CN108264547A - 一种纯化蛋白的方法以及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化学和发酵工程领域，涉及一种纯化蛋白的方法以及试剂盒。具体地，所述纯化蛋白的方法，包括将蛋白包涵体的复性产物进行层析的步骤。本发明的方法纯化蛋白的复性率高，收率高，具有良好的应用前景。

Description

一种纯化蛋白的方法以及试剂盒
技术领域
本发明属于生物化学和发酵工程领域，涉及一种纯化蛋白的方法以及试剂盒。具体地，所述蛋白为血小板生成素模拟肽或其融合蛋白。
背景技术
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种常见的出血性疾病，其患者有很大的出血风险。2008年8月，美国FDA批准罗米司亭(含有血小板生成素模拟肽)上市，用于治疗特发性血小板减少性紫癜。罗米司亭产生自大肠埃希杆菌，系利用重组DNA技术制成的能刺激血小板生成的Fc肽融合蛋白，包含2个相同的单链亚单元，每个单链包含IgG Fc区和血小板生成素(thrombopoietin，TPO)模拟肽，分子量约为59kDa，其中Fc段可有效延长药物半衰期，而血小板生成素模拟肽可与巨核祖细胞上的血小板生成素受体结合，使其活化，经由细胞内信号传导促进血小板生成。由于该药物同TPO无同源性，不产生抗体，耐受性好，且药效显著，被广泛用于ITP患者。罗米司亭的结构式如下面的式A所示，其中TMP表示血小板生成素模拟肽IEGPTLRQWLAARA(SEQ ID NO:1)。
该血小板生成素模拟肽多为原核发酵以包涵体的形式表达，需要经过变复性等复杂工艺制备，工艺大致为菌体破碎、包涵体洗涤、变性、复性、层析纯化。现有生产工艺由于复性率低，且相关杂质去除率低，导致生产成本高、产品纯度低，不适宜工业化生产。例如中国专利公开CN102321168报道了一种制备血小板生成素模拟肽的方法，包含以下步骤：将含有血小板生成素模拟肽基因的大肠杆菌工程菌高密度发酵后，将菌体超声破碎，尿素裂解，复性，调pH，经过亲和层析、阳离子层析、分子筛层析三步层析得到血小板生成素模拟肽。其复性率为30％－40％，纯化收率为每升发酵液可得血小板生成素模拟肽300mg。
然而，该方法存在复性率低(30％－40％)，收率低(每升仅得到成品300mg)的缺点。另外，该工艺采用分子筛层析来去除小分子，但分子筛层析对装柱高度和柱效以及上样量要求严格，多在实验室阶段使用，并不适于工业生产。另外当蛋白电荷变异超过一个pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学，因此仍需提高纯度，改善其组织分布及药代动力学。
因此，尚需要开发新的针对血小板生成素模拟肽的蛋白纯化工艺。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种纯化血小板生成素模拟肽或其融合蛋白的方法。本发明人惊奇地发现，在血小板生成素模拟肽或其融合蛋白包涵体的复性产物的层析处理中，当采用羟基磷灰石层析(特别是不采用分子筛层析)时，得到的蛋白的收获量显著提高，蛋白的活性和纯度亦非常高。进一步地，本发明还优化了蛋白包涵体复性之前的预处理工艺，显著地提高了复性率。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种纯化蛋白的方法，包括将蛋白包涵体的复性产物进行层析的步骤，其中，
所述蛋白为血小板生成素模拟肽或其融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有一个或多个血小板生成素模拟肽；优选地，所述融合蛋白包含2、3、4、5或6个血小板生成素模拟肽；
所述层析包括羟基磷灰石层析；
其中，所述血小板生成素模拟肽长度为9－16个氨基酸(例如9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸)，并且包含下面的式I所示的肽段：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9
式I
其中，
X1选自谷氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸和缬氨酸；
X2选自甘氨酸和丙氨酸；
X3选自脯氨酸；
X4选自苏氨酸和丝氨酸；
X5选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸；
X6选自精氨酸和赖氨酸；
X7选自谷氨酰胺、天门冬酰胺和谷氨酸；
X8选自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；
X9选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和赖氨酸；
当融合蛋白含有一个或多个血小板生成素模拟肽时，血小板生成素模拟肽之间、血小板生成素模拟肽与融合蛋白之间和/或融合蛋白之间通过Linker连接；优选地，所述Linker为2－10个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)甘氨酸(G)或者一个或多个(例如2、3、4、5、6个或6个以上)二硫键(－S－)，优选为5、6、7、8、9或10个甘氨酸(G)。
不拘于理论的限制，本发明人发现，针对本发明所述的血小板生成素模拟肽或其融合蛋白，羟基磷灰石层析能够有效地去除目标蛋白的降解片段，以及来自宿主细胞的小分子量蛋白。另外，羟基磷灰石层析能够更有效地富集目标蛋白，提高了目标蛋白的收获量。
所述蛋白能够与羟基磷灰石层析柱结合，并被洗脱下来。
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其中，
所述血小板生成素模拟肽的氨基酸序列如SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示。
IEGPTLRQWLAARA(SEQ ID NO:1)
IEGPTLRQCLAARA(SEQ ID NO:2)
IEGPTLRQALAARA(SEQ ID NO:3)
IEGPTLRDWLAARA(SEQ ID NO:4)
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述融合蛋白为血小板生成素模拟肽与人IgG Fc的融合蛋白；
优选地，所述血小板生成素模拟肽与人IgG Fc通过Linker连接；优选地，所述Linker为2－10个(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个)甘氨酸；
优选地，所述人IgG Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
Fc的氨基酸序列：
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:5)
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述蛋白如下面的式II所示：
其中，
TMP表示血小板生成素模拟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示。
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述羟基磷灰石为陶瓷羟基磷灰石；优选地，为I型陶瓷羟基磷灰石。
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述羟基磷灰石层析包括下述步骤：
a)用平衡缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱；优选地，所述平衡缓冲液为磷酸缓冲液；
b)将含有目的蛋白的样品上样；
c)用洗脱缓冲液进行梯度洗脱；优选地，所述洗脱缓冲液为含有NaCl的磷酸缓冲液。
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其特征在于如下的(1)－(4)项中的任意一项或者多项：
(1)步骤a)中，所述磷酸缓冲液为pH为6.0－7.0的10－20mM磷酸缓冲液；
(2)步骤b)中，上样量为5－20mg蛋白/ml填料；
(3)步骤c)中，所述含有NaCl磷酸缓冲液为含有pH为6.0－7.0的含0.5－1.5MNaCl的10－20mM磷酸缓冲液；
(4)步骤c)中，洗脱体积为10－25倍柱体积，收集第二个洗脱峰。
在本发明的一个实施方式中，所述的纯化方法，其特征在于如下的(1)－(4)项中的任意一项或者多项：
(1)步骤a)中，所述磷酸缓冲液为pH为6.0的15mM磷酸缓冲液；
(2)步骤b)中，上样量10mg蛋白/ml填料；
(3)步骤c)中，所述含有NaCl磷酸缓冲液为含有pH为6.0的含1M NaCl的15mM磷酸缓冲液；
(4)步骤c)中，洗脱体积为15倍柱体积，收集第二个洗脱峰。
在本发明的一个实施方式中，所述的纯化方法，其特征在于如下的(1)－(4)项中的任意一项或者多项：
(1)步骤a)中，所述磷酸缓冲液为pH为7.0的20mM磷酸缓冲液；
(2)步骤b)中，上样量20mg蛋白/ml填料；
(3)步骤c)中，所述含有NaCl磷酸缓冲液为含有pH为6.0的含1.5M NaCl的20mM磷酸缓冲液；
(4)步骤c)中，洗脱体积为25倍柱体积，收集第二个洗脱峰。
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述层析还包括亲和层析和/或阴离子层析；
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其中，将蛋白的复性产物依次进行亲和层析、阴离子层析和羟基磷灰石层析；
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法还包括将羟基磷灰石层析得到的产物进行浓缩或除菌的步骤；
在本发明的一些实施方式中，所述亲和层析使用选自如下的亲和层析柱：
Mabselect、Mabselect sure、ProSep Ultra Plus、Eshmuno A或AF-rProtein AHC-650F；
在本发明的一些实施方式中，所述阴离子层析使用选自如下的阴离子层析柱：
Q Sepharose HP、Fractogel EMD TMAE、POROS 50HQ、POROS 50PI或SuperQ-650M；
在本发明的一些实施方式中，所述羟基磷灰石层析使用陶瓷羟基磷灰石层析柱；优选地，所述陶瓷羟基磷灰石为I型陶瓷羟基磷灰石或II型陶瓷羟基磷灰石；
在本发明的一些实施方式中，所述层析不包括分子筛层析和/或阳离子层析。
在本发明的优选地实施方式中，所述的亲和层析使用Mabselect亲和层析，所述阴离子层析使用Q Sepharose HP阴离子层析，所述羟基磷灰石层析使用陶瓷羟基磷灰石层析(CHT，I型)。
在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中，所述羟基磷灰石层析包括：在阴离子层析洗脱液中加入30mM磷酸缓冲液，并调节pH至6.0－7.0，用pH为6.0－7.0的15mM磷酸缓冲液平衡柱子，随后上样，上样量为5－20mg蛋白/ml填料，用平衡液作为A液，pH为6.0－7.0的含1M NaCl的15mM磷酸缓冲液作为B液进行梯度洗脱，洗脱体积为15倍柱体积，收集第二个洗脱峰。
优选地，所述的纯化方法，其中，所述Mabselect亲和层析包括：复性液用1－3M醋酸调节pH为6.0－7.5，随后用深层过滤膜包过滤；先用pH值为6.0－7.5含有0.1－0.5MNaCl的10－30mM磷酸缓冲液平衡层析柱，上样，上样量10－30mg蛋白/ml填料，然后用pH为4.0－6.0含有40－60mM醋酸钠溶液平衡，再用pH为3.0－4.0含有40－60mM醋酸溶液洗脱，收集洗脱峰。
在本发明的一个实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述Mabselect亲和层析包括：复性液用2M醋酸调节pH为6.0，随后用深层过滤膜包过滤；先用pH值为6.0含有0.2MNaCl的20mM磷酸缓冲液平衡层析柱，上样，上样量20mg蛋白/ml填料，然后用pH为5.0含有40mM醋酸钠溶液平衡，再用pH为3.5含有40mM醋酸溶液洗脱，收集洗脱峰。
在本发明的一个实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述Mabselect亲和层析包括：复性液用2M醋酸调节pH为7.5，随后用深层过滤膜包过滤；先用pH值为7.0含有0.5MNaCl的30mM磷酸缓冲液平衡层析柱，上样，上样量30mg蛋白/ml填料，然后用pH为6.0含有60mM醋酸钠溶液平衡，再用pH为3.0含有60mM醋酸溶液洗脱，收集洗脱峰。
在本发明的一个实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述Q Sepharose HP阴离子层析包括：将Mabselect亲和层析层析洗脱液用4－6M NaCl和注射用水调节电导至1－5mS/cm，用1－4M Tris调节pH至6.5－8.5，柱子用pH为6.5－8.5的10－30mM Tris缓冲液平衡后，上样流穿，上样量为10－30mg蛋白/ml填料，收集洗脱峰。
在本发明的一个实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述Q Sepharose HP阴离子层析包括：将Mabselect亲和层析层析洗脱液用4M NaCl和注射用水调节电导至4.7mS/cm，用2M Tris调节pH至8.0，柱子用pH为8.0的20mM Tris缓冲液平衡后，上样流穿，上样量为30mg蛋白/ml填料，收集流穿峰。
在本发明的一个实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述Q Sepharose HP阴离子层析包括：将Mabselect亲和层析层析洗脱液用6M NaCl和注射用水调节电导至3mS/cm，用1M Tris调节pH至6.5，柱子用pH为6.5的20mM Tris缓冲液平衡后，上样流穿，上样量为10mg蛋白/ml填料，收集流穿峰。
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，还包括在蛋白复性之前，将蛋白包涵体的变性产物进行透析或超滤的步骤；
优选地，所述透析或超滤的截留分子量范围是5－20kD，更优选为8－15kD；
优选地，所用透析液的pH为2.5－3.5；更优选地，所用透析液的pH为2.7－3.2。在本发明的一个实施方案中，所用透析液为1－100mM HCl溶液，优选为2－30mM HCl溶液；更优选为5或30mM HCl溶液。在本发明的另一个实施方案中，所用透析液为20－100mM的醋酸溶液，优选为50mM的醋酸溶液；
优选地，透析时间为10－40小时，更优选为15－30小时。
本发明人意外的发现，DTT(二硫苏糖醇)等还原剂对本发明目标蛋白的复性率影响较大，去除之后能够有效地提高目标蛋白的复性率。在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，还包括在蛋白复性之前，从蛋白包涵体的变性产物中去除还原剂的步骤；优选地，所述还原剂为DTT；优选地，采用透析或者超滤去除DTT。
在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中所述透析包括：将上清液按照与透析液(1：5)－(1：50)的体积比进行透析，所述透析液为1－100mM HCl溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中所述透析包括：将上清液按照与透析液(1：10)－(1：30)的体积比进行透析，所述透析液为1－100mM HCl溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中所述透析包括：将上清液按照与透析液(1：15)－(1：25)的体积比进行透析，所述透析液为1－100mM HCl溶液。
在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其中所述透析包括：将上清液按照与透析液1：20的体积比进行透析，所述透析液为5mM HCl溶液。
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其还包括在所述透析或超滤之后，将透析截留产物或超滤截留产物进行氧化生成二硫键的步骤；优选地，通过加入选自胱胺、氧化性谷胱甘肽和胱氨酸的任意一种或者几种进行氧化生成二硫键。
优选地，所述的纯化方法，其中，所述氧化衍生包括：然后在透析收获液(袋内截留液)中加入适量的尿素，使得尿素终浓度为7－10M，搅拌直至溶液澄清，然后加入终浓度为0.5－2g/L的胱胺及0.1－1g/L的EDTA搅拌溶解后，用2M Tirs调节pH至7.0－9.0，静置氧化衍生1－5h。
在本发明的一个实施方式中，所述氧化衍生包括：然后在透析收获液(袋内截留液)中加入适量的尿素，使得尿素终浓度为8M，搅拌直至溶液澄清，然后加入终浓度1g/L的胱胺及0.5g/L的EDTA搅拌溶解后，用2M Tirs调节pH至8.5，静置氧化衍生2h。
在本发明的一个实施方式中，所述氧化衍生包括：然后在透析收获液(袋内截留液)中加入适量的尿素，使得尿素终浓度为10M，搅拌直至溶液澄清，然后加入终浓度2.0g/L的胱胺及1g/L的EDTA搅拌溶解后，用2M Tirs调节pH至8.5，静置氧化衍生4h。
在本发明的一些实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述蛋白采用下述蛋白复性液进行复性；
所述蛋白复性液包括50－60mMTris，40－400mMArg，1－5mM氧化还原对，0.5－2mMEDTA，1－2M尿素的溶液，pH为7.0－9.0。
在本发明的一个实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述蛋白采用下述蛋白复性液进行复性；所述复性液为具有50mMTris，400mMArg，2mM胱胺，1.5mM半胱氨酸，1mM EDTA，1M尿素的溶液，pH为8.5。
在本发明的一个实施方式中，所述的纯化方法，其中，所述蛋白采用下述蛋白复性液进行复性；所述复性液具有60mMTris，300mMArg，5mM胱胺，3mM半胱氨酸，1.5mM EDTA，1.5M尿素的溶液，pH为9.0。
在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，还包括菌体破碎、包涵体收集与洗涤、蛋白(包涵体)变性和复性的步骤。
本发明的所述的纯化方法，可以包括如下步骤：：菌体破碎、包涵体收集与洗涤、蛋白(包涵体)变性和复性、亲和层析、阴离子层析、羟基磷灰石层析、超滤浓缩换液和过滤除菌。在本发明的一个实施方案中，所述的纯化方法，其工艺流程如图1所示。
本发明的所述的纯化方法，可以包括如下步骤：菌体破碎、包涵体收集与洗涤、蛋白变性、透析或超滤、氧化衍生、复性、亲和层析、阴离子层析、羟基磷灰石层析、超滤浓缩液、除菌过滤。
本发明的另一方面还涉及一种制备蛋白的方法，其包括本发明中任一项所述的纯化方法。在本发明的一些实施方案中，所述制备方法可以包括：接种、种子培养、发酵培养、收集菌体，本发明中任一项所述的纯化方法步骤。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包括独立包装的i－iii：
i.截留分子量为5－20kD的透析袋或超滤膜、1－100mM HCl溶液；
ii.氧化生成二硫键的试剂；
iii.羟基磷灰石或羟基磷灰石填充柱；
优选地，所述氧化生成二硫键的试剂选自胱胺、氧化性谷胱甘肽和胱氨酸中的任意一种或者多种。
在本发明的一些实施方式中，所述的试剂盒，其还包括独立包装的iv：
iv.蛋白复性液；
优选地，所述蛋白复性液包括40－60mMTris，40－400mMArg，1－5mM氧化还原对，0.5－2mM EDTA，1－2M尿素的溶液，pH为7.0－9.0；
优选地，所述蛋白复性液包括50mM Tris，40－400mM Arg，0.5－5mM胱胺，0.4－4mM半胱氨酸，0.5－2mM EDTA，1－2M尿素的溶液，pH为7.0－9.0。
优选地，所述蛋白复性液包括50mMTris，200－400mMArg，1－5mM氧化还原对，1mMEDTA，1－2M尿素的溶液，pH为7.0－9.0；
更优选地，所述复性液为具有50mMTris，400mMArg，2mM胱胺，1.5mM半胱氨酸，1mMEDTA，1M尿素的溶液，pH为8.5。或所述复性液具有60mMTris，300mMArg，5mM胱胺，3mM半胱氨酸，1.5mM EDTA，1.5M尿素的溶液，pH为9.0。
优选地，所述氧化还原对选自胱胺和半胱氨酸、还原型和氧化型的谷胱甘肽(GSH/GSSG)、半胱氨酸和胱氨酸(cysteine/cystine)、半胱胺和胱胺(cysteamine/cystamine)、二硫苏糖醇和氧化型谷胱甘肽(DTT/GSSG)，以及二流赤藓糖醇和氧化型谷胱甘肽(DTE/GSSG)；
优选地，所述氧化还原对为0.5－5mM胱胺和0.4－4mM半胱氨酸。
在本发明的一个实施方式中，所述氧化还原对为2mM胱胺和1.5mM半胱氨酸。
在本发明的一个实施方式中，所述氧化还原对为5mM胱胺和3mM半胱氨酸。
在本发明的一个实施方案中，所述的试剂盒，其用于纯化蛋白或者制备治疗和/或预防特发性血小板减少性紫癜的药物。
本发明的再一方面涉及的试剂盒在纯化蛋白或者制备治疗和/或预防特发性血小板减少性紫癜的药物中的用途；优选地，所述药物为蛋白，并且其为血小板生成素模拟肽或其融合蛋白；优选地，所述蛋白如前面所述。
本发明中，
术语“变性”是指蛋白质受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，理化性质发生改变并失去原有的生物学活性。
术语“复性”是指在适当条件下变性蛋白质恢复其天然构象和生物活性。
术语“柱效”是指色谱柱的分离效果。
术语“血小板生成素”是指，指人内源性血小板生成素(TPO)，是一种60－70kDa的糖基化蛋白，主要在肝脏和肾脏产生，包括332个氨基酸，该蛋白在不同物种间高度保守，其体外作用包括，特异性诱导纯化鼠骨髓造血干细胞和人CD34+细胞，巨核细胞集落形成，巨核细胞的产生呈倍性增加，并诱导巨核细胞的终末成熟和血小板产生。
术语“血小板生成素模拟肽”也可称作血小板生成素拟肽，是指，蛋白质配体与其受体的相互作用界面上只有几个关键基团真正参与了绝大部分的结合活动，使寻找小型活性配体成为可能，此处指一种具有模拟血小板生成素活性的肽。优选地，其包含SEQ IDNOs:1－4中任一序列所示的多肽；特别优选地，其包含SEQ ID NO:1所示的多肽。
发明的有益效果
本发明根据血小板生成素模拟肽及其融合蛋白的结构特点，对其纯化方法进行了大量实验摸索和工艺改进。本发明的方法具有复性率高(可达60％以上)，收率高(蛋白收获量可达900mg蛋白/每升发酵液)，且得到的产品纯度高、质量好的优点，并且还具有稳定的生物学活性。本发明的纯化工艺与现有的纯化工艺相比杂质去除率更高、生产成本更低，本发明的方法有利于血小板生成素或血小板生成素模拟肽纯化的工业生产放大。
附图说明
图1：血小板生成素模拟肽的纯化工艺流程图。
图2：对照1样品(复性前无透析、氧化衍生处理)复性后蛋白HIC纯度(复性率)。
图3：实施例2制备的样品(复性前透析、氧化衍生预处理)复性后蛋白HIC纯度(复性率)。
图4：羟基磷灰石去除小分子的样品和分子筛层析去除小分子的样品的SDS-PAGE图。从左至右，第1泳道为分子量Marker，第2泳道为空白，第3泳道为经过阴离子层析后的样品，第4泳道经过分子筛层析处理后的样品，第5泳道为经过羟基磷灰石层析处理后的样品。
图5：羟基磷灰石去除电荷异构体的样品和阳离子层析去除电荷异构体的样品的等电聚焦电泳(IEF)图。泳道1为参比品，泳道2为用SP Sepharose H.P阳离子层析洗脱样品，泳道3为marker，泳道4为CHT羟基磷灰石层析洗脱样品。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社；《中国药典》2010版)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下面的实施例中，如果没有特别说明，所用的参比品为罗米司亭，通过商业购买得到，生产厂商是安进公司。
实施例1：菌株的发酵扩增
所用菌株为能够表达血小板生成素模拟肽融合蛋白的重组的大肠杆菌GM221，购自ATCC(菌株保藏号98957，质粒保藏号98113))，该菌株表达本发明式A所示的蛋白。
采用常规发酵条件下培养，使所需肽表达。所用培养基为LB培养基，可以按照《分子克隆实验指南》配制。
也可以按照下面的步骤进行：
将保藏的菌株解冻，按50μl接种到含有50mlLB培养基250ml三角瓶摇瓶中进行活化，在30℃，转速150－300r/min，培养过夜，将此菌液转入含2L LB培养基的三角瓶中，37℃，250－400r/min，适时补充培养基，培养过夜，OD600nm值＞1.5时，扩增下级种子。
将过夜培养物按1％的接种量转接入含发酵培养基的50L发酵罐中于34℃－38℃进行恒溶氧分批补料培养，培养第3hr起开始指数流加补料培养基，阶段性控制补料量，控制通气量10－300L/min，溶氧30％，转速与溶氧关联，pH值6.0－7.5，当OD600达60左右时，加入终浓度为0.4mmol的IPTG，诱导3－6小时后终止发酵。
配制发酵培养基包括如下组分及含量(含量以g/L计)：
补料培养基的配方：
葡萄糖(glucose) 500g/L
柠檬酸三胺((NH4)3-citric) 0.8g/L
硫酸镁(MgSO4) 0.25g/L
收集的菌体用于下面的实施例。
实施例2：蛋白纯化
(1)菌体破碎：按照菌体与破菌液1:5(w：v)混合搅拌，所述破菌液为具有20mMTris，10mM EDTA的溶液，其pH为8.0；充分混匀后，在1000bar，10℃条件下用低温超高压连续流细胞破碎仪破菌2次。
(2)包涵体收集与洗涤：将步骤(1)中破菌液在10℃温度下9500rpm离心20min，收集包涵体沉淀，然后将沉淀按1:10(w：v)加入洗涤缓冲液I混合搅拌，所述的洗涤缓冲液I为具有20mM Tris，0.1％－0.2％Triton X-100，0.1M NaCl，1mM EDTA，1M尿素的溶液，其pH为8.5，离心收集沉淀；然后将收集的沉淀按1:10(w：v)加入洗涤缓冲液II混合搅拌，所述的洗涤缓冲液II为具有20mM Tris，1mM EDTA的溶液，其pH为8.5，10℃温度下9000rpm离心20min收集沉淀。
(3)变性：将步骤(2)中所得包涵体与增溶还原缓冲液1:10(W/V)比例密闭混合搅拌1h，所述增溶还原缓冲液为具有20mM Tris，1mM EDTA，5mM DTT，8M尿素的溶液，其pH为9.0；9000rpm离心10min收集上清；
(4)透析：将上清液按照与透析液1:20(v：v)进行透析，所述透析液为5mM HCl溶液；
(5)氧化衍生：然后在透析收获液(袋内截留液)中加入适量的尿素，使得尿素终浓度为8M，搅拌直至溶液澄清，然后加入终浓度1g/L的胱胺及0.5g/L的EDTA搅拌溶解后，用2MTirs调节pH至8.5，静置氧化衍生2h；
(6)复性：随后用8M尿素溶液稀释蛋白液至浓度15g/L，随后将蛋白液按照与复性液1:9(v：v)的比例滴加到复性液中，使得蛋白终浓度约为1.5g/L，所述复性液为具有50mMTris，400mMArg，2mM胱胺，1.5mM半胱氨酸，1mM EDTA，1M尿素的溶液，pH为8.5；在10－15℃下复性48h；
(7)Mabselect亲和层析：复性液用2M醋酸调节pH为6.0，随后用深层过滤膜包过滤；先用pH值为6.0含有0.2M NaCl的20mM磷酸缓冲液平衡层析柱，上样，上样量20mg蛋白/ml填料，然后用pH为5.0含有40mM醋酸钠溶液平衡，再用pH为3.5含有40mM醋酸溶液洗脱，收集洗脱峰；
(8)Q Sepharose HP阴离子层析：将Mabselect亲和层析层析洗脱液用4M NaCl和注射用水调节电导至4.7mS/cm，用2M Tris调节pH至8.0，柱子用pH为8.0的20mM Tris缓冲液平衡后，上样流穿，上样量为30mg蛋白/ml填料，收集流穿峰；
(9)陶瓷羟基磷灰石层析(CHT，I型)：在阴离子层析洗脱液中加入30mM磷酸缓冲液，并调节pH至6.0，用pH为6.0的15mM磷酸缓冲液平衡柱子，随后上样，上样量为10mg蛋白/ml填料，用平衡液作为A液，pH为6.0的含1M NaCl的15mM磷酸缓冲液作为B液进行梯度洗脱，洗脱体积为15倍柱体积，收集第二个洗脱峰。
(10)超滤换液：用10kD超滤膜包将羟基磷灰石洗脱液浓缩至2g/L后，用原液缓冲液换液10倍体积。
(11)除菌过滤：用0.22μm除菌滤器过滤得到原液。
上述步骤中，涉及样品中的蛋白质量的，可以采用紫外-可见分光光度法测定，具体步骤可参考下面的实施例4。
实施例3：蛋白纯化
实施例3的步骤(1)－(3)参考实施例2的步骤(1)－(3)，步骤(4)－(11)如下所示：
(4)透析：将上清液按照与透析液1:30(v：v)进行透析，所述透析液为30mM HCl溶液；
(5)氧化衍生：然后在透析收获液(袋内截留液)中加入适量的尿素，使得尿素终浓度为10M，搅拌直至溶液澄清，然后加入终浓度2.0g/L的胱胺及1g/L的EDTA搅拌溶解后，用2.5M Tirs调节pH至8.5，静置氧化衍生4h；
(6)复性：随后用10M尿素溶液稀释蛋白液至浓度15g/L，随后将蛋白液按照与复性液1:10(v：v)的比例滴加到复性液中，使得蛋白终浓度约为1.5g/L，所述复性液为具有60mMTris，300mMArg，5mM胱胺，3mM半胱氨酸，1.5mM EDTA，1.5M尿素的溶液，pH为9.0；在10－15℃下复性48h；
(7)Mabselect亲和层析：复性液用2M醋酸调节pH为7.5，随后用深层过滤膜包过滤；先用pH值为7.0含有0.5M NaCl的30mM磷酸缓冲液平衡层析柱，上样，上样量30mg蛋白/ml填料，然后用pH为6.0含有60mM醋酸钠溶液平衡，再用pH为3.0含有60mM醋酸溶液洗脱，收集洗脱峰；
(8)Q Sepharose HP阴离子层析：将Mabselect亲和层析层析洗脱液用6M NaCl和注射用水调节电导至3mS/cm，用1M Tris调节pH至6.5，柱子用pH为6.5的20mM Tris缓冲液平衡后，上样流穿，上样量为10mg蛋白/ml填料，收集流穿峰；
(9)陶瓷羟基磷灰石层析(CHT，I型)：在阴离子层析洗脱液中加入30mM磷酸缓冲液，并调节pH至6.0，用pH为7.0的20mM磷酸缓冲液平衡柱子，随后上样，上样量为20mg蛋白/ml填料，用平衡液作为A液，pH为7.0的含1.5M NaCl的20mM磷酸缓冲液作为B液进行梯度洗脱，洗脱体积为25倍柱体积，收集第二个洗脱峰。
(10)超滤换液：用10kD超滤膜包将羟基磷灰石洗脱液浓缩至3g/L后，用原液缓冲液换液15倍体积。
(11)除菌过滤：用0.22μm除菌滤器过滤得到原液。
上述步骤中，涉及样品中的蛋白质量的，可以采用紫外-可见分光光度法测定，具体步骤可参考下面的实施例4。
对照例1：对照样品1的制备(复性前无透析、氧化衍生处理)
与实施例2的方法相同，除了不采用步骤(4)和(5)，即在完成步骤(3)之后直接进入步骤(6)：用8M尿素溶液稀释步骤(3)收集的上清液至蛋白浓度5－15g/L。
制得对照1样品。
对照例2：对照样品2的制备(将羟基磷灰石层析替换为分子筛层析)
与实施例2的方法相同，除了将步骤(9)替换为如下的步骤(9－1)：
(9－1)分子筛层析：用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，平衡SephacrylS-200分子筛柱子3－5个柱体积，用醋酸调节样品pH至5.0后上样，上样量为柱床体积的1％－5％，用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，收集目的蛋白峰。
制得对照2样品。
对照例3：对照样品3的制备(将羟基磷灰石层析替换为阳离子层析)
与实施例2的方法相同，除了将步骤(9)替换为如下的步骤(9－2)：
(9－2)阳离子层析：用pH值为5.0含100mM氯化钠的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液平衡SP Sepharose H.P阳离子柱，将阴离子层析洗脱样品用醋酸调节pH至5.0后上样，然后用pH值为5.0含100mM氯化钠的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液再平衡柱子，去除杂质，最后用pH值为5.0含300mM氯化钠的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。
制得对照3样品。
实施例4：收率和产量的测定和比较
1.实验方法
本发明人对实施例2中制备样品的蛋白收率进行了测定。
蛋白量的测定方法按照《中国药典》2010版三部附录ⅡA。
紫外-可见分光光度法测定。在279nm波长下对样品和参比品测定吸光度，按下公式计算浓度，CX＝(AX/AR)CR，CX为样品浓度，AX为样品吸光度，CR为参比品浓度。AR为参比品吸光度，纯化收率计算为层析后CX*体积/层析前CX*体积。
2.实验结果
结果表明，本发明实施例2制备的样品的蛋白收率为42％，纯化得到高纯度血小板生成素模拟肽融合蛋白的收率相对于现有技术CN102321168A纯化血小板生成素模拟肽的20％－30％有显著的提高，并且本发明每升发酵液可以获得900mg以上的高纯度血小板生成素模拟肽融合蛋白，亦显著高于CN102321168A的300mg/每升发酵液。
实施例5：复性率的测定和比较
1.实验样品
对照例1制备中步骤(6)复性得到的样品。
实施例2制备中步骤(6)复性得到的样品。
2.实验方法
比较复性后蛋白HIC纯度。
复性率用HIC(hydrophobic interaction chromatography，疏水性相互作用色谱法)测得的纯度表示(HIC纯度)。
测定方法如下：
采用Tosoh TSKgel Butyl-NPR色谱柱，流动相A为1.2M硫酸铵，流动相B：60％30mMNa2HPO4(pH为7.0)+40％异丙醇，按下面的表1进行梯度洗脱。
表1：洗脱条件
时间(分钟) 流速ml/分钟 A％ B％
0 0.5 70 30
5 0.5 70 30
20 0.5 55 45
30 0.5 70 30
将样品和参比品分别进样50μg，按面积归一法，对出峰进行积分，复性率的计算采用，计算样品出峰中与参比品出峰时间相同的峰在所有峰面积中的比例，即为复性率。
3.实验结果
如图2和图3所示。
图2表明，对照例1制备的复性得到的样品的复性率为38.7％。
图3表明，实施例2制备的复性得到的样品的复性率为61.6％。
可见，基于血小板生成素模拟肽融合蛋白特殊的立体结构，本发明针对性的增加了透析去除还原剂，氧化衍生形成二硫键的操作，实验表明所述透析、氧化衍生步骤的增加大幅度提高了纯化复性率(HIC HPLC纯度)。含有透析、氧化衍生的方法复性率可以达到60％以上，而未经透析、氧化衍生的样品的复性率仅为30％－40％左右。
实施例6：纯度的测定和比较
1.实验样品
对照例2制备的对照2样品。
实施例2制备的样品。
另取实施例2中经过阴离子层析得到的样品加入泳道3。
2.实验方法
比较上述3个样品的纯度。参照《中国药典》2010版三部附录IV C非还原SDS-PAGE进行纯度检测。分离胶胶浓度为13.5％，加样量不低于10μg(考马斯亮蓝染色法)经扫描仪扫描。
3.实验结果
如图4所示和下面的表2所示，图4和表2中的第1泳道为分子量Marker，第2泳道为空白，第3泳道为经过阴离子层析后的样品，第4泳道经过分子筛层析处理后的样品，第5泳道为经过羟基磷灰石层析处理后的样品。
表2：各样品电泳后的扫描结果
结果表明，泳道5的小分子杂质含量显著少于泳道3和泳道4的小分子杂质含量，可见，在纯化血小板生成素模拟肽融合蛋白时，在工艺步骤中引入羟基磷灰石层析替代分子筛层析，能够更有效的去除小分子杂质，样品纯度更高。
另外，从成本方面考虑，羟基磷灰石与分子筛层析相比，工业生产放大时更有优势。
实施例7：电荷异构体纯度检测
1.实验样品
对照例3制备的对照3样品。
实施例2制备的样品。
另取参比品加入泳道1。
2.实验方法
参照《中国药典》2010版三部附录IVD IEF方法测定电荷异构体纯度。上样5μg。
3.实验结果
如图5所示和下面的表3所示。
泳道1为参比品，泳道2为用SP Sepharose H.P阳离子层析洗脱样品(对照例3)，泳道3为marker，泳道4为CHT羟基磷灰石层析洗脱样品(实施例2)。考马斯亮蓝染色法，经扫描仪扫描。
表3：各样品的电泳结果
结果表明，在纯化血小板生成素模拟肽融合蛋白时，在工艺步骤中引入CHT羟基磷灰石层析替代阳离子层析，能够更有效的去除电荷异构体杂质，样品纯度更高。
实施例8：各项指标的检测
1.实验样品
实施例2制备的样品，实施例3制备的样品。
参比品为罗米司亭，通过商业购买得到，生产厂商是安进公司。
2.实验方法
检测项目如下面的表6所列出。
(1)生物学活性测定：参照《TPO对MO7e细胞的作用探究》解放军医学院学报，2010,31(5):470-471，用Mo7e细胞增值法测定Mo7e细胞计数，得出样品浓度与Mo7e细胞增值曲线，比较与参照品差异。
(2)SEC(尺寸排阻色谱法)纯度测定：参照《中国药典》2010版三部附录III D。
(3)IEC纯度(离子交换色谱法)：采用ProteomixSCX-NP3色谱柱，以20mM PBS+15％CAN，pH8.0溶液为流动相A，以20mM PBS+500mM NaCl+15％CAN，pH8.0溶液为流动相B，流速为每分钟0.5ml，柱温为40℃，检测波长为280nm，取稀释至1mg/ml的供试品进样60μl，按下面的表4进行梯度洗脱。
表4：洗脱条件
(4)HIC参见实施例6。
(5)RP(反向色谱法)纯度测定：依法测定(中国药典2015年版通则0512)。采用C8色谱柱，以0.1％三氟乙酸-水溶液为流动相A)，以0.1％三氟乙酸-乙腈溶液为流动相B，流速为每分钟1.0ml，检测波长为280nm，取稀释至1mg/ml的供试品进样20ml，按下面的表5进行梯度洗脱
表5：洗脱条件
时间(分钟) 流速ml/分钟 A％ B％
0 1 100 0
10 1 90 10
40 1 20 80
50 1 90 10
(6)分子量测定：参照《中国药典》2010版三部附录IV C非还原SDS-PAGE。
(7)蛋白A残留量测定：用酶联免疫法测定，采用商品化CygnusF600试剂盒，结果采用cubic-spline(log-linear)拟合方式。
(8)宿主菌蛋白残留量测定：用酶联免疫法测定，采用商品化CygnusF410试剂盒，结果采用四参数拟合方式。
(9)外源DNA残留量测定：参照《中国药典》2010版三部附录IXB外源DNA残留量测定法。
(10)细菌内毒素测定：参照中国药典2010版附录XII E细菌内毒素检查法。
(11)肽图：参照《中国药典》2010版三部附录VIII E，采用胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法。
3.实验结果
如下面的表6所示。
表6：原液质量检测结果
结果表明：
(1)本发明制备的产品质量优秀，纯度高，生物学活性稳定，符合药品质量要求。
(2)本发明样品IEC纯度及HIC纯度均优于参比品。
(3)本发明的菌体蛋白残留，外源DNA残留量，细菌内毒素的量均显著低于现有技术CN102321168，具有更高的纯度。
(4)此外，本发明的样品分子量与参比品的分子量相同。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 四川科伦博泰生物医药股份有限公司
<120> 一种纯化蛋白的方法以及试剂盒
<130> IDC170205
<160> 7
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 血小板生成素模拟肽
<400> 1
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 血小板生成素模拟肽
<400> 2
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Cys Leu Ala Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 血小板生成素模拟肽
<400> 3
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Ala Leu Ala Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 血小板生成素模拟肽
<400> 4
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Asp Trp Leu Ala Ala Arg Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 228
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Linker
<400> 6
Gly Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Linker
<400> 7
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5

Claims (15)

1.一种纯化蛋白的方法，包括将蛋白包涵体的复性产物进行层析的步骤，其中，
所述蛋白为血小板生成素模拟肽融合蛋白，其中，所述融合蛋白含有一个或多个血小板生成素模拟肽；优选地，所述融合蛋白包含2、3、4、5或6个血小板生成素模拟肽；
所述层析包括羟基磷灰石层析；
其中，所述血小板生成素模拟肽长度为9－16个氨基酸(例如为9个氨基酸)，并且其包含下面的式I所示的肽段：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9
式I
其中，
X1选自谷氨酸、天门冬氨酸、赖氨酸和缬氨酸；
X2选自甘氨酸和丙氨酸；
X3选自脯氨酸；
X4选自苏氨酸和丝氨酸；
X5选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸；
X6选自精氨酸和赖氨酸；
X7选自谷氨酰胺、天门冬酰胺和谷氨酸；
X8选自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸；
X9选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或赖氨酸；
优选地，当血小板生成素模拟肽融合蛋白包含多个血小板生成素模拟肽时，血小板生成素模拟肽之间、血小板生成素模拟肽与融合蛋白之间和/或融合蛋白之间通过Linker连接；优选地，所述Linker为2－10个甘氨酸或者一个或多个二硫键，优选地，所述甘氨酸的个数为5、6、7、8、9或10个。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，
所述血小板生成素模拟肽的氨基酸序列如SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示。
3.根据权利要求1或2所述的纯化方法，其中，所述融合蛋白为血小板生成素模拟肽与人IgG Fc的融合蛋白；
优选地，所述血小板生成素模拟肽与人IgG Fc通过Linker连接；优选地，所述Linker为2－10个甘氨酸；
优选地，所述人IgG Fc的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的纯化方法，其中，所述蛋白如下面的式II所示：
其中，
TMP表示血小板生成素模拟肽，其氨基酸序列如SEQ ID NOs:1－4中任一序列所示。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的纯化方法，其中，所述羟基磷灰石为陶瓷羟基磷灰石；优选地，为I型陶瓷羟基磷灰石。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的纯化方法，其中，所述羟基磷灰石层析包括下述步骤：
a)用平衡缓冲液平衡羟基磷灰石层析柱；优选地，所述平衡缓冲液为磷酸缓冲液；
b)将含有目的蛋白的样品上样；
c)用洗脱缓冲液进行梯度洗脱；优选地，所述洗脱缓冲液为含有NaCl的磷酸缓冲液。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于如下的(1)－(4)项中的任意一项或者多项：
(1)步骤a)中，所述磷酸缓冲液为pH为6.0－7.0的10－20mM磷酸缓冲液；
(2)步骤b)中，上样量为5－20mg蛋白/ml填料；
(3)步骤c)中，所述含有NaCl的磷酸缓冲液为含有pH为6.0－7.0的含0.5－1.5M NaCl的10－20mM磷酸缓冲液；
(4)步骤c)中，洗脱体积为10－25倍柱体积，收集第二个洗脱峰。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的纯化方法，其中，所述层析还包括亲和层析和/或阴离子层析；
优选地，将蛋白的复性产物依次进行亲和层析、阴离子层析和羟基磷灰石层析；
优选地，其还包括将羟基磷灰石层析得到的产物进行浓缩或除菌的步骤；
优选地，所述亲和层析使用选自如下的亲和层析柱：
Mabselect、Mabselect sure、ProSep Ultra Plus、Eshmuno A或AF-rProtein A HC-650F；
优选地，所述阴离子层析使用选自如下的阴离子层析柱：
Q Sepharose HP、Fractogel EMD TMAE、POROS 50HQ、POROS 50PI或SuperQ-650M；
优选地，所述羟基磷灰石层析使用陶瓷羟基磷灰石层析柱；优选地，所述陶瓷羟基磷灰石为I型陶瓷羟基磷灰石或II型陶瓷羟基磷灰石；
优选地，所述层析不包括分子筛层析和/或阳离子层析。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的纯化方法，还包括在蛋白复性之前，将蛋白包涵体的变性产物进行透析或超滤的步骤；
优选地，所述透析或超滤的截留分子量范围是5－20kD，更优选为8－15kD；
优选地，所用透析液的pH为2.5－3.5；更优选地，所用透析液的pH为2.7－3.2；优选地，所用透析液为1－100mM HCl溶液，更优选为2－30mM HCl溶液；
优选地，透析时间为10－40小时，更优选为15－30小时。
10.根据权利要求9所述的纯化方法，其还包括在所述透析或超滤之后，将透析截留产物或超滤截留产物进行氧化生成二硫键的步骤；优选地，通过加入选自胱胺、氧化性谷胱甘肽和胱氨酸的任意一种或者几种进行氧化生成二硫键。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的纯化方法，其中，所述蛋白采用下述蛋白复性液进行复性；
所述蛋白复性液包括40－60mM Tris，40－400mM Arg，1－5mM氧化还原对，0.5－2mMEDTA，1－2M尿素的溶液，pH为7.0－9.0。
12.一种制备蛋白的方法，其包括权利要求1至11中任一权利要求所述的纯化方法。
13.一种试剂盒，其包括独立包装的i－iii：
i.截留分子量为5－20kD的透析袋或超滤膜、1－100mM HCl溶液；
ii.氧化生成二硫键的试剂；
iii.羟基磷灰石或羟基磷灰石填充柱；
优选地，所述氧化生成二硫键的试剂选自胱胺、氧化性谷胱甘肽和胱氨酸中的任意一种或者多种。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其还包括独立包装的iv：
iv.蛋白复性液；
优选地，所述蛋白复性液包括40－60mM Tris，40－400mM Arg，1－5mM氧化还原对，0.5－2mM EDTA，1－2M尿素的溶液，pH为7.0－9.0；
优选地，所述蛋白复性液包括50mM Tris，40－400mM Arg，0.5－5mM胱胺，0.4－4mM半胱氨酸，0.5－2mM EDTA，1－2M尿素的溶液，pH为7.0－9.0。
15.权利要求13或14所述的试剂盒在纯化蛋白或者制备治疗和/或预防特发性血小板减少性紫癜的蛋白药物中的用途；优选地，所述蛋白药物为血小板生成素模拟肽或其融合蛋白。
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