CN1530373A - 无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液、其制备方法和使用这种提取液的无细胞蛋白质合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液的制备方法、酵母提取液、使用酵母提取液的蛋白质的无细胞合成方法和包含酵母提取液的无细胞蛋白质合成试剂盒，其中提取液易于制备并比利用常规酵母提取液能合成更多数量的蛋白质。本发明的方法包括在冷冻状态下破碎酵母细胞，并获取其提取物。

Description

无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液、 其制备方法和使用这种提取液的无细胞蛋白质合成方法

技术领域

本发明涉及无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液、其制备方法、在使用这种提取液的无细胞系统中的蛋白质的合成方法和包含酵母提取液的无细胞蛋白质合成试剂盒。

背景技术

近年来，已译解出多种生物体如人类基因组的遗传信息。在这种情况下，蛋白质的功能分析和基于这种遗传信息的基因组医学的创立正引起对postgenomic研究的注意。与这种药品等所需遗传信息相应的蛋白质的应用和利用需要在短时间内容易地合成出各种蛋白质。

目前，已广泛利用基因重组技术并使用酵母活细胞、昆虫细胞等的表达系统(下文中往往称为“细胞系统”)作为蛋白质的生产方法。但是，活细胞由于其功能保留而表现出外源蛋白质消失的倾向，并且由于活细胞中细胞毒性蛋白质的表达阻止了细胞生长而存在许多不能被容易地表达的蛋白质。

另一方面，作为无细胞系统的蛋白质生产方法，已知无细胞蛋白质合成包括：向细胞破碎、提取液等中加入培养基、酶等，以在试管内提供广泛可供选择的生物体遗传信息翻译系统，并重建能利用编码目的蛋白质的mRNA以希望的次序连接必要数量的氨基酸残基的合成系统。这种无细胞蛋白质合成相对而言没有强加在上述细胞系统蛋白质合成上的限制，并能在不杀伤生物体的情况下合成蛋白质。另外，由于蛋白质的生产不伴有培养等操作，因而与细胞系统相比，可在短时间内合成蛋白质。此外，由于无细胞蛋白质合成技术还用来大规模生产由不被生物体利用的氨基酸序列组成的蛋白质，因而有望成为有前途的表达方法。至于被应用于无细胞蛋白质合成的细胞破碎或提取液，已考虑使用各种生物衍生物，并正在进行研究。在这些衍生物中，由于酵母象原核生物如大肠杆菌等一样易于培养，因而能获得低成本的提取液。由于酵母是真核生物，可进行不适用于大肠杆菌等提取液的翻译后修饰如糖基化等。从上面观点看，源于酵母的无细胞蛋白质合成用提取液的发展正引起更多的关注。

Gasior等人最先报道了使用源于酵母的提取液的无细胞蛋白质合成方法(例如，Gasior，E.等，J.Biol.Chem.，254，3965-3969，1979)。根据Gasior等人的方法，首先培养酵母，使用蜗牛酶(glusulase)制备原生质球，然后再在包含0.4M MgSO4的YM-5培养基中培养。然后再通过离心收集细胞，悬浮到缓冲液中并用杜恩斯(Dounce)匀浆器破碎。先在30000×g下，再在10000×g下离心破碎物。用Sephadex(交联葡聚糖凝胶)G-25处理得到的上清液，收集高蛋白质含量的馏分作为无细胞蛋白质合成用提取液。但是，Gasior等人的方法需要非常复杂的提取液的制备，并为此需要大量时间和人力。

为解决这个问题，Hussain等人通过改变细胞破碎方法，开发出一种更便利的无细胞蛋白质合成用提取液的制备方法(例如，Hussain，I等人，Gene，46，13-23，1986)。Hussain等人提出的方法是一种非常便利的提取液制备方法，包括培养酵母、收集细胞、用缓冲液洗涤细胞、悬浮，然后用玻璃珠破碎细胞，在30000×g下离心得到的破碎物，并用Sephadex(交联葡聚糖凝胶)G-25处理得到的上清液。

另外，US2002/0168705 A1(JP-A-2002-262867)公开了重原子同晶体置换产物蛋白质的无细胞合成方法，适于使用源于酵母等的提取液的蛋白质的X-射线结晶分析。

但是，使用上述任一种方法得到的提取液合成的蛋白质的数量非常少，而且只能通过摄取有放射标记的氨基酸测定蛋白质合成活性。因此，期望有制备源于酵母的提取液的方法，使其能容易地被制备并能合成大量蛋白质。

发明概述

为解决上述问题完成了本发明，并旨在提供一种无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液的制备方法、酵母提取液、使用这种酵母提取液的无细胞蛋白质合成方法，和包含这种酵母提取液的无细胞蛋白质合成试剂盒，其中提取液易于制备并比利用常规酵母提取液能合成更多数量的蛋白质。

为尝试解决上述问题，本发明人进行了广泛研究，从而完成了本发明。因此，本发明提供以下方面。

(1)一种制备无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液的方法，该方法包括在冷冻状态下破碎酵母细胞和获取其提取液。

(2)上述(1)中的制备方法，其中用液氮冷冻酵母细胞。

(3)上述(1)或(2)中的制备方法，其中用研棒在研钵内捣碎酵母细胞。

(4)上述(1)-(3)中的任一种制备方法，还包括，在从酵母细胞中提取后，从提取液中除去分子量不超过5000的胞内组分，并浓缩得到的提取液。

(5)用上述(1)-(4)中任一种方法制备的无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液。

(6)一种蛋白质的无细胞合成方法，该方法包括使用包含上述(5)中的酵母提取液的反应液。

(7)上述(6)中的方法，其中将反应液调整到pH6.0-8.0。

(8)上述(6)中的方法，该方法包括在合成蛋白质的同时透析反应液。

(9)无细胞蛋白质合成试剂盒，包括上述(5)中的酵母提取液。

附图简述

图1为使用实施例1和对比例1中的酵母提取液在每段反应时间内合成萤光素酶的数量示意图，其中纵轴表示合成萤光素酶的数量(ng/mL)，横轴表示反应时间(分钟)。

图2为使用浓缩提取液从合成反应开始3小时内合成萤光素酶的数量示意图，其中纵轴表示合成萤光素酶的数量(ng/mL)，横轴表示提取液在280nm时的吸光度。

图3为透析法无细胞蛋白质合成反应和间歇法无细胞蛋白质合成反应之间的萤光素酶合成数量相对于反应时间的对比示意图。

发明详述

本说明书中的“无细胞蛋白质合成”是指利用无细胞翻译系统通过读取mRNA信息合成蛋白质的蛋白质合成。正如这里所使用的，根据本发明的合成方法在无细胞系统中合成的“蛋白质”包含具有任意分子量的任意肽，其由多个氨基酸残基组成，即从低分子量的肽到高分子量的肽。本说明书中的“蛋白质”包括糖基化的糖蛋白。

发明实施方式

下面详细解释本发明。

本发明涉及一种制备无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液的方法，该方法包括破碎冷冻的酵母细胞并从酵母细胞获取提取液。通过利用这种方法制备酵母提取液，可比利用Gasior，E.等人在J.Biol.Chem.，254，3965-3969，1979中描述的方法更便利、比利用Hussain，I等人在Gene，46，13-23，1986中描述的方法更温和的条件下破碎细胞。

本发明的制备方法需要冷冻酵母细胞。希望使用惰性气体如液氮等快速冷冻酵母细胞。当不能快速冷冻细胞时，可能不能便利地灭活蛋白质合成用的必需组分等，而且可能不能完全达到本发明的上述效果。

可通过使用例如上面提到的液氮、丙酮-干冰等实现上述的酵母细胞冷冻。优选使用液氮，因为使用有机溶剂如丙酮等可能灭活蛋白质合成用的必需组分。

如上所述，冷冻酵母细胞并在冷冻状态下破碎。可利用任一种方法破碎酵母细胞，只要使冷冻的酵母细胞成为粉末即可。例如，可使用研棒在研钵内捣碎酵母细胞，也可使用金属颗粒作为粉碎介质来粉碎，以及多珠振荡器(YASUI KIKAI CORPORATION制造)或其它方法。优选利用研棒在研钵内捣碎来破碎酵母细胞，因为这样可在较温和的条件下破碎酵母细胞，并且不从酵母细胞中提取无细胞蛋白质合成不需要的物质。

至于本发明中的“酵母”，可使用有孢子酵母菌、担子菌类酵母和无孢子酵母菌中的任一种而没有任何特殊限制，只要按惯例被通常认为是酵母即可。在这些酵母中间，优选使用有孢子酵母菌。在有孢子酵母菌中间，更优选使用裂殖酵母，在裂殖酵母中间，尤其优选使用裂殖酵母属球形物(schizosaccaromyces pombe)。

可由单种酵母细胞或由多种酵母细胞完成本发明的提取。

根据本发明的方法，在上述破碎后通过向酵母细胞中加入提取液进行破碎酵母细胞的提取。对使用的提取液没有特殊限制，但优选包含至少一种蛋白酶抑制剂。当使用包含蛋白酶抑制剂的提取液时，就能抑制源于酵母的提取物中包含的蛋白酶的活性，并能阻止不希望有的由蛋白酶引起的提取物中活性蛋白质的退化。因此，可有效地提升利用源于酵母的提取物控制的蛋白质合成能力。

对上述蛋白酶抑制剂没有特殊限制，只要它能抑制蛋白酶的活性即可，例如，可使用苯甲基磺酰氟(phenylemethanesulfonyl fluoride)(下文中往往称为“PMSF”)、抑蛋白酶肽、苯丁抑制素、亮抑酶肽、抑胃酶肽A、E-64(L-反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰酰胺基(4-胍基)丁烷)、乙二胺四乙酸、磷酰胺(phosphoramidon)等。由于假定酵母细胞内部有强丝氨酸蛋白酶活性，因此在上述这些抑制剂中，优选使用PMSF，其作为抑制剂对丝氨酸蛋白酶具有高的特异性。此外，不仅可使用一种蛋白酶抑制剂，还可使用几种蛋白酶抑制剂的混合物(蛋白酶抑制剂混合物)。

对提取液中蛋白酶抑制剂的含量没有任何特殊限制，但优选为1μM-50mM，较优选为0.01mM-5mM，因为这可优选抑制实施本发明需要的酶的分解。这是因为当蛋白酶抑制剂少于1μM时，通常不能充分抑制蛋白酶的分解活性，而当蛋白酶抑制剂超过50mM时，又趋向于抑制蛋白质合成反应。

除了上述蛋白酶抑制剂外，本发明的提取液优选至少包含钾盐、镁盐、二硫苏糖醇和缓冲液。

对上述钾盐没有任何特殊限制，只要它不阻碍实施本发明即可，而且可以以常规形式使用，如醋酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二钾、硫酸钾、磷酸二氢钾、碘化钾、邻苯二甲酸钾等，优选使用醋酸钾。钾盐在蛋白质合成反应中作为辅助因子。

对提取液中钾盐的含量没有任何特殊限制，但从保存稳定性方面看，在单价钾盐如醋酸钾等的情况下，优选为1mM-500mM，较优选为10mM-300mM。当钾盐的含量少于1mM或多于500mM时，蛋白质合成的必要组分趋向于变得不稳定。

对上述镁盐没有任何特殊限制，只要它不阻碍实施本发明即可，而且可以以常规形式使用，如醋酸镁、硫酸镁、氯化镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、硝酸镁、草酸镁等，优选使用醋酸镁。镁盐在蛋白质合成反应中也作为辅助因子。

对提取液中镁盐的含量没有任何特殊限制，但从保存稳定性方面看，在二价镁盐如醋酸镁等的情况下，优选为0.01mM-10mM，较优选为0.1mM-5mM。当镁盐的含量少于0.01mM或多于10mM时，蛋白质合成的必要组分趋向于变得不稳定。

为防止氧化，加入上述二硫苏糖醇(下文中有时称为“DTT”)，并且在提取液中的数量优选为0.01mM-10mM，较优选为0.1mM-5mM。当DTT的含量少于0.01mM或多于10mM时，蛋白质合成的必要组分趋向于变得不稳定。

上述缓冲液为提取液提供缓冲能力，并且是为了防止由于加入诸如酸性或碱性物质等造成的提取液pH的剧烈变化从而导致提取物变性而加入。对这种缓冲液没有任何特殊限制，而且可使用例如HEPES-KOH、Tris-HCl、醋酸-醋酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸、硼酸、MES、PIPES等。

缓冲液优选为保持提取液的pH在4-10、较优选在6-8的那种缓冲液。当提取液的pH小于4或超过10时，可能使本发明反应必需的组分变性。从这方面考虑，在上述缓冲液中，尤其优选使用HEPES-KOH(pH6-8)。

尽管对提取液中缓冲液的含量没有任何特殊限制，但优选为5mM-200mM，较优选为10mM-100mM，以保持优选的缓冲能力。当缓冲液的含量小于5mM时，由于加入酸性或碱性物质而使pH趋向于剧烈变化，从而可能导致提取物的变性，而当缓冲液的含量超过200mM时，盐浓度变得太高，蛋白质合成的必要组分趋向于变得不稳定。

在本发明的酵母提取物的制备方法中，对从上述破碎后酵母细胞的提取到获得无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液的步骤没有特殊限制，例如，可采用以下步骤。

首先，向上述破碎后的酵母细胞中加入提取液，并将获得的包含酵母提取物的液体进行离心分离。在这个领域内通常使用的条件下进行离心分离(10000×g-50000×g，0℃-10℃，10-60分钟)。收集上清液，并且在上述条件下再进行离心分离。

离心后，凝胶过滤上清液。对于凝胶过滤，例如，可优选使用脱盐柱PD-10(Amersham Biosciences制造)。根据常规方法，用包含20％甘油的提取液平衡柱，供入式样，并用上述提取液洗脱混合物。在本发明中也可使用这些条件。上述凝胶过滤用缓冲液优选为补充有甘油的提取液。使用这些物质，能有利地稳定蛋白质合成的必要组分。一般只需加入5(v/v)％-40(v/v)％的甘油。

可按照一般凝胶过滤法，将经凝胶过滤得到的滤出液分馏出0.1mL-1mL，并优选使用0.4mL-0.6mL作为一个馏分，以有效地得到具有高蛋白质合成能力的馏分。

随后，使用仪器如Ultrospec 3300 pro(Amersham Biosciences制造)，从凝胶过滤后的滤出液中分馏出280nm时的吸光度不小于20且260nm时的吸光度不小于30的馏分，以得到本发明的酵母提取液。

优选在使用前述具有优选组成的提取液进行上述快速冷冻前洗涤要进行本发明制备方法制备的酵母细胞，以便能阻止培养基组分等对蛋白质合成反应的抑制。为了用提取液进行洗涤，向酵母细胞中加入提取液，并且离心分离(如4℃，8000×g，5分钟)混合物。

为完全除去培养基，以1g(湿重)酵母细胞计，优选使用的洗涤用提取液的数量为1mL-20mL，较优选为2mL-15mL。

对进行本发明制备方法的酵母细胞的数量没有特殊限制。

按照本发明方法制备的无细胞蛋白质合成用提取液优选包含比例为1mg/mL-200mg/mL，较优选为10mg/mL-100mg/mL源于酵母的衍生提取物。当源于酵母的提取物的含量少于1mg/mL时，蛋白质合成所需的必要组分的浓度变低，并且不能合成足够数量的蛋白质。当源于酵母的提取物的含量超过200mg/mL时，由于它包含许多抑制蛋白质合成反应的提取因子，可能会明显缩短合成反应时间。

可测定提取液中源于酵母的提取物的蛋白质含量，例如，使用BCA蛋白质检测盒(PIERCE制造)测定。其步骤包括向反应试剂(2mL)中加入0.1mL样品，在37℃下使混合物反应30分钟，并测定562nm处的吸光度。一般使用牛血清白蛋白作为对照。

可通过，例如分析提取物中包含的核糖体RNA的碱基序列来确定提取液中包含的提取物是否源于酵母。

本发明的提取液优选包含源于酵母提取物的蛋白质浓度比例为1mg/mL-200mg/mL，同时含有1mM-500mM的醋酸钾，0.01mM-10mM的醋酸镁，0.01mM-10mM的DTT，1μM-50mM的PMSF和5mM-200mM的HEPES-KOH(pH6-8)。

另外，在通过上述制备方法得到本发明的提取液后，优选除去分子量为5000或更低(优选10000或更低)的细胞内组分并浓缩。通过浓缩，可除去蛋白质合成中不需要的组分，而且必需组分的浓缩提高了蛋白质合成的反应速度。

对上述浓缩方法没有特殊限制，可使用常规已知的适当方法。按照这种方式进行浓缩，即浓缩后提取液280nm处的吸光度优选变为10-100，较优选为20-80。当上述浓缩后提取液的吸光度小于10时，蛋白质合成速度变慢，结果合成数量倾向于不能增加。当上述吸光度超过100时，由于合成反应时间大大缩短，合成速度加快但合成数量倾向于不能增加。

对浓缩提取液的方法没有特殊限制，可使用常规已知的各种方法，如超原料-0.5离心过滤器和管(排除分子量：10000或更低，Millipore制造)。

本发明还提供使用上述提取液的无细胞蛋白质合成方法。在合成反应中，通常制备的反应液包含上述提取液和无细胞蛋白质合成必需的添加剂。对上述添加剂没有特殊限制，可使用任何一种添加剂，只要它为在无细胞蛋白质合成领域中通常使用的即可。

优选按以下方式制备上述反应液：包含本发明提取液的比例为10(v/v)％-90(v/v)％、尤其是20(v/v)％-80(v/v)。

也就是说，在整个上述反应液中，源于酵母细胞的提取物的含量优选制备到0.1mg/mL-180mg/mL，更优选到2mg/mL-80mg/mL。当蛋白质浓缩物中提取物的含量小于0.1mg/mL或超过180mg/mL时，目的蛋白质的合成速度趋于变得太慢。

优选将本发明无细胞蛋白质合成方法用的反应液调整到pH6.0-8.0，更优选6.5-7.5(常规无细胞蛋白质合成用反应液的pH为7.4-7.6)。当反应液的pH低于6.0时，会使蛋白质合成的必需组分变性，当pH超过8.0时也不是蛋白质合成的必需组分所需要的，因为反应速度趋于变慢。

通常，对不同于上述提取液的组分，上述反应液至少包含钾盐、镁盐、DTT、5′-三磷酸腺苷、5′-三磷酸鸟苷、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸组分、核糖核酸酶抑制剂、tRNA、mRNA和缓冲液。这有利地实现了无细胞蛋白质合成用反应液，并还能在短时间内合成大量蛋白质。

对于反应液中的钾盐，可优选使用上述作为提取液组分的各种钾盐，优选醋酸钾。出于与前述提取液中钾盐同样的考虑，反应液中含有钾盐的比例优选为10mM-500mM，更优选为20mM-300mM。

对于反应液中的镁盐，可优选使用上述作为提取液组分的各种镁盐，优选醋酸镁。出于与前述提取液中镁盐同样的考虑，反应液中含有镁盐的比例优选为0.1mM-10mM，更优选为0.5mM-5mM。

出于与前述提取液中DTT同样的考虑，反应液中含有DTT的比例优选为0.01mM-10mM，更优选为0.1mM-5mM。

从蛋白质合成速度方面考虑，反应液中含有5′-三磷酸腺苷(下文中有时称为“ATP”)的比例优选为0.01mM-2mM，更优选为0.1mM-1mM。当含有ATP的比例小于0.01mM或超过2mM时，蛋白质的合成速度趋于变得较慢。

从蛋白质合成速度方面考虑，反应液中含有5′-三磷酸鸟苷(下文中有时称为“GTP”)的比例优选为0.01mM-10mM，更优选为0.2mM-5mM。当含有GTP的比例小于0.01mM或超过5mM时，蛋白质的合成速度趋于变得较慢。

反应液中的磷酸肌酸是连续合成蛋白质所需要的组分，加入的目的是用于ATP和GTP的再生。从蛋白质合成速度方面考虑，反应液中含有磷酸肌酸的比例优选为10mM-50mM，更优选为15mM-35mM。当含有磷酸肌酸的比例小于10mM时，不能容易地再生足够量的ATP和GTP。因此，蛋白质的合成速度趋于变得较慢。当磷酸肌酸的含量超过50mM时，它充当抑制物质，蛋白质的合成速度趋于变得较慢。

反应液中的肌酸激酶是连续合成蛋白质所需要的组分，与磷酸肌酸一起加入用于ATP和GTP的再生。从蛋白质合成速度方面考虑，反应液中含有肌酸激酶的比例优选为1μg/mL-1000μg/mL，更优选为10μg/mL-500μg/mL。当肌酸激酶的含量小于1μg/mL时，不能再生足够量的ATP和GTP。因此，蛋白质的合成速度趋于变得较慢。当肌酸激酶的含量超过1000μg/mL时，它充当抑制物质，蛋白质的合成速度趋于变得较慢。

反应液中的氨基酸组分包含至少20种氨基酸，即缬氨酸、蛋氨酸、谷氨酸、丙胺酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、色氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸和精氨酸。氨基酸组分通常含有几乎等量的上述20种氨基酸中的每一种。

在本发明中，从蛋白质合成速度方面考虑，反应液中含有上述氨基酸组分的比例优选为1μM-1000μM，更优选为10μM-500μM。当氨基酸组分的量小于1μM或超过1000μM时，蛋白质的合成速度趋于变得较慢。

在本发明的无细胞蛋白质合成过程中，反应液中加入核糖核酸酶抑制剂，以防止源于污染提取液的酵母细胞中的核糖核酸酶不能如愿地消化mRNA和tRNA并阻止蛋白质的合成。反应液中含有核糖核酸酶抑制剂的比例优选为0.1U/μL-20U/μL，更优选为0.2U/μL-10U/μL。当核糖核酸酶抑制剂的量小于0.1U/μL时，经常不能充分地抑制核糖核酸酶的降解活性，而当核糖核酸酶抑制剂的量超过20U/μL，趋向于抑制蛋白质合成反应。

至于反应液中的外源mRNA，对利用这种方法编码的蛋白质(包括肽)没有特殊限制，而且mRNA可编码有毒蛋白质或糖蛋白。对使用的mRNA的碱基数没有限制，而且所有的mRNA不必具有相同数目的碱基，只要它们能合成目的蛋白质即可。另外，只要序列同源到能合成目的蛋白质的程度，可删除、取代、插入或添加每个mRNA的多个碱基。

本发明中使用的mRNA可为合适的市售产品。当使用源于pT_NT载体(Promega生产)的载体通过转录反应得到的mRNA时，能提高无细胞转录反应的效率，这样就能优选地提供大量的目的蛋白质，其中编码目的蛋白质的DNA起始密码子被插入5′-β珠蛋白前导序列的下游。

从蛋白质合成速度方面考虑，在反应液中，含有mRNA的比例优选为1μg/mL-1000μg/mL，更优选为10μg/mL-500μg/mL。当mRNA小于1μg/mL或高于1000μg/mL时，蛋白质合成速度趋于变慢。

反应液中的tRNA包含几乎与上述20种氨基酸相应的tRNAs的每一种等量。在本发明中，从蛋白质合成速度方面考虑，反应液中含有tRNA的比例优选为1μg/mL-1000μg/mL，更优选为10μg/mL-500μg/mL。当tRNA的量小于1μg/mL或超过1000μg/mL时，蛋白质合成速度趋于变慢。

反应液中含有的缓冲液优选接近于本发明中前述提取液用缓冲液，并因同样的理由优选使用HEPES-KOH(pH6-8)。出于与前述提取液中含有的缓冲液同样的考虑，含有缓冲液的量优选为5mM-200mM，更优选为10mM-100mM。

上述反应液还优选含有甘油。当加入甘油时，可在蛋白质合成反应中有利地稳定蛋白质合成的必需组分。当加入甘油时，甘油的数量一般为5(v/v)％-20(v/v)％。

也就是说，除了10(v/v)％-90(v/v)％的上述提取液外，优选使本发明的无细胞蛋白质合成方法使用的反应液含有10mM-500mM的醋酸钾，0.1mM-10mM的醋酸镁，0.01mM-10mM的DTT，5(v/v)％-20(v/v)％的甘油，0.01mM-2mM的ATP，0.01mM-10mM的GTP，10mM-50mM的磷酸肌酸，1μg/mL-1000μg/mL的肌酸激酶，1μM-1000μM的氨基酸组分，0.1U/μL-20U/μL的核糖核酸酶抑制剂，1μg/mL-1000μg/mL的tRNA，1μg/mL-1000μg/mL的mRNA和5mM-200mM的HEPES-KOH(pH6-8)。

可在，例如通常已知的低温培育箱中使用本发明如上所述的提取液实现本发明的无细胞蛋白质合成方法。为了反应，一般制备并使用包含上述提取液的反应液。

反应温度一般在10℃-40℃的范围内，优选在15℃-35℃。当反应温度低于10℃时，蛋白质合成速度趋于变慢，当反应温度超过40℃时，趋于使必需组分变性。

此外，在本发明的无细胞蛋白质合成方法中，优选在透析酵母提取液的同时合成蛋白质。通过在按这种方式进行透析的同时合成蛋白质，可用透析用外部溶液连续供应ATP等蛋白质合成必需的能源，从而有利地延长了蛋白质合成反应时间。

当在透析酵母提取液的同时合成蛋白质时，将包含在透析膜中的反应液注入含有透析用外部溶液的反应槽内，借此进行蛋白质合成反应。

对使用的透析膜没有特殊限制，可使用常规已知的各种膜。优选能从反应液中将分子量为3000或更低、尤其是10000或更低的物质分散到透析用外部溶液中的膜。对于这类透析膜，例如，可提及的是Slide-A-Lyzer(PIERCE生产，排出分子量：10000或更低)等。

对使用的透析用外部溶液没有特殊限制，只要它具有允许上述透析进行的组成即可。例如，可使用组成为从反应液组成中排除了提取液、tRNA、mRNA、肌酸激酶和核糖核酸酶抑制剂的透析反应液用外部溶液。

本发明涉及包含本发明酵母提取液的无细胞蛋白质合成试剂盒。试剂盒中包含的酵母提取液优选不含分子量为5000或更低的胞内组分，并经过浓缩。优选地，试剂盒还包含部分或全部钾盐、镁盐、DTT、5′-三磷酸腺苷、5′-三磷酸鸟苷、磷酸肌酸、肌酸激酶、氨基酸组分和核糖核酸酶抑制剂、tRNA和缓冲液。在试剂盒中这些组分可以粉末或溶液的形式存在。在试剂盒中这些组分还能以部分或全部混合的粉末或溶液的形式存在。更优选地，试剂盒包含前述透析膜和/或透析外部溶液。优选将试剂盒的组分分别包装并装在一个单独包装内。

可通过酶活性测定、SDS-PAGE、免疫测定等确定利用本发明的无细胞蛋白质合成方法合成的蛋白质的数量。

对可利用本发明的无细胞蛋白质合成方法合成的蛋白质没有任何特殊限制。

实施例

下文中通过参考实施例更详细地解释本发明。以下实施例不限制本发明。

参考实施例1

裂殖酵母属球形物细胞的培养

将裂殖酵母属球形物接种到含6mLYEPD培养基(葡糖：1.0％，酵母提取物：1.0％，ploypepton：2.0％)的广口试管内，并在30℃下振荡培养16小时。利用其作为预培养基，将10mL预培养基接种到包含0.5μM硫胺素的YEPD培养基(2.5L)中，在通风条件和30℃下搅拌培养约15小时，直到660nm处的吸光度变为1.0。离心分离(4℃，8000×g，5分钟)培养基，并收集细胞。结果，从2.5L培养基中得到约6g湿细胞。

实施例1

无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液的制备

用蒸馏水洗涤上述参考实施例1中得到的酵母细胞，并再次通过离心分离(4℃，8000×g，5分钟)收集细胞。用3mL每1g(湿重)细胞中具有下列组成的提取液洗涤细胞。

[提取液组成]

·50mM HEPES-KOH(pH7.0)

·100mM  醋酸钾

·2mM  醋酸镁

·2mM  DTT

再次通过离心分离(4℃，8000×g，5分钟)收集细胞。将收集的细胞(约5g)置于冷冻到-80℃的研钵内。向其中加入液氮，并使用研棒在研钵内用力捣碎混合物。向捣碎的细胞中加入含有0.5mM PMSF的提取液(4.5mL)，并提取混合物。提取后，通过离心分离(4℃，30000×g，10分钟)除去细胞残渣，并再离心分离(4℃，30000×g，10分钟)得到的上清液。将离心后的上清液(2.0mL)加到用含20(v/v)％甘油的提取液平衡的PD-10(AmershamBiosciences制造)中，并用同样的提取液洗脱。分馏出500μL洗脱液。测定各个馏分在280nm和260nm处的吸光度，并分别收集吸光度不低于20和30的馏分以得到源于酵母的无细胞蛋白质合成用提取液。通过这种操作，得到约1.5mL 280nm和260nm处的吸光度分别为25和42的提取液。

对比例1

利用玻璃珠法生产酵母提取液

用蒸馏水洗涤上述参考实施例1中得到的酵母细胞，并再次进行离心分离(4℃，8000×g，5分钟)收集细胞。用3mL每1g(湿重)细胞中具有下列组成的提取液洗涤细胞。

[提取液组成]

·50mM  HEPES-KOH(pH7.0)

·100mM  醋酸钾

·2mM  醋酸镁

·2mM  DTT

再次通过离心分离(4℃，8000×g，5分钟)收集细胞。将收集的细胞(约5g)悬浮于含0.5mM PMSF的提取液(5mL)中，并加入玻璃珠(10g)。使用多珠振荡器(YASUI KIKAI CORPORATION制造)在2500rpm下破碎酵母细胞30秒，循环10次。破碎后，通过离心分离(4℃，8000×g，5分钟)除去残余细胞。离心分离(4℃，30000×g，10分钟)得到的上清液，并对得到的上清液再进行离心分离(4℃，30000×g，30分钟)。将得到的上清液(2.0mL)加到用含20(v/v)％甘油的提取液平衡的PD-10(Amersham Biosciences制造)中，并用同样的提取液洗脱。分馏出500μL洗脱液。测定各个馏分在280nm和260nm处的吸光度，并分别收集吸光度不低于90和150的馏分，得到源于酵母的无细胞蛋白质合成用提取液。通过这种操作，得到约1.5mL 280nm和260nm处的吸光度分别为110和180的提取液。

试验例1

使用实施例1和对比例1中得到的提取液的无细胞蛋白质合成

使用上述实施例1和对比例1中得到的提取液，制备具有以下组成的反应液。

[反应液组成]

·50(v/v)％酵母提取液

·25mM HEPES-KOH(pH7.0)

·50mM  醋酸钾

·2mM  醋酸镁

·1mM  DTT

·10(v/v)％  甘油

·0.5mM  ATP

·0.1mM  GTP

·25mM  磷酸肌酸

·200μg/mL  肌酸激酶

·40μM  氨基酸(20种)

·1U/μL  核糖核酸酶抑制剂(源于人类胎盘)

·200μg/mL  tRNA(源于酵母)

·20μg/mL  mRNA

对于mRNA，使用编码萤光素酶的mRNA(萤光素酶控制RNA，Promega生产)。使用低温干块G-1000(由TOKYO RIKAKIKAI公司制造)作为反应设备，在无细胞系统中进行蛋白质合成反应。反应温度为30℃，反应液的量为25μL。使用萤光素酶检测试剂盒(E-1500，Promega制造)确定合成的萤光素酶的量。将反应液(2.5μL)加入到萤光素酶检测试剂(50μL)中，并使用光度计(Turner Designs TD-20/20，由Promega制造)测定萤光素酶发的光。

图1为使用实施例1和对比例1的酵母提取液时在每段反应时间内合成的萤光素酶的数量示意图。在图1中，纵轴表示合成萤光素酶的数量(ng/mL)，横轴表示反应时间(分钟)。如图1所示，使用冷冻破碎法制备的酵母提取液的蛋白质合成反应在反应开始后持续了3小时，并合成了60ng/mL萤光素酶。相反，使用玻璃珠法制备的酵母提取液的合成反应在1小时内停止，合成萤光素酶的数量为14ng/mL。

试验例2

使用浓缩提取液的无细胞蛋白质合成

使用超游离-0.5离心过滤器和管(Millipore制造，排除分子量：10000或更低)连续浓缩上述实施例1中制备的提取液，以得到280nm处的吸光度为22、37、50、62和74的浓缩提取液。使用各种浓缩提取液制备同上述试验例1中具有同样组成的反应液，并进行无细胞蛋白质合成。按照与试验例1同样的方式确定合成萤光素酶的量。

图2为使用浓缩提取液时从合成反应开始3小时内合成萤光素酶的数量示意图。在图2中，纵轴表示合成萤光素酶的数量(ng/mL)，横轴表示提取液在280nm处的吸光度。如图2所示，提取液在280nm处的吸光度为35-50的浓缩提取液显示出最高的合成量，合成了大约100ng/mL萤光素酶。

参考实施例2

mRNA的制备

(1)载体DNA的构建

使用作为模板的pGEM-luc载体(5ng，由Promega制造)、碱基序列描述在SEQ ID；No 1中的引物(Luc T7-F3-Kpn)，碱基序列描述在SEQ ID；No 2中的引物(Luc T7-R4-Kpn)，并在97℃、15秒，55℃、30秒和68℃、120秒条件下进行KOD(由TOYOBO公司制造)加PCR，循环30次。通过乙醇沉淀纯化DNA片段，并用KpnI消化。

另外，用KpnI消化pT_NT载体(由Promega制造)。通过琼脂糖凝胶电泳分离反应液，并使用Gen Elute凝胶纯化试剂盒(由SIGMA制造)纯化DNA片段。

使用Ligation High(由TOYOBO公司制造)连接由上述pGEM-luc载体得到的DNA片段和由上述pT_NT载体得到的DNA片段，并转化大肠杆菌DH5α(由TOYOBO公司制造)。通过碱-SDS方法由转化的大肠杆菌制备质粒DNA，并使用碱基序列描述在SEQ ID；No3中的引物(T7启动子)和Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS(由Applied Biosystems制造)进行测序反应(96℃、10秒，50℃、5秒和60℃、4分钟，循环30次)。将这种反应液加到ABI PRISM 310基因分析器(由Applied Biosystems制造)中，并分析碱基序列。将具有被插入到源于pT_NT载体的5′-β-株蛋白前导序列下游的萤光素酶基因的起始密码子的质粒命名为pT_NT-Luc。

(2)体外转录反应

用BamHI消化在上述(1)中制备的pT_NT-Luc，并通过苯酚-氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化。使用其作为模板，进行体外转录反应。使用的转录反应液具有以下组成。

[转录反应液组成]

·80mM  HEPES-KOH(pH7.4)

·24mM  醋酸镁

·40mM  DTT

·7.5mM  NTPs(ATP，GTP，UTP，CTP)

·2mM  spemidine

·1U/μL  核糖核酸酶抑制剂(源于人类胎盘)

·1U/μL  T7 RNA聚合酶

·50μg/mL pTNT-Luc/BamHI

分别使用NTPs(由SIGMA制造)，核糖核酸酶抑制剂(由TAKARASHUZO公司制造)和T7 RNA聚合酶(由Promega制造)。对于反应设备，使用低温干块MG-1000(由TOKYO RIKAKIKAI公司制造)。在37℃下进行转录反应4小时，反应液的量为20μL。

(3)外源mRNA的纯化

在转录反应完成后，将1U RQ1 RNase自由DNase(由Promega制造)加入到上述(2)的反应液(20μL)中。在37℃时培育混合物15分钟，以消化模板DNA。用苯酚-氯仿提取法除去蛋白质，并加入醋酸钾至最终浓度为0.3M，进行乙醇沉淀。将得到的沉淀物溶于100μL蒸馏水中，并加到Nick柱(由Amersham Biosciences制造)中，用蒸馏水(400μL)洗脱。收集洗脱馏分，加入醋酸钾至最终浓度为0.3M，并进行乙醇沉淀。为确定合成外源mRNA的量，测定260nm处的吸光度。结果，通过20μL规模的反应，合成了大约60μg外源mRNA。

试验例3

使用参考例2中得到的mRNA的无细胞蛋白质合成

按照实施例1中同样的方式制备与试验例1具有同样组成的反应液，进行无细胞蛋白质合成反应并确定合成萤光素酶的量，除了使用上述参考例2中得到的mRNA作为模板，使用按实施例1制备并以280nm处的吸光度变为35这样的方式浓缩的提取液作为提取液。

结果，合成反应3小时后，萤光素酶合成的数量为218ng/mL，其大约为使用对照mRNA(由Promega生产)作为模板时的2.5倍，其为89ng/mL。

试验例4

无细胞蛋白质合成中各种加入组分数量的影响

按照与实施例1类似的方法制备提取液，将其浓缩至280nm处的吸光度变为35，利用这样得到的样品来测定无细胞蛋白质合成反应中各种加入组分数量的影响。结果，得到的反应液的最佳组成如下。

[反应液组成]

·50(v/v)％  酵母提取液

·25mM  HEPES-KOH(pH7.0)

·50mM  醋酸钾

·2mM  醋酸镁

·1mM  DTT

·10(v/v)％  甘油

·0.5mM  ATP

·0.1mM  GTP

·2 mM  磷酸肌酸

·200μg/mL  肌酸激酶

·40μM  氨基酸(20种)

·1U/μL  核糖核酸酶抑制剂(源于人类胎盘)

·200μg/mL  tRNA(源于酵母)

·80μg/mL  mRNA

使用具有这种最佳组成的反应液并按照与试验例1同样的方式，按照与实施例1同样的方式进行萤光素酶合成反应和定量。结果，从合成反应开始3小时内，合成了580ng/mL萤光素酶。

试验例5

利用透析法的无细胞蛋白质合成

按照与实施例1类似的方法制备提取液，使其280nm处的吸光度变为35，使用通过浓缩提取液得到的样品，制备具有上述试验例4组成的反应液。利用透析法使混合物进行无细胞蛋白质合成。对于透析膜，使用Slide-A-Lyzer(排除分子量：10000或更低，由PIERCE制造)，并使用具有下列组成的透析用外部溶液(1.1mL)。

[透析用外部溶液组成]

·25mM  HEPES-KOH(pH7.0)

·50mM  醋酸钾

·2mM  醋酸镁

·1mM  DTT

·10(v/v)％  甘油

·0.5mM  ATP

·0.1mM  GTP

·25mM  磷酸肌酸

·40μM  氨基酸(20种)

按照试验例1中同样的方式进行无细胞蛋白质合成反应并确定合成萤光素酶的量。

图3为透析法无细胞蛋白质合成反应和间歇法无细胞蛋白质合成反应(试验例4的结果)之间的萤光素酶合成数量相对于反应时间的对比示意图。在图3中，纵轴表示合成萤光素酶的数量(μg/mL)，横轴表示反应时间(分钟)。如图3所示，利用透析法合成了1.0μg/mL的萤光素酶，其大约是不采用透析时合成数量的1.7倍。

工业适用性

从上述说明可清楚看出，根据本发明，可提供无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液的制备方法、酵母提取液、使用酵母提取液的蛋白质无细胞合成方法，和包含酵母提取液的无细胞蛋白质合成试剂盒，其中提取液易于制备并比利用常规酵母提取液能合成更多数量的蛋白质。

本申请基于在日本提交的专利申请号001317/2003，这里引入其全部内容作为参考。

序列表自由格式文本

SEQ ID；No 1

引物Luc T7-F3-Kpn

SEQ ID；No 2

引物Luc T7-R4-Kpn

SEQ ID；No 3

引物T7启动子

                                       序列表

<110>联合株式会社(RENGO CO，LTD.)

<120>无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液、其制备方法和使用这种提取液的无细胞蛋白质合成方法

<130>1161

<140>

<141>

<150>JP2003-1317

<151>2003-1-7

<160>3

<210>1

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Luc T7-F3-Kpn

<400>1

ggggtaccat ggaagacgcc aaaaacataa 30

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Luc T7-R4-Kpn

<400>2

ggggtacctt acaatttgga ctttccgcc 29

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>T7启动子

<400>3

taatacgact cactataggc 20

Claims (9)

1.一种制备无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液的方法，包括在冷冻状态下破碎酵母细胞并获取其提取液。

2.权利要求1的方法，其中用液氮冷冻酵母细胞。

3.权利要求1或2的方法，其中用研棒在研钵内捣碎酵母细胞。

4.权利要求1-3任一的方法，还包括在从酵母细胞提取后，从提取液中除去分子量不超过5000的胞内组分，并将所得溶液浓缩。

5.一种无细胞蛋白质合成所用的酵母提取液，它利用权利要求1-4任一的方法制备。

6.一种蛋白质无细胞合成方法，包括使用含有权利要求5的酵母提取液的反应液。

7.权利要求6的方法，其中将反应液调节到pH 6.0-8.0。

8.权利要求6的方法，包括在合成蛋白质的同时对反应液进行透析。

9.一种无细胞蛋白质合成试剂盒，其包含权利要求5的酵母提取液。