CN1384889A

CN1384889A - 反应方法、反应装置和酶

Info

Publication number: CN1384889A
Application number: CN 00815117
Authority: CN
Inventors: 梶野勉; 高桥治雄; 杉山英彦; 浅见修; 笹木俊哉; 李波
Original assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 1999-10-28
Filing date: 2000-10-30
Publication date: 2002-12-11
Also published as: WO2001031066A1; CA2389212A1; EP1251184A1

Abstract

一种向含有底物的反应体系中投入处于活性状态的介质的反应方法。最好是将该介质活化作为前工序通过酶在温和条件下进行。另外最好是向上述反应体系投入活性和/或稳定性进一步提高的高活性介质。一种将氧化酶过氧化物酶固定于在尺寸与酶大小几乎一致、结构稳定的结构单元中,在酶的固定化容许的浓度范围内的氧化剂存在下分解上述底物的底物的酶分解方法。一种用于通过氧化酶分解底物的反应体系中,可与具有在氧化酶作用下自由基化的二酮结构一起溶于水的反应促进剂。通过培养白色腐朽菌的变异株SC26菌株获得的锰过氧化物酶液和锰过氧化物酶。

Description

反应方法、反应装置和酶

技术领域

本发明涉及反应方法、反应装置和酶，更详细地讲，本发明涉及使用活性介质对反应底物进行分解的反应方法和在该反应方法的特定实施方案中可以有效利用的反应装置，一定底物的酶分解方法、反应促进剂和利用该反应促进剂分解疏水性底物或难分解物质的分解方法，新的锰过氧化物酶及其制造方法。

背景技术

近年来，诸如以过氧化物酶和漆酶等氧化酶(氧化还原酶)参与的反应等为中心，作为反应介体的介质参与的酶反应的存在已为人们所知。即具有下述反应机制的反应：作为反应介体的介质通过作为介质活化手段的酶的活化成为活性介质，然后该活性介质作用于底物，完成既定反应。这些反应用于诸如作为纸浆着色物质的木质素以及环境激素类，特别是被认为毒性强成为问题的二噁英等难分解物质的分解处理很理想，由于可以避免使用在废液处理中成为问题的氯等化学漂白剂以及环境负荷大的热分解处理，所以非常有用。另外，上述的锰过氧化物酶(以下也称为“MnP”)是特别有效的酶，在过氧化氢存在下作为介质的2价锰离子被活化为3价的锰离子。然后该活性介质通过反应促进剂(丙二酸是众所周知的反应促进剂)的自由基化等可以氧化各种各样的目的物质。

作为与上述反应有关的众所周知的技术有以下报道：例如在“纸浆技术协会会志vol.150，59-68(原园等人)”中涉及到纸浆中含有的着色物质木质素通过过氧化物酶分解的报道，在该分解反应中有作为介质的锰离子参与。另外在特开平11-158790号公报中涉及到通过漆酶进行的同样的木质素分解反应，在该分解反应中有作为介质的HBT(1-羟基苯并三唑，1-hydroxybenzotriazole)参与。此外在特开平9-239396号公报中报道了利用氧化酶过氧化物酶对于难分解物质的分解技术。但是在上述的以往技术中，无论哪种介质都是以非活性状态介质投入到有底物存在的反应体系中(例如含有纸浆的被处理液中)，在该反应体系内通过酶活化使其成为活性介质。因此存在象以下那样的问题。第1，如果将酶投入到被处理的液体中，不容易分离回收价格高的酶。即使使酶担载到不溶性载体，回收时固液分离的对策，在上述被处理液体中混有各种各样固体片段时实施固液分离也很困难。将酶担载到固定床上的对策使得酶与低浓度特定物质的接触效率不好。而将酶挂在柱子上，使被处理液体通过柱子的对策也难于应用于混有固体片段的被处理液体的处理中。第2，在工业处理过程中追求处理效率，按照底物要求变化的内容，例如要求在高温、强酸或强碱等严格条件下的高反应效率时，在这些严格的条件下酶失活达不到处理的目的。第3，总而言之，在使活性介质作用于底物可以达到目的的反应中，实用的介质活化手段除了酶以外是否还有别的手段这一重要的问题还没有研究。另外在反应体系中对介质进行活化是否必要的这一重要问题也没有研究。第4，由于在反应体系中通过酶活化介质的这一形式受到限定，所以介质的活化形式或活化程度(例如，为了使介质活化的激发状态程度)明显受到制约。

本申请发明的第1个目的是在高浓度氧化剂存在下通过氧化酶过氧化物酶对底物、特别是难分解物质的底物进行高效地分解，而且要避免价格高的酶的失活，可有效地回收和再利用。另外要研究除了酶以外的其它实用的介质活化手段，研究其有效的利用方法。

以提高上述酶的稳定性为目的的众所周知的技术有以下一些报道，有Gravski，A.C.等人(Appl.Biochem.Biotechnol.60，1-17(1996))有关固定于有机聚合物粒子的锰过氧化物酶的报道；Fawer，M.S.等人(Biochem.Biophys.Acta.1076，15-22(1991))和Ather，M.等人(Appl.Biochem.Biotechnol.38，57-67(1993))有关固定于玻璃珠、有机聚合物、琼脂各种粒子的木质素过氧化物酶的报道。在将氧化酶固定于上述的有机聚合物粒子、玻璃珠、琼脂时，在该固定化酶的使用形式(填充柱子等)以及依次进行的后处理(过滤等)中都能对酶有效回收和再利用。另外作为固定化酶的一般的优点人们认为对温度和pH的容许范围也相对地变宽了。然而根据本发明人的研究可知在用以往方式进行固定化的氧化酶中，与固定化前相比对于氧化剂浓度的容许范围几乎没有扩展。想要利用氧化剂分解底物、特别是分解难分解物质的底物时，试图将氧化剂浓度尽可能提高以提高分解效率是一个重要的技术课题，可以说不能适应这一点的固定化酶具有实用上的致命的缺陷。

因此，本发明的第2个目的是提供能够识别而且选择性地分解诸如木质素和纤维素那样的类似的物质的反应促进剂以及利用该促进剂的酶分解方法。本发明人注意到以往技术涉及到的反应促进剂丙二酸是亲水性的二羧酸，因此生成的自由基也是亲水的。与木质素相比，亲水的自由基优先分解亲水的纤维素，或者至少是同时分解木质素和纤维素。

涉及到上述反应促进剂的众所周知的技术在“纸浆技术协会杂志50卷4号1996”文献的报道中指出丙二酸作为使锰离子稳定在3价状态的螯合剂是有效的。按照本发明人的理解，丙二酸是通过锰离子被自由基化，对木质素等物质进行分解的反应促进剂。然而通过本发明人的研究可知丙二酸的自由基不仅对木质素有一定的分解能力，而且对纤维素也有作用。因此，纸浆漂白即木质素分解很容易不充分，而且由于纤维素也受到损伤，结果会制造出强度低的纸。一般来说，识别非常类似的高分子物质木质素和纤维素，有选择地分解其中的一种物质是相当困难的。

因此，本发明的第3个目的是提供能够识别、而且有选择地分解诸如木质素和纤维素那样的类似的物质的反应促进剂以及利用该促进剂的酶分解方法。本发明人注意到以往技术涉及到的反应促进剂丙二酸是亲水性的二羧酸，因此生成的自由基也是亲水的。与木质素相比，亲水的自由基优先分解亲水的纤维素，或者至少是同时分解木质素和纤维素。

涉及到锰过氧化物酶的众所周知的技术有以下一些报道：据J.Biotechnol.vol 30，79-90(1990)刊载的Cai D.等人的论文报道，白色腐朽菌(Phanerochaete crysosporium)中存在着4种MnP，其中只有3种MnP的等电点和分子量等理化特性已经被解析。另外EnzymeMicrobiol.Technol.vol 18，27-32(1986)刊载的T.K.Kirk等人的论文报道了对白色腐朽菌实施UV变异，使MnP产量提高的变异株。但有关该变异株产生的MnP的耐热性和耐过氧化氢等特性还没有分析。可是，在酶反应中一般来说酶的耐热性是个问题，特别是在MnP参与的反应中，大多希望根据3价锰离子以及通过它生成的自由基的反应性等理由，将反应温度设定较高来提高反应效率。另外，由于MnP参与的反应的效率也受到过氧化氢浓度控制，所以通常都要求尽可能将过氧化氢浓度设定较高。为了适应这些要求，MnP必须同时具备很好的耐热性和耐过氧化氢性能。然而，以前报道有具有于50℃下耐热10分钟左右的耐热性的MnP，但该MnP耐过氧化氢性能很差(特开平7-274958号公报)。相反，报道有具有在10mM以下浓度的过氧化氢中1分钟后残余活性在35％以上的耐过氧化氢性的MnP(特开2000-83658号公报)而且由于该MnP常时间与过氧化氢接触，1分钟短时间的耐性没有实用价值，另外在上述文献中就有关MnP的耐热性也没有给出明确的实验条件。所以，由于没有提供同时具有实际使用水平的良好的耐热性和良好的耐过氧化氢性能的MnP，所以其现状是尽管MnP很有用，但还不能被产业上充分利用。

因此，本发明的第4个目的是提供具备可适应实用要求的耐热性和耐过氧化氢性能的MnP及其制造方法。

发明的公开

本申请的第1发明是一种反应方法，其特征是对于有底物存在的反应体系，在活性状态作用于上述底物进行既定反应的介质是以处于上述活性状态的活性介质投入的。在第1发明中，由于事先使介质活化后再投入反应体系，所以没有必要使介质活化手段存在于反应体系中，因此象上述以往技术那样从混有底物的反应体系中回收介质活化手段(例如价格高的酶)的困难就不存在了。另外由于反应体系中不存在介质活化手段(例如容易失活的酶)，可以将反应体系设定在诸如高温、强酸区或强碱区等高反应效率的严格条件下。由于可以不用考虑与反应体系的关系而使用任意方法、任意手段制备介质，所以介质活化手段的自由度大了。其结果制备通过酶活化不能实现的那样高活性和/或高稳定性的高活性介质也成为可能。而且，预先贮存准备投入到反应体系的上述活性介质或高活性介质成为可能，由于可以在所希望的时间将希望的量的活性介质或高活性介质任意地投入到反应体系中，所以反应体系的控制变得容易了。

本申请的第2发明是一种反应方法，其特征是在上述第1发明涉及到的反应方法中设置一个通过介质活化手段-酶使介质活化的活化步骤，然后将通过该活化步骤得到的活性介质投入到上述反应体系中。如果介质被活化的步骤和使活性介质作用于底物的步骤是在同一反应池中进行的话，酶分离回收的困难或酶与底物的接触效率的问题都是无法摆脱的。而在第2发明中，无底物存在环境下的活化步骤和底物存在环境下的底物反应步骤在工序上是被隔离开的。因此，由于介质活化手段本来就与底物(如各种各样的固体片段和水溶性物质等混在一起的被处理液体)分开的，所以该介质活化手段是酶时，酶的回收是很容易的。更具体来说，使作为介质活化手段的酶担载在粉粒状的不溶性载体上时，只是通过过滤等适当的固液分离方法(使固体和液体分离的方法)将酶与活性介质水溶液分离，就可容易地回收酶。另外，如将酶搭载到固定床上时，由于固定床的作用是在不存在底物的环境下活化介质，所以不必担心酶与低浓度特定物质的接触效率。还有，由于在介质溶液中没混有多余的固体片段，所以将它通过搭载酶的柱子时，使介质活化效率提高也容易。在第2发明中，一个条件是将通常为水溶性的活性介质水溶液与介质活化手段分离后转移，但只要使用诸如电极等固定结构物或固定于不溶性载体的酶(只要介质活化手段不是水溶性物质)作为介质活化手段，通过单纯使溶液移动或简单的固液分离操作，就可以容易地进行分离。

在上述第2发明中，更为理想的是第2发明的活性介质是稳定的物质(特别稳定的低分子物质)时，在温和的条件下使酶和介质接触进行上述的活化步骤，在能获得高反应效率的严格条件下进行上述活性介质和底物的反应。在该反应方法中，前提是介质活化手段是酶，活化介质是稳定物质。在此前提下，由于是在温和条件下进行活化步骤，所以酶不易失活，而且由于在高反应效率的严格条件下进行底物反应步骤，所以有望获得适合工业化处理过程的高的底物处理效率。而且作为稳定物质(特别是稳定的低分子物质)的活性介质即使在高反应效率的严格条件下也不易失活。即理所当然地避开象上述以往技术那样的在工业处理过程中的高处理效率要求和维持反应活性要求之间的矛盾。

本申请的第3发明是一种反应方法，其特征是将上述第1发明涉及到的介质以高活化状态的高活性介质投入到上述反应体系中，它们的活性和/或稳定性比上述处于活性状态的活性介质的更高。由于该高活性介质在活性和/或稳定性比通常的活性介质的更高，所以第1发明的反应方法可以更高的效率实施，另外容许在更高温度下的反应、在酸性更强区域的反应、在碱性更强区域的反应等设定效率更高的严格反应条件。

在上述第3发明中，更为理想的是高活性介质与上述活性介质相比处于更高活性的激发状态，或者至少是包括配位化合物的情况下的介质的高级次的化合物。这些是高活性介质的代表性例子。在上述第1发明～第3发明中，更理想的是：活性介质或高活性介质可以通过对上述介质进行酶作用、催化作用、光照射、电磁波照射、加电压或等离子体化来制备。活性介质或高活性介质的制备手段由于不需要在底物存在的反应体系中对介质进行活化，所以可使用包括酶在内的任意手段，作为其代表性的手段诸如通过酶作用、通过酶以外的催化作用、通过光照射(包括为了激发光催化而进行的光照射)、通过电磁波照射、通过加电压、或通过等离子体化等手段。在上述第1发明～第3发明中，更理想的是：酶是过氧化物酶或漆酶等氧化酶，底物是为使纸浆漂白而要分解的木质素。在这样的情况下，可以提供反应方法特别实用的要求高的实施方案。

本申请的第4发明是为实施上述第2个发明的反应方法的反应装置，其中包括(1)“具备与活性介质为可分离形态的介质活化手段，通过该手段可实施上述活化步骤的活化反应场所”和(2)“通过活性介质的输送手段与上述活化反应场所连接，可实施上述活性介质和底物反应的底物反应场所”。该反应装置提供上述第2发明的有效的实施手段。

本申请的第5发明是底物的酶分解方法，其特征是在使用氧化剂通过氧化酶-过氧化物酶分解酶底物的方法中，使用将上述氧化酶固定于具有与酶大小大致相符的空间(即容积)而且结构稳定的结构单元中形成的固定化酶，在酶固定化所容许的浓度范围的氧化剂存在下分解上述底物。第5发明中用的固定化酶与以前的固定化酶相比，相对来说对温度和pH的稳定性都比较高，尤其是对过氧化氢等氧化剂的浓度的容许范围显著扩大了。虽然其理由不一定很明确，但我们认为可能是由于在结构单元中被固定的氧化酶的立体结构没有全部暴露于外部环境，结构单元具有结构稳定性，所以对氧化酶的保护作用强，以及由于结构单元与酶的大小大体一致，表现出对氧化酶有适当的保护作用的缘故。在第5发明中由于容许的氧化剂的浓度范围显著扩大，第1、相对于底物投入高浓度的氧化剂可以提高分解效率，第2、即使氧化剂浓度的正确调控在技术上是困难的，但随着氧化剂浓度的上升也不会使酶失活。另外作为固定化酶的一般特征不用说在下列场合下对氧化酶的回收和再利用都是可能，即通过向柱子填充的固定化、向被处理液流动的固定床的固定化等使用形式的场合以及在反应结束后对将投入到不含固体成分的被处理液中的固定化酶进行过滤的场合。

在上述第5发明中，底物是难分解的物质。这样情况下，由于非常需要在酶反应中尽可能地投入高浓度的氧化剂以便提高分解效率，所以能极大地发挥第5发明的实用价值。在上述第5发明中，难分解物质为木质素更理想。分解着色物质木质素以漂白纸浆在产业界特别需要。在上述第5发明中结构单元是中孔(性)的二氧化硅多孔体中的各个细孔更理想。在这样的情况下，由于提供了将氧化酶固定于多孔体的多数细孔中这一效率好的实施形式的结构单元，所以反应效率特别高，而且作为二氧化硅多孔体的结构单元有结构稳定性极高的优点。

本申请的第6发明是在通过氧化酶分解底物的反应体系中所使用的反应促进剂，是具有基于上述酶的作用可自由基化的二酮结构、而且可溶于水的反应促进剂。作为可溶于水的该反应促进剂溶于含有氧化酶的水溶液，通过氧化酶的作用容易自由基化。因此，如投入到用氧化酶进行纸浆漂白的体系中，可有效地溶解于纸浆中，而且在自由基化后进行木质素的分解，结果使纸浆漂白。而且具有二酮结构的反应促进剂作为可溶于水的反应促进剂具有疏水性特别强的化学结构。因此，容易接触纸浆中疏水性的木质素并分解它，而由于难于接触亲水性的纤维素，所以几乎不分解纤维素。其结果由于木质素分解使得纸浆漂白进行得非常充分，而且由于纤维素没有受到损伤，可以制造强度高的纸。不只是纸浆漂白，一般来说对于水中混有亲水性底物和相对疏水性底物的底物溶液，将第6发明的反应促进剂与氧化酶共同使用的话，可以预料具有有选择地分解疏水性底物的能力。在上述第6发明中，反应促进剂是乙酰丙酮更理想。

本申请的第7发明是促进疏水性底物分解的方法，其特征是在混有亲水性底物和与它相比相对疏水性的底物的水溶液中使氧化酶以及反应介质和第6发明提到的反应促进剂共存，自由基化了的反应促进剂优先地使疏水性底物分解。如第7发明所述，对于水中混有亲水性底物和与它相比相对疏水性底物的底物溶液，如果在使用氧化酶以及反应介质的同时使用第6发明的反应促进剂，被自由基化的疏水性反应促进剂可有选择地分解疏水性底物。因此对使用主要分解亲水性底物的反应促进剂的情形与使用同等分解亲水性和疏水性底物的反应促进剂的情形进行比较时，结果表明第1、对疏水性底物的分解能力相对高些；第2、可以抑制亲水性底物的分解。即在上述那样的底物溶液中，希望使疏水性底物充分分解时，尤其是希望避免亲水性底物分解时，第7发明提到的促进疏水性底物分解的方法最有效。作为第7发明的一般的反应机制可能是：首先通过氧化酶使反应介质活化(例如锰变成3价锰离子)，通过被活化的反应介质使反应促进剂自由基化，该反应促进剂自由基使底物分解。

在上述第7发明中，更理想的促进疏水性底物分解的方法是包括以下工序的方法，即包括通过氧化酶使反应介质活化的工序、将被活化的反应介质和第6发明中提到的反应促进剂添加到混有亲水性底物和与它相比相对疏水性底物的水溶液中，通过自由基化的上述反应促进剂优先分解上述疏水性底物的工序。这样的情况下，由于氧化酶在没有反应促进剂存在时可以对反应介质进行活化，所以即使使用高浓度的反应促进剂也不会使氧化酶失活。而且通过高浓度反应促进剂的使用可进一步促进疏水性底物的分解。在上述第7发明中反应的水溶液是纸浆，亲水性底物是纤维素，相对疏水性底物是木质素最理想。第7发明在这样的场合特别有效。这样场合下着色物质疏水性木质素可充分被分解，达到良好的漂白效果的同时，又抑制造纸原料纤维素的分解，可以制造出强度高的纸。在上述第7发明中，促进上述疏水性底物分解的方法中间插入纸浆的碱萃取处理工序后多级反复操作最理想。这样情况下，在纸浆固体成分中的木质素之中，埋没于纤维素中的难分解的木质素通过纸浆的碱萃取处理暴露出来，使其更好地被分解。因此通过上述的多级反复操作方法可进一步提高纸浆的白度。在上述第7发明中最理想的是氧化酶至少是从包括锰过氧化物酶、辣根过氧化物酶和木质素过氧化物酶中选择的过氧化物酶，反应介质是锰离子。这些氧化酶和反应介质特别理想。

本申请的第8发明是难分解物质的分解方法，其特征是在含有难分解物质的水溶液中使氧化酶和反应介质以及第6发明中提到的反应促进剂共存，通过自由基化的反应促进剂分解难分解物质。难分解物质呈现亲水性结构是很少见的，这成了难分解的一个原因，对此使用疏水性反应促进剂对缩短分解时间会起到很好的作用。

在上述第8发明中，难分解物质为二噁英、多氯联苯(PCB)，或扰乱内分泌物质更理想。这些难分解物质特别重要。

本申请的第9发明是锰过氧化物酶液，可以是白色腐朽菌(Phanerochaete crysosporium)经紫外线照射产生的变异株SC26菌株(以ATCC-64314的保藏号保藏)的培养液、或从该培养液获得的表现出以下的(1)耐热性以及(2)耐过氧化氢性能的锰过氧化物酶。(1)于50℃下进行45分钟热处理后的锰过氧化物酶的残余活性在50％以上。(2)在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的锰过氧化物酶的残余活性在15％以上。本申请发明人正当获得以ATCC-64314保藏的白色腐朽菌SC26菌株后进行培养时，发现能获得耐热性和耐过氧化氢性能方面都非常好的锰过氧化物酶液(以下也称之为“MnP酶液”)。另外到现在为止，又发现了在该MnP酶液中含有称为S1～S5的5种MnP同功酶。第9发明的MnP酶液由于表现出上述(1)和(2)的特性，所以非常有用。应予说明，在获得和进口上述SC26菌株时受到防疫上的一定必要条件的限制，即必须是配备对付规定水平以上生物污染的设备者。配备这样设备者有可能接受转让和进口。本申请发明人也准备在正当的理由下将第9发明涉及到的MnP酶液或该酶液中含有的MnP转让给任何人。

本申请的第10发明是符合以下(3)～(5)条件的锰过氧化物酶。(3)白色腐朽菌通过紫外线照射产生的变异株SC26菌株(以ATCC-63414保藏)产生的锰过氧化物酶；(4)等电点处于4.3～4.7范围内；(5)于50℃下进行45分钟热处理后的锰过氧化物酶的残余活性在50％以上，在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的锰过氧化物酶的残余活性在15％以上。上述称为S1～S5的5种MnP中，S1、S2和S3三种的等电点都处于4.3～4.7范围内，无论哪种都表现出于50℃下进行45分钟热处理后的锰过氧化物酶的残余活性在50％以上的很好的耐热性，以及在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的锰过氧化物酶的残余活性在15％以上的很好的耐过氧化氢特性。有可能从第9发明的MnP酶液中发现符合第10发明的新的MnP同功酶。第10发明的MnP在表现出优良的耐热性以及耐过氧化氢特性方面是很有用的，而且与第9发明的MnP酶液比较，由于是分别以单一的酶分离出来的，所以实用上很方便。

在上述第10发明中，更优选的锰过氧化物酶是其等电点为4.3，50℃下进行45分钟热处理后的锰过氧化物酶的残余活性在90％以上，在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的锰过氧化物酶的残余活性在30％以上的锰过氧化物酶。在上述第10发明中，更理想的锰过氧化物酶是其等电点为4.5，50℃下进行45分钟热处理后的锰过氧化物酶的残余活性在90％以上，在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的锰过氧化物酶的残余活性在45％以上的锰过氧化物酶。在上述第10发明中，更理想锰过氧化物酶是其等电点为4.7，50℃下进行45分钟热处理后的锰过氧化物酶的残余活性在50％以上，在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的锰过氧化物酶的残余活性在15％以上的锰过氧化物酶。以上的MnP同功酶尤其更有用。

发明的实施方案[第1发明～第4发明的实施方案]

反应方法

第1发明涉及到的反应方法是将在活化状态下作用于底物进行规定反应的介质以活化状态的活性介质投入到存在底物的反应体系的反应方法。这里所谓“投入”包括将预先通过任意手段制备的活性介质在制备后立刻投入，或通过任意手段或方法贮藏后投入的所有形式。活性介质的投入量和投入方法可以根据需要任意决定，但最好是将与底物的反应效率、底物量、反应时间等作为基准来决定投入量，可以按照底物的变换一面随时调整投入量，一面连续地或间歇地投入。反应方法中每1步骤中预定量的活性介质可以一次性地投入。

第2发明涉及到的反应方法是包括以下步骤的反应方法：即包括在没有底物存在的环境下，通过介质活化手段的作用使介质活化的活化步骤以及将活性介质从上述介质活化手段中分离出来后，转移到存在底物的环境下，使其作用于该底物的底物反应步骤。优选的反应方法是：当上述第2发明涉及到的活性介质是稳定的低分子物质时，在温和条件下使酶和介质接触来进行上述活化步骤，在高反应效率的严格的条件下进行上述活性介质和底物之间反应的反应方法。

第3发明涉及到的反应方法是将上述第1发明涉及到的介质以高活化状态的高活性介质投入到上述反应体系的反应方法，其中高活性介质的活性和/或稳定性比上述活化状态的活性介质的更高。

介质

所谓介质就是反应介体，是通过酶以及其它任意的介质活化手段活化使之成为活性介质，作用于反应的底物完成既定反应的物质。例如，已知有以锰过氧化物酶作为介质活化手段的锰离子、以漆酶作为介质活化手段的HBT(1-羟基苯并三唑)或NHA(N-羟基乙酰苯胺，N-hydroxyacetanilide)等，无论哪一种都可用于本发明中。作为介质还有诸如ABTS(2，2’-偶氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，2，2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)和以木质素过氧化物酶为活化手段的3，4-二甲氧基苄醇等。另外从更广泛的意义上来说NAD和NADP等辅酶类也可以成为本发明的介质。

活性介质

所谓活性介质是指作用于底物能够进行既定反应的那样的处于活性状态的介质。活性介质是通过使后面讲到的介质活化手段作用于介质生成的。活性介质中包括通常的活性介质和高活性介质。所谓通常活性介质是指象诸如3价锰离子那样的通常的活化状态而且处于游离状态的活性介质。所谓高活性介质是指与通常活性介质相比，其活性和/或稳定性更高的高活化状态的介质，例如与通常活性介质相比处于高活性的激发状态的活性介质，或者是通常的活性介质呈现至少含有配位化合物的高级次化合物形态，变成高稳定性的介质。作为处于特别高活性的激发状态的活性介质的例子如具有高的氧化还原电位的金属配位化合物、氧化剂(金属离子等)和二酮和/或其衍生物的混合体、金属和二酮和/或其衍生物的配位化合物、酮类(二酮或其衍生物)的自由基等。稳定性特别高的高活性介质如活性介质通过与稳定剂结合而使其稳定的活性介质(例如3价锰离子与丙二酸或二酮结构体等形成配位化合物的活性介质)等。

介质活化手段

在第1发明或第3发明的反应方法中，介质活化手段包括酶，但不限定于酶。关于酶下面将讲到，而就酶以外的介质活化手段来说，可以根据活性介质的种类或其使用目的等任意选择。例如可以通过酶以外的催化剂、光照射、电磁波照射、外加电压或介质的等离子体化活化介质。作为催化剂可以利用具有通常催化作用的各种化学物质、光催化剂等。上述化学物质并不限定于电子受体类物质，例如是金属离子、金属配位化合物、有机酸、芳香族羧酸等。关于光催化剂可以有效利用上述光照射，具体来说如二氧化钛。作为通过电磁波照射、外加电压和等离子体化的例子如传荷配位化合物等电荷不平衡的物质或价电子处于激发状态的物质等。

在第2发明的反应方法中介质活化手段是该介质参与酶反应的酶。只要是酶反应机制中有介质参与的酶，并不限定于哪一种类。例如理想的有代表性的酶是锰过氧化物酶和漆酶等氧化酶。

在活化反应场所和底物反应场所被不使酶通透的半透膜隔离开的那样情况下，也可以将酶以单一的水溶液形式投入到活化反应场所。不过一般来说，最好是通过不溶性载体对酶进行固定化。作为酶的固定化及其使用的形式可以是将酶固定于粉粒状的不溶性载体上之后，分散投入到介质溶液中，或者是将固定化酶填充到使介质溶液通过的柱子中，或者是将酶固定于介质溶液通过的作为固定床组成材料的载体上。一个理想的不溶性载体例子是多孔载体，而多孔形不溶性载体中更理想的例子是具有很多与通常大小的酶相当的中孔，通过这些中孔容纳酶，使其不溶解和稳定的中孔(性)多孔体。特别是例如以水硅钠石等硅酸盐为原料，利用形成细孔用模板物质等构成的中孔性的硅多孔体(以下也称为“FSM”)。

在活化反应场所中当通过酶以外的手段可以使介质活化时也可以使用该手段。所述的手段如在锰过氧化物酶存在下将作为介质的锰离子活化为3价离子时，可以通过适当的化学手段将氧化锰氧化，或使二氧化锰还原，另外也可以通过电象上述那样进行氧化或还原。在这种情况下，使介质溶液中预先含有螯合剂，使3价锰离子稳定也优选。

底物

在确定介质和酶(或者酶以外的介质活化手段)后底物的种类或者类型也就自动地确定了。而如以锰过氧化物酶或漆酶等氧化酶为例，作为反应对象的种类或含有该底物的工业上被处理的材料的种类范围非常广泛。最优选的底物以及工业的被处理材料例子如被处理材料是纸浆，底物是为使纸浆漂白纸浆中应当分解的木质素。

反应装置

上述第2发明涉及到的反应方法最好利用第4发明涉及到的反应装置进行，上述活化步骤在第4发明的上述活化反应场所进行，而上述底物反应场所在第4发明的上述底物反应场所进行。所谓活化场所和底物反应场所至少要保持能防止底物从后者转移到前者的隔离状态，而且需要通过可使化学介质从前者转移到后者的输送手段将两者联系起来。只要具备这些条件，上述两个反应场所也可以由适当形式的分别独立的反应容器或反应槽等构成，或者是通过将同一反应容器内或反应槽内用隔膜或隔板等分开来构成上述两个反应场所。虽然上述输送手段的内容没有限定，但由于介质通常处于水溶液状态，活性介质也以水溶液转移，所以最好使用诸如输送液体用的(最好是具备通过泵进行强制性输送能力)泵等。在必要的时候，在该输送手段中也可以设置使介质活化手段和活性介质分离的分离手段(例如滤器等固液分离手段)。活化反应场所只要至少具备与活性介质可分离的形态的介质活化手段就够了。“可分离形态”的具体内容没有限定，在活性介质为水溶液时，可分离形态最好是诸如固定的结构物或不溶性的固体。作为固定的结构物如在介质是通过价数变化被活化的金属时的电极。不溶性的固体如固定于不溶性载体的酶。

在活化反应场所以水溶液等形态提供介质，通过介质活化手段被活化，然后将该活性介质输送到底物反应场所，这一连串工序连续进行，所以可做成连续式的。在活化反应场所不提供底物。考虑到反应条件的稳定性可以将成为介质以及活性介质的介体水配成缓冲液，另外根据需要可以含有使活性介质稳定的稳定剂。例如在锰过氧化物酶的酶反应中如果成为活性介质的3价锰离子变成2价就失去活性了，但如果存在丙二酸等特定的螯合剂，可以通过与3价锰离子结合使其稳定在3价状态。在底物反应场所提供底物，而且通过上述输送手段由活化反应场所提供活性介质。也可以使底物和活性介质连续不断地供给，在底物反应场所经过预定的处理的底物可连续输送到后面的任意工序那样构成各个工序。

活化反应场所以及底物反应场所中的pH、温度等反应条件可以通过任意手段设定，例如可以调整提供给活化反应场所的上述介质溶液的pH，在底物反应场所中追加pH调节剂，调整两个反应场所的温度等。具体的反应条件根据需要可以任意设定，但象上述第2发明那样介质活化手段是酶，活性介质是稳定的低分子物质时，活化步骤应在温和条件下进行以避免酶失活，而在高反应效率的严格条件下进行底物反应步骤，有望提高底物处理效率。在这种情况下，作为稳定的低分子物质的活性介质不会失活。即使在担心活性介质的稳定性的场合因为不存在由于酶那样的立体结构变化引起的失活机制，所以象通过上述螯合剂使3价锰离子稳定那样，用各种方法通过一定的稳定化处理使其稳定是有可能。[第5发明的实施方案]

氧化酶和氧化剂

氧化酶是利用氧化剂分解底物的一种类型的氧化酶。这种类型的酶通常称为过氧化物酶，只要是利用氧化剂类型的氧化酶，尽管其称呼和氧化剂的种类不同，都包括在第5发明的氧化酶中。这样的代表性的酶如锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶、漆酶等，另外代表性的氧化剂如过氧化氢，另外还有氧、过氧乙酸等有机过氧化物等。

使用的氧化剂浓度是在固定化酶容许的浓度范围内，其浓度范围因氧化酶、氧化剂、难分解物质的种类以及温度、pH等反应条件的不同而各异，所以没有统一的规定，例如，通过上述以前通常模式固定化的锰过氧化物酶在过氧化氢浓度为0.5～1mM左右时迅速失活，而使用同样的锰过氧化物酶的固定化酶一般情况下过氧化氢浓度为上述浓度的6倍～12倍的6mM浓度下，相当一段时间内都不失活。从这点来看，例如在以往使用锰过氧化物酶对纸浆等进行漂白时，由于过氧化氢传感器的灵敏度在0.1mM以上，有必要用葡萄糖氧化酶等酶对过氧化氢的产生进行控制。如果使用固定化酶，由于可以将过氧化氢控制在高浓度下，所以具有用便宜的双氧水就可控制的很大优点。

固定化酶

氧化酶在被固定于与该酶大小大致相当、具有结构稳定性的结构单元中后使用。此时可以将整个酶蛋白质分子固定于结构单元中，也可以固定酶的活性单元(含有活性部位的酶的片段)。就象图26和图27表示的那样，结构单元9是对pH、热、流体的流动等环境条件具有稳定性的中空的结构体，其内部固定有酶10(也可以是酶的活性单元)。结构单元9的内径大致为酶10大小的尺寸为宜。

锚定单元11在固定化酶中并不是必需构成要素，但是是连接结构单元9和酶10的要素，在将结构单元9的上述结构稳定性传递给酶10后在抑制由于酶10立体结构大的变化引起的失活的同时，赋予了容许活性部位比较小的结构变化的自由度，该结构变化是酶与底物12相互作用所必需的。构成锚定单元的分子的结构基本上与结构单元的结构相同最好，为了与酶结合，需要结合诸如羟基、氨基、吡啶基、脲基、羧基、羟基等官能团。固定于结构单元的氧化酶不通过上述那样的锚定单元，而通过范德华力等与结构单元结合也可以。在每个结构单元可容纳一个或少数几个酶。

上述结构单元可以用无机材料或聚合物等有机材料构成，该材料种类只要不妨碍本发明的目的并没有特别限定。由无机材料构成的结构单元可以由诸如硅酸或氧化铝等各种金属氧化物、与Si和Al等金属形成的复合氧化物等构成。例如作为由硅酸构成的结构单元的形成方法最好使用水硅钠石等层状硅酸盐、硅胶、水玻璃、硅酸钠。最理想的结构单元是形成由硅酸构成的有很多结构单元的集合体的中空(性)硅多孔体。中空(性)硅多孔体的制作方法没有限定，但理想的方法是使无机材料，例如水硅钠石等层状硅酸盐与作为模板物质的表面活性剂(可以使用烷基三甲基铵等阳离子表面活性剂、烷基磺酸盐等阴离子表面活性剂、聚乙二醇等非离子表面活性剂)混合反应，使可形成无机骨架的表面活性剂/无机复合体在表面活性剂的胶团周围形成后，通过诸如在400～600℃下烧结或通过有机溶剂萃取除去表面活性剂，使与表面活性剂的胶团具有相同形状的中空细孔在无机骨架中形成的方法。

使用水硅钠石等层状硅酸盐形成结构单元时，其细孔表面为疏水性，而且具有阴离子特性。疏水性表面对于没有水合作用的酶的稳定固定化最理想，阴离子性表面对于表面有氨基等阳离子的酶的固定化最理想。

如上所述，结构单元的大小最好与酶大小大致相当。中空硅多孔体中这样的结构单元的尺寸(即细孔的直径)的调整可以通过改变表面活性剂的烷基链的长度来调整胶团的直径来实现。通过将三甲基苯、三丙基苯等比较疏水性的分子与表面活性剂一起添加，使胶团溶胀，结果也可以形成大的结构单元。细孔径通常为1～30nm，理想的是2～10nm。象以上那样构成的固定化酶的形态有粉末状、颗粒状、片状、块状、膜状等形状，可以通过将它们分散投入到被处理材料中，填充到使被处理溶液通过的柱子中，构成使被处理液通过的固定床、膜、多层集聚等形态使用。

底物

作为处理对象的种类只要是使用氧化剂通过氧化酶-过氧化物酶可以分解的底物，就没有限定，例如可以将邻甲氧基苯酚、1，2，3-苯三酚等酚类作为底物。不过以社会上希望分解处理的难分解物质作为底物特别合适。有关的难分解物质举2，3个例子，如纸浆漂白处理中应当分解的着色物质木质素、作为环境激素被看作问题的二噁英、双酚A、多氯联苯类(PCB)等。[第6发明～第8发明的实施方案]

反应促进剂

反应促进剂是用于氧化酶分解底物的反应体系中的物质，需要具备两个条件：具有以下“化1”表示的二酮结构和可溶于水。由于具有二酮结构，所以确保使反应促进剂有一定的疏水性。化1

在上述的“化1”中，R1、R2、R3只要至少不是羟基和烷氧基，就没有限定。具体来说，例如可以从氢、甲基、乙基、异丙基等分子量小的烷基、这些烷基的衍生物基(例如二溴甲基和三氟甲基)、苯基等的碳5员环或6员环基、噻吩基等5员杂环或6员杂环等选择合适的。无论R1、R2、R3是同一基团，还是不同的基团都可以。但是，必须避免由于上述R1、R2、R3基的选择，结果使化1分子量过高、使反应促进剂变成不可溶于水的。特别理想的反应促进剂当R2是氢、R1和R3中的任一个是氢，而另外一个是甲基时即为乙酰乙醛，两者都是甲基时即乙酰丙酮，尤其反应促进剂是乙酰丙酮最理想。

氧化酶

氧化酶只要是通过使反应介质活化而能够使反应促进剂自由基化的酶都可以使用，并没有限定。理想的酶是氧化还原酶、特别是过氧化物酶。过氧化物酶的种类虽然没有限定，但最好使用锰过氧化物酶、辣根过氧化物酶或木质素过氧化物酶。氧化酶通过不溶性载体进行固定最理想。其固定化以及使用形式最好是将酶固定于粉粒状载体后再使用。理想的不溶性载体之一如多孔的载体，多孔的不溶性载体中更理想的是有很多大小与通常酶大小相对应的中孔，通过将酶收容在这些中孔使其不溶和稳定的中孔多孔体，尤其是诸如以水硅钠石等层状硅酸盐为原料，利用形成细孔用的模板物质等构成的多孔体的中孔硅多孔体。

反应介质

所谓反应介质是指通过特定的酶活化后成为活性介质，使反应促进剂自由基化的物质。反应介质有时由氧化酶的种类决定，例如在锰过氧化物酶中可以利用锰离子、在木质素过氧化物酶中可以利用3，4-二甲氧基苄醇等。介质是其活化状态在高反应效率的严格条件下能够维持活性的稳定的低分子物质特别理想。在上述条件下活性态即便不一定稳定，但通过诸如与稳定剂结合那样的一定处置可以稳定的物质也很理想。

促进疏水性底物分解的方法

第1个促进疏水性底物分解的方法是在混有亲水性底物和与之相比相对疏水性的底物的水溶液中，使氧化酶和反应介质以及反应促进剂共存，通过自由基化的反应促进剂使疏水性底物优先分解的方法。第2个促进疏水性底物分解的方法是包括以下工序的方法：通过氧化酶使反应介质活化的工序，将被活化的反应介质和反应促进剂添加到混有亲水性底物和相对疏水性底物的水溶液中，通过自由基化的上述反应促进剂使上述疏水性底物优先分解的工序。

在这些方法中，氧化酶以及反应介质的种类如前面所说的那样。在这些方法中作为处理对象的底物溶液是混有亲水性底物和与之相比相对疏水性底物的以水为媒介的底物溶液。亲水性底物和疏水性底物的种类没有限定。特别理想的底物溶液是应当进行漂白处理的纸浆液。即亲水性底物是应当避免被氧化酶分解的纤维素，而相对疏水性底物是要分解的着色物质木质素。底物溶液是要进行漂白处理的纸浆液时，中间可以引入纸浆的碱萃取处理，使促进疏水性底物分解的方法多级反复操作在使纸浆的漂白程度进一步提高上最理想。

难分解物质的分解方法

难分解物质的分解方法是在含有难分解物质的水溶液中使氧化酶和反应介质以及上述反应促进剂共存，通过自由基化的反应促进剂分解上述难分解物质的方法。虽然难分解物质的种类没有限定，但二噁英、PCB或扰乱内分泌的物质特别重要。扰乱内分泌物质如双酚、壬基苯酚等。

[第9发明～第11发明的实施方案]

MnP酶液

第9发明涉及到的MnP酶液可以是通过白色腐朽菌(Phanerochaetecrysosporium)的紫外线照射产生的变异株SC21菌株的培养液；或者是该培养液通过过滤或离心分离除去固体成分，得到的更高纯度的MnP酶液；也可以是通过盐析或柱层析等操作得到的更高纯度的MnP酶液。第9发明涉及到的更高纯度的MnP酶液于50℃下进行45分钟热处理后的MnP的残余活性在50％以上，在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的MnP的残余活性在15％以上。具备这样高度耐热性和耐过氧化氢特性的MnP酶液至今还属未知。该酶液由于至少包括本申请发明人称为S1～S5的5种MnP的同功酶，所以可以认为酶液的上述特性反映了所有这些MnP同功酶的特性。第9发明涉及到的MnP酶液可以以上述各种纯度的酶液原封不动地作为商品流通或被利用，也可以通过酶制剂上的任意的各种加工手段做成各种剂型、例如冷冻剂型或冷冻干燥剂型形式作为商品流通或被利用。

MnP

第10发明涉及到的MnP是白色腐朽菌的上述变异株SC21菌株产生的，等电点处于4.3～4.7范围，而且于50℃下进行45分钟热处理后的MnP的残余活性在50％以上，在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的MnP的残余活性在15％以上。上述MnP中，特别理想的是称之为S1的MnP同功酶，称为S2的MnP同功酶以及称为S3的MnP同功酶。这些MnP同功酶无论哪一个以前都没有报道过或获得过。

S1等电点为4.3，于50℃下进行45分钟热处理后的MnP的残余活性在90％以上，在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的MnP的残余活性在30％以上。S1的分子量是40.5kDa。

S2等电点为4.5，于50℃下进行45分钟热处理后的MnP的残余活性在90％以上，在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的MnP的残余活性在45％以上。S2的分子量是40.5kDa。

S3等电点为4.7，于50℃下进行45分钟热处理后的MnP的残余活性在50％以上，在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的MnP的残余活性在15％以上。S3的分子量是40.5kDa。

MnP的制造方法

按照MnP的制造方法可以制造第9发明涉及到的MnP酶液，或第10发明涉及到的任一种MnP或一种以上的MnP。具体来说，培养上述SC21菌株，可以提取上述任一种MnP酶液或MnP。SC21菌株的培养条件没有限定。有关培养基的种类和添加剂等也没有特别限定。有关的培养方法也没有特别限定，但理想的作法是：例如将1L合适的培养基加入2L的三角烧瓶中，然后添加菌体悬浊液80mL(该菌体悬浊液是通过将预先培养2天的前培养菌体搅匀后得到的)，于30℃、120rpm条件下进行适当的时间的振荡培养。有关上述以外的培养条件，最好是例如在培养至第3天时添加3，4-二甲氧基苄醇等酶诱导剂，或者向培养烧瓶内酶满后密封等。该酶的置换最好是在培养第3天以后直至培养结束每天换一次。

利用该制造方法在提取MnP酶液时，为了使酶液的纯度提高，可以象上述那样对培养液进行过滤或离心分离、为了获得更高纯度可以进行盐析或柱层析等各种操作。可以从SC21的培养物，或者从上述MnP酶液中对各个MnP分别提取和纯化。该提取和纯化工作的内容没有限定，但可以任意进行阴离子交换层析或阳离子交换层析等操作。

MnP的固定化

当使用第10发明涉及到的各种MnP时，为了进一步提高耐热性和耐过氧化氢特性，通过不溶性载体将MnP进行固定化更理想。酶的固定化以及使用形式可以是将酶固定于粉粒状的不溶性载体上之后，分散投入到介质溶液中，或者是将固定化酶填充到使介质溶液通过的柱子中，或者是将酶固定于介质溶液通过的固定床的构成材料载体上使用。一种理想的不溶性载体如多孔载体，而多孔形不溶性载体中更理想的例子如具有很多大小与通常酶大小相当的中孔，通过将酶收纳在这些中孔中使其不溶化和稳定的中孔(性)多孔体，尤其是例如以水硅钠石等层状硅酸盐为原料，利用细孔形成用的模板物质等构成多孔体的中孔(性)硅多孔体(FSM)。

MnP的利用

MnP酶液以及各种MnP用途广泛。例如，用于纸浆中木质素的分解(目的是使纸浆漂白)，以及人体中有害的难分解物质的分解等都很理想。作为有害的难分解物质如二噁英、PCB、双酚、壬基苯酚等扰乱内分泌的物质等。除此之外，尼龙等化学纤维或其它的塑料的高效分解等都是MnP酶液或各种MnP的理想用途。在MnP酶液或MnP引起的酶反应中，都同时存在着作为介质的锰离子和过氧化氢。

所谓介质是指来自于酶反应的反应产物，通过酶MnP的作用使其成为活性介质(2价锰变成3价锰)，然后作用于底物完成既定反应的物质。作为活性介质的3价锰离子通过与丙二酸等指定的螯合剂共存，通过与螯合剂结合可以使3价锰离子稳定。考虑到反应条件的稳定性，可以将作为介质以及活性介质的介体水配成缓冲液。

过氧化氢浓度对MnP酶液或MnP引起的酶反应的速度有重要的影响。在以往利用锰过氧化物酶的酶反应中，为了避免酶失活，过氧化氢浓度为0.1mM左右是实质上的上限。在本发明涉及到的MnP酶液或MnP过氧化氢浓度可以提高到0.3mM(1小时)左右。在将第10发明涉及到的MnP作为上述FSM-MnP用时，还可以将过氧化氢浓度提高到0.6mM(1小时)左右。

在酶反应中一般都提到，本发明涉及到的MnP酶液或MnP参与的酶反应中也提到反应温度对酶反应速度有重要的影响。在以往利用锰过氧化物酶的酶反应中，为了避免酶失活，反应温度为30℃左右是实质上的上限。在本发明涉及到的MnP酶液或MnP经过1小时以上可以使反应温度提高直至50℃左右。在将本发明涉及到的MnP作为上述FSM-MnP用时，经过1小时以上可以使反应温度提高直至60℃左右。

实施例[第1发明～第3发明涉及到的实施例]

(实施例1-小规模反应装置的构成例子)

图1给出了一种简易构成的反应装置。容器1中装有介质的水溶液。介质的水溶液可以是合适的缓冲液，而且可以含有可使化学介质稳定的螯合剂等稳定剂。容器1内部通过玻璃管2与作为活化反应场所的反应柱3上端连通。反应柱3内部填充了粒状的中孔(性)硅多孔体，大多数中孔内收纳酶并使其固定化。该酶是进行有上述介质参与的酶反应的酶。反应柱3的下端通过玻璃管4与作为底物反应场所的容器5内部连通。在容器5中装有水样悬浊液状态的上述酶的底物(不溶性固体物)的碎片。容器5通过栓6密闭，构成与上述反应柱3同样的封闭系统。另外容器5的内部通过玻璃管7与作为收容废液的容器8的内部连通。另外在上述玻璃管2、4、7中的任一个管中都安置了图中省略的驱动泵，都有设计好的指定流量，可以将容器1内部的水溶液依次强制性地转移到反应柱3、容器5、容器8中。

通过以上构成，装在容器1内水溶液中的介质通过玻璃管2转移到作为活化反应场所的反应柱3中，被酶活化，然后活性介质被输送到作为底物反应场所的容器5中，对底物进行所期望的反应，通过该反应变成无活性介质的水溶液废弃到容器8中。在上述实施例中，底物是水溶性物质时，将容器8作为用于进行指定的后续工序的反应容器，可以将在容器5中的进行所期望的反应后的底物连同用过的介质一起运输到容器8中。

(实施例2-活化步骤和底物反应步骤的分离)

将所定活性单位的锰过氧化物酶(以下锰过氧化物酶也称之为“MnP”)固定化的FSM(以下固定了MnP的FSM也称之为“FSM-MnP”)粉末5mg悬浮于含有介质2价锰和活性介质(3价锰)的稳定剂丙二酸盐的缓冲液[25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)、1mM丙二酸钠、0.5mM硫酸锰、0.1mM过氧化氢]中，于37℃反应5分钟后，通过离心分离除去固定化酶，得到反应上清。该反应上清含有3价锰，而且通过另外的酶活力检测可以确认没有混入MnP。将上述反应上清与一定量的含有过量浓度底物2，6-二甲氧基苯酚的水溶液混合，通过对生成的有色溶液测定470nm的吸光度，对反应上清氧化DMP的氧化能力进行定量。图2的曲线给出了测定的结果。图2中横坐标的“反应液量(ml)”表示混合在上述一定量底物水溶液中的反应上清的量。另外作为与上述不同的比较实验，用没有固定MnP的FSM进行同样的操作，可以确认在使用该反应上清时没有看到DMP发色。

就象图2表明的那样，不含有MnP的本实施例的反应上清可以使DMP发色，发色量随反应上清的量的增大而增大。由此可以确认在有介质参与的酶反应中，可以象第1发明那样将活化步骤与底物反应步骤分开。

(实施例3-活性介质的稳定性)

将实施例2得到的反应上清装入容器后置于冰中，以对DMP的氧化活性作为指标定量一定时间后的该反应上清中的3价锰的残存量。图3曲线给出了以实施例2中获得的反应上清直接测得的DMP氧化活性设为100％的相对活性的测定结果。图3中横坐标的“处理时间(时间)”表示上述在冰中放置的时间。根据测得结果可知，反应上清中活性介质中的3价锰6小时后残存有60％，即使24小时后还残存约40％，可见至少在3价锰被螯合剂(丙二酸)稳定的情况下，在从活化反应场所向底物反应场所转移过程所需要的时间内是十分稳定的。

(实施例4-酶的稳定性)

将固定有所定活性单位MnP的FSM的较粗粒状体填充到柱子中，用39℃的缓冲液[50mM丙二酸缓冲液(pH4.5)、0.1mM硫酸锰、0.05％Tween80、0.1mM过氧化氢]洗脱柱子，流速为200mL/hr，使3价锰离子连续生成。以上操作完成后，上述粒状多孔体用蒸馏水洗净后，保存于4℃下。以上操作用同样的粒状多孔体以一日一次的程度反复进行30天，以从柱子的流出液对DMP的氧化活性为指标，评价固定于粒状多孔体的MnP的酶活性的稳定性。其结果以第一天操作时的流出液对DMP的氧化活性为100％的相对活性表示在图4的曲线中。

如果从该结果来看，流出液的DMP氧化活性虽然随着天数增加的同时渐渐降低，但即使在30天后仍然维持着大约70％的相对活性。其结果一方面表示固定于FSM的酶的稳定性，同时也表明在介质参与的酶反应中，使酶只参与从空间上与底物反应步骤分开的活化步骤，这对酶的稳定性也有利。

(实施例5-纸浆的漂白)

在用与实施例4相同的缓冲液在同样的条件下洗脱与实施例4准备的同样柱子，通过连续地将流出液输送到收容1％未漂白纸浆的反应槽(底物反应场所)，进行纸浆的漂白。上述无论哪一操作都是在39℃下进行的。另外作为比较例，对填充了没有固定化酶的FSM的稍粗粒状体的柱子也用上述那样的缓冲液洗脱，用流出液进行同样的纸浆漂白实验。

实验结果以纸浆白度(％)随相应漂白实验开始后反应时间过程的变化表示在图5的曲线中，从“●”曲线给出的本实施例可以看出纸浆白度有效提高，相对于用“X”给出的比较例表现出显著差别。

(实施例6-在各个温度下3价锰的反应性)

向50μl固定了所定活性单位MnP的FSM中加入底物溶液[30mM丙二酸缓冲液(pH4.5、10mM硫酸锰、0.1mM过氧化氢)]1mL，于37℃下反应5分钟。通过离心分离分离固定化酶，将反应上清作为活性Mn溶液保存在冰中。将活性Mn溶液于各个温度下保温10分钟，以270nm的吸光度变化作为指标测定消失的Mn(III)、即3价锰量。图6给出了在各个温度下Mn(III)的消失量，即反应速度。与丙二酸形成配位化合物的Mn(III)即使在约30℃以下的低温区也几乎不反应(还原反应)，维持稳定，而相反在约40℃以上的高温区，随着温度的上升，其反应速度急剧增加。这表明在高温通过使Mn(III)与纸浆接触，可以有效地与纸浆反应。

(实施例7-酶柱以及反应槽的反应温度与纸浆漂白效率的关系)

将0.4mL所定活性单位的MnP的FSM填充到柱子中，用活化缓冲液[10mM硫酸锰、0.05％Tween80、0.1mM过氧化氢、30mM丙二酸缓冲液(pH4.5)]洗脱柱子，流速为360mL/hr，使Mn(III)连续生成。将含有Mn(III)的酶反应液连续地输送到收容1％未漂白纸浆的反应槽中，进行纸浆漂白。在此过程中，酶柱和反应槽分别保温在39℃或70℃下。酶柱和反应槽都保温在39℃时(图7(A)表示的情况)，虽然酶活性大约能保持10小时，但纸浆漂白效率低。酶柱和反应槽都保温在70℃时(图7(B)表示的情况)，酶活性从反应刚开始就急速下降，虽然初期白度上升很快，但随着酶的失活，白度的上升也达到顶点。另外将酶柱保温在39℃下，而反应槽保温在70℃时(图7(C)表示的情况)，在酶活性保持稳定的同时，漂白速度也快了，能更有效地漂白纸浆。从图7(A)～图7(C)的结果可以确认通过将酶柱和反应槽分别设定在最适温度，可以实现更有效的酶反应。

(实施例8-酶处理和碱萃取配合的多级漂白)

使利用固定了MnP的FSM的酶漂白与碱萃取交替反复操作，对未漂白纸浆进行漂白。在上述实施例7给出的系统中，通过将酶柱保温在39℃，反应槽保温在70℃进行60分钟酶漂白后，将纸浆悬浮于碱性溶液(2.5％氢氧化钠)中，于70℃下保温5分钟。将纸浆洗净后，反复进行上述操作，直至获得目的白度(白度85％)为止。结果表明通过进行7次酶漂白和7次碱萃取，就象图8“●”曲线表示的那样，可以看到总共用大约450分钟就可达到目的白度，实际的纸浆漂白可以达到产业上可实用的水平。另外就象图8“○”曲线表示的那样，漂白过程中通过FSM-MnP生成的Mn(III)的量(用吸光度270nm测定)稳定，FSM-MnP具备可适用于实际纸浆漂白工序的充分稳定性。

(实施例9-利用固定化漆酶漂白纸浆)

将固定了所定活性单位漆酶的FSM填充到柱子中，保温于40℃下，连续地用作为介质含有1mM ABTS的50mM乙酸缓冲液(pH4.5)进行洗脱。将反应液连续地输送到保温在70℃的装有1％未漂白纸浆的反应槽中，进行纸浆漂白。此时，以436nm的吸光度为指标检测来自反应液中含有的ABTS的活性自由基的浓度，检测结果如图9(b)所示，与此同时每隔一定时间从反应槽中取纸浆样品进行白度测定，结果如图9(a)所示。

图9(a)、(b)中，●曲线代表的上述实施例通过酶使介质活化，生成了自由基，通过自由基与纸浆反应，纸浆的白度上升，与此相反，■曲线代表的比较例(填充了没有固定漆酶的FSM的柱子)没有给反应槽提供活化的自由基，所以纸浆的白度也没有上升。在FSM固定化漆酶柱和反应槽两者都保温在40℃的比较例(×曲线)中，可以确认相对于实施例，漂白速度变慢。

从这些结果可以确认：本发明的方法可适用于使用漆酶的纸浆漂白中，通过使酶反应阶段和纸浆漂白阶段的反应条件分别最适化，与使用MnP时一样可有效地漂白纸浆。

(实施例10-通过固定化木质素过氧化物酶漂白纸浆)

将固定了木质素过氧化物酶的FSM填充到柱子中，保温于40℃下，用含有10mM邻甲氧基苯酚和0.4mM过氧化氢的琥珀酸缓冲液(pH4.5)连续洗脱，通过与实施例7同样的系统对纸浆漂白2小时，结果表明与实施例中白度63.3％相比，填充了没有固定化木质素过氧化物酶的FSM的柱子的比较例白度是61.9％。通过显著性差异检测，可以确认该实施例与比较例的差异存在统计上的显著差异。[第5发明涉及到的实施例]

(实施例11：中孔(性)多孔体的合成)

向100mL的烧杯中分别加入5.0g(0.028mol)的δ-Na₂Si₂O₅(水硅钠石)、50mL的离子交换水，于约25℃下搅拌3小时，进行阳离子交换。然后过滤掉水溶液，得到δ-Na_1.6H_0.4Si₂O₅沉淀。向该沉淀加入50mL的离子交换水搅拌直至成为均匀的分散液，将这种溶液作为A液。另外，向100mL的三角烧瓶中加入3.0g(0.0082mol)的十六烷基三甲基溴铵(HDTMA-Br)和50mL的离子交换水，于60℃下搅拌变成完全透明，然后添加5.0g(0.025mol)的三异丙基苯(TIPB)，剧烈搅拌10分钟，将该溶液作为B液。将上述A液移至250mL的三口烧瓶中，在剧烈搅拌下慢慢地添加B液，使温度升至80℃后，连续进行3小时恒温反应。然后一边用2N盐酸将该反应液的pH调至8.5±0.1，一边搅拌3小时后，立刻过滤，用200mL的离子交换水进行5次洗涤过滤。将过滤的生成物(白色粉末)于45℃下，风干24小时，然后于550℃的电炉中烧结，得到除去了模板物质的中孔(性)硅多孔体约3.5g。用X射线衍射仪(理学RAD-B)测定该多孔体的结构，用氮气吸附装置(Autosorb mp-1)测定多孔体的细孔直径和表面积以及细孔总容积。详细测定过程省略，细孔直径几乎均一都是约50。该多孔体称之为“FSM-50载体”。

一方面准备与上述相同的A液，另一方面向100mL的三角烧瓶中加入4.0g(0.01mol)的二十二烷基三甲基氯铵(DTMA-C1)和50mL的离子交换水，于约60℃下搅拌直至完全透明，然后添加8.0g(0.04mol)的TIPB，剧烈搅拌10分钟，将该溶液保持在60℃下，作为B2液。就A液和B2液进行象上述实施例1-1中对A液和B1液那样的操作，得到的生成物同样进行风干和烧结，得到约4.5g的中孔(性)硅多孔体。就该多孔体进行与实施例1-1同样的结构确认和测定。详细测定过程省略，细孔直径几乎均一都是约70，该多孔体称之为“FSM-70载体”。

除了将上述的B液的制备过程中使用的TIPB量由8.0g(0.04mol)变更为16.0g(0.08mol)以外，其它操作完全与上述操作相同，得到约4.5g中孔(性)硅多孔体。就该多孔体进行与实施例1-1同样的结构确认和测定。详细测定过程省略，但细孔直径几乎均一都是约90，该多孔体称之为“FSM-90载体”。

(实施例12：FSM-MnP等的制备)

将培养白色腐朽菌得到的锰过氧化物酶(MnP)用pH4.5的50mM琥珀酸缓冲液调整为0.2mg/mL。然后将3份约70mL的该酶液分别加到上述的各200mg的“FSM-50载体”、“FSM-70载体”和“FSM-90载体”粉末中，于4℃下缓慢地混合16小时以上，然后离心分离，再用去离子水洗3次，得到固定化酶(结合了MnP的各个FSM载体)。将固定化载体不同的上述3种固定化酶一并称之为“FSM-MnP载体”，要将它们分别称呼时，使用FSM-50载体的FSM-MnP简单地称为“FSM-50/MnP”，使用FSM-70载体的FSM-MnP简单地称为“FSM-70/MnP”，使用FSM-90载体的FSM-MnP简单地称为“FSM-90/MnP”。

另外一方面按照“Applied Biochemistry and Biotechnology，60卷、1-17页，1996年”记载的方法，准备将与上述FSM-MnP情况相同的锰过氧化物酶固定于聚合物的固定化酶，而固定的酶量平均重量与上述相同。该固定化酶以下称之为“Emphaze”，用作比较例的固定化酶。另外，使用富士Silysia公司生产的硅胶5D(平均细孔直径为190)，准备将与上述FSM-MnP情况相同的锰过氧化物酶固定了的固定化酶，而固定的酶量平均重量与上述相同。该固定化酶以下称之为“硅胶”(silica gel)，用作比较例的固定化酶。

(实施例13：FSM-MnP的评价)

氧化剂存在下FSM-MnP的pH稳定性

向5mg的FSM-70/MnP中加入90μL的50mM各种不同pH的缓冲液，于37℃下处理1小时，离心分离固体成分后，用500μL的离子交换水洗净。向该FSM-70/MnP中加入含有作为底物的0.5mM的MnSO₄和2mM草酸钠和0.1mM过氧化氢的950μL50mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)，于37℃下反应5分钟，然后离心5分钟，测定上清的270nm的吸光度(作为酶反应生成物的3价锰的配位化合物)。以该测定值评价FSM-70/MnP的酶活性，图10中的曲线是按照以最大活性值为100的相对数值画的曲线。

另外向4单位非固定化的锰过氧化物酶中加入90μL的50mM各种不同pH的缓冲液，于37℃下处理1小时，用其中的5μL进行同样的反应，同样测定吸光度，如图10所示。另外，对上述5mg“Emphaze”和FSM-70/MnP也进行同样处理，进行反应，同样测定吸光度。如图所示10。就象图10表示的那样，以标记为“Native”的非固定化的锰过氧化物酶和“Emphaze”几乎没什么差别，与这两者相比，可看出“FSM-70/MnP”在超过pH4范围内显著的pH稳定性。

氧化剂存在下FSM-MnP随时间变化的稳定性

向5mg的FSM-70/MnP中加入200μL的25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)，于60℃下进行不同时间的处理，离心分离固体成分后，用500μL的离子交换水洗净。向该FSM-70/MnP中加入含有作为底物的0.5mM MnSO₄和2mM的草酸钠和0.1mM的过氧化氢的950μL的25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)，于37℃下反应5分钟，然后离心5分钟，测定上清的270nm的吸光度(作为酶反应生成物的3价锰的配位化合物)。以该测定值评价FSM-70/MnP的酶活性，图11中的曲线是按照以最大活性值为100的相对数值(图11中用“相对活性”表示)画的曲线。

另外向4单位非固定化的锰过氧化物酶中加入50μL的50mM pH4.5琥珀酸缓冲液，于60℃下进行与上述同样的各种时间处理，用其中的2.5μL进行同样的反应，同样测定吸光度，如图11所示。另外，就上述的“Emphaze”和“silica gel”各5mg也象FSM-70/MnP那样处理，使其反应，同样测定吸光度，如图11所示。就象图11表示的那样，以“Native”表示的非固定化的锰过氧化物酶随时间变化的稳定性非常低，而“Emphaze”和“silica gel”活性也迅速降低很多，而“FSM-70/MnP”在经过2小时后仍然维持大约70％的相对活性。

氧化剂存在下FSM-MnP的热稳定性

向各5mg的FSM-50/MnP、FSM-70/MnP以及FSM-90/MnP中分别加入200μL的25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)，于各种不同的温度下处理1小时，离心分离后，再用500μL的离子交换水洗净。向各个FSM-MnP中分别加入含有作为底物的0.5mM的MnSO₄和2mM的草酸钠和0.1mM的过氧化氢的950μL的25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)，于37℃下反应5分钟，然后离心5分钟，测定上清的270nm的吸光度(作为酶反应生成物的3价锰的配位化合物)。用该测定值评价各个FSM-MnP的酶活性，图12中的曲线是按照以最大活性值为100的相对数值画的曲线。

另外向4单位非固定化的锰过氧化物酶中加入50μL的50Mm的pH4.5的琥珀酸缓冲液，于上述相同的各种温度下处理1小时，用其中的2.5μL进行同样的反应，同样测定吸光度，如图12所示。就象图12表示的那样，以“Native”表示的非固定化的锰过氧化物酶和各个FSM-MnP在比较高的温度范围内可以看到显著性差异。另外，就各个FSM-MnP之间来说，具有与锰过氧化物酶的酶直径几乎一致的细孔直径的“FSM-70/MnP”特别好。

氧化剂存在下FSM-MnP随时间变化的稳定性

向各5mg的FSM-50/MnP、FSM-70/MnP以及FSM-90/MnP中分别加入200μL的200mM的50mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)，于60℃下进行各种不同时间的处理，离心分离后，再用500μL的离子交换水洗净。向各个FSM-MnP中分别加入含有作为底物的0.5mM的MnSO₄和2mM的草酸钠和0.1mM的过氧化氢的950μL的25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)，于37℃下反应5分钟，然后离心5分钟，测定上清的270nm的吸光度(作为酶反应生成物的3价锰的配位化合物)。以该测定值评价各个FSM-MnP的酶活性，图13中的曲线是按照以时间0点活性值为100的相对数值(图13中用“相对活性”表示)画的曲线。

另外向4单位非固定化的锰过氧化物酶中加入50μL的50Mm的pH4.5的琥珀酸缓冲液，于60℃下进行上述那样各种时间的处理，用其中的2.5μL进行同样的反应，同样测定吸光度，如图13所示。就象图13表示的那样，可以看出以“Native”表示的非固定化的锰过氧化物酶和各个FSM-MnP随时间变化的稳定性有显著的差异。另外就各个FSM-MnP之间比较来说“FSM-70/MnP”特别好。

FSM-MnP对氧化剂浓度的稳定性

向2mg的FSM-70/MnP中加入含有作为底物的0.5mM的MnSO₄和2mM的草酸钠和各种不同浓度过氧化氢的950μL的25mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)，于37℃下反应5分钟，然后离心5分钟，测定上清的270nm的吸光度(作为酶反应生成物的3价锰的配位化合物)。以该测定值评价FSM-70/MnP的酶活性，图14中的曲线是按照相对于过氧化氢浓度为0时的吸光度的比吸光度(图14中用“相对活性’’表示)画的曲线。

另外向3单位非固定化的锰过氧化物酶中加入含有上述那样各种不同浓度过氧化氢的缓冲液，进行同样的反应，测定吸光度，如图14所示。就象图14表示的那样，以“Native”表示的非固定化的锰过氧化物酶和“Emphaze”在0.5mM过氧化氢浓度下已经表现出显著的失活，与此相反，“FSM-70/MnP”即使在最大为6mM的过氧化氢浓度内仍维持有效的活性。而各个例子在过氧化氢的极低浓度范围内没有表现出充分的活性，但这是由于氧化剂绝对量不足引起的，并不意味着酶的活性低。

(实施例14：纸浆的漂白)

将FSM-70/MnP的稍粗的粒状体填充到柱子中，用39℃的缓冲液[50mM丙二酸缓冲液(pH4.5)、0.1mM硫酸锰、0.05％Tween80、0.1mM过氧化氢]洗脱柱子1小时，流速为200mL/hr，使3价锰离子连续生成。然后连续地将该流出液输送到收容1％未漂白纸浆的反应槽，进行纸浆的漂白。上述无论哪一操作都是在39℃下进行的。

另外作为比较例，对填充了没有固定化的FSM-70载体的稍粗的粒状体的柱子也用上述那样的缓冲液洗脱，用流出液进行同样的纸浆漂白实验。

这些结果作为纸浆白度(％)随漂白实验开始后的反应时间过程的变化表示在图15的曲线中，在“●”曲线给出的本实施例中可以看出纸浆白度有效提高，相对于用“X”给出的比较例可以看出显著性差异。[第6发明～第8发明涉及到的实施例]

(实施例15：纸浆的漂白)

Kraft法(磷酸盐法(制浆))蒸煮后的纸浆1kg用5L蒸馏水洗3次，制备未漂白纸浆。另外利用阴离子交换层析从P.chrysosporiumBFC-1767菌株(ATCC 64314)的培养液中纯化锰过氧化物酶。

然后相对于含有0.1mM硫酸锰、0.05％Tween80、0.5M的葡萄糖的50mM乙酸缓冲液(pH4.5)分别加入各50mM的乙酰丙酮、丙二酸、柠檬酸或酒石酸，制备各种测试溶液。

向上述各个实验溶液100mL添加上述未漂白纸浆使纸浆浓度为1％，然后加入锰过氧化物酶100单位和5单位葡萄糖氧化酶，于37℃、50rpm下一边振荡一边使其反应。

然后使用反应刚开始后，反应开始5小时后以及反应开始24小时后的各个实验溶液，将纸浆过滤后，做成手制纸，按照JIS P-8123测定这些手制纸白度。结果如图16所示。在图16的曲线图中，横坐标表示反应开始后经历的时间，纵坐标表示白度(％)。

就象从图16的结果所了解的那样，与作为反应促进剂使用的丙二酸以及其它有机酸情况相比，使用本发明实施例使用的乙酰丙酮能迅速地提高纸浆的白度。在本发明实施例中从反应开始5小时后直到反应开始24小时后的纸浆白度的提高达到顶点，考虑这是由于木质素分解效果(提高白度的效果)已经饱和的缘故。

(实施例16-乙酰丙酮浓度的影响)

进行与实施例15中加有50mM的乙酰丙酮的试验例相关的试验例，其中乙酰丙酮的添加量变更为0mM、5mM、15mM、150mM以及500mM，其它方面与上述实施例15试验例相同。应予说明白度测定的时间是反应刚开始后、反应开始2小时后以及4小时后。包括添加50mM的乙酰丙酮的例子在内的结果都表示在图17中。

就象从图17的结果所了解的那样，乙酰丙酮的浓度越高，纸浆的白度也迅速提高。但从添加了高浓度的乙酰丙酮的例子可看到纸浆白度迅速上升后有变平的倾向。其理由可能是效果饱和了，也可能是由于高浓度的乙酰丙酮使酶失活了。

(实施例17-多级分解法)

将实施例15中制备的未漂白纸浆悬浮于2.5％氢氧化钠溶液中，使纸浆浓度为1％，于60℃下加热搅拌30分钟(该碱提取处理称之为E工序)。将经E工序处理的未漂白纸浆完全象实施例1那样按照本发明的促进分解方法进行处理(该工序称为M工序)。

然后使E工序和M工序交替反复多级操作，共进行9次，每当在第3、第5、第7、第9工序的E工序结束时，过滤纸浆做成手制纸，按照JIS P-8123标准测定纸白度。

另外也进行在M工序不添加乙酰丙酮，其它都同样进行的比较例实验以及在M工序不添加乙酰丙酮和锰过氧化物酶，其它都同样进行的比较例实验，

结果如图18所示。在图18中，“MnP⁺，acac⁺”代表本发明的实施例，“MnP+，acac-”代表没有添加乙酰丙酮的比较例，“MnP-，acac-”代表没有添加乙酰丙酮和锰过氧化物酶的比较例。另外，图中的横坐标不是工序次数，而表示在各次工序中分解反应的累计时间。各个曲线由左边开始依次代表第3、第5、第7、第9工序。

从图18可以看出，与比较例相比实施例纸浆白度提高效果非常迅速，直至得到高的白度之前没有出现效果饱和的倾向，最终能达到超过80％的非常高的白度。

(实施例18-酶的固定化)

以层状硅酸盐水硅钠石作为原料，利用形成细孔用的模板物质，按照所定的方法构成具有均一50细孔径的中孔(性)硅多孔体(该多孔体称之为“FSM-70”)。

另外用pH4.5的10mM乙酸琥珀酸缓冲液将实施例15制备的锰过氧化物酶配成5mg/mL溶液。然后将该溶液5mL加到200mg的上述FSM-70中，于4℃下缓慢地混合16小时以上，获得固定于FSM-70上的锰过氧化物酶(该固定化酶称之为“FSM-MnP”)。

(实施例19-酶反应与纸浆漂白反应的分离)

使含有0.1mM硫酸锰、0.05％Tween80、1mM过氧化氢的200mL的50mM丙二酸缓冲液(pH4.5)通过填充了3mg FSM-MnP的小柱子，流速为8mL/分，回收穿过液，制备3价锰离子溶液。

相对于50mL上述回收的穿过液，作为比较例添加干重0.5g的纸浆，而作为实施例添加干重0.5g的纸浆和乙酰丙酮0.5M(最终浓度)，于70℃下振荡1小时。然后根据270nm吸光度消失确认3价锰离子的消失后，进行与实施例15同样的操作做成手制纸，测定白度。

测定结果是：在实施例中白度为62.3％，与未处理的纸浆白度比较提高了3.3％。比较例中的白度为59.9％，白度提高了0.9％。以上结果表明在本发明的促进疏水性底物分解的方法中氧化酶的作用在于提供了作为活化反应介质的3价锰离子，在进行纸浆漂白反应时，如果存在活化反应介质、反应促进剂和底物最好。

因此，通过将利用氧化酶作用生成活性反应介质的反应和利用该活性反应介质进行纸浆漂白的反应分别在不同场所进行，既避免了由于反应促进剂引起的酶的失活，又可通过添加高浓度反应促进剂促进疏水性底物的分解，该方法是个值得极力推荐的方法。

(实施例20-纸的质量实验)

将实施例17中“MnP+，acac+”的第9工序后的纸浆和用乙酰丙酮代替丙二酸进行同样处理的第9工序后的纸浆分别用水调整到纸浆浓度约为0.3％，按照JIS P 8222标准，用每边为250mm的方形片纸机做成手制纸，标准为干透张重60g/m²。按照JIS P 8111标准将手制纸于23℃、50％r.h的条件下进行预处理后，根据JIS P 8112标准测定破裂强度。

测定结果表明比破裂强度为6.8kPa·m²/g，而添加了丙二酸的漂白纸浆的比破裂强度降低到6.5kPa·m²/g。而添加乙酰丙酮的漂白纸浆的比破裂强度为6.8kPa·m²/g，与漂白前一样。以上结果表明通过使用作为反应促进剂的乙酰丙酮，只分解作为疏水性底物的木质素进行漂白，因不分解作为亲水性底物的纤维素又可以避免纸的质量下降。[第9发明～第11发明涉及到的实施例]

(实施例21-SC21菌株的培养和粗酶液的制备)

使用T.K.Kirk等人(Arch.Microbiol.117，277-285(1978))和M.H.Gold等人(Arch.Biochem.Biophys.234，353-363(1984))的培养基培养从ATCC(美国典型培养物保藏中心)获得的白色腐朽菌(Phanerchaete crysosporium)SC21菌株(ATCC-64314)。

将孢子接种于斜面培养基上，于37℃下培养约2周，使孢子充分形成。将形成的孢子悬浮于5mL的蒸馏水，制备孢子悬浮液，将1mL的孢子悬浮液接种于100mL的前培养基，于37℃下静置培养3天。

对前培养液进行30秒均化，使菌丝充分分散后，将100mL前培养液接种于1L正式培养液。然后于37℃下旋转培养3天(50mm、150rpm)后，添加3，4-二甲氧基苄醇，再对烧瓶内用氧进行置换、加压(0.25kgf/cm²)，继续培养。以后每日一次象上述那样继续用氧置换、加压直至培养结束。

在培养液的颜色呈红褐色、上清中的酶活性非常高时终止培养。然后通过玻璃过滤器除去菌体获得培养滤液。向该培养滤液加PEG4000(5％)，用氢氧化钠将pH调至7.2，于冰中缓慢搅拌。生成的沉淀用玻璃过滤器除去，获得粗酶液。

(实施例22-MnP的纯化)

使实施例21获得的粗酶液1L吸附于阴离子交换树脂DEAESepharose Fast Flow柱(Pharmacia公司生产，50mm×100mm)，用洗净缓冲液(10mM磷酸钠，pH7.2)洗，然后依次用洗脱缓冲液-1(20mM磷酸钠，pH6.0)、洗脱缓冲液-2(20mM琥珀酸钠，pH5.5)和洗脱缓冲液-3(50mM琥珀酸钠，pH4.5)三种缓冲液进行洗脱，将MnP洗脱下来。通过测定血红素蛋白特有的405nm的吸光度检测MnP。405nm处的吸峰与MnP活性一致性良好，由图19可见MnP被洗脱缓冲液3洗脱。在图19中，上述洗净缓冲液用①表示，洗脱缓冲液-1用②表示，洗脱缓冲液-2用③表示，洗脱缓冲液-3用④表示。将洗脱出来的MnP活性级分用10mM琥珀酸钠(pH3.5)缓冲液透析后，吸附于阳离子交换柱MonoS 5/5HR上。

通过氯化钠的0～0.4M线性浓度梯度将吸附的MnP从柱子上洗脱下来，就象图20给出的那样，分离出5个具有405nm吸收的峰。这些峰级分都有MnP活性，它们是性质不同的5种同功酶。将各个活性峰包含的同功酶从保留时间最短的开始依次命名为S1、S2、S3、S4和S5。

(实施例23-同功酶分子量和等电点的解析)

通过SDS-PAGE解析各个活性峰包含的MnP的分子量。发现来自各个活性峰的MnP为分子量约46000的单一一条带，是分子量几乎相同的一组同功酶。另外，通过使用IEF PAGE mini(テフコ生产)等电点电泳解析各个活性峰包含的MnP的等电点，可知上述5种同功酶的等电点pI分别为：S1为4.3、S2为4.5、S3为4.7、S4为4.8、S5为4.9，它们是等电点都不同的一组同功酶。

(实施例24-酶的稳定性)

将上述各个同功酶于50mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)中在50℃下进行一定时间的热处理，然后通过测定随时间变化的残存活性，评价酶的耐热性。结果如图21所示。就象图21所表明的那样，S4和S5的耐热性比较差，S1和S2表现出很好的耐热性。S3的耐热性处于中间。

另外、测定在0mM、0.03mM、0.3mM和3mM浓度的过氧化氢存在下于37℃下对各个同功酶处理1小时后的残存活性。结果如图22所示。就象图22所表明的那样，S4和S5在有0.03mM过氧化氢存在下几乎完全失活了，而在同样浓度的过氧化氢情况下，S1和S2的残存活性在70％以上，S3的残存活性在50％以上，而且即使在有3mM的高浓度的过氧化氢存在下，仍有一定的残存活性。

这些结果表明在各个同功酶中有时即使其功能相同，但对环境耐性差异异很大，在产业的应用上对环境耐性好的酶或同功酶是很重要的。

(实施例25-FSM-MnP的制备)

含有S1～S5各个同功酶的活性级分对10mM琥珀酸缓冲液充分透析，相对于含有约70埃细孔径的上述FSM以50U/mg的比例添加透析后的酶液，通过4℃下搅拌过夜，制备MnP固定于FSM的FSM-MnP。

(实施例26-FSM-MnP的耐热性)

将象上述那样固定S1～S5各个同功酶后构成的FSM-MnP分别在50mM琥珀酸缓冲液(pH4.5)中于60℃下进行一定时间热处理，通过测定随时间变化的残存活性来评价酶的耐热性。结果如图23所示。通过对比图23和图21可知，FSM-MnP的耐热性反映了固定化同功酶的耐热程度。

(实施例27-用FSM-MnP漂白纸浆)

将象上述那样固定了S1～S5各个同功酶后构成的FSM-MnP各20mg分别装柱，通过使漂白缓冲液[30mM丙二酸缓冲液(pH4.5)、10mM硫酸锰、0.05％Tween80、0.1mM过氧化氢]连续地从柱子中流过，对锰进行活化。将含有活化了的锰的酶反应液输送到含有1％浓度纸浆的反应槽，进行纸浆漂白。

在通过测定270nm的吸光度检测酶活性随时间变化的同时，从反应槽中取出经过一定时间的纸浆样品制作纸浆纸，通过测定其白度(％)(依据JIS P 8123)，评价FSM-MnP的漂白纸浆活性。图24给出了酶活性随时间变化的测定结果，图25给出了漂白纸浆活性的评价结果。

从图24可知固定了S1或S2的FSM-MnP经8小时实验后的活性约为90％，而经过同样时间实验的固定了S3的FSM-MnP的活性约50％，而在固定了S4或S5的FSM-MnP中，反应开始后活性急剧下降，反应1小时后的残存活性在30％，而反应2小时后酶几乎完全失活了。

从图25可知使用固定了S1或S2的FSM-MnP时，纸浆白度随反应时间延长而提高，虽然在反应后期其上升程度变慢，但经过8小时后白度分别提高了8点或10点。使用固定了S3的FSM-MnP时经过8小时后白度上升了5点。使用固定了S4或S5的FSM-MnP时，经过8小时后白度上升停止在2点左右。

这些结果表明为了使通过MnP漂白技术实用化，必须使用稳定性高的MnP。

产业上的利用范围

如上所述，本发明可以被有效地用于有介质参与的各种产业上有用的酶反应、以及利用酶以外的介质活化手段的反应、尤其是用于纸浆的木质素分解和各种难分解物质的分解中。

按照条约第19条的修改

1.一种反应方法，是向有底物存在的反应体系中投入在活性状态下作用于上述底物完成既定反应的介质的反应方法，该介质是以处于上述活性状态的活性介质投入的。

2.权利要求1记载的反应方法，特征是在上述反应方法，将通过作为介质活化手段的酶使介质活化的活化步骤设置在前面，然后将通过该活化步骤得到的活性介质投入到反应体系中。

3.权利要求2记载的反应方法，特征是当上述活性介质是稳定物质时，使酶和介质在温和条件下接触来进行活化步骤，在可获得高反应效率的严格条件下进行活性介质和底物的反应。

4.权利要求1记载的反应方法，特征是将上述介质以比处于活性状态的活性介质的活性和/或稳定性更高的高活化状态的高活性介质投入到反应体系中。

5.权利要求4记载的反应方法，其中上述高活性介质是处于比活性介质更高活性的激发状态，或者是至少含有配位化合物的高级次化合物。

6.权利要求1、4或5记载的反应方法，其中上述活性介质或高活性介质是通过对介质实施酶作用、催化作用、光照射、电磁波照射、加电压或等离子体化而制备的。

7.权利要求2、3或6记载的反应方法，其中上述酶是氧化酶，底物是为使纸浆漂白应当分解的木质素。

8.为实施权利要求2或3记载的反应方法的反应装置，具有活化反应场所和底物反应场所，活化反应场所具备可与活性介质相分离的介质活化手段、完成上述活化步骤，底物反应场所通过活性介质输送手段与上述活化反应场所连接、可完成上述活性介质和底物的反应。

9.权利要求2、3或7记载的反应方法，所述酶是在尺寸与酶大小大致相符、结构稳定的结构单元中固定了上述氧化酶过氧化物酶的固定化酶，在酶的固定化容许的浓度范围内的氧化剂存在下分解上述底物的底物。

10.权利要求9记载的反应方法，其中上述的结构单元是中孔(性)硅多孔体中的细孔。

11.权利要求1、2、3或7记载的反应方法，所述存在底物的反应体系中具有反应促进剂，该反应促进剂具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮结构、而且可溶于水。

12.权利要求11记载的反应方法，其中上述反应促进剂是乙酰丙酮。

13.权利要求1、2、3或7记载的反应方法，是在混有亲水性底物和相对于亲水性底物来说相对疏水性底物的水溶液中，使氧化酶、反应介质与具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮结构、而且可溶于水的反应促进剂共存，通过自由基化了的反应促进剂优先分解疏水性底物。

14.权利要求13记载的反应方法，其中上述反应促进剂是乙酰丙酮。

15.权利要求1、2、3或7记载的反应方法，其中包括通过氧化酶活化反应介质的工序，以及将被活化的反应介质添加到混有亲水性底物和相对于亲水性底物来说相对疏水性底物的水溶液中，通过被自由基化的反应介质使疏水性底物优先分解的工序。

16.权利要求15记载的反应方法，其中上述反应促进剂是乙酰丙酮。

17.权利要求13、14、15或16记载的反应方法，其中上述水溶液是纸浆、亲水性底物是纤维素、相对疏水的底物是木质素。

18.权利要求17记载的反应方法，其特征是中间设置纸浆的碱萃取处理工序，并多级反复操作。

19.权利要求17或18记载的促进疏水性底物分解的方法，其中上述氧化酶至少是从锰过氧化物酶、辣根过氧化物酶和木质素过氧化物酶中选出的过氧化物酶，反应介质是锰离子。

20.权利要求1、2、3或7记载的反应方法，是使氧化酶和被活化的反应介质与具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮结构、而且可溶于水的反应促进剂共存于含有难分解物质的水溶液中，通过自由基化的上述反应促进剂使上述难分解物质分解。

21.权利要求20记载的反应方法，其中上述反应促进剂是乙酰丙酮。

22.权利要求20或21记载的难分解物质的分解方法，上述难分解物质是二噁英、多氯联苯(PCB)，或扰乱内分泌物质。

23.权利要求2、3或7记载的反应方法，其中所述酶是从白色腐朽菌Phanerochaete crysosporium经紫外线照射产生的变异株SC26菌株，ATCC-64314的培养液获得的、或从该培养液获得的表现出以下的(1)耐热性以及(2)耐过氧化氢特性的锰过氧化物液：

(1)于50℃下进行45分钟热处理后的锰过氧化物酶的残余活性在50％以上；

(2)在有0.3mM的过氧化氢存在下于37℃1小时后的锰过氧化物酶的残余活性在15％以上。

24.权利要求2、3或7记载的反应方法，所述酶是符合以下(3)～(5)条件的锰过氧化物酶：

(3)白色腐朽菌经紫外线照射产生的变异株SC26菌株产生的锰过氧化物酶；

(4)等电点处于4.3～4.7范围内；

(5)于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在50％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在15％以上。

25.权利要求24记载的反应方法，其中上述的锰过氧化物酶的等电点是4.3，于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在90％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在30％以上。

26.权利要求24记载的反应方法，其中上述的锰过氧化物酶的等电点是4.5，于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在90％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在45％以上。

27.权利要求24记载的反应方法，其中上述的锰过氧化物酶的等电点是4.7，于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在50％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在15％以上。

28.一种底物的酶分解方法，即在使用氧化剂通过氧化酶过氧化物酶分解酶底物的方法中，使用在尺寸与酶大小大致相符、结构稳定的结构单元中固定了上述氧化酶的固定化酶，在酶的固定化容许的浓度范围内的氧化剂存在下分解上述底物的底物。

29.权利要求28记载的底物的酶分解方法，其中上述底物是难分解物质。

30.权利要求29记载的反应方法，其中上述难分解物质是木质素。

31.权利要求28、29或30记载的反应方法，其中上述的结构单元是中孔(性)硅多孔体中的细孔。

32.一种用于通过氧化酶分解底物的反应体系中的反应促进剂，具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮结构、而且可溶于水。

33.权利要求32记载的反应促进剂，其中上述反应促进剂是乙酰丙酮。

34.一种促进疏水性底物优先分解的方法，是在混有亲水性底物和相对于亲水性底物来说相对疏水性底物的水溶液中，使氧化酶和被活化的反应介质与权利要求32或33记载的反应促进剂共存，通过自由基化了的反应促进剂优先分解疏水性底物。

35.一种促进疏水性底物分解的方法，其中包括通过氧化酶活化反应介质的工序，以及将被活化的反应介质与权利要求32或33记载的反应促进剂添加到混有亲水性底物和相对于亲水性底物来说相对疏水性底物的水溶液中，通过被自由基化的反应介质使疏水性底物优先分解的工序。

36.权利要求34或35记载的促进疏水性底物分解的方法，其中上述水溶液是纸浆、亲水性底物是纤维素、相对疏水的底物是木质素。

37.权利要求36记载的促进疏水性底物分解的方法，其特征是中间设置纸浆的碱萃取处理工序，并多级反复操作。

38.权利要求35、36或37记载的促进疏水性底物分解的方法，其中上述氧化酶至少是从锰过氧化物酶、辣根过氧化物酶和木质素过氧化物酶中选出的过氧化物酶，反应介质是锰离子。

39.一种难分解物质的分解方法，是使氧化酶和被活化的反应介质与权利要求32或33记载的反应促进剂共存于含有难分解物质的水溶液中，通过自由基化的上述反应促进剂使上述难分解物质分解。

40.权利要求39记载的难分解物质的分解方法，上述难分解物质是二噁英、多氯联苯(PCB)，或扰乱内分泌物质。

41.一种锰过氧化物酶液，是从白色腐朽菌Phanerochaetecrysosporium经紫外线照射产生的变异株SC26菌株(以ATCC-64314保藏)的培养液获得的、或从该培养液获得的表现出以下的(1)耐热性以及(2)耐过氧化氢特性的锰过氧化物液：

42.一种符合以下(3)～(5)条件的锰过氧化物酶：

(4)等电点处于4.3～4.7范围内；

43.权利要求42记载的锰过氧化物酶，其中上述的锰过氧化物酶的等电点是4.3，于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在90％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在30％以上。

44.权利要求42记载的锰过氧化物酶，其中上述的锰过氧化物酶的等电点是4.5，于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在90％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在45％以上。

45.权利要求42记载的锰过氧化物酶，其中上述的锰过氧化物酶的等电点是4.7，于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在50％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在15％以上。

Claims

5.权利要求4记载的反应方法，其中上述高活性个质是处于比活性介质更高活性的激发状态，或者是至少含有配位化合物的高级次化合物。

9.一种底物的酶分解方法，即在使用氧化剂通过氧化酶过氧化物酶分解酶底物的方法中，使用在尺寸与酶大小大致相符、结构稳定的结构单元中固定了上述氧化酶的固定化酶，在酶的固定化容许的浓度范围内的氧化剂存在下分解上述底物的底物。

10.权利要求9记载的底物的酶分解方法，其中上述底物是难分解物质。

11.权利要求10记载的反应方法，其中上述难分解物质是木质素。

12.权利要求9、10或11记载的反应方法，其中上述的结构单元是中孔(性)硅多孔体中的细孔。

13.一种用于通过氧化酶分解底物的反应体系中的反应促进剂，具有由于上述氧化酶作用自由基化的二酮结构、而且可溶于水。

14.权利要求13记载的反应促进剂，其中上述反应促进剂是乙酰丙酮。

15.一种促进疏水性底物优先分解的方法，是在混有亲水性底物和相对于亲水性底物来说相对疏水性底物的水溶液中，使氧化酶和被活化的反应介质与权利要求13或14记载的反应促进剂共存，通过自由基化了的反应促进剂优先分解疏水性底物。

16.一种促进疏水性底物分解的方法，其中包括通过氧化酶活化反应介质的工序，以及将被活化的反应介质与权利要求13或14记载的反应促进剂添加到混有亲水性底物和相对于亲水性底物来说相对疏水性底物的水溶液中，通过被自由基化的反应介质使疏水性底物优先分解的工序。

17.权利要求15或16记载的促进疏水性底物分解的方法，其中上述水溶液是纸浆、亲水性底物是纤维素、相对疏水的底物是木质素。

18.权利要求17记载的促进疏水性底物分解的方法，其特征是中间设置纸浆的碱萃取处理工序，并多级反复操作。

19.权利要求17、18或19记载的促进疏水性底物分解的方法，其中上述氧化酶至少是从锰过氧化物酶、辣根过氧化物酶和木质素过氧化物酶中选出的过氧化物酶，反应介质是锰离子。

20.一种难分解物质的分解方法，是使氧化酶和被活化的反应介质与权利要求13或14记载的反应促进剂共存于含有难分解物质的水溶液中，通过自由基化的上述反应促进剂使上述难分解物质分解。

21.权利要求20记载的难分解物质的分解方法，上述难分解物质是二噁英、多氯联苯(PCB)，或扰乱内分泌物质。

22.一种锰过氧化物酶液，是从白色腐朽菌Phanerochaetecrysosporium经紫外线照射产生的变异株SC26菌株(以ATCC-64314保藏)的培养液获得的、或从该培养液获得的表现出以下的(1)耐热性以及(2)耐过氧化氢特性的锰过氧化物液：

23.一种符合以下(3)～(5)条件的锰过氧化物酶：

(4)等电点处于4.3～4.7范围内；

24.权利要求23记载的锰过氧化物酶，其中上述的锰过氧化物酶的等电点是4.3，于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在90％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在30％以上。

25.权利要求23记载的锰过氧化物酶，其中上述的锰过氧化物酶的等电点是4.5，于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在90％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在45％以上。

26.权利要求23记载的锰过氧化物酶，其中上述的锰过氧化物酶的等电点是4.7，于50℃下进行45分钟热处理后的残存活性在50％以上，在有0.3mM过氧化氢存在下于37℃下1小时后的残存活性在15％以上。