Sol-GelPolymer for Rapid Detection of Histamine in Foods.J.Agric.Food.Chem.2014，62，5269–5274.即戴杰等.基于新型分子印迹溶胶-凝胶多聚物的石英晶体微天平传感器用于食品中组胺快速检测的开发和应用研究.Journal of Agricultural and Food Chemistry2014，62，5269–5274。
氧化铝纳米多孔膜蜂窝状结构使得氧化铝纳米多孔膜比表面积大且容易修饰。基于氧化铝纳米多孔膜的电化学阻抗传感器，主要在膜上固定检测物所对应的抗体，捕获目标分子。利用目标分子在纳米孔内的阻塞效应，阻碍溶液中离子通过多孔膜，该现象可通过电化学阻抗分析方法检测。基于氧化铝纳米多孔膜的电化学阻抗传感器已被发展用于核酸和癌症标记物等生物分子检测，参照文献3：Wu,S.M.；Ye,W.W.；Yang,M.； Taghipoor,M.；Meissner,R.；Brugger,J.；Renaud，P.Impedance sensing of DNA immobilization andhybridization by microfabricated alumina nanopore membranes.Sens.Actuators BChem.2015，216，105–112.即吴松梅等.利用微加工的氧化铝纳米孔膜的阻抗法检测DNA固定和杂交， Sensors and Actuators B:Chemical 2015,216，105–112；文献4：De laA.；Chunglok,W.；Surareungchai,W.；A. Nanochannels fordiagnostic of thrombin-related diseases in human blood.Biosens.Bioelectron.2013，40，24–31。但由于组胺分子较小，在孔内的阻塞效果不明显。
(三)发明内容
本发明目的是针对现有技术的不足，提供一种基于纳米孔膜-磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器的制备方法。
本发明采用的技术方案是：
一种基于纳米孔膜-磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)制备以氧化铝纳米孔膜为核心传感芯片的电化学组胺传感器：将氧化铝纳米多孔膜在沸腾双氧水中处理30-40分钟后，先用去离子水清洗烘干，再用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行硅烷化处理，最后将硅烷化处理后的氧化铝纳米多孔膜用环氧树脂胶封在PDMS容器的上下腔之间，制得以纳米孔膜为核心芯片的电化学组胺传感器；
(2)固定组胺抗体：往步骤(1)电化学组胺传感器中加入组胺单克隆抗体溶液，0～4℃下静置3～6小时后(使得单克隆组胺抗体与经3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的多孔膜上的功能基团环氧基进行反应后固定在多孔膜上)，往芯片上腔以恒定的速率(5μL/min)通入PBS缓冲液，清洗1～3次(清洗未被固定的单克隆组胺抗体)，PBS缓冲液以恒定的速率(5μL/min)缓慢抽出，再用含牛血清蛋白的PBS缓冲液封闭纳米孔膜，所得传感器于4℃保存备用；
(3)表面羧基化Fe3O4磁性纳米颗粒固定组胺抗体：表面羧基化Fe3O4磁性纳米颗粒(分散于PBS缓冲液中)，先用EDC/NHS活化羧基，再将磁性纳米颗粒分散到PBS缓冲液中，加入组胺抗体，充分混合，0～4℃静置6～10小时后，在磁场作用下分离得到组胺抗体修饰的磁性纳米颗粒，重新分散到PBS缓冲液中，4℃下保存备用；
(4)利用磁性纳米颗粒富集组胺到纳米多孔膜上：将步骤(3)得到的Fe3O4磁性纳米颗粒加入到待测试样品(如鱼肉粗提取液)中， 20-40分钟后，在磁场作用下分离出磁性纳米颗粒并加入到步骤 (2)得到的传感器芯片上，静置15～30分钟后，加入PBS缓冲液洗去纳米孔膜表面非特异性结合的磁性纳米颗粒，得到基于纳米孔膜-磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器。
具体的，步骤(1)中硅烷化处理方法如下：将双氧水处理并清洗烘干后的氧化铝纳米多孔膜浸没到3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，其中3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的质量分数为1～5％， 50～70℃下静置20～24小时后取出，用甲苯清洗三次后置于加热板上 60～80℃下固化1～2小时。
步骤(1)中PDMS(聚二甲基硅氧烷)容器可按如下方法制备：将道康宁DC184灌封胶的基本组分与固化剂按10:1质量比完全混合，制成上下腔连通且上下腔直径不同的PDMS容器，其中上腔直径为13mm，下腔直径为10mm。
步骤(2)中组胺单克隆抗体溶液浓度为7μg/mL，溶剂为pH 7.4、 0.1M的PBS缓冲液。
步骤(3)中EDC/NHS摩尔比为2：1。
本发明利用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的氧化铝纳米多孔膜表面的环氧基团共价结合组胺抗体，将抗体固定到氧化铝纳米多孔膜表面。表面羧基化Fe3O4磁性纳米颗粒利用EDC/NHS活化，固定组胺抗体，从样品中富集组胺到氧化铝纳米多孔膜上。与传统的组胺检测相比，操作过程简单，易于测量。本发明所述的电化学传感器灵敏度下限为3 nM。通过固定不同类型的抗体，可用于不同生物胺的检测。
本发明有益的效果主要体现在：本发明将组胺捕获抗体固定在氧化铝纳米多孔膜上，用于组胺的检测；表面羧基化的磁性纳米颗粒固定抗体，用于组胺富集以及阻抗信号放大；实验表明该方法构建的电化学阻抗传感器可用于快速、简便的组胺检测，检测灵敏度高，检测下限低且特异性强。
(四)附图说明
图1为本发明电化学阻抗传感器腔体图；
图2为本发明阻抗传感器的核心芯片纳米多孔膜修饰图；
图3为本发明磁性纳米颗粒表面修饰过程图
图4为本发明电化学阻抗传感器制备过程中阻抗固定前后的电化学阻抗谱曲线；
图5为本发明电化学阻抗传感器检测不同浓度组胺的电化学阻抗谱曲线；
图6为本发明电化学阻抗传感器阻抗与组胺浓度的对数之间的线性关系；
图7为电化学阻抗传感器与浓度为100μM的色胺反应前后的电化学阻抗谱曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
1、电化学阻抗传感器腔体制备。腔体主要利用PDMS材料制备。道康宁DC184灌封胶的组分A(主要成分为双键封端的聚甲基硅氧烷加铂系催化剂)和组分B(主要成分为双键封端的聚甲基硅氧烷和多官能度的含Si-H的聚甲基硅氧烷)按10:1重量比完全混合，倒入模具中120℃下固化2小时，制作上下腔联通的PDMS容器。氧化铝纳米多孔膜(Whatman, Inc.,UK.)在沸腾双氧水中处理30分钟后，用去离子水清洗烘干，再浸没到3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(Sigma Aldrich)和甲苯(Sigma Aldrich)的混合溶液中，其中3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的质量分数为2％，60℃下静置20小时进行硅烷化处理，然后取出氧化铝纳米多孔膜，用甲苯清洗三次后置于加热板上60℃下固化2小时。用环氧树脂胶将硅烷化后的氧化铝纳米多孔膜封在PDMS腔的上下腔之间，制得以纳米孔膜为核心芯片的阻抗传感器。如图1所示，氧化铝纳米多孔膜1 将PDMS腔2分隔成上腔3和下腔4。其中上腔直径为13mm，高为10mm, 下腔直径为10mm，高为10mm。工作电极5和参考电极6为铂电极，直径0.5mm分别置于PDMS的上腔和下腔。
2、电化学阻抗传感器制备过程如图2所示：阻抗传感器中加入100μL 的浓度为7μg/mL的组胺单克隆抗体(Sigma Aldrich)溶液，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH 7.4，0.1M指的是PBS缓冲液中磷酸盐的摩尔浓度)，4℃下静置4小时，使得单克隆组胺抗体与经3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷修饰的多孔膜上功能基团环氧基进行反应后固定在多孔膜上。从芯片上腔以恒定的速率(5μL/min)缓慢通入PBS缓冲液，用于清洗未被固定的单克隆组胺抗体，PBS缓冲液以恒定的速率(5μL/min)缓慢抽出，重复上述步骤三次。再用质量浓度为1％牛血清蛋白(Sigma Aldrich)的 PBS缓冲液封闭纳米孔膜，将准备好的传感器放在4℃条件下备用。
3、磁性纳米颗粒表面修饰过程如图3所示：表面羧基化Fe3O4磁性纳米颗粒(XFNANO，南京)在磁场作用下分离后，加PBS缓冲液清洗，重复该步骤三次。取上述准备好的Fe3O4磁性纳米颗粒(600μL，0.4mg/mL)，加入EDC(0.26M，3μL)(Sigma Aldrich)和NHS(0.26M，1.5μL)(Sigma Aldrich)充分混合。静置半小时后，加入组胺抗体(12μL，0.73mg/mL)， 4℃静置8小时后，在磁场作用下分离出组胺抗体修饰的磁性纳米颗粒，分散到PBS缓冲液中，并在4℃下保存备用。
在氧化铝纳米多孔膜表面固定抗体前后，都需要对每个传感器芯片进行电化学阻抗谱扫描用于对纳米孔膜芯片进行电化学表征和对处理过程进行验证。传感器上下腔内注入PBS缓冲液作为电解液，以电化学工作站为仪器平台对氧化铝纳米多孔膜进行电化学阻抗谱扫描。具体测试参数为：交流电压幅度为50mV，扫频范围为1Hz-1kHz。抗体固定前后得到 1Hz-1kHz范围的阻抗谱曲线如图4所示。从图中可以看出，氧化铝纳米多孔膜表面固定抗体后，阻抗显著增加，是因为抗体在很大程度上阻碍了离子通过纳米孔，电流减少，导致阻抗增加。因此，氧化铝纳米多孔膜表面已成功地固定了抗体。
用本发明的方法制备的传感器可用于组胺检测：电化学阻抗传感器准备好之后，抗体修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒(100μL)加入到含有不同浓度的组胺样品中。30分钟后，在磁场作用下分离出磁性纳米颗粒并加入到步骤2经生物功能化的传感器芯片上，静置30分钟后，加入PBS缓冲液洗去非特异性结合在纳米孔膜上的纳米颗粒，获得基于氧化铝纳米多孔膜结合磁性纳米颗粒的电化学阻抗传感器。
另外用组胺抗体修饰的Fe3O4磁性纳米颗粒富集色胺作为阴性对照，重复以上步骤。
以两根铂电极作为工作电极和参考电极，PDMS上下腔内分别注满 PBS缓冲液作为电解液，以电化学工作站作为仪器平台对多孔膜进行电化学阻抗谱扫描。具体测试参数为：交流电压幅度为50mV，扫频范围为 1Hz-1kHz。得到电化学阻抗谱曲线。不同组胺浓度的阻抗谱曲线如图5 所示。由图可见，随着组胺浓度的增加，阻抗增加。
以阻抗谱的幅值(Y)为纵坐标，组胺浓度为横坐标，制作线性曲线，如图6所示。线性关系公式为Y＝2.581ln[C]+20.222，线性度为0.96。
同时，阴性对照组处理前后的阻抗曲线没有明显的变化，如图7所示，说明本发明电化学阻抗传感器特异性强。

Claims (5)

1.一种基于纳米孔膜-磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)制备以氧化铝纳米孔膜为核心传感芯片的电化学组胺传感器：将氧化铝纳米多孔膜在沸腾双氧水中处理30-40分钟后，先用去离子水清洗烘干，再用3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷进行硅烷化处理，最后用环氧树脂胶封在PDMS容器的上下腔之间，制得以纳米孔膜为核心芯片的电化学组胺传感器；
(2)固定组胺抗体：往步骤(1)电化学组胺传感器中加入组胺单克隆抗体溶液，0～4℃下静置3～6小时后，往芯片上腔通入PBS缓冲液，清洗1～3次，再用含牛血清蛋白的PBS缓冲液封闭纳米孔膜，所得传感器于4℃保存备用；
(3)表面羧基化Fe3O4磁性纳米颗粒固定组胺抗体：表面羧基化Fe3O4磁性纳米颗粒，先用EDC/NHS活化羧基，再将磁性纳米颗粒分散到PBS缓冲液中，加入组胺抗体，充分混合，0～4℃静置6～10小时后，在磁场作用下分离得到组胺抗体修饰的磁性纳米颗粒，分散到PBS缓冲液中，4℃下保存备用；
(4)利用磁性纳米颗粒富集组胺到纳米多孔膜上：将步骤(3)得到的Fe3O4磁性纳米颗粒加入到待测试样品中，20-40分钟后，在磁场作用下分离出磁性纳米颗粒并加入到步骤(2)得到的传感器芯片上，静置15～30分钟后，加入PBS缓冲液洗去纳米孔膜表面非特异性结合的磁性纳米颗粒，得到基于纳米孔膜-磁性纳米颗粒的电化学组胺传感器。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中硅烷化处理方法如下：将双氧水处理并清洗烘干后的氧化铝纳米多孔膜浸没到3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，其中3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的质量分数为1～5％，50～70℃下静置20～24小时后取出，用甲苯清洗三次后置于加热板上60～80℃下固化1～2小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中PDMS容器按如下方法制备：将道康宁DC184灌封胶的基本组分与固化剂按10:1质量比完全混合，制成上下腔连通且上下腔直径不同的PDMS容器，其中上腔直径为13mm，下腔直径为10mm。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中组胺单克隆抗体溶液浓度为7μg/mL，溶剂为pH 7.4、0.1M的PBS缓冲液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中EDC/NHS摩尔比为2：1。
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