JP3480884B2 - オンラインバイオセンサー - Google Patents
オンラインバイオセンサーInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は培養細胞や脳内の微
小組織など微小領域での生体関連物質の定量測定を目的
としたバイオセンサーに関する。
小組織など微小領域での生体関連物質の定量測定を目的
としたバイオセンサーに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、神経科学や分子生物学などの発展
により、生体内の微小領域に含まれる生理活性物質をリ
アルタイムで計測しようという試みが数多くなされてい
る。その中で電気化学的な分析法は、（１）微少量の計
測に適している、（２）感度が比較的高い、（３）選択
的な膜や酵素などで電極を修飾することにより高選択的
な測定が可能である、（４）簡便で低価格のセンサーを
作製することができる、などの特徴を有している。神経
伝達物質の中でドーパミン、ノルエピネフリンなどのカ
テコールアミンやセロトニンなどのインドールアミン、
及びその代謝物は電気化学的に直接酸化することができ
る〔例えば、Ｔ．Ｊ．シュレーダー（T.J.Schroeder)、
Ｊ．Ａ．ヤンコウスキー（J.A.Jankowski)、Ｋ．Ｔ．カ
ワゴー（K.T.Kawagoe)、Ｒ．Ｍ．ワイトマン（R.M.Wigh
tman) 、Ｃ．レフロウ（C.Lefrou)、及びＣ．アマトア
（C.Amatore)、アナリチカル ケミストリー（Analytic
al Chemistry) 、第６４巻、第３０７７〜３０８３頁
（１９９２）〕。一方、アセチルコリン、コリンやグル
タミン酸などの伝達物質は電極上で直接電気化学反応せ
ず、光に対する感度も低い。しかしながら、コリンやグ
ルタミン酸に対しては酸化酵素が市販されており、酸素
を含む溶液中で酵素反応によって酸化され、電気化学的
に容易に酸化あるいは還元することができる過酸化水素
を生じるために白金電極やメディエータで修飾した電極
を利用して検出されている〔例えば、Ｙ．フー（Y.Hu)
、Ｋ．Ｍ．ミッチェル（K.M.Mitchell) 、Ｆ．Ｎ．ア
ルバハダイリイ（F.N.Albahadily) 、Ｅ．Ｋ．ミケリス
（E.K.Michelis) 、及びＧ．Ｓ．ウイルソン（G.S.Wils
on) 、ブレイン リサーチ（Brain Research) 、第６５
９巻、第１１７〜１２５頁（１９９４）〕。また、アセ
チルコリンについては、アセチルコリンエステラーゼ
（酵素）を用いて一度コリンに変換したのち、コリン酸
化酵素（酸化酵素）により過酸化水素を発生させ、それ
を電気化学的に測定してアセチルコリンの量を定量する
ことができる。
により、生体内の微小領域に含まれる生理活性物質をリ
アルタイムで計測しようという試みが数多くなされてい
る。その中で電気化学的な分析法は、（１）微少量の計
測に適している、（２）感度が比較的高い、（３）選択
的な膜や酵素などで電極を修飾することにより高選択的
な測定が可能である、（４）簡便で低価格のセンサーを
作製することができる、などの特徴を有している。神経
伝達物質の中でドーパミン、ノルエピネフリンなどのカ
テコールアミンやセロトニンなどのインドールアミン、
及びその代謝物は電気化学的に直接酸化することができ
る〔例えば、Ｔ．Ｊ．シュレーダー（T.J.Schroeder)、
Ｊ．Ａ．ヤンコウスキー（J.A.Jankowski)、Ｋ．Ｔ．カ
ワゴー（K.T.Kawagoe)、Ｒ．Ｍ．ワイトマン（R.M.Wigh
tman) 、Ｃ．レフロウ（C.Lefrou)、及びＣ．アマトア
（C.Amatore)、アナリチカル ケミストリー（Analytic
al Chemistry) 、第６４巻、第３０７７〜３０８３頁
（１９９２）〕。一方、アセチルコリン、コリンやグル
タミン酸などの伝達物質は電極上で直接電気化学反応せ
ず、光に対する感度も低い。しかしながら、コリンやグ
ルタミン酸に対しては酸化酵素が市販されており、酸素
を含む溶液中で酵素反応によって酸化され、電気化学的
に容易に酸化あるいは還元することができる過酸化水素
を生じるために白金電極やメディエータで修飾した電極
を利用して検出されている〔例えば、Ｙ．フー（Y.Hu)
、Ｋ．Ｍ．ミッチェル（K.M.Mitchell) 、Ｆ．Ｎ．ア
ルバハダイリイ（F.N.Albahadily) 、Ｅ．Ｋ．ミケリス
（E.K.Michelis) 、及びＧ．Ｓ．ウイルソン（G.S.Wils
on) 、ブレイン リサーチ（Brain Research) 、第６５
９巻、第１１７〜１２５頁（１９９４）〕。また、アセ
チルコリンについては、アセチルコリンエステラーゼ
（酵素）を用いて一度コリンに変換したのち、コリン酸
化酵素（酸化酵素）により過酸化水素を発生させ、それ
を電気化学的に測定してアセチルコリンの量を定量する
ことができる。
【０００３】一方、グリシン、アスパラギン酸などのア
ミノ酸、γ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡと略記する）
などは選択的に反応する酸化酵素や、アセチルコリンの
場合のように、酸化酵素の反応が起る分子へ変換するた
めの良い酵素がないため、これらの分子を連続的に測定
するのは困難である。現状では、アミノ酸やＧＡＢＡを
含む溶液にＯＰＡなどの誘導体化試薬を加えて一定時間
反応させ、その後高速液体クロマトグラフィやキャピラ
リ電気泳動装置などで分離した後、電気化学的、あるい
は蛍光法により検出が行われている。近年、動物の脳、
神経系における神経伝達物質の検出にはリアルタイムで
微少量の試料を高感度に分析する技術が要求されてい
る。培養神経細胞の計測においては、刺激に対応した神
経伝達物質の放出が細胞外の伝達物質濃度を微小電極を
用いることによりカテコールアミンやセロトニンについ
ては単一細胞レベルでリアルタイムに計測できるように
なってきている。また、生体内〔イン ビボ（inviv
o)〕計測においても動物の行動と脳内神経伝達物質濃度
の関係を図２に示すようにマイクロダイヤリシスなどの
インビボプローブで採取した溶液をオンラインでフロー
センサーに送り込むことにより、リアルタイム計測を行
うことができる〔例えば、Ｗ．Ｊ．アルベリイ（W.J.Al
bery) 、Ｍ．Ｇ．ボウテル（M.G.Boutelle) 、Ｐ．Ｔ．
ガレイ（P.T.Galley) 、ジャーナル オブ ケミカル
ソサィエティ、ケミカル コミュニケーションズ（J.Ch
em.Soc.,Chem.Commun.) 、１９９２年、第９００頁〕。
なお、図２は、従来のマイクロダイヤリシスプローブと
オンラインフローセンサーを組合せた脳内神経伝達物質
の測定の模式図である。更に、コリン酸化酵素やグルタ
ミン酸酸化酵素を修飾した電極を脳内組織に直接挿入す
ることにより伝達物質濃度のリアルタイム計測が行われ
ている〔例えば、Ｍ．Ｇ．ガルギーロ（M.G.Garguilo)
及びＡ．Ｃ．ミカエル（A.C.Michael)、ジャーナル オ
ブ アメリカン ケミカル ソサィエティ（J.Am.Chem.
Soc.) 、第１１５巻、第１２２１８頁（１９９３）〕。
これらの方法では、液体クロマトグラフィに比べ、より
短い時間範囲での脳内伝達物質濃度を計測することがで
きることに加え、誘導体化などの処理をする必要がない
ために微少量の試料の分析に適するなどの特徴を有す
る。
ミノ酸、γ−アミノ酪酸（以下、ＧＡＢＡと略記する）
などは選択的に反応する酸化酵素や、アセチルコリンの
場合のように、酸化酵素の反応が起る分子へ変換するた
めの良い酵素がないため、これらの分子を連続的に測定
するのは困難である。現状では、アミノ酸やＧＡＢＡを
含む溶液にＯＰＡなどの誘導体化試薬を加えて一定時間
反応させ、その後高速液体クロマトグラフィやキャピラ
リ電気泳動装置などで分離した後、電気化学的、あるい
は蛍光法により検出が行われている。近年、動物の脳、
神経系における神経伝達物質の検出にはリアルタイムで
微少量の試料を高感度に分析する技術が要求されてい
る。培養神経細胞の計測においては、刺激に対応した神
経伝達物質の放出が細胞外の伝達物質濃度を微小電極を
用いることによりカテコールアミンやセロトニンについ
ては単一細胞レベルでリアルタイムに計測できるように
なってきている。また、生体内〔イン ビボ（inviv
o)〕計測においても動物の行動と脳内神経伝達物質濃度
の関係を図２に示すようにマイクロダイヤリシスなどの
インビボプローブで採取した溶液をオンラインでフロー
センサーに送り込むことにより、リアルタイム計測を行
うことができる〔例えば、Ｗ．Ｊ．アルベリイ（W.J.Al
bery) 、Ｍ．Ｇ．ボウテル（M.G.Boutelle) 、Ｐ．Ｔ．
ガレイ（P.T.Galley) 、ジャーナル オブ ケミカル
ソサィエティ、ケミカル コミュニケーションズ（J.Ch
em.Soc.,Chem.Commun.) 、１９９２年、第９００頁〕。
なお、図２は、従来のマイクロダイヤリシスプローブと
オンラインフローセンサーを組合せた脳内神経伝達物質
の測定の模式図である。更に、コリン酸化酵素やグルタ
ミン酸酸化酵素を修飾した電極を脳内組織に直接挿入す
ることにより伝達物質濃度のリアルタイム計測が行われ
ている〔例えば、Ｍ．Ｇ．ガルギーロ（M.G.Garguilo)
及びＡ．Ｃ．ミカエル（A.C.Michael)、ジャーナル オ
ブ アメリカン ケミカル ソサィエティ（J.Am.Chem.
Soc.) 、第１１５巻、第１２２１８頁（１９９３）〕。
これらの方法では、液体クロマトグラフィに比べ、より
短い時間範囲での脳内伝達物質濃度を計測することがで
きることに加え、誘導体化などの処理をする必要がない
ために微少量の試料の分析に適するなどの特徴を有す
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】一方、神経伝達物質の
中でＧＡＢＡは中枢神経における代表的な抑制性の伝達
物質として数多く研究がなされているが、ＧＡＢＡを直
接酸化検出することができる酵素がないために、ほとん
どの場合、誘導体化反応と液体クロマトグラフィを組合
せて測定を行っているのが現状である。このため、細胞
外に放出されるＧＡＢＡの濃度をリアルタイムに検出す
ることができない。一方、ＧＡＢＡと反応する酵素とし
てγ−アミノブチレート−ケトグルタレートアミノトラ
ンスフェラーゼ（以下、ＧＡＢＡ−Ｔと略記する）とス
クシン セミアルデヒド ジヒドロゲナーゼ（以下、Ｓ
ＳＤＨと略記する）の２種類の酵素の混合物であるギャ
バーゼ（Gabase) が市販されており、下記式（化１）
（化２）で示すような反応を起す。
中でＧＡＢＡは中枢神経における代表的な抑制性の伝達
物質として数多く研究がなされているが、ＧＡＢＡを直
接酸化検出することができる酵素がないために、ほとん
どの場合、誘導体化反応と液体クロマトグラフィを組合
せて測定を行っているのが現状である。このため、細胞
外に放出されるＧＡＢＡの濃度をリアルタイムに検出す
ることができない。一方、ＧＡＢＡと反応する酵素とし
てγ−アミノブチレート−ケトグルタレートアミノトラ
ンスフェラーゼ（以下、ＧＡＢＡ−Ｔと略記する）とス
クシン セミアルデヒド ジヒドロゲナーゼ（以下、Ｓ
ＳＤＨと略記する）の２種類の酵素の混合物であるギャ
バーゼ（Gabase) が市販されており、下記式（化１）
（化２）で示すような反応を起す。
【０００５】
【化１】ＧＡＢＡ＋α−ケトグルタレート → （ＧＡ
ＢＡ−Ｔ／ＳＳＤＨ） → スクシン セミアルデヒド
（ＳＳＡ）＋グルタミン酸（Ｇｌｕ）
ＢＡ−Ｔ／ＳＳＤＨ） → スクシン セミアルデヒド
（ＳＳＡ）＋グルタミン酸（Ｇｌｕ）
【０００６】
【化２】ＳＳＡ＋ＮＡＤＰ＋Ｈ2 Ｏ → スクシネート
＋ＮＡＤＰＨ
＋ＮＡＤＰＨ
【０００７】上記式（化２）中、ＮＡＤＰはニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨはジヒ
ドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の略
号である。
ミドアデニンジヌクレオチドリン酸、ＮＡＤＰＨはジヒ
ドロニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の略
号である。
【０００８】この一連の反応において、生成物を酵素反
応に伴う吸光度変換により測定している〔Ｍ．Ｌ．セシ
（M.L.Sethi)、ジャーナル オブ ファーマシュウチカ
ルアンド バイオメジカル アナリシス（J.Pharmaceut
ical & Biomedical Analysis) 、第１１巻、第６１３〜
６１７頁（１９９３）〕。しかしながら、光吸収法は感
度も劣り、測定には３０分以上の時間が必要である。更
に、ＧＡＢＡレセプターを有する培養神経細胞をそのま
まセンサーに用いて、ＧＡＢＡ濃度の変化を細胞の電位
変化として測定することにより、リアルタイム測定が可
能であるが、この方法では細胞の寿命によりセンサーの
寿命が決まってしまうこと、センサーの作製に細胞培養
技術などが必要で作製が難しい、定量性に劣るなどの問
題点があった。本発明の目的は、このような問題点を解
決し、ＧＡＢＡのリアルタイム測定を実現するためのＧ
ＡＢＡ検出用オンラインバイオセンサーを提供すること
にある。
応に伴う吸光度変換により測定している〔Ｍ．Ｌ．セシ
（M.L.Sethi)、ジャーナル オブ ファーマシュウチカ
ルアンド バイオメジカル アナリシス（J.Pharmaceut
ical & Biomedical Analysis) 、第１１巻、第６１３〜
６１７頁（１９９３）〕。しかしながら、光吸収法は感
度も劣り、測定には３０分以上の時間が必要である。更
に、ＧＡＢＡレセプターを有する培養神経細胞をそのま
まセンサーに用いて、ＧＡＢＡ濃度の変化を細胞の電位
変化として測定することにより、リアルタイム測定が可
能であるが、この方法では細胞の寿命によりセンサーの
寿命が決まってしまうこと、センサーの作製に細胞培養
技術などが必要で作製が難しい、定量性に劣るなどの問
題点があった。本発明の目的は、このような問題点を解
決し、ＧＡＢＡのリアルタイム測定を実現するためのＧ
ＡＢＡ検出用オンラインバイオセンサーを提供すること
にある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はオンラインバイオセンサーに関する
発明であって、試料をサンプリングする設備、その下流
にグルタミン酸酸化酵素、及び過酸化水素を分解する酵
素を固定化したプレカラム、更にその下流に少なくとも
ギャバーゼ／グルタミン酸酸化酵素により修飾された電
極を内蔵したフローセル、及び電流値測定機器を有し、
電解質含有水溶液を送液として各設備を連結し、該送液
を移動させる手段を有してなるオンラインバイオセンサ
ーにおいて、該送液の少なくとも一部がα−ケトグルタ
レートを含むことを特徴とする。本発明の第２の発明
は、他のオンラインバイオセンサーに関する発明であっ
て、試料をサンプリングする設備、その下流にグルタミ
ン酸酸化酵素を固定化したプレカラム、そのまた下流に
生成した過酸化水素を除去するための電解用電極、更に
その下流に少なくともギャバーゼ／グルタミン酸酸化酵
素により修飾された電極を内蔵したフローセル、及び電
流値測定機器を有し、電解質含有水溶液を送液として各
設備を連結し、該送液を移動させる手段を有してなるオ
ンラインバイオセンサーにおいて、該送液の少なくとも
一部がα−ケトグルタレートを含むことを特徴とする。
本発明の第３の発明は、更に他のオンラインバイオセン
サーに関する発明であって、上記した第１又は第２の発
明において、電極としてバルク又は薄膜の導電体を用
い、電極とギャバーゼ／グルタミン酸酸化酵素層の間に
西洋ワサビペルオキシダーゼを複合したメディエータ層
を介在させ、酵素反応によって発生した過酸化水素を還
元して検出することを特徴とする。
発明の第１の発明はオンラインバイオセンサーに関する
発明であって、試料をサンプリングする設備、その下流
にグルタミン酸酸化酵素、及び過酸化水素を分解する酵
素を固定化したプレカラム、更にその下流に少なくとも
ギャバーゼ／グルタミン酸酸化酵素により修飾された電
極を内蔵したフローセル、及び電流値測定機器を有し、
電解質含有水溶液を送液として各設備を連結し、該送液
を移動させる手段を有してなるオンラインバイオセンサ
ーにおいて、該送液の少なくとも一部がα−ケトグルタ
レートを含むことを特徴とする。本発明の第２の発明
は、他のオンラインバイオセンサーに関する発明であっ
て、試料をサンプリングする設備、その下流にグルタミ
ン酸酸化酵素を固定化したプレカラム、そのまた下流に
生成した過酸化水素を除去するための電解用電極、更に
その下流に少なくともギャバーゼ／グルタミン酸酸化酵
素により修飾された電極を内蔵したフローセル、及び電
流値測定機器を有し、電解質含有水溶液を送液として各
設備を連結し、該送液を移動させる手段を有してなるオ
ンラインバイオセンサーにおいて、該送液の少なくとも
一部がα−ケトグルタレートを含むことを特徴とする。
本発明の第３の発明は、更に他のオンラインバイオセン
サーに関する発明であって、上記した第１又は第２の発
明において、電極としてバルク又は薄膜の導電体を用
い、電極とギャバーゼ／グルタミン酸酸化酵素層の間に
西洋ワサビペルオキシダーゼを複合したメディエータ層
を介在させ、酵素反応によって発生した過酸化水素を還
元して検出することを特徴とする。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明のオンラインバイオセンサーの構造と検出反
応の模式図を図１に示す。図１において、ＧｌｕＯｘは
グルタミン酸酸化酵素、ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシ
ダーゼを意味する。従来、ＧＡＢＡの定量ではＯＰＡの
ような蛍光試薬を用いて誘導体化したのち高速液体クロ
マトグラフィにより検出を行うか、あるいは式（化
１）、（化２）の反応に伴うスペクトル変化により測定
を行ってきたが、式（化１）の１段階目の反応でＧＡＢ
Ａがスクシン セミアルデヒド（ＳＳＡ）に変換される
反応と等価にα−ケトグルタレートより生成するグルタ
ミン酸（Ｇｌｕ）の濃度をグルタミン酸センサー〔丹羽
修（O.Niwa) 、鳥光慶一（K.Torimitsu)、森田雅夫
（M.Morita) 、Ｐ．Ｇ．オズボーン（P.G.Osborne)、及
びＫ．山本（K.Yamamoto) 、アナリチカル ケミストリ
ー、第６８巻、第１８６５〜１８７０頁（１９９６）〕
により評価することにより、ＧＡＢＡの連続的な測定が
可能になる。グルタミン酸ではその酸化酵素が精製、市
販されており、ＧＡＢＡに比較し容易に高感度測定がで
きる。式（化１）の反応によりＧＡＢＡをグルタミン酸
に変換した場合、本来細胞外液に存在するグルタミン酸
とＧＡＢＡの酵素反応によって変換されたグルタミン酸
を区別できないが、電極の前にグルタミン酸酸化酵素と
カタラーゼ（あるいはペルオキシダーゼ）を固定したビ
ーズを充てんしたカラムを入れることにより、グルタミ
ン酸を酸化分解し、生成した過酸化水素もカタラーゼ
（ペルオキシダーゼ）により分解することができる。あ
るいは、生成した過酸化水素をカタラーゼなどの酵素を
用いずに、グルタミン酸酸化酵素を充てんしたプレカラ
ムと電極の間に細い白金チューブを挿入し、銀／塩化銀
電極に対して０．５Ｖ程度の電位を印加し、本来試料中
に存在するグルタミン酸のプレカラム内での反応により
生じた過酸化水素を除くことができる。これらの反応に
より細胞外に元々存在するグルタミン酸の影響を除い
て、ＧＡＢＡの量に対応した測定をオンラインで行うこ
とができる特徴を有している。更に、前電解用電極を用
いると生体中に多量に存在するＬ−アスコルビン酸によ
る妨害を除く効果もある。
る。本発明のオンラインバイオセンサーの構造と検出反
応の模式図を図１に示す。図１において、ＧｌｕＯｘは
グルタミン酸酸化酵素、ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシ
ダーゼを意味する。従来、ＧＡＢＡの定量ではＯＰＡの
ような蛍光試薬を用いて誘導体化したのち高速液体クロ
マトグラフィにより検出を行うか、あるいは式（化
１）、（化２）の反応に伴うスペクトル変化により測定
を行ってきたが、式（化１）の１段階目の反応でＧＡＢ
Ａがスクシン セミアルデヒド（ＳＳＡ）に変換される
反応と等価にα−ケトグルタレートより生成するグルタ
ミン酸（Ｇｌｕ）の濃度をグルタミン酸センサー〔丹羽
修（O.Niwa) 、鳥光慶一（K.Torimitsu)、森田雅夫
（M.Morita) 、Ｐ．Ｇ．オズボーン（P.G.Osborne)、及
びＫ．山本（K.Yamamoto) 、アナリチカル ケミストリ
ー、第６８巻、第１８６５〜１８７０頁（１９９６）〕
により評価することにより、ＧＡＢＡの連続的な測定が
可能になる。グルタミン酸ではその酸化酵素が精製、市
販されており、ＧＡＢＡに比較し容易に高感度測定がで
きる。式（化１）の反応によりＧＡＢＡをグルタミン酸
に変換した場合、本来細胞外液に存在するグルタミン酸
とＧＡＢＡの酵素反応によって変換されたグルタミン酸
を区別できないが、電極の前にグルタミン酸酸化酵素と
カタラーゼ（あるいはペルオキシダーゼ）を固定したビ
ーズを充てんしたカラムを入れることにより、グルタミ
ン酸を酸化分解し、生成した過酸化水素もカタラーゼ
（ペルオキシダーゼ）により分解することができる。あ
るいは、生成した過酸化水素をカタラーゼなどの酵素を
用いずに、グルタミン酸酸化酵素を充てんしたプレカラ
ムと電極の間に細い白金チューブを挿入し、銀／塩化銀
電極に対して０．５Ｖ程度の電位を印加し、本来試料中
に存在するグルタミン酸のプレカラム内での反応により
生じた過酸化水素を除くことができる。これらの反応に
より細胞外に元々存在するグルタミン酸の影響を除い
て、ＧＡＢＡの量に対応した測定をオンラインで行うこ
とができる特徴を有している。更に、前電解用電極を用
いると生体中に多量に存在するＬ−アスコルビン酸によ
る妨害を除く効果もある。
【００１１】
【実施例】以下、実施例及び図面を参照して本発明を更
に具体的に説明する。なお本発明は以下の実施例のみに
限定されるものではない。
に具体的に説明する。なお本発明は以下の実施例のみに
限定されるものではない。
【００１２】実施例１
グラッシーカーボン（ＧＣ）電極〔バイオアナリチカル
システムズ（Bioanalytical systems)社製、直径６ｍ
ｍ〕の表面に過酸化水素を低い電位で還元する性質を有
する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含むオス
ミウム（Ｏｓ）ポリビニルピリジン酸還元ポリマー（Ｏ
ｓポリマー）（バイオアナリチカル システムズ社製）
をコートし、乾燥させて薄膜（メディエータ層）を形成
した。次に、ギャバーゼ（シグマ社製）とグルタミン酸
酸化酵素（ヤマサ醤油社製）を合せて２％の濃度になる
ように２％牛血清アルブミン溶液に溶解させたのち架橋
剤としてグルタルアルデヒドを０．２％の濃度になるよ
うに加え、４μｌを電極上にキャストした。一方、１０
００ｍｇのアミノプロピル化したビーズ上にグルタミン
酸酸化酵素２００ユニット／１ｍｌ、カタラーゼ２００
ユニット／１ｍｌと混合し、リン酸緩衝生理食塩水を加
えて１００ｍｌとした後、２５％のグルタルアルデヒド
を２ｍｌ加えて４℃で２０時間かくはんしビーズにグル
タミン酸酸化酵素とカタラーゼを固定化した。その後、
長さ２．５ｃｍ、内径１ｍｍのポリエチレンチューブに
固定化したビーズを充てんした後、チューブの両方の末
端をフェルトにより、栓をして酵素リアクター（プレカ
ラム）を作製した。作製した電極の模式図を図３に、及
びプレカラムの模式図を図４に示す。この電極とプレカ
ラムを用いて図５に示すオンラインセンサーを形成し
た。図５において、送液にはシリンジポンプを用い、一
方のシリンジ内（ブランク側）に０．１ｍＭのα−ケト
グルタレートを含むリン酸緩衝生理食塩水を、もう一方
のシリンジ（試料側）内には種々の濃度のＧＡＢＡと
０．１ｍＭのα−ケトグルタレートを含むリン酸緩衝生
理食塩水を満たした。測定は電極の電位を０Ｖ（vs Ａ
ｇ／ＡｇＣｌ）に保ち、流速１６μｌ／ｍｉｎでまずα
−ケトグルタレートのみを含むリン酸緩衝生理食塩水を
送液した後、ＧＡＢＡを含む溶液に切り替えた。溶液を
切り替えて２分後に還元電流が流れ始め、その後定常状
態の電流が得られた。次に溶液をまた、緩衝溶液に切り
替えると２分後に電流は減少した。この定常状態の電流
は、α−ケトグルタレート単独、あるいはＧＡＢＡ単独
を送液しても観測されず、式（化１）のＧＡＢＡ−Ｔに
よる酵素反応でグルタミン酸（Ｇｌｕ）が生成した後、
グルタミン酸酸化酵素で酸化され電極で検出されている
ことが分かった。図６にＧＡＢＡ濃度（横軸、μＭ）と
得られる限界電流（縦軸、ｎＡ）の関係を示す。図６に
示すように、１〜１００μＭの範囲で良好な直線性が得
られた。一方、試料側にＧＡＢＡの代りに１μＭのグル
タミン酸を入れて測定を行うと還元電流は全く観測され
ず、グルタミン酸、及びその電気化学活性な酵素反応生
成物である過酸化水素はすべてプレカラム内で反応して
消費されていることが分かった。この結果より本発明の
センサーを用いることによりＧＡＢＡのみを選択的に検
出することができることが分かった。このセンサーの試
料側のシリンジの回路に図５に示すようにマイクロダイ
ヤリシスチューブを接続した。試料側シリンジにリン酸
緩衝生理食塩水、ブランク側のシリンジに０．１ｍＭの
α−ケトグルタレートを含むリン酸緩衝生理食塩水を入
れ、試料側シリンジを流速４μｌ／ｍｉｎ、ブランク側
シリンジを１２μｌ／ｍｉｎで送液し、マイクロダイヤ
リシスチューブをＧＡＢＡ３０μＭを含むリン酸緩衝生
理食塩水中に浸漬すると、３分後に還元電流が増加し始
め、０．１ｎＡの定常状態電流が観測された。
システムズ（Bioanalytical systems)社製、直径６ｍ
ｍ〕の表面に過酸化水素を低い電位で還元する性質を有
する西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を含むオス
ミウム（Ｏｓ）ポリビニルピリジン酸還元ポリマー（Ｏ
ｓポリマー）（バイオアナリチカル システムズ社製）
をコートし、乾燥させて薄膜（メディエータ層）を形成
した。次に、ギャバーゼ（シグマ社製）とグルタミン酸
酸化酵素（ヤマサ醤油社製）を合せて２％の濃度になる
ように２％牛血清アルブミン溶液に溶解させたのち架橋
剤としてグルタルアルデヒドを０．２％の濃度になるよ
うに加え、４μｌを電極上にキャストした。一方、１０
００ｍｇのアミノプロピル化したビーズ上にグルタミン
酸酸化酵素２００ユニット／１ｍｌ、カタラーゼ２００
ユニット／１ｍｌと混合し、リン酸緩衝生理食塩水を加
えて１００ｍｌとした後、２５％のグルタルアルデヒド
を２ｍｌ加えて４℃で２０時間かくはんしビーズにグル
タミン酸酸化酵素とカタラーゼを固定化した。その後、
長さ２．５ｃｍ、内径１ｍｍのポリエチレンチューブに
固定化したビーズを充てんした後、チューブの両方の末
端をフェルトにより、栓をして酵素リアクター（プレカ
ラム）を作製した。作製した電極の模式図を図３に、及
びプレカラムの模式図を図４に示す。この電極とプレカ
ラムを用いて図５に示すオンラインセンサーを形成し
た。図５において、送液にはシリンジポンプを用い、一
方のシリンジ内（ブランク側）に０．１ｍＭのα−ケト
グルタレートを含むリン酸緩衝生理食塩水を、もう一方
のシリンジ（試料側）内には種々の濃度のＧＡＢＡと
０．１ｍＭのα−ケトグルタレートを含むリン酸緩衝生
理食塩水を満たした。測定は電極の電位を０Ｖ（vs Ａ
ｇ／ＡｇＣｌ）に保ち、流速１６μｌ／ｍｉｎでまずα
−ケトグルタレートのみを含むリン酸緩衝生理食塩水を
送液した後、ＧＡＢＡを含む溶液に切り替えた。溶液を
切り替えて２分後に還元電流が流れ始め、その後定常状
態の電流が得られた。次に溶液をまた、緩衝溶液に切り
替えると２分後に電流は減少した。この定常状態の電流
は、α−ケトグルタレート単独、あるいはＧＡＢＡ単独
を送液しても観測されず、式（化１）のＧＡＢＡ−Ｔに
よる酵素反応でグルタミン酸（Ｇｌｕ）が生成した後、
グルタミン酸酸化酵素で酸化され電極で検出されている
ことが分かった。図６にＧＡＢＡ濃度（横軸、μＭ）と
得られる限界電流（縦軸、ｎＡ）の関係を示す。図６に
示すように、１〜１００μＭの範囲で良好な直線性が得
られた。一方、試料側にＧＡＢＡの代りに１μＭのグル
タミン酸を入れて測定を行うと還元電流は全く観測され
ず、グルタミン酸、及びその電気化学活性な酵素反応生
成物である過酸化水素はすべてプレカラム内で反応して
消費されていることが分かった。この結果より本発明の
センサーを用いることによりＧＡＢＡのみを選択的に検
出することができることが分かった。このセンサーの試
料側のシリンジの回路に図５に示すようにマイクロダイ
ヤリシスチューブを接続した。試料側シリンジにリン酸
緩衝生理食塩水、ブランク側のシリンジに０．１ｍＭの
α−ケトグルタレートを含むリン酸緩衝生理食塩水を入
れ、試料側シリンジを流速４μｌ／ｍｉｎ、ブランク側
シリンジを１２μｌ／ｍｉｎで送液し、マイクロダイヤ
リシスチューブをＧＡＢＡ３０μＭを含むリン酸緩衝生
理食塩水中に浸漬すると、３分後に還元電流が増加し始
め、０．１ｎＡの定常状態電流が観測された。
【００１３】実施例２
ガラス基板上にメタルマスクを重ね、スパッタ法により
チタン及び白金を順に堆積させた。電極は直径６ｍｍの
白金薄膜電極に幅２ｍｍ、長さ３ｃｍのリード用薄膜を
有する構造とした。この電極上に実施例１と同様な方法
によりギャバーゼ（シグマ社製）とグルタミン酸酸化酵
素（ヤマサ醤油社製）を含む牛血清アルブミン架橋膜を
作製した。この電極と実施例１に示したプレカラムを用
いて図５と同様なオンラインセンサーを組立てた。実施
例１と異なり白金チューブ（内径１００μｍ、長さ４ｃ
ｍ）をプレカラムの前に挟んで、電気化学活性な妨害物
質であるＬ−アスコルビン酸を酸化するための前電解用
電極として利用した。測定は実施例１と同様な流速と
し、白金チューブ電極に０．３Ｖ、測定用電極に０．５
Ｖの電位を印加した。ブランク側からＧＡＢＡを含む試
料側溶液にシリンジを切り替えることにより、還元電流
の増加が観測された。また、試料溶液側に１０μＭのＧ
ＡＢＡと４０μＭのＬ−アスコルビン酸を含む溶液を入
れて測定を行うと還元側の電流値はＬ−アスコルビン酸
を含まない場合に比較し約５０％の応答が得られた。一
方、白金チューブを用いずに測定を行うと、還元電流は
全く得ることができなかった。一方このセンサーの試料
側シリンジに２μＭのグルタミン酸を入れて測定を行っ
ても還元電流は得られず、このＧＡＢＡ計測用センサー
はグルタミン酸の妨害を除去してＧＡＢＡのみを選択的
に検出できることが分かった。
チタン及び白金を順に堆積させた。電極は直径６ｍｍの
白金薄膜電極に幅２ｍｍ、長さ３ｃｍのリード用薄膜を
有する構造とした。この電極上に実施例１と同様な方法
によりギャバーゼ（シグマ社製）とグルタミン酸酸化酵
素（ヤマサ醤油社製）を含む牛血清アルブミン架橋膜を
作製した。この電極と実施例１に示したプレカラムを用
いて図５と同様なオンラインセンサーを組立てた。実施
例１と異なり白金チューブ（内径１００μｍ、長さ４ｃ
ｍ）をプレカラムの前に挟んで、電気化学活性な妨害物
質であるＬ−アスコルビン酸を酸化するための前電解用
電極として利用した。測定は実施例１と同様な流速と
し、白金チューブ電極に０．３Ｖ、測定用電極に０．５
Ｖの電位を印加した。ブランク側からＧＡＢＡを含む試
料側溶液にシリンジを切り替えることにより、還元電流
の増加が観測された。また、試料溶液側に１０μＭのＧ
ＡＢＡと４０μＭのＬ−アスコルビン酸を含む溶液を入
れて測定を行うと還元側の電流値はＬ−アスコルビン酸
を含まない場合に比較し約５０％の応答が得られた。一
方、白金チューブを用いずに測定を行うと、還元電流は
全く得ることができなかった。一方このセンサーの試料
側シリンジに２μＭのグルタミン酸を入れて測定を行っ
ても還元電流は得られず、このＧＡＢＡ計測用センサー
はグルタミン酸の妨害を除去してＧＡＢＡのみを選択的
に検出できることが分かった。
【００１４】実施例３
実施例１と同様な方法により、ギャバーゼ−グルタミン
酸酸化酵素とＨＲＰ−Ｏｓ−ｇｅｌの２層膜で修飾され
たグラッシーカーボン電極、及びグルタミン酸酸化酵
素、カタラーゼを固定化したプレカラムを作製した。こ
の電極とプレカラムを用いて図７に示すオンラインセン
サーを形成した。図７において、溶液のサンプリング部
は内径０．７ｍｍのガラスキャピラリをマイクロピペッ
ト製作器（成茂製）により溶融延伸することにより先端
内径１５μｍのサンプリング部分を作製し、内径約１０
０μｍのテフロンチューブ（ＣＭＡマイクロダイヤリシ
ス社製）を延伸した側の反対側から奥まで差し込んでエ
ポキシ樹脂により封入して作製した。このサンプリング
キャピラリ付きテフロンチューブをグルタミン酸酸化酵
素／カタラーゼを固定したプレカラムに接続した後、ギ
ャバーゼ／グルタミン酸酸化酵素膜／Ｏｓ−ｇｅｌ−Ｈ
ＲＰ膜により修飾された電極をセットした薄層セルに接
続した。また、フローセルの出口側をテフロン細管を介
してシリンジポンプに接続し、吸引することによりオン
ラインセンサーを駆動した。また同じサンプリングキャ
ピラリをもう一本用意し、先端を０．１ｍＭα−ケトグ
ルタレートを含むリン酸緩衝生理食塩水中に浸漬させ、
テフロンチューブ側をプレカラムの下流側でＴ字管によ
り合流させた。サンプリングキャピラリをグルタミン酸
１μＭを含む溶液に浸漬し、シリンジを８μｌ／ｍｉｎ
で駆動し、電極に０ｍＶの電位を印加して測定を行っ
た。プレカラムでグルタミン酸が効果的に除去されたた
めに、溶液が電極に到達しても電流変化は全く観測され
なかった。次に、試料溶液濃度が２μＭになるようにＧ
ＡＢＡを加えて測定を行うと、４分後に還元電流が増加
し始め０．３ｎＡの定常状態の電流が観測された。一
方、図７のセンサーから、α−ケトグルタレート溶液の
合流回路を取り除いて、ＧＡＢＡ２μＭを含む溶液の測
定を行うと、酵素（ＧＡＢＡ−Ｔ）の反応が進行せず、
電流が観測されなかった。一方、試料溶液をＧＡＢＡ２
μＭ、グルタミン酸２０μＭを含む溶液に変更すると
０．２ｎＡの還元電流が得られた。グルタミン酸だけを
測定しても反応によりグルタミン酸と生成物の過酸化水
素が消費され電流が観測されないことから、得られた電
流はＧＡＢＡの酵素反応によるものと考えられる。これ
は、ＧＡＢＡの酵素反応に必要なα−ケトグルタレート
を加えない場合でも、試料溶液中にグルタミン酸が存在
すれば、グルタミン酸の酵素反応によりα−ケトグルタ
レートが多量に生成し、これが電極上でＧＡＢＡの酵素
反応に使われるためにＧＡＢＡを定量的に検出できるこ
とが分かった。
酸酸化酵素とＨＲＰ−Ｏｓ−ｇｅｌの２層膜で修飾され
たグラッシーカーボン電極、及びグルタミン酸酸化酵
素、カタラーゼを固定化したプレカラムを作製した。こ
の電極とプレカラムを用いて図７に示すオンラインセン
サーを形成した。図７において、溶液のサンプリング部
は内径０．７ｍｍのガラスキャピラリをマイクロピペッ
ト製作器（成茂製）により溶融延伸することにより先端
内径１５μｍのサンプリング部分を作製し、内径約１０
０μｍのテフロンチューブ（ＣＭＡマイクロダイヤリシ
ス社製）を延伸した側の反対側から奥まで差し込んでエ
ポキシ樹脂により封入して作製した。このサンプリング
キャピラリ付きテフロンチューブをグルタミン酸酸化酵
素／カタラーゼを固定したプレカラムに接続した後、ギ
ャバーゼ／グルタミン酸酸化酵素膜／Ｏｓ−ｇｅｌ−Ｈ
ＲＰ膜により修飾された電極をセットした薄層セルに接
続した。また、フローセルの出口側をテフロン細管を介
してシリンジポンプに接続し、吸引することによりオン
ラインセンサーを駆動した。また同じサンプリングキャ
ピラリをもう一本用意し、先端を０．１ｍＭα−ケトグ
ルタレートを含むリン酸緩衝生理食塩水中に浸漬させ、
テフロンチューブ側をプレカラムの下流側でＴ字管によ
り合流させた。サンプリングキャピラリをグルタミン酸
１μＭを含む溶液に浸漬し、シリンジを８μｌ／ｍｉｎ
で駆動し、電極に０ｍＶの電位を印加して測定を行っ
た。プレカラムでグルタミン酸が効果的に除去されたた
めに、溶液が電極に到達しても電流変化は全く観測され
なかった。次に、試料溶液濃度が２μＭになるようにＧ
ＡＢＡを加えて測定を行うと、４分後に還元電流が増加
し始め０．３ｎＡの定常状態の電流が観測された。一
方、図７のセンサーから、α−ケトグルタレート溶液の
合流回路を取り除いて、ＧＡＢＡ２μＭを含む溶液の測
定を行うと、酵素（ＧＡＢＡ−Ｔ）の反応が進行せず、
電流が観測されなかった。一方、試料溶液をＧＡＢＡ２
μＭ、グルタミン酸２０μＭを含む溶液に変更すると
０．２ｎＡの還元電流が得られた。グルタミン酸だけを
測定しても反応によりグルタミン酸と生成物の過酸化水
素が消費され電流が観測されないことから、得られた電
流はＧＡＢＡの酵素反応によるものと考えられる。これ
は、ＧＡＢＡの酵素反応に必要なα−ケトグルタレート
を加えない場合でも、試料溶液中にグルタミン酸が存在
すれば、グルタミン酸の酵素反応によりα−ケトグルタ
レートが多量に生成し、これが電極上でＧＡＢＡの酵素
反応に使われるためにＧＡＢＡを定量的に検出できるこ
とが分かった。
【００１５】実施例４
実施例１と同様な方法により、ギャバーゼ−グルタミン
酸酸化酵素とＨＲＰ−Ｏｓ−ｇｅｌの２層膜で修飾され
たグラッシーカーボン電極、及びグルタミン酸酸化酵
素、カタラーゼを固定化したプレカラムを作製した。実
施例３の図７と同様なオンライン酵素センサーを組立
て、細胞外液のＧＡＢＡ計測を応用した。試料として、
ラット大脳の神経細胞をシャーレ上に２０日間培養し
た。この培養細胞にマニピュレーターを用いてキャピラ
リを近接させて細胞近傍の溶液を連続サンプリングしな
がら、もう一本のキャピラリから１００ｍＭの塩化カリ
ウム水溶液により細胞を刺激すると、３分後に電流値が
０．５ｎＡ減少（還元電流である負の電流が増大）し
た。これは神経細胞の刺激によるＧＡＢＡ放出を本発明
によるＧＡＢＡセンサーにより連続的に測定することが
できることを示している。
酸酸化酵素とＨＲＰ−Ｏｓ−ｇｅｌの２層膜で修飾され
たグラッシーカーボン電極、及びグルタミン酸酸化酵
素、カタラーゼを固定化したプレカラムを作製した。実
施例３の図７と同様なオンライン酵素センサーを組立
て、細胞外液のＧＡＢＡ計測を応用した。試料として、
ラット大脳の神経細胞をシャーレ上に２０日間培養し
た。この培養細胞にマニピュレーターを用いてキャピラ
リを近接させて細胞近傍の溶液を連続サンプリングしな
がら、もう一本のキャピラリから１００ｍＭの塩化カリ
ウム水溶液により細胞を刺激すると、３分後に電流値が
０．５ｎＡ減少（還元電流である負の電流が増大）し
た。これは神経細胞の刺激によるＧＡＢＡ放出を本発明
によるＧＡＢＡセンサーにより連続的に測定することが
できることを示している。
【００１６】実施例５
図８は、本発明によるオンラインバイオセンサーの一実
施例による構成を説明する概略図である。プレカラムと
して内径１ｍｍ、長さ２．５ｃｍのテフロンチューブに
グルタミン酸酸化酵素を固定化したビーズを充てんし
た。実施例３で使用したものと同様のサンプリングキャ
ピラリをプレカラムに接続し、その下流に内径１００μ
ｍ（長さ４ｃｍ）の白金チューブを介した後薄層フロー
セルに接続した。ＧＡＢＡ検出用電極は実施例１と同様
なものを使用した。また、白金チューブの下流に合流回
路を設け、０．１ｍＭのα−ケトグルタレートを含むリ
ン酸緩衝生理食塩水を合流させた。流速１６μｍｌ／ｍ
ｉｎでキャピラリを吸引し、試料溶液にグルタミン酸１
μＭ、ＧＡＢＡ２μＭ、Ｌ−アスコルビン酸１０μＭに
なるように各溶液を注入した。測定は白金電極に５００
ｍＶ、ＧＡＢＡ測定用電極に０ｍＭの電位を印加して行
った。各溶液を試料側の溶液に注入して約３分で還元電
流が増加し始め０．３ｎＡの大きさに達した。ＧＡＢＡ
を入れていない溶液では電流値の変化は観測されずグル
タミン酸はプレカラムの酵素反応で消費され、酵素反応
生成物である過酸化水素とＬ−アスコルビン酸はＬ−ア
スコルビン酸による過酸化水素の還元反応、及び白金チ
ューブ電極での両者の電気化学的酸化反応により消費さ
れていることが分かった。
施例による構成を説明する概略図である。プレカラムと
して内径１ｍｍ、長さ２．５ｃｍのテフロンチューブに
グルタミン酸酸化酵素を固定化したビーズを充てんし
た。実施例３で使用したものと同様のサンプリングキャ
ピラリをプレカラムに接続し、その下流に内径１００μ
ｍ（長さ４ｃｍ）の白金チューブを介した後薄層フロー
セルに接続した。ＧＡＢＡ検出用電極は実施例１と同様
なものを使用した。また、白金チューブの下流に合流回
路を設け、０．１ｍＭのα−ケトグルタレートを含むリ
ン酸緩衝生理食塩水を合流させた。流速１６μｍｌ／ｍ
ｉｎでキャピラリを吸引し、試料溶液にグルタミン酸１
μＭ、ＧＡＢＡ２μＭ、Ｌ−アスコルビン酸１０μＭに
なるように各溶液を注入した。測定は白金電極に５００
ｍＶ、ＧＡＢＡ測定用電極に０ｍＭの電位を印加して行
った。各溶液を試料側の溶液に注入して約３分で還元電
流が増加し始め０．３ｎＡの大きさに達した。ＧＡＢＡ
を入れていない溶液では電流値の変化は観測されずグル
タミン酸はプレカラムの酵素反応で消費され、酵素反応
生成物である過酸化水素とＬ−アスコルビン酸はＬ−ア
スコルビン酸による過酸化水素の還元反応、及び白金チ
ューブ電極での両者の電気化学的酸化反応により消費さ
れていることが分かった。
【００１７】
【発明の効果】以上、説明したように本発明によるＧＡ
ＢＡセンサーでは従来、一般的にＧＡＢＡ測定に利用さ
れてきた誘導体化反応によって蛍光あるいは電気化学的
検出可能な構造に変換した後、液体クロマトグラフィ等
により分析する検出法に比較し、よりリアルタイムに近
い形で連続的にＧＡＢＡを計測することができる特徴を
有する。また、ギャバーゼを用いて色変化で検出する方
法に比較しても、より短時間で高感度な測定が可能であ
る。更に、リアルタイム計測として知られる、ＧＡＢＡ
レセプターを有する細胞とパッチクランプ法などの細胞
の膜電位測定法を組合せたセンサーに比較しても、細胞
培養などの技術が不要で、センサーの安定性や定量性に
優れるなどの利点を数多く有しており、脳神経科学や医
療用センサーとして極めて利用価値が高い。
ＢＡセンサーでは従来、一般的にＧＡＢＡ測定に利用さ
れてきた誘導体化反応によって蛍光あるいは電気化学的
検出可能な構造に変換した後、液体クロマトグラフィ等
により分析する検出法に比較し、よりリアルタイムに近
い形で連続的にＧＡＢＡを計測することができる特徴を
有する。また、ギャバーゼを用いて色変化で検出する方
法に比較しても、より短時間で高感度な測定が可能であ
る。更に、リアルタイム計測として知られる、ＧＡＢＡ
レセプターを有する細胞とパッチクランプ法などの細胞
の膜電位測定法を組合せたセンサーに比較しても、細胞
培養などの技術が不要で、センサーの安定性や定量性に
優れるなどの利点を数多く有しており、脳神経科学や医
療用センサーとして極めて利用価値が高い。
【図１】本発明のオンラインバイオセンサーの構造と検
出反応のフローを示す模式図である。
出反応のフローを示す模式図である。
【図２】マイクロダイヤリシスプローブとオンラインフ
ローセンサーを組合せた脳内神経伝達物質の測定の基本
構造を示す模式図である。
ローセンサーを組合せた脳内神経伝達物質の測定の基本
構造を示す模式図である。
【図３】ＧＡＢＡ検出用電極の構造を示す模式図であ
る。
る。
【図４】酵素反応プレカラムの構造を示す模式図であ
る。
る。
【図５】実施例１に記載したＧＡＢＡ測定用オンライン
フローセンサーの構造を示す模式図である。
フローセンサーの構造を示す模式図である。
【図６】実施例１に記載したセンサーを用いて測定した
ＧＡＢＡ濃度と得られる還元電流の関係を示すグラフで
ある。
ＧＡＢＡ濃度と得られる還元電流の関係を示すグラフで
ある。
【図７】実施例３に記載したＧＡＢＡ測定用オンライン
フローセンサーの構造を示す模式図である。
フローセンサーの構造を示す模式図である。
【図８】実施例５に記載したＧＡＢＡ測定用オンライン
フローセンサーの構造を示す模式図である。
フローセンサーの構造を示す模式図である。
フロントページの続き
(72)発明者 森田 雅夫
東京都新宿区西新宿三丁目19番２号 日
本電信電話株式会社内
(72)発明者 栗田 僚二
東京都武蔵野市御殿山一丁目１番３号
エヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロ
ジ株式会社内
(56)参考文献 特開 平10−38844（ＪＰ，Ａ)
特開 平８−136496（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 27/26 - 27/49
C12Q 1/00 - 3/00
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (6)
- 【請求項１】 試料をサンプリングする設備、その下流
にグルタミン酸酸化酵素、及び過酸化水素を分解する酵
素を固定化したプレカラム、更にその下流に少なくとも
ギャバーゼ／グルタミン酸酸化酵素により修飾された電
極を内蔵したフローセル、及び電流値測定機器を有し、
電解質含有水溶液を送液として各設備を連結し、該送液
を移動させる手段を有してなるオンラインバイオセンサ
ーにおいて、該送液の少なくとも一部がα−ケトグルタ
レートを含むことを特徴とするオンラインバイオセンサ
ー。 - 【請求項２】 請求項１に記載のオンラインバイオセン
サーにおいて、α−ケトグルタレートを含む水溶液を、
プレカラムの上流側の送液、又はプレカラムの下流側で
フローセルの上流側の送液と合流させる手段を有してな
ることを特徴とするオンラインバイオセンサー。 - 【請求項３】 請求項１又は２において過酸化水素を分
解する酵素がカタラーゼ、あるいはペルオキシダーゼで
あることを特徴とするオンラインバイオセンサー。 - 【請求項４】 試料をサンプリングする設備、その下流
にグルタミン酸酸化酵素を固定化したプレカラム、その
また下流に生成した過酸化水素を除去するための電解用
電極、更にその下流に少なくともギャバーゼ／グルタミ
ン酸酸化酵素により修飾された電極を内蔵したフローセ
ル、及び電流値測定機器を有し、電解質含有水溶液を送
液として各設備を連結し、該送液を移動させる手段を有
してなるオンラインバイオセンサーにおいて、該送液の
少なくとも一部がα−ケトグルタレートを含むことを特
徴とするオンラインバイオセンサー。 - 【請求項５】 請求項４に記載のオンラインバイオセン
サーにおいて、該電解用電極の下流側でフローセルの上
流側の送液と、α−ケトグルタレートを含む水溶液とを
合流させる手段を有してなるオンラインバイオセンサ
ー。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のオ
ンラインバイオセンサーにおいて、電極としてバルク又
は薄膜の導電体を用い、電極とギャバーゼ／グルタミン
酸酸化酵素層の間に西洋ワサビペルオキシダーゼを複合
したメディエータ層を介在させ、酵素反応によって発生
した過酸化水素を還元して検出することを特徴とする請
求項１〜５のいずれか１項に記載のオンラインバイオセ
ンサー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26230796A JP3480884B2 (ja) | 1996-09-12 | 1996-09-12 | オンラインバイオセンサー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26230796A JP3480884B2 (ja) | 1996-09-12 | 1996-09-12 | オンラインバイオセンサー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1090214A JPH1090214A (ja) | 1998-04-10 |
| JP3480884B2 true JP3480884B2 (ja) | 2003-12-22 |
Family
ID=17373972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26230796A Expired - Lifetime JP3480884B2 (ja) | 1996-09-12 | 1996-09-12 | オンラインバイオセンサー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3480884B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1384889A (zh) * | 1999-10-28 | 2002-12-11 | 株式会社丰田中央研究所 | 反应方法、反应装置和酶 |
| GB0300820D0 (en) * | 2003-01-14 | 2003-02-12 | Diagnoswiss Sa | Membrane-microchannel strip |
| JP3902156B2 (ja) * | 2003-06-03 | 2007-04-04 | 日本電信電話株式会社 | オンラインカテコールアミンセンシングデバイス |
-
1996
- 1996-09-12 JP JP26230796A patent/JP3480884B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH1090214A (ja) | 1998-04-10 |
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