CN109321547B

CN109321547B - 一种RNasin的制备方法

Info

Publication number: CN109321547B
Application number: CN201811169661.1A
Authority: CN
Inventors: 钟淑瑶; 章瑞程; 蔡统聪
Original assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Fapon Biotech Co Ltd
Priority date: 2018-10-08
Filing date: 2018-10-08
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2038-10-08
Also published as: CN109321547A

Abstract

本发明涉及蛋白表达纯化领域，具体而言，涉及一种RNasin的制备方法。所述方法包括：1)将转染有包含RNasin表达基因的大肠杆菌于LB培养基中进行20℃～26℃诱导表达，诱导表达的体系中包含还原性保护剂；2)将大肠杆菌裂解产物与复性缓冲液接触；所述复性缓冲液中，起复性作用的主要物质的浓度≤5M。本发明采用原核表达系统不仅表达周期短、表达量巨大，且表达过程中增加还原性保护剂后会提高正确折叠蛋白的表达，表达工艺稳定，克服了目前RNasin的表达难点。为了提高得率，在纯化过程中使用变复性来增加可溶性RNasin的量，本发明的变复性条件工艺简单、重复性好。大大降低了生产成本。

Description

一种RNasin的制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白表达纯化领域，具体而言，涉及一种RNasin的制备方法。

背景技术

RNA酶污染是所有从事RNA相关实验的人员的头号公敌，即使是100度高温或者是高压灭菌也不能完全灭活无孔不入的RNases。因而相关的实验中往往要用到RNA酶抑制剂。RNasin具有广谱的RNA酶抑制作用，能与RNA酶通过非共价键以1：1的比例发挥作用。而且RNasin与RNA酶的结合是非常迅速的，能够确保在短时间内有效地抑制RNA酶。

RNasin的分子量大约为50KD，等电点为4.7左右，单个蛋白含有21.5％左右的亮氨酸(正常蛋白质只含有9％左右)。并且单个蛋白的半胱氨酸含量为6.5％左右(约含有32个游离的Cys)，所以RNasin非常容易被氧化，但是RNasin必须要在还原的条件下才有活性。其蛋白结构由16个连续的LRR结构维持了“马蹄形”的构象，马蹄型结构有利于与Rnase A结合从而抑制Rnase A的活性。

但是，原核表达系统表达RNasin基本上都是包涵体的形式存在，如果使用包涵体变复性的条件也很难得到有活性的RNasin，所以为了得到更多的有活性的酶，大多数人选择探索可溶性表达的可能。目前已有重组的Porcine RNasin在弱启动子trp promoter中表达出可溶性的蛋白，但产量太低，不适用工业化生产。还有人使用真核表达系统(如酵母和细胞)表达，但是表达周期太长且成本太高。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明目的在于提供一种RNasin的制备方法，该制备方法为原核表达，同时为了进一步提高纯度，还可对制备得到的Rnasin进行纯化。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明涉及一种RNasin的制备方法，包括：

1)将转染有包含RNasin表达基因的大肠杆菌于LB培养基中进行20℃～26℃诱导表达，诱导表达的体系中包含还原性保护剂；

2)将大肠杆菌裂解产物与复性缓冲液接触；所述复性缓冲液中，起复性作用的主要物质的浓度≤5M。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用原核表达系统不仅表达周期短、表达量巨大，且表达过程中增加还原性保护剂后会提高正确折叠蛋白的表达，表达工艺稳定，克服了目前RNasin的表达难点。为了提高得率，在纯化过程中使用变复性来增加可溶性RNasin的量，本发明的变复性条件工艺简单、重复性好。大大降低了生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中经纯化后的Rnasin蛋白的胶图；

图2为本发明一个实施例中RNasin的比活胶图；

图3为本发明一个实施例中RNasin的稳定性检测结果。

具体实施方式

本发明涉及一种RNasin的制备方法，包括：

常规使用LB培养基37℃作为表达条件，但表达出来的基本上都是包涵体的形式。本发明使用LB培养基在低温条件下进行表达，并在培养基中添加还原性保护剂来促使RNasin正确折叠，所表达出来的包涵体不那么致密可以被低浓度的复性试剂复溶。

在一些实施方式中，步骤1)中的诱导表达的温度为22℃～24℃，或23℃。

在一些实施方式中，起复性作用的主要物质的浓度≤4M。

其中，在本申请中，起复性作用的主要物质不包括EDTA。

在一些实施方式中，所述裂解液与所述复性缓冲液包含所述还原性保护剂。

在一些实施方式中，所述裂解液的成分包括：

40～60mM PB，6～10％甘油，1.8～2.2mM EDTA，6～10mM DTT，170～230mM NaCL，pH7.0～7.4。

在一些实施方式中，所述裂解液的成分包括：

50mM PB，8％甘油，2mM EDTA，8mM DTT，200mM NaCL，pH7.2。

在一些实施方式中，在将裂解产物与复性缓冲液接触之前，使用洗涤缓冲液洗涤所述裂解产物，所述洗涤缓冲液中包含所述还原性保护剂。

在一些实施方式中，所述洗涤缓冲液的成分包括：

40～60mM PB，6～10％甘油，1.8～2.2mM EDTA，6～10mM DTT，170～230mM NaCL，0.3～0.7％TritonX-100，pH6.8～7.2。

在一些实施方式中，所述洗涤缓冲液的成分包括：

50mM PB，8％甘油，2mM EDTA，8mM DTT，200mM NaCL，0.5％TritonX-100，pH7.0。

在一些实施方式中，所述还原性保护剂为巯基保护剂。

在一些实施方式中，所述还原性保护剂为二硫苏糖醇。

在一些实施方式中，所述二硫苏糖醇的浓度为6mM～12mM，还可以选择7mM，8mM，9mM，10mM，11mM。

在一些实施方式中，所述起复性作用的主要物质的浓度为3.5M～4.5M，还可以选择4M。

在一些实施方式中，所述起复性作用的主要物质为尿素。

在一些实施方式中，所述起复性作用的主要物质还可以选择盐酸胍(例如0.5M-2M)。

在一些实施方式中，所述复性缓冲液的成分包括：

40～60mM PB，6～10％甘油，0.8～1.2mM EDTA，6～10mM DTT，170～230mM NaCL，3～5M尿素，pH＝6.8～7.2。

在一些实施方式中，所述复性缓冲液的成分包括：

50mM PB，8％甘油，1mM EDTA，8mM DTT，200mM NaCL，4M尿素，pH＝7.0。

在一些实施方式中，所述LB培养基额外添加有50g/L～150g/L的葡萄糖；还可以选择60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L的葡萄糖。

在一些实施方式中，所述裂解液中包含0.7mg/ml～1.3mg/ml的溶菌酶，还可以选择0.8mg/ml，0.9mg/ml，1.0mg/ml，1.1mg/ml.，1.2mg/ml的溶菌酶。

在一些实施方式中，所述大肠杆菌为BL21(DE3)菌株。

在一些实施方式中，所述方法还包括：

将所述方法制备得到的含有Rnasin的复合物顺次经a)亲和层析柱上复性和b)阴离子交换层析处理。

目前纯化RNasin的方法主要是RNase A亲和层析，而这种亲和层析的劣势非常明显，工艺重复性差，且难以被洗脱下来。所以目前最新的研究进展是在RNasin的N端或者是C端加入融合蛋白，不仅能够提高目的蛋白的可溶性，还能使用亲和层析柱进行纯化，优势非常明显。本发明第一步使用亲和层析，后续使用离子交换层析和复合型填料等，所制备的RNasin纯度高、活性高和稳定性好。纯化生产工艺稳定、生产成本低。

常规表达出来的RNasin是比较致密的包涵体且需要较高浓度的尿素进行变复性，本发明所表达出来的包涵体能被低浓度的尿素所溶解保证了RNasin的活性。且使用柱上复性取代了常规的透析复性，大大缩短了纯化周期和减少了buffer的使用，而且柱上复性的工艺重复性高，未被复性成功的一般会形成聚体/沉淀在柱子上难以被洗脱下来。

在一些实施方式中，在步骤a)中，所述RNasin表达基因带有his tag，所用亲和层析柱为不会被6mM～10mM(或8mM)二硫苏糖所还原的镍柱；

所述亲和层析的各个步骤所用缓冲液中均包含6mM～10mM(或8mM)二硫苏糖醇。

在一些实施方式中，所述亲和层析柱选自GE Healthy公司的NI excel。

常规使用RNase A亲和层析纯化，成本高且工艺重复性差。本发明中使用的是纯化带有标签的RNasin，如带His标签可使用NI柱，但是由于RNasin必须在高浓度DTT下才有活性，所以推荐使用NI Excel。

在一些实施方式中，步骤b)分两步进行，第一步使用常规的离子交换层析填料例如Q柱、DEAE等，第二步使用高分辨率的离子交换层析，例如SOUCE 30Q和Nuvia Q等填料。

在一些实施方式中，所述阴离子交换层析所用缓冲液中均包含6mM～10mM二硫苏糖醇，且pH＝7.3～7.8。

在一些实施方式中，所述阴离子交换层析所用缓冲液中均包含8mM二硫苏糖醇，且pH＝7.5。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1表达条件的优化

(1)培养基的筛选和表达温度的优化。

重组RNasin在大肠杆菌中表达，使用BL21(DE3)菌株。取100ul甘油菌接菌至150mlLB培养基中，37℃200rpm活化6h后OD600值达到0.3，进行转接，取10ml上述种子菌液分别转接至500ml的LB培养基(在原LB培养基的基础上补加100g/L的葡萄糖)、TB培养基和自诱导培养基中进行培养，当37℃200rpm培养至OD值达到0.6，开始进行诱导，诱导温度分别设置23℃、28℃和37℃，诱导时间分别为4h、8h和12h。

结果表明，在TB培养基的所有表达条件下表达量大且均形成包涵体。而在自诱导培养基中菌株生长缓慢，表达量较LB的要低，随着表达温度的降低表达量随着降低；随着表达时间的延长，表达量增多，但均是包涵体的形式。LB培养基(在原LB培养基的基础上补加100g/L的葡萄糖)的表达在23℃低温条件下表达随着表达时间的延长，表达量增多，但可溶性表达并没有增加。

(2)在诱导过程中尝试补加6mM、8Mm、10mM、12Mm的DTT。

在LB培养基(在原LB培养基的基础上补加100g/L的葡萄糖)的诱导过程中加入6～12mM DTT后，相对于不加DTT的，将其包涵体洗涤两次后可以使用较低浓度的尿素进行复溶，证明在表达过程中加入了DTT进行诱导是有利于包涵体复溶，因为加入DTT后有利于RNasin的正确折叠，所形成的包涵体没有那么致密可以很容易地被低浓度的尿素复溶。

实施例2纯化条件的优化

(1)裂解条件

由于大肠杆菌胞内的环境为还原条件，当细胞被破碎以后，RNasin被释放出来，在外界环境中及其容易被氧化，所以裂解条件显得尤为重要，最关键的一点是需要高浓度的DTT来维持，否则会形成无活性的RNasin。由于所表达出来的大部分是包涵体，裂解buffer为：50mM PB，8％甘油，2mM EDTA，8mM DTT，200mM NaCl，pH7.2。使用1mg/ml溶菌酶处理，室温静置30min后离心。将破碎沉淀用洗涤buffer洗涤两次，洗涤buffer为：50mM PB，8％甘油，2mM EDTA，8mM DTT，200mM NaCl，0.5％TritonX-100，pH7.0。洗涤后的包涵体直接使用含有尿素的复溶buffer进行复溶，复溶buffer为：50mM PB,8％甘油，1mM EDTA，8mM DTT，200mM NaCl，4M尿素，pH7.0。

(2)第一步Capture使用亲和层析进行纯化并柱上复性

表达出来的RNasin带有His标签，可使用亲和层析，第一步Capture的目的是能够快速分离、稳定和浓缩目的蛋白。如果第一步使用亲和层析，可获得大量纯度高的RNasin，可减少后续纯化的压力，需要注意的是，如果RNasin带有His标签，裂解液中含有8Mm的高浓度DTT会将镍柱上的NI离子还原，所以这里的镍柱建议使用GE Healthy的NI excel进行纯化。NI柱的平衡Buffer为25mM PB、500mM NaCl、5mM咪唑、1mM EDTA、8mM DTT,4M尿素，pH8.0。wash buffer为25mM PB、500mM NaCl、5mM咪唑、1mM EDTA、8mM DTT,2M尿素，pH8.0。注意wash buffer需要wash很长一段时间，至少需要50CV，且流速应相应地降低，因为包涵体的复性需要较长的时间来促使蛋白质的正确折叠。洗杂buffer为25mM PB、500mM NaCl、50mM咪唑、1mM EDTA、8mM DTT,pH8.0。一步洗脱buffer为25mM PB、500mM NaCl、500mM咪唑、1mM EDTA、8mM DTT,pH8.0。

(3)第二步中度纯化使用离子交换层析

通过第一步的亲和层析捕获以后，中纯可使用阴离子交换层析，因离子交换层析包括Q柱、DEAE等，筛选一系列的填料组合达到除杂的效果。由于RNasin的等电点较低，在过阴离子交换时结合是在pH7.5的条件下，bufferA为：10mM Tris-HCl,50mM NaCl，2mM EDTA，8mM DTT,pH7.5。bufferB是在bufferA的基础上补加1M NaCl。洗脱梯度为0％～100％B20CV(柱体积)提高分离效果。

(4)第三步精细纯化使用高分辨率的离子交换层析

经过以上两个步骤纯化以后，纯度已达到75％左右，但还有一些与RNasin性质较为相似的杂质存在难以除去，这时需要使用高分辨率的离子交换层析，比如SOUCE 30Q和Nuvia Q等填料，bufferA为：10mM Tris-HCl,50mM NaCl，2mM EDTA，8mM DTT，pH7.5。bufferB是在bufferA的基础上补加1M NaCl。洗脱梯度为0％～100％B 20CV，注意分管收集。

经过以上三个步骤的纯化，目的蛋白的纯度已达到95％以上，纯度胶结果如图1中显示。

实施例3活性检测

RNasin使用荧光定量PCR的方法对其进行活性测定，逆转录体系中添加酶量梯度的RNasin，扩增曲线呈梯度RnaseA被抑制现象，显示FAPONRNasin能够完全抑制RNase A的活性，所以认为RNasin有活性。且用本发明所制备的RNasin的比活有显著提升，比活胶图如图2中显示。

实施例4稳定性检测

不同的表达和纯化条件，会影响酶的稳定性。将实施案例二中制备出来的RNasin透析到贮存buffer中，贮存buffer为20mM Hepes-KOH,50mM KCl,8mM DTT,50％glycerolpH 7.5。放到37℃恒温箱中做加速试验，对比0天和7天的稳定性差异，跑SDS-PAGE胶显示37℃7天并无明显的降解和聚体，检测活性也无明显下降。认为稳定性合格(图3)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种RNasin的制备方法，其特征在于，包括：

2)将大肠杆菌裂解产物与复性缓冲液接触；所述复性缓冲液中，起复性作用的主要物质的浓度≤5M；

所述还原性保护剂为疏基保护剂；起复性作用的主要物质为尿素或盐酸胍。

2.根据权利要求1所述的RNasin的制备方法，其特征在于，裂解液与所述复性缓冲液包含所述还原性保护剂。

3.根据权利要求1所述的RNasin的制备方法，其特征在于，在将裂解产物与复性缓冲液接触之前，使用洗涤缓冲液洗涤所述裂解产物，所述洗涤缓冲液中包含所述还原性保护剂。

4.根据权利要求1～3任一项所述的RNasin的制备方法，其特征在于，所述还原性保护剂为二硫苏糖醇。

5.根据权利要求4所述的RNasin的制备方法，其特征在于，所述二硫苏糖醇的浓度为6mM～12mM。

6.根据权利要求1所述的RNasin的制备方法，其特征在于，所述起复性作用的主要物质的浓度为3.5M～4.5M。

7.根据权利要求1或6所述的RNasin的制备方法，其特征在于，所述起复性作用的主要物质为尿素。

8.根据权利要求1所述的RNasin的制备方法，其特征在于，所述LB培养基额外添加有50g/L～150g/L的葡萄糖。

9.根据权利要求1所述的RNasin的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BL21(DE3)菌株。

10.根据权利要求1、2、3、5、6、8、9任一项所述的RNasin的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：

将所述方法制备得到的含有RNasin的复合物顺次经a)亲和层析柱上复性和b)阴离子交换层析处理；

任选的，在步骤a)中，所述RNasin表达基因带有his tag，所用亲和层析柱为不会被6mM～10mM二硫苏糖所还原的镍柱；

所述亲和层析的各个步骤所用缓冲液中均包含6mM～10mM二硫苏糖醇；

任选的，所述亲和层析柱选自GE Healthy公司的NI excel；

任选的，所述阴离子交换层析所用缓冲液中均包含6mM～10mM二硫苏糖醇，且pH＝7.3～7.8。