CN1038123A - 交联葡萄糖异构酶 - Google Patents

交联葡萄糖异构酶 Download PDF

Info

Publication number
CN1038123A
CN1038123A CN89103117A CN89103117A CN1038123A CN 1038123 A CN1038123 A CN 1038123A CN 89103117 A CN89103117 A CN 89103117A CN 89103117 A CN89103117 A CN 89103117A CN 1038123 A CN1038123 A CN 1038123A
Authority
CN
China
Prior art keywords
isomerase
enzyme
glucose
insoluble
crystalloid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN89103117A
Other languages
English (en)
Inventor
克拉维·维萨瑞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Danisco Finland Oy
Original Assignee
Cultor Oyj
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cultor Oyj filed Critical Cultor Oyj
Publication of CN1038123A publication Critical patent/CN1038123A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/24—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of an isomerase, e.g. fructose

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

本发明是关于新的水不溶的葡萄糖异构酶，该酶 是通过使结晶状酶交联而转化为固体形式得到的。 本发明还涉及在至少含有一个氨基的化合物存在下， 用二醛进行交联化反应来制备上述新的结晶状葡萄 糖异构酶的方法，以及这种新的酶制品作为异构化催 化剂的应用。

Description

本发明是关于通过使结晶酶交联而生成的新的水不溶的葡萄糖异构酶。本发明还涉及制备该水不溶的交联葡萄糖异构酶的方法。
在连续运行的反应器中应用固定不动的酶（即连结在固体载体上的酶）是日益优先选用的技术，因为这种技术可以降低酶的费用和最终产物的纯化费用。用固定的葡萄糖异构酶使葡萄糖转化为果糖是常用的方法。
一般来讲，酶是水溶性的，因此在连续操作中有必要采用固定技术。必须采用一种能使酶不溶于水相，同时又能保持其活性的方法使酶结合在一固相上。已提出许多使酶与固体载体结合的方法，其中有将酶吸附、共价连接、交联或微胶囊化。另外一种方法是，使产生酶的整个微生物结合到固相上。对于上述技术，在例如Mooo-young，M.（ed），Comprehensive    Biotechnology，2，Pe-rgamon    press，伦敦1985，p.191-211中，有很好的综述。
在以前的方法中，是使酶结合到另外制备的载体材料上，这样做对于底物的化学动力学或流动也许是有益的。但是，在大多数情况下，尤其在大规模生产（例如在制糖工业）中，载体材料比作为催化剂的酶更贵。另一个方法是，可以使酶与惰性成分（例如凝胶）交联而将其固定。总之，在现有技术中作为催化剂的酶只构成所用材料重量和体积的一小部分，在各个具体方法中一般只占5%以下，通常为1-2%。
从技术上讲，用戊二醛进行交联对于例如葡萄糖异构酶的固定具有重要的意义。已知美国食品医药管理局（FDA）已认可戊二醛在食品工业中可用于固定酶。
其它已经应用的技术还有使酶与离子交换剂相连和把酶吸附在固体载体上。在美国专利4，699，882（K.Visuri;稳定的葡萄糖异构酶）中可以找到应用上述方法的实例。然而，在这一现有技术方法中应用的载体比较昂贵，并且该技术还需使用一种大反应器。
工业上应用固定酶技术所需的费用不一定与所应用的酶有关系。这些费用包括制造工艺设备和建造厂房的费用;载体材料添置（再添置）费用，失活酶材料的处理费用;排空和装填反应器（或载体再生）的劳务费用;由于反应器迟钝所需的附加费用。长期操作时常会出现非酶作用的不利副反应，尤其是在果糖生产中。
上述科技文献中有几个用戊二醛来交联结晶酶的实例。在这些研究中，为了基础研究目的而对酶结晶进行了交联。酶结晶的结构通常是很弱的，以至于在X射线衍射研究中它们不能经受住所应用的射线束;然而使用戊二醛却常可以使结晶酶稳定，从而能够用于X射线衍射研究。此外，还为研究结晶酶的稳定性和催化剂动力学特性而对结晶酶进行了交联。在结晶交联成功的情况下，只应用了戊二醛，而介质是由一种溶液构成，在该溶液中各个特定的酶能保持结晶形式。现在看来，通过戊二醛与酶蛋白反应，可以直接生成一种不溶的结晶。Quiocho和Richards（Proc.Natl.Acad.Sci（美国）52（1964）p.833和Biochemistry5（1966）p.4062）首先将戊二醛用来交联羧基肽酶。Bishop和Richards（J.Mol.Biol.33（1968），p.415～421）用1%戊二醛水溶液于室温下对结晶状β-乳球蛋白进行了交联。应用所得结晶研究了酶的电学性质。Heas（Biophysic.Journ.8（1968），p.549-555）应用12%的戊二醛溶液在4%硝酸钠溶液（PH8）存在下对浴菌酶结晶进行了交联。
Dyer、Phillips和Townsend（Thermochimica    Acta8（1974），p.456～464）研究了用戊二醛交联的羧基肽酶结晶的热稳定性。Dyer等人发现，交联使稳定性增加。Tuechsen和Ottesen（Carlsberg    Res.Commun    42（1977），p.407-420）研究了在硫酸钠溶液中用戊二醛交联的枯草溶菌素结晶的动力学性质。对映低分子量的底物，该结晶的活性强，而对于高分子量的底物（如蛋白质或多肽，它们不能扩散到结晶中），结晶的活性是不显著的。
Wong等（Biochem.and    Biophysic.Research    Commun    ications    80（1978），p.886-890）在硫酸铵溶液中用戊二醛对源于微生物的酸性蛋白酶进行了交联。在交联中，硫酸铵的存在被认为是技术上的缺点。
Morozov和Morozova（Biopolymers    20（1981），p.451-467）应用2-6%戊二醛溶液，反应时间2-10天，于室温下对溶菌酶结晶、血红蛋白结晶和肌红蛋白结晶进行了交联。在2-甲基-2，4-戊二醇（25%）存在下，Lee等（Bioorganic    Chemistry    14（1986），p.202-210）用戊二醛对醇脱氢酶结晶进行了交联。
已知用戊二醛得到不溶的酶是困难的，尤其是如果蛋白质含有的赖氨酸较少时则更困难。对此问题通常作这样的处理：在酶中混入一种蛋白质（例如白蛋白），它可以交联产生一种不溶物（G.B.Broun，Methods    in    Enzymology，44（1976），p.263）。但是当需要交联的酶为晶状体时，加入上述无关的惰性蛋白质是不可能的。对于仅用戊二醛无法使结晶体交联成为不溶物的情况，目前还没有交联方法。
如以上所提到的，已知可用戊二醛固定葡萄糖异构酶。这样可以将异构酶交联到载体材料上。该方法在工业上已得到广泛应用。在该文献中未曾叙述使葡萄糖异构酶结晶交联成为不溶形式的尝试。
现已发现，可以将葡萄糖异构酶结晶交联，并使其保持原来的结晶状态而酶的活性仍然很高;最好的操作方法可以使交联产物保持同原来的酶一样的活性。本发明的产物不溶于任何应用酶技术时可能存在的溶剂中。在工业异构化方法中，可以用交联的结晶酶直接装填异构化柱。应用新的交联的结晶可以在比以前所用的柱小得多、有效得多的柱中进行连续的异构化处理。熟悉本技术领域的专业人员明白，本发明可以应用填充有纯的酶而不是与惰性材料结合的酶的柱子，该惰性材料经常占据了柱子大部分空间并且其费用占柱子费用的一大部分。
在本发明的方法中，用二醛（例如戊二醛）和至少含一个氨基的化合物（例如铵化合物、胺或氨基酸，最好用铵盐或赖氨酸）使葡萄糖异构酶结晶交联。有几种胺和氨基酸是适用的。同样明显的是，在本发明的方法中，除了戊二醛之外，也可以应用许多其它的二醛和与氨基反应的物质（称为交联剂）。
用本发明方法制得的固体状结晶酶的活性是很高的，或者与游离酶的活性实际上是相同的。在连续的处理过程中，固体状结晶酶可以用作柱填充剂。固体状结晶酶很稳定，并且能很好地耐受机械压力。
如果需要，按已知的物理化学方法，还可以使交联的结晶进一步结合形成较大的本体，其形状可以圆的、叶片状的、带状的等。这样得到的酶制品能够经得住机械的处理。
熟悉本领域的专业人员可以认识到，按照本文所述的方法，实际上可以由迄今通常是由于其氨基酸成分而不适用于交联的任何结晶酶来制成不溶的酶制品。
下面将更详细地叙述本发明的方法。
用作起始有利的结晶状葡萄糖异构酶的制备
将硫酸铵（约10%（重））溶于葡萄糖异构酶溶液（按干燥蛋白质测定，异构酶占1～10%（重））中。在不断搅拌下，将溶液慢慢冷却至约1～2℃。异构酶基本上完全结晶（大于95%）。可以用硫酸镁或硫酸钠代替硫酸铵作为结晶剂。所用盐的浓度可以在宽范围内变化，例如可从5%到25%（重）。结晶过程所需的时间也可以在较宽的范围内变化，例如可从1小时到数天。制备大的结晶时，最好用逐渐冷却的方法，并且异构酶要尽可能纯。美国专利4，699，882（Visuri叙述了该结晶过程，该专利收编在本申请中作为参考。
在结晶之后，用离心的方法或沉积法将结晶物质从母液中分离出来。如果需要，用硫酸铵、硫酸镁或其它适用于结晶作用的物质的纯溶液洗涤结晶物质。对不含有任何游离的过量母液并且经沉积和离心成为致密形式的结晶物质进行交联。该结晶物质的标准活性为10，000GIU/g。它含有20～30%（重）的纯的酶蛋白质（按干物质计算）。应该注意，如果将酶结晶干燥，酶结晶就会丧失其结构。
交联
将结晶物质悬浮在一种在其中该结晶其溶解的盐溶液中。在该溶液中酶结晶的浓度可以在较宽的范围内变化，例如可以为2～17%（按干物质计）
如果该盐溶液在开始时不含有铵、合适的胺或氨基酸（例如赖氨酸），则向该溶液中加入铵盐。通过加入例如氢氧化钠溶液，将混合物的PH值调节到5至9，最好调节到6至8。酸度用磷酸盐缓冲液（例如0.05M磷酸钠）控制，或用碱溶液（例如氢氧化钠溶液）通过自动PH调节来控制。加入的胺或氨基酸的浓度可以在较宽的范围内变化，并且取决于其它成分的浓度。在胺或氨基酸的浓度为最终混合物重量的1～15%时，已制得高产率的本发明产物。
随后，将戊二醛加到混合物中以引发交联反应。戊二醛的量可以在较宽的范围内变化，可以为1～45%（按湿的酶结晶物质计算）。较好的用量取决于例如混合物中所含的胺的浓度。一般来讲，较好的浓度是每3g异构酶（按干燥的酶计算），用3～4.5g戊二醛。反应进行时，要连续地搅拌溶液;温度范围是2～25℃。虽然温度似乎不很关键，但低温是有益的。反应可以在几分钟内很快地发生。在低温下，反应时间可以直到20小时。
在反应之后，通过沉积或离心从混合物中分离出不溶的结晶。将结晶物质悬浮在水或合适的盐溶液中，并且再次离心，以此进行洗涤。反复洗涤数次，直到结晶物质足够纯而可用做催化剂。关于洗涤，最好将细粒状沉淀冲去。
如果所得的结晶物质是要作为酶过程中的催化剂使用，那么干燥该结晶物质是不合适的。湿的结晶物质可以充分地保持其活性至少6个月，而无需采取任何特殊措施。
最终产物的特征
在外观和大小方面，按本发明制得的交联结晶同原有的原料结晶相似。结晶的大小不很关键。直径为100～200μm或更大些（直至1mm）的结晶特别适合于工业应用。
本发明的结晶最重要的性质在于该结晶不溶于水、盐溶液和糖溶液。本发明的异构酶结晶不溶于浓的葡萄糖和果糖溶液，甚至在高温时也不溶，这一点特别重要。在工业生产中，温度通常采用60℃，而糖浓度为45%（按重量计）。在上述条件下，以及在任何其它糖浓度和较高的温度（直至100℃）下，交联结晶均是不溶的。交联结晶的活性与原有的酶的活性处于相同的等级。本发明结晶的活性比固定在惰性载体上的酶的活性高许多倍，这在技术上是有益和非常重要的。
把一种酶交联化为结晶形式的另一优点是，该结晶之内的作用力以及自然地使该结晶保持结晶态的力，可以十分显著地将该酶稳定化。
表征起始原料和最终产物所用的方法
异构酶的活性规定为每1g干燥酶制品的国际葡萄糖异构酶单位（简写为GIU）数。1个单位（GIU）表示在下述条件下能以1μmol/分钟的速率使葡萄糖转变为果糖的酶的量：葡萄糖浓度为2.0mole/l，PH为7.0，温度为60℃。
为了测定活性，将0.1～1g酶制品（原有的结晶物质或充分洗涤的交联结晶物质）混合到100ml如前面所述的底物溶液中。在适当的时间（如10分钟）后，测定溶液中果糖的含量，计算并以上述单位表示活性。选择酶的用量和反应时间，使生成的果糖少于总糖含量的5%，这是为了使测定结果反映反应开始时的转变速率。按常规方法，在105℃干燥样品至恒重，以测定起始原料和产物的干含量。
异构化工艺过程
结晶状交联酶可以按常规方式用于间歇式异构化过程，在反应之后，用过的酶例如可以用过滤法分离出来，并且如果需要，还可重复使用。
不过，以工业规模进行异构化时，最好采用连续的异构化工艺。在连续的异构化工艺中，是使待异构化的糖溶液流过酶柱。通过改变保留时间和/或温度，异构化过程容易控制。在较宽的温度范围内，从冰点到超过100℃，酶都是有活性的。低温下操作的缺点是反应慢，并且糖（葡萄糖和果糖）水合物会结晶析出，而在高温下，酶和果糖会相当显著地较快破坏。
连续异构化一般是这样进行：用100～300μm的交联酶结晶装柱。在各个具体情况下根据所需要的容量改变柱的孔径和长度。小柱的适宜填充物长度为5～50cm。温度也可以在较宽的范围内调整。室温是非常可行的。如果微生物污染问题较严重，可以提高温度到至少约60℃来消除污染。
通过改变线性流速，可以容易地控制异构化过程。
小柱的线性流速范围为2～30cm/分钟。新鲜酶的合适保留时间为1～2分钟。压力为1大气压。压降是不明显的（每50cm长度的柱填充物，压降小于0.2巴）。保留时间可通过改变柱填充物长度以及流速来调节。升高温度可加速异构化反应。
在大部分情况下，常规工业化方法的目的是得到糖溶液，其中40～45%的糖是果糖。当酶活性下降时柱随之老化，此时减慢流速可保持所得糖溶液具有所需组成。
下列实例更详细地阐明了本发明。
实例1
称取在10%硫酸铵溶液中结晶的葡萄糖异构酶结晶物质（如美国专利4，699，882所述）850g，并将其加到PH用0.5M磷酸钠缓冲液调至7.4的1000ml硫酸盐溶液中。将混合物冷却至10℃。所得的混合物用螺旋桨式搅拌器以低速（200～400转/分）连续搅拌，以减轻结晶的破坏。向混合物中加入160ml    25%戊二醛等分溶液。1小时后将201纯水加到混合物中使反应中止。立即停止搅拌，用时2小时让结晶物质沉降于容器底部，倾出母液，注意不要冲出结晶。再次将201纯水混合到结晶物质中，然后倾出洗涤水。用水再次洗涤。所得到的用水洗涤过3次的异构酶湿结晶物质可直接用于异构化试验、活性测定和其它实验。
所制得的交联葡萄糖异构酶呈结晶状态（显微镜鉴别）。该结晶不溶于水、各种盐的稀溶液（PH在2～9范围内）、稀酸（1mol/l）、直至100℃的热水和热盐溶液中，也不溶于直至100℃的浓葡萄糖、果糖和糖溶液中。在所有上述条件下，该结晶的外观保持不变，而未交联的结晶异构酶溶解或以无定形沉淀形式析出。交联异构酶的酶活性是原有未交联的异构酶活性的52%，即当原有异构酶的活性为40，000GIU/g时，交联结晶的活性相应地为20，000GIU/g以上（按干燥的酶蛋白质计算）。
实例2
按照实例1的方法于25℃制备以下反应混合物：
14g异构酶（按纯的酶蛋白质计算）
10g硫酸铵
1.5g戊二醛（约8ml    25%戊二醛溶液）
0.05M磷酸钠缓冲液（溶液PH为7.4）
100ml水
反应1小时后，用实验室用离心分离机以1000转/分的转速离心5分钟，将游离溶液从混合物中除去。把得到的结晶物质悬浮于200ml纯水中，并按上述方法再次离心。按上述方法再次用水洗涤。回收经洗涤的湿的结晶物质，用于进一步研究。该法制得的结晶物质的活性是原结晶物质活性的49%。
实例3～8
按实例1的方法，于10℃制备具有与实例2所述相同初始组成的各反应混合物。经不同的反应时间后，中止反应并洗涤结晶物质，然后测定各结晶物质的活性，结果示于以下表Ⅰ中。
表Ⅰ
实例    反应时间    活性（表示为原来结晶物质活性的百分比）
实例3    10分钟    45
实例4    30分钟    46
实例5    60分钟    49
实例6    90分钟    48
实例7    2小时    40
实例8    3小时    40
从以上结果可见，反应能很快完成。而反应时间增加，活性没有大的变化。
实例9～16
按实例1的方法，于10℃制备具有以下初始组成的反应混合物：
14g    葡萄糖异构酶蛋白质（结晶形式）
10g硫酸铵
90ml    0.5M磷酸钠溶液（如表Ⅱ所示，PH为6.0，7.0，8.0或8.4）
0.12g、0.5g、2.0g、3.5g或4.12g戊二醛（如表Ⅱ所示）
反应时间为1小时。所得各结晶物质的活性（表示为原来结晶物质活性的百分数）列于表Ⅱ中。
表Ⅱ
实例    PH    戊二醛（g）    活性（%）
实例9    6.0    0.5    22
实例10    6.0    3.5    24
实例11    7.0    0.12    60
实例12    7.0    2.0    65
实例13    7.0    4.12    59
实例14    8.0    0.5    41
实例15    8.0    3.5    44
实例16    8.4    2.0    39
从以上结果看来，戊二醛的量在相当宽的范围内变化时，仍可得到较高的活性。酸度明显地影响结果;虽然在试验的整个PH范围内，即PH6.0～8.4，都可以得到有效的制品，但是最佳的PH值为约7.0。
实例17～27
按以上各实例进行一系列相似的试验，但温度为2℃，反应时间为18小时。反应混合物的组成如下：
3g异构酶结晶（按干燥蛋白质计算）
50ml水（作为介质）
7.5g盐（硫酸钠、硫酸镁和/或硫酸铵，见表Ⅲ）
氢氧化钠（用来调节PH至7.0，用量不大于2毫克当量，即80mg）
0.125～2.5g戊二醛（见表Ⅲ）
表Ⅲ
盐（g）
实例 （NH4）2SO4MgSO4Na2SO4戊二醛 活性（%）
实例17    7.5    0.5    0
实例18    7.5    2.5    0
实例19    7.5    0.125    0
实例20    7.5    0.5    0
实例21    7.5    0.75    0
实例22    7.5    1.25    0
实例23    0.45    7.05    0.75    20
实例24    0.90    6.6    0.75    19
实例25    1.8    5.7    0.75    28
实例26    3.75    3.75    0.75    40
实例27    7.5    0.75    60
从以结果看来，在没有铵盐的情况下进行交联时，得不到不溶的结晶，即使戊二醛浓度较高也得不到不溶结晶。即使只用少量的铵盐，也可以促进不溶结晶的形成。
实例28～38
按以下一般方法，用不同的含氮化合物制备不溶的异构酶结晶：
3g结晶状异构酶（按干蛋白质计算）
7.5g硫酸镁
10mmol含氮化合物（见表Ⅳ）
2.5g戊二醛（按100%计算）
温度为2℃，
反应时间为18小时
表Ⅳ
实例    含氮化合物    用量（g）    活性（%）
实例28    赖氨酸    1.83    80
实例29    精氨酸    1.74    17
实例30    组氨酸    1.55    26
实例31    谷氨酰氨    1.46    18
实例32    亮氨酸    1.31    21
实例33    异亮氨酸    1.31    18
实例34    脯氨酸    1.15    10
实例35    甲硫氨酸    1.49    27
实例36    苯丙氨酸    1.65    17
实例37    色氨酸    2.04    44
实例38    三甲铵乙内酯    1.17    23
从以上结果看来，一些不同的胺对交联过程具有相似的作用。
实例39～51
按以下一般方案，用不同量的戊二醛和赖氨酸制备不溶的异构酶结晶。
3g结晶状异构酶（按干燥蛋白质计算）
7.5g硫酸镁
0.47～2.34g赖氨酸（见表Ⅴ）
用氢氧化钠溶液将PH调至8.0
0.5～1.25g戊二醛（100%;见表Ⅴ）
将溶液于2℃反应18小时。
表Ⅴ
实例    戊二醛（g）    赖氨酸（g）    活性（%）
实例39    0.5    0.47    67
实例40    0.5    0.94    77
实例41    0.5    1.40    60
实例42    0.75    0.47    72
实例43    0.75    0.94    83
实例44    0.75    1.40    92
实例45    0.75    1.87    81
实例46    0.75    2.34    75
实例47    1.25    0.47    68
实例48    1.25    0.94    78
实例49    1.25    1.40    90
实例50    1.25    1.87    102
实例51    1.25    2.34    100
从以上结果看来，赖氨酸和戊二醛用量之间的比率会影响不溶结晶的形成，也就是说，在各个戊二醛用量下，都有一个最佳的赖氨酸用量。
实例52～57
按以下一般方案，在赖氨酸存在下，于硫酸铵溶液中使异构酶结晶进行交联。
10g异构酶结晶置于10%硫酸铵溶液中（即3.72g纯的异构酶蛋白质（按干燥物质计算），0.63g硫酸铵和5.65g水）
5g硫酸铵
45g水
1.25g戊二醛（按100%计算）
0～3g赖氨酸（见表Ⅵ）
在搅拌前用氢氧化钠将所有反应充分的PH调至8.0。
混合物于3℃搅拌18小时。
表Ⅵ
实例    赖氨酸（g）    活性（%）
实例52    0    40
实例53    0.3    62
实例54    0.6    66
实例55    1.2    72
实例56    1.8    92
实例57    3.0    96
由以上结果看来，赖氨酸对交联结晶的活性具有十分有利的作用。虽然单独使用硫酸铵可得到满意的结果，但是当应用赖氨酸时，硫酸铵对结果影响不很大。
实例58～69
异构酶和赖氨酸的用量保持不变，其它成分按表Ⅶ所示改变。
3g葡萄糖异构酶（按干态计算）
1g赖氨酸
0.01g氢氧化钠（PH8的溶液）
于2℃反应18小时。
表Ⅶ
实例 戊二醛 MgSO4水 反应溶液的总量 活性
（g）    （g）    （g）    （g）    （%）
实例58    0.5    2.1    11.9    18.5    39
实例59    0.5    2.7    15.3    22.5    70
实例60    0.5    4.2    23.8    32.5    70
实例61    0.5    5.3    32.7    42.5    73
实例62    0.5    10.2    57.8    72.5    75
实例63    0.5    16.2    91.8    112.5    77
实例64    1.25    2.1    11.9    19.25    86
实例65    1.25    2.7    15.3    23.25    99
实例66    1.25    4.2    23.8    33.25    101
实例67    1.25    5.3    32.7    43.25    89
实例68    1.25    10.2    57.8    73.25    83
实例69    1.25    16.2    91.8    113.25    89
从以上结果看来，反应混合物的浓度对最终结果几乎没有什么影响。反应成分（酶、赖氨酸（或胺）和戊二醛）之间的重量比例则具有较大的影响。
实例70
将水洗过的1g交联葡萄糖异构酶物质（按实例56制得;0.4g干物质）混入PH值已调至7.0的100g    40%葡萄糖溶液中。混合物于60℃不断搅拌。从混合物中间歇地取样，用旋光计测定样品的果糖含量，用已糖激酶以酶法测定葡萄糖含量。在3小时内果糖含量上升到溶液总糖含量（葡萄糖+果糖＝100%）的42%。试验后交联异构酶经过滤从混合物中分出并用水洗涤。测定所得结晶物质的活性及其干含量。试验中未发现活性酶溶解或消失。用同一批酶可以重复试验数次。
实例71
洗去按实例1所述制得的结晶物中的细粒状沉淀，并在把结晶材料悬浮于水中并将水倾出（3次）的过程中，将结晶材料轧细。将所得平均大小为100μm的大结晶部分装入于直径为2.6cm、高为5cm的圆柱形反应器内。把具有以下组成的葡萄糖溶液于60℃泵入柱内使其通过：
582g葡萄糖一水合物
590g水
0.37g Mg SO47H2O
0.19g Na HSO3
PH6.9（1M    NaOH，用量低于1ml）
试验开始时流速为11ml/分，同时从柱中流出的溶液的果糖含量上升到总糖含量的42%。试验连续进行200小时，此后流速须减至9ml/分以保持原有的转化率（果糖含量为42%）。因此，在这期间酶的活性下降到初始值的81%，在试验期间未观察到结晶物质减少或溶解。
实例72～76
称取43.42g水洗过的湿的活性异构酶（按实例67的方法制得;10.0g酶（按干物质计算）。
将200ml按实例71所述方法制得的葡萄糖溶液与该结晶物质相混合。于60℃将混合物搅拌不同时间，然后通过圆形滤纸过滤混合物。留在滤纸上的结晶物质仔细地用水冲洗，以除去所有可溶性物质。在恒温箱中于105℃将结晶物质干燥，然后称重。结果列于表Ⅷ中。
表Ⅷ
实例    搅拌时间    试验后结晶物质的干重（g）
实例72    10分钟    9.9
实例73    2小时    11.0
实例74    4小时    10.9
实例75    6小时    10.7
实例76    21小时    10.4
从以上结果看来，在常规工业操作条件下，按本发明方法制得的交联结晶异构酶不溶于底物溶液中。
实例77
将结晶状交联异构酶、固定连结在DEAE纤维素上的异构酶和原来的游离可溶性异构酶都置于完全相同的化学和物理条件下，对它们进行相互比较。选择条件，使每个酶样品的活性在合理的短时间内（即10～30小时）能有在可测范围内的下降。每个酶制品取5g混入150ml    0.05M磷酸钠缓冲液（PH6.0）（含有1.5mmol/l    Mg    SO和2mmol/l    Na    HSO）中。混合物于70℃振摇数小时。从混合物中间歇地取样，经由样品测定剩余异构酶的活性。根据活性降到情况，确定出每个酶样品的半寿期（即活性降至原有值的1/2时所用的时间），结果示于表Ⅸ中。
表Ⅸ
酶样品    半寿期（h）
原来的可溶性异构酶    2.2
固定在DEAE纤维素上的异构酶    3.3
结晶状交联结晶异构酶    19.0
从以上结果看来，交联结晶保持其酶活性的能力大大强于游离酶或用已知方法固定的酶。
实例78
将结晶状交联异构酶和固定在DEAE纤维素上的异构酶装入与实例71所述类似的圆柱形反应器内。用泵使葡萄糖溶液连续地从柱中通过。此葡萄糖溶液除PH调至6.0外，其组成与实例71中的相同。在试验期间柱温为60℃。柱中所含酶的活性根据流速和流出溶液的果糖含量进行计算。结果列于表Ⅹ中。
表Ⅹ
反应器装填物    活性半寿期〔小时（h）〕
结晶状交联异构酶    120
在DEAE纤维素上固定的异构酶    36
从以上结果看来，交联结晶能很好地保持其酶活性。
实例79～81
柱处理法中交联结晶与现有技术的固定异构酶的比较
将工业上应用的典型异构酶样品与本发明的交联结晶装入垂直的实验柱内。该交联结晶是按实例51所述方法制备的。圆柱形柱的内径为2.7cm，高为50cm。实验柱有一个60℃的恒温水夹层。柱子的下端有一个筛网，以便把酶颗粒保持在柱中，同时能使糖溶液从柱中流过。将各为20g按干燥物计算的每种酶装入各个柱中。具有实例71组成的葡萄糖底物用可调节的实验泵泵入各柱中。每个柱子各用一个泵。底物的温度调至60℃。测定流出柱子的产物中的葡萄糖和果糖。当底物流速相同时，观察到经每种不同的酶制品得到不同含量的果糖。各个柱子的流速分别用尝试法调节，直到各个产物中果糖的含量同样是总糖（葡萄糖+果糖）的45%。下表列出了所用的酶以及生成45%果糖时的相应流速。
表Ⅺ
实例    20g按干燥物质计算的酶    底物溶液流速
（ml/h）
（比较用样品）    SPEZYME    IGI，    179
芬兰糖业公司的市售产品
（比较用样品）    SWEETZYME    T.    197
丹麦NOVO公司的市售产品
（比较用样品）    TAKASWEET，    94
Miles-Kali    Chemie的
市售产品
79    直径100～200μm的交联异构    1364
酶结晶
80    直径500～600μm的交联异构    1121
酶结晶
81    直径900～1100μm的交联异构    1098
酶结晶
含有市售酶的柱子的流速十分典型地代表了目前工业实践中所观察到的流速。含有交联异构酶结晶的柱子其流速高得多。在工业实践中，使用高活性的交联结晶时采用较小的酶柱就够了，这样就可以减少投资和操作费用。

Claims (14)

1、结晶状葡萄糖异构酶，其特征在于通过交联使结晶状可溶的葡萄糖异构酶转变为水不溶的形式。
2、按照权利要求1所述的葡萄糖异构酶，其特征在于在PH范围为1-10的稀酸和碱溶液中是不溶的。
3、按照权利要求1或2所述的葡萄糖异构酶，其特征在于它在葡萄糖、果糖和其它糖的水溶液中是不溶的。
4、按照权利要求3所述的葡萄糖异构酶，其特征在于该结晶在上述糖溶液中是不溶的，甚至在提高温度下也是不溶的。
5、按照权利要求1所述的葡萄糖异构酶，其特征在于它可催化它的天然底物（如葡萄糖、果糖和木糖）的异构化，甚至在上述糖的浓溶液中它也可进行催化。
6、按照权利要求1-5所述的葡萄糖异构酶，其特征在于通过化学和物理的作用该结晶结合成较大的圆形、片状、带状的物体或这些物体的可能的混合物。
7、用于连续生产果糖的反应器，该反应器含有水不溶性、充分纯的结晶状交联葡萄糖异构酶。
8、制备水不溶的结晶状交联酶的方法，该方法的特征在于：
a）将二醛加到结晶状异构酶悬浮液中，在加入二醛之前或在交联反应进行时，加入含有至少一个氨基的化合物，例如铵盐、胺或氨基酸，以及
b）用水或其它液体洗涤交联结晶，以除去试剂残余物。
9、按照权利要求8的方法，其中的酶为葡萄糖异构酶。
10、按照权利要求8的方法，其特征在于二醛为戊二醛。
11、按照权利要求8或9的方法，其特征在于戊二醛的用量为0.4～8%（重）。
12、使底物异构化的方法，其中应用结晶状交联异构酶催化底物转变为它的异构体。
13、权利要求12的方法，其中所述的底物为葡萄糖、果糖或木糖，并且上述异构酶为葡萄糖异构酶。
14、连续生产果糖的方法，其中使含有葡萄糖的溶液流经含有水不溶的结晶状交联葡萄糖异构酶的反应器。
CN89103117A 1988-05-13 1989-05-12 交联葡萄糖异构酶 Pending CN1038123A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI882249A FI85285C (fi) 1988-05-13 1988-05-13 Tvaerbundet, vattenoloesligt glukosisomeras och foerfarande foer framstaellning daerav.
FI882249 1988-05-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1038123A true CN1038123A (zh) 1989-12-20

Family

ID=8526447

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN89103117A Pending CN1038123A (zh) 1988-05-13 1989-05-12 交联葡萄糖异构酶

Country Status (18)

Country Link
US (3) US5437993A (zh)
EP (1) EP0341503B1 (zh)
JP (1) JP2599789B2 (zh)
KR (1) KR900018370A (zh)
CN (1) CN1038123A (zh)
AT (1) ATE95232T1 (zh)
AU (1) AU3381689A (zh)
CA (1) CA1320463C (zh)
DD (1) DD297843A5 (zh)
DE (1) DE68909488T2 (zh)
DK (1) DK169039B1 (zh)
ES (1) ES2059610T3 (zh)
FI (1) FI85285C (zh)
HU (1) HU206134B (zh)
IE (1) IE63128B1 (zh)
IN (1) IN169420B (zh)
NO (1) NO891943L (zh)
ZA (1) ZA893460B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103849927A (zh) * 2012-11-30 2014-06-11 有研半导体材料股份有限公司 一种直拉法生长低电阻率单晶硅用掺杂装置及掺杂方法
CN104903496A (zh) * 2012-11-29 2015-09-09 索拉克斯有限公司 用于改善的连续直拉法的热屏障
CN105063747A (zh) * 2015-07-21 2015-11-18 李剑 一种液态连续加料多晶硅铸锭设备及其生产方法
CN106012010A (zh) * 2016-08-15 2016-10-12 江苏协鑫硅材料科技发展有限公司 一种二次添加掺杂剂的方法和装置
CN108301038A (zh) * 2017-01-12 2018-07-20 新疆知信科技有限公司 一种单晶硅提拉炉和生长单晶硅的拉制方法
CN110714223A (zh) * 2012-09-10 2020-01-21 Gtat Ip控股有限责任公司 连续cz方法和设备

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1991008288A1 (en) * 1989-11-23 1991-06-13 Novo Nordisk A/S An immobilized enzyme preparation whereby a basic amino acid has been incorporated and a process for the isomerization of glucose or xylose
US5618710A (en) * 1990-08-03 1997-04-08 Vertex Pharmaceuticals, Inc. Crosslinked enzyme crystals
US5801022A (en) * 1990-08-03 1998-09-01 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Method of producing a product with crosslinked crystals of thermolysin
ATE323158T1 (de) * 1990-08-03 2006-04-15 Vertex Pharma Verwendung von vernetzten kristallen als neue form von immobilisierung von enzymen
WO1995009907A1 (en) * 1993-10-01 1995-04-13 The Uab Research Foundation Chemical separation using crystals of biological macromolecules
US6207437B1 (en) * 1996-03-11 2001-03-27 Genencor International, Inc. Crystalline protease and method for producing same
AU6029998A (en) * 1997-01-17 1998-08-07 Regents Of The University Of Minnesota Dna molecules and protein displaying improved triazine compound degrading ability
US6140475A (en) * 1997-04-11 2000-10-31 Altus Biologics Inc. Controlled dissolution crosslinked protein crystals
US6500933B1 (en) 1997-09-05 2002-12-31 Altus Biologics Inc. Methods of preparing carbohydrate crosslinked glycoprotein crystals
DK1009759T3 (da) * 1997-09-05 2008-08-04 Altus Pharmaceuticals Inc Carbohydrat-tværbundne glycoproteinkrystaller
AU2001231155A1 (en) 2000-01-25 2001-08-07 Hugh Mctavish Microbes and methods for remediation
US8835143B2 (en) 2004-10-28 2014-09-16 Clea Technologies Bv Method for preparing hybrid cross-linked enzyme-silica aggregates
NL1027360C2 (nl) * 2004-10-28 2006-05-01 Clea Technologies B V Werkwijze voor de bereiding van vernette enzymaggregaten met verbeterde eigenschappen.
EP3269383A1 (de) * 2008-09-04 2018-01-17 Stada Arzneimittel Ag Behandlung von fruktose-malabsorption
AU2011272825A1 (en) 2010-06-30 2013-01-10 Codexis, Inc. Chemically modified carbonic anhydrases useful in carbon capture systems
GB201409451D0 (en) 2014-05-28 2014-07-09 Ipabc Ltd Antimicrobial preparations, methods for preparing the same and uses thereof to combat microorganisms
CN114729346A (zh) 2019-09-13 2022-07-08 丹尼斯科美国公司 热稳定的葡萄糖异构酶变体
WO2023114814A2 (en) 2021-12-14 2023-06-22 Danisco Us Inc. Compositions and methods for producing allulose

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2773002A (en) * 1955-03-31 1956-12-04 Nat Dairy Res Lab Inc Purification of lactase enzyme and spray-drying with sucrose
US3666627A (en) * 1968-10-14 1972-05-30 Corning Glass Works Method of stabilizing enzymes
US3980521A (en) * 1974-08-28 1976-09-14 Novo Industri A/S Immobilization of glucose isomerase
US4237231A (en) * 1979-11-13 1980-12-02 Uop Inc. Method of purifying glucose isomerase and a composition for storing same
US4411996A (en) * 1982-06-30 1983-10-25 Nabisco Brands, Inc. Process for isomerizing glucose
US4567142A (en) * 1982-06-30 1986-01-28 Nabisco Brands, Inc. Process for isomerizing glucose
IT1163947B (it) * 1982-10-06 1987-04-08 Novo Industri As Metodo per la produzione di un preparato di enzima immobilizzato per mezzo di un agente di reticolazione
DE3408299A1 (de) * 1984-03-07 1985-09-12 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verfahren zur immobilisierung von zellen und enzymen
US4683203A (en) * 1984-04-14 1987-07-28 Redco N.V. Immobilized enzymes, processes for preparing same, and use thereof
DK8502857A (zh) * 1984-06-25 1985-12-26
US5120650A (en) * 1989-10-13 1992-06-09 Stabra Ag Method for producing crystalline glucose isomerase

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110714223A (zh) * 2012-09-10 2020-01-21 Gtat Ip控股有限责任公司 连续cz方法和设备
CN104903496A (zh) * 2012-11-29 2015-09-09 索拉克斯有限公司 用于改善的连续直拉法的热屏障
CN103849927A (zh) * 2012-11-30 2014-06-11 有研半导体材料股份有限公司 一种直拉法生长低电阻率单晶硅用掺杂装置及掺杂方法
CN105063747A (zh) * 2015-07-21 2015-11-18 李剑 一种液态连续加料多晶硅铸锭设备及其生产方法
CN106012010A (zh) * 2016-08-15 2016-10-12 江苏协鑫硅材料科技发展有限公司 一种二次添加掺杂剂的方法和装置
CN108301038A (zh) * 2017-01-12 2018-07-20 新疆知信科技有限公司 一种单晶硅提拉炉和生长单晶硅的拉制方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0341503A3 (en) 1990-06-13
FI85285B (fi) 1991-12-13
DD297843A5 (de) 1992-01-23
ES2059610T3 (es) 1994-11-16
JPH02291265A (ja) 1990-12-03
DE68909488T2 (de) 1994-01-20
AU3381689A (en) 1989-11-16
IE63128B1 (en) 1995-03-22
US5437993A (en) 1995-08-01
FI85285C (fi) 1992-03-25
NO891943L (no) 1989-11-14
DE68909488D1 (de) 1993-11-04
ATE95232T1 (de) 1993-10-15
US5900364A (en) 1999-05-04
IN169420B (zh) 1991-10-12
HU206134B (en) 1992-08-28
DK231989A (da) 1989-11-14
EP0341503B1 (en) 1993-09-29
IE891435L (en) 1989-11-13
EP0341503A2 (en) 1989-11-15
FI882249A0 (fi) 1988-05-13
JP2599789B2 (ja) 1997-04-16
ZA893460B (en) 1990-01-31
NO891943D0 (no) 1989-05-12
DK169039B1 (da) 1994-08-01
FI882249A (fi) 1989-11-14
KR900018370A (ko) 1990-12-21
DK231989D0 (da) 1989-05-12
CA1320463C (en) 1993-07-20
US5811280A (en) 1998-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1038123A (zh) 交联葡萄糖异构酶
CN1229500C (zh) 碱性纤维素酶及其产生方法
CN1029987C (zh) 新的固相生物催化剂及其制备和应用
CN1174953C (zh) 生产纯化乳酸溶液的方法
CN1075557C (zh) 丙烯酸铵的生产
CN1080301C (zh) 提纯重组体人血清清蛋白的方法
CN1292023A (zh) 使用阴离子交换层析法提纯有机酸
CN1061090C (zh) 制备固定化酶共轭体的方法及由此制备的固定化酶共轭体
CN1006807B (zh) 啤酒的处理方法
CN86107569A (zh) 一种蛋白质氨基末端残基的有选择化学去除
CN1341112A (zh) 制备α－亚甲基内酯的方法
CN85105753A (zh) 制备特高纯度山梨醇糖浆的方法
CN1530373A (zh) 无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液、其制备方法和使用这种提取液的无细胞蛋白质合成方法
CN1049864A (zh) 抗吗啡单克隆抗体及其制备、吗啡的检测药盒及检测方法
CN1026130C (zh) 用非沸石型聚合吸附剂从发酵液中分离柠檬酸
CN1088198A (zh) 伯胺的制备方法及其适用的催化剂系统
CN1392257A (zh) L－脯氨酸4位羟基化酶的制备方法
CN1229143A (zh) 生产l－天冬氨酸的方法
Pan et al. Biomass yields and energetic yields of oleaginous yeasts in batch culture
CN86107635A (zh) 稳定的α-淀粉酶溶液的生产方法及由此生产的液体α-淀粉酶
CN1924010A (zh) 食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺
CN1523011A (zh) 以氟化物为添加剂制备氨基腈的方法
CN86103223A (zh) 溶剂诱导的细胞自溶作用
CN100406565C (zh) 在改进的常规分批反应器中使用稳定的酵母结晶生产乙醇的方法
CN1026014C (zh) 淀粉酶的分离精制方法，所用的吸附剂及分离精制装置

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C01 Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication