CN112521480A - 一种人干扰素-κ突变体及其制备方法 - Google Patents

一种人干扰素-κ突变体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人干扰素‑κ(hIFN‑κ)突变体及其制备方法。所述的hIFN‑κ变体是将hIFN‑κ的SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第166位游离的半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)，或者突变为与丝氨酸结构相近的甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。与含有野生型hIFN‑κ序列的菌株相比，含有本发明的突变体序列的质粒的菌株表达产生的hIFN‑κ产量较高，与干扰素‑κ受体结合的亲和力更高，体外活性也更好。

Description

一种人干扰素-κ突变体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及人干扰素-κ的突变体及其制备方法。
背景技术
干扰素(Interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的细胞因子。其可以通过结合靶细胞上的同源受体复合物而发挥抗病毒的活性。
干扰素卡帕(Interferon-κ，IFN-κ)是近年来发现的一个新的IFN成员，与IFN-α、IFN-β共同使用一个受体蛋白，属于I型干扰素。IFN-κ由207个氨基酸残基组成，包括N端27个氨基酸残基的信号肽，与Ⅰ型IFN的其他成员有约30％的同源性，IFN-κ比其他Ⅰ型IFN稍大，在C和D螺旋间有12个氨基酸残基的插入。IFN-κ基因位于第9对染色体短臂，与其他Ⅰ型IFN的基因邻近，其他Ⅰ型IFN基因无内含子，但IFN-κ基因的3′端非编码区含有1个内含子。目前，有研究发现编码IFN-κ基因选择性的在上皮角蛋白细胞中表达，重组的hIFN-κ与其他同型的干扰素类似，可以保护细胞免于病毒的感染；且所述的表达具有种族的特异性。
天然干扰素-κ序列中含有两对二硫键和一个单独未成对的半胱氨酸。干扰素-κ的体外表达一直是个难题，目前都采用原核表达的方法，但通常都以包涵体形式表达，因而在蛋白质复性过程中蛋白的正确折叠和二硫键的正确配对便成了关键。另外，在复性过程中，游离半胱氨酸的存在往往对这种正确折叠和配对带来干扰，同时也使得蛋白在复性过程中形成聚集体而失活。
因此，改善蛋白质复性过程中蛋白的正确折叠和二硫键的正确配对，减少干扰素-κ在复性过程的蛋白质聚集，对于提高干扰素-κ蛋白的纯度显得尤为重要。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种干扰素-κ突变体，其与未突变的天然干扰素-κ蛋白相比，在与受体结合亲和力和活性方面都具有显著的改善。
本发明的另一目的在于提供一种制备干扰素-κ突变体的方法，通过培养、诱导表达、收集包涵体、复性、层析等操作，实现了较高的复性效率，且所获得的蛋白具有更高的活性。
本发明的目的通过包括以下的本申请的技术方案来实现：
根据本发明的一个方面，提供一种人干扰素kappa(hIFN-κ)突变体。
在所述突变体中，天然hIFN-κ的氨基酸序列中第166位的半胱氨酸突变为不能形成二硫键的氨基酸残基，其中所述突变体可以消除蛋白表达纯化过程中包涵体的复性过程中对于正确折叠的影响。
在所述hIFN-κ突变体中，1)天然存在的hIFN–κ的对应于SEQ ID NO:1中第166位置上的半胱氨酸替换为20种天然氨基酸中的除半胱氨酸外的其他19种氨基酸中的任一种，优选为丝氨酸；或，2)来源于人且与SEQ ID NO:1具有99％同源性的氨基酸序列的对应于SEQID NO:1的第166位的半胱氨酸替换为20种天然氨基酸中的除半胱氨酸外的其他19种氨基酸中的任一种，优选为丝氨酸；或，3)所述hIFN-κ突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明中，所述20种天然氨基酸为本领域已知的20种天然氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸。
根据本发明的第二方面，提供一种编码所述hIFN-κ突变体的核酸分子，其中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
ATGCTGGACTGCAATCTGCTGAACGTTCATCTGCGTCGCGTTACCTGGCAAAATCTGCGTCATCTGAGCAGCATGAGCAATAGCTTTCCGGTTGAGTGCCTGCGCGAAAATATCGCGTTTGAACTGCCGCAGGAATTTCTGCAGTATACCCAGCCGATGAAACGCGACATCAAAAAAGCCTTCTACGAGATGAGCCTGCAGGCGTTTAACATCTTCAGCCAGCACACCTTCAAATACTGGAAAGAGCGCCACCTGAAACAGATTCAGATTGGTCTGGACCAGCAGGCAGAATATCTGAATCAGTGCCTGGAAGAAGATAAAAACGAGAACGAGGACATGAAAGAGATGAAAGAGAACGAGATGAAACCGTCTGAAGCACGCGTTCCGCAACTGAGCAGCCTGGAACTGCGTCGTTATTTTCACCGCATCGACAACTTCCTGAAAGAGAAAAAATACAGCGATTGCGCTTGGGAAATTGTACGCGTCGAAATTCGCCGCAGCCTGTACTACTTTTACAAATTCACCGCCCTGTTCCGCCGTAAATAA(SEQ ID NO:3)
根据本发明的第三方面，提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包含所述的核苷酸序列；优选地，所述核酸构建体为载体；更优选地，所述载体为质粒载体；最优选地，所述质粒载体为pET28a、pET30a、pCZN1、pET22b、pET20b和pET-11c中的任意一种。
根据本发明的第四个方面，提供一种重组的基因工程细胞，所述基因工程细胞包含上述的核酸分子或核酸构建体。
其中，所述基因工程细胞为表达产生所述hIFN-κ突变体的原核宿主细胞；优选地，所述原核宿主细胞为来自细菌的细胞；更优选地，所述原核宿主细胞为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞或大肠杆菌(Escherichia coli)细胞；最优选地，所述原核宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)细胞。
根据本发明的第五个方面，提供一种制备hIFN-κ突变体的方法。
其中，所述hIFN–κ突变体通过培养上述的基因工程细胞获得。
具体地，所述方法包括：
1)培养所述基因工程细胞，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达；
2)离心收集菌体，超声破碎后收集包涵体；
3)盐酸胍复性收集获得hIFN-κ突变体；
4)利用层析纯化获得蛋白。
其中，在步骤1)中，将所述细胞培养到OD600值为0.4-1.2、优选0.5-1.0、最优选0.6-0.8时添加IPTG；且所述IPTG的浓度为0.4-1.4mM、优选为0.6-1.2mM，更优选为0.8-1mM。
在步骤3)中，利用4-8M的盐酸胍或尿素溶解所述包涵体。
在步骤4)中，先用阴离子层析以流穿的方式除去杂蛋白，再用阳离子层析以结合的方式纯化目的蛋白；优选地用10-30mM PB结合缓冲液平衡层析柱，然后复性液上样，待全部上样后用平衡缓冲液清洗层析柱至UV值到20mAu以下，然后用10-30mM PB+300-800mMNaCl的洗脱缓冲液梯度洗脱目的蛋白。
其中，所述方法还包括检测获得的hIFN-κ突变体与受体结合的亲和力以及体外的细胞活性。
根据本发明的第六个方面，提供一种药物组合物，其包含上述的hIFN-κ突变体。
根据本发明的第七个方面，提供本发明的hIFN-κ突变体在制备治疗病毒感染或肿瘤方面的药物中的应用。
在本发明中，天然的hIFN-κ与野生型hIFN-κ的含义相同，都是指其氨基酸序列未发生变化的hIFN-κ蛋白，可替换使用。
本发明的有益效果在于：本发明的hIFN–κ突变体的氨基酸序列中第166位的半胱氨酸突变为除了半胱氨酸之外的其他氨基酸，如丝氨酸，因此去除了游离巯基的干扰。另外，丝氨酸在结构上与半胱氨酸相近且是一个比较简单的氨基酸，因此半胱氨酸突变不会影响hIFN–κ蛋白的整体结构。在hIFN–κ蛋白的整体结构未受影响的情况下，该突变显著提高该蛋白的复性效率，在相同浓度下与受体的结合能力显著增加，且蛋白活性也得到显著改善，从而极大地提高hIFN–κ蛋白的生产效率，降低成本。
附图说明
图1：野生型hIFN–κ以及hIFN–κ突变体与受体结合解离曲线：A为野生型hIFN–κ与受体结合解离曲线，B为hIFN–κ突变体与受体的结合解离曲线；和
图2：野生型hIFN–κ以及hIFN–κ突变体的活性检测结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，本领域技术人员将知晓，所描述的实施例仅是出于举例的目的，而不是本发明的全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员将更好地理解和掌握本发明所要求保护的技术方案及其实现的技术效果。
在下面的具体实施例中，除了特殊制备的试剂外，其余试剂皆是可商购的试剂。
实施例1hIFN-κ突变体编码基因及表达载体获得
hIFN–κ的氨基酸序列如下所示：
MLDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAFNIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCLEEDKNENEDMKEMKENEMKPSEARVPQLSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRCLYYFYKFTALFRRK(SEQ ID NO:1)
根据现有技术公开的hIFN–κ氨基酸序列以及其高级结构，可以获知第166位的半胱氨酸(Cys)并不参与形成二硫键，因此发明人将其进行了定点突变，构建了突变文库，即将其突变为20种常见氨基酸中的除Cys外的不含有巯基的其他另外十九种氨基酸中的任一种，突变后的序列如下所示：
MLDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAFNIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCLEEDKNENEDMKEMKENEMKPSEARVPQLSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRXLYYFYKFTALFRRK(SEQ ID NO:4)
其中X为除Cys外的其他的任意的十九种常见氨基酸中的任一种。
通过生物信息学建模，分析上述含有上述突变序列的hIFN–κ与其受体的结合特异性，申请人发现将其突变为甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸的情况下对其高级结构影响较小，且与受体结合的活性与野生型差别较小，选取上述三种突变体进行实验验证。对于上述SEQ IDNO:4，其中X为Gly、Ala或Ser。
鉴于半胱氨酸与丝氨酸结构最为相似，最终选取了丝氨酸取代进行实验验证，其氨基酸序列如下所示：
MLDCNLLNVHLRRVTWQNLRHLSSMSNSFPVECLRENIAFELPQEFLQYTQPMKRDIKKAFYEMSLQAFNIFSQHTFKYWKERHLKQIQIGLDQQAEYLNQCLEEDKNENEDMKEMKENEMKPSEARVPQLSSLELRRYFHRIDNFLKEKKYSDCAWEIVRVEIRRSLYYFYKFTALFRRK(SEQ ID NO:2)
为了提高基因的翻译效率，对突变后的hIFN-κ氨基酸序列SEQ ID NO:2进行大肠杆菌密码子优化，最终获得编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述基因由苏州泓迅生物科技有限公司合成。
将获得的SEQ ID NO:3所示的编码基因交由苏州泓迅生物科技有限公司连接入载体pET28a(+)，得到重组质粒pET28-hIFN-κ-MUT。
实施例2蛋白制备
1、将实施例1制备的重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经卡那霉素抗性筛选，挑取单菌落进行PCR鉴定，筛选出阳性克隆细胞即为含重组质粒pET28-hIFN–κ-MUT的工程菌。
2、重组质粒pET28-hIFN–κ-MUT在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达和纯化：
1)将含有重组质粒pET28-hIFN-κ-MUT的大肠杆菌BL21(DE3)单菌落接种于5ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃下200r/min震荡培养16h，将5ml菌液加入500ml含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，1：100扩大培养。
2)当步骤1)中培养的大肠杆菌的OD600值达到0.6-0.8之间时，向菌液中加入1mMIPTG，16℃震荡培养4h。离心收集诱导的菌体，重悬，冰浴30min后超声破碎约15min，离心收集沉淀，即包涵体，用3M尿素溶液清洗包涵体3-5次。
3)用6M盐酸胍溶液溶解包涵体，稀释复性，复性后过滤澄清，收集上清液，备用；先用20mM PB结合缓冲液平衡层析柱，将上清液上样，待全部上样后用平衡缓冲液清洗层析柱至UV值到20mAu以下，然后用包含20mM PB和500mM NaCl的洗脱缓冲液梯度洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液。
其中，在步骤1)中，最佳OD600值采用单因素变量法进行确定：在OD600值为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2时分别添加IPGT，然后进行SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色，判断蛋白表达浓度，确定最佳菌液OD600为0.6-0.8时将获得最佳的蛋白浓度。
在步骤2)中，最佳IPTG浓度的通过以下步骤进行确定：在细菌培养到OD600在0.6-0.8时，添加0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM、1.2mM、1.4mM终浓度的IPGT，诱导表达4h，收集部分菌体进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染色验证蛋白浓度，最终确定在IPGT浓度在0.8-1mM时获得最佳的目的蛋白浓度。
实施例3活性测定
1、干扰素-κ蛋白与其受体结合的亲和力测定
采用苏州晶源实验室的gator非标记生物分子分析仪(probelife)，按照其使用说明书操作步骤，检测干扰素-κ和其受体的结合亲和力：首先倍比稀释纯化好的干扰素-κ，总共5个浓度，然后让抗-huFc探针先结合干扰素受体，再与不同浓度的干扰素kappa反应，此时受体与干扰素-κ蛋白结合形成一条动态曲线，再将反应后的探针放入解离缓冲液中，此时受体与干扰素-κ蛋白会慢慢发生解离形成一条动态曲线，最后根据曲线和浓度计算出亲和力。具体结果如表1和图1A-B所示。
表1
样品 Koff(1/s) Kon(1/Ms) KD(M) 响应
野生型干扰素-κ 0.00422 5.21E+04 8.10E-08 0.146
干扰素-κ突变体 0.00734 1.13E+05 6.51E-08 0.187
如表1和图1所示，本发明的干扰素-κ突变体的KD值低于野生型干扰素-κ的KD值，这充分表明干扰素-κ突变体与其受体的结合力要高于野生型干扰素-κ。另外，经过半胱氨酸突变后的干扰素-κ突变体的响应值也显著地大于野生型未经突变的干扰素-κ蛋白。结果表明，把干扰素-κ的氨基酸序列中的游离的半胱氨酸突变为不能形成的连接两条肽链的二硫键的丝氨酸，避免了该游离半胱氨酸与其它正常配对的半胱氨酸之间的非正常连接，因此这种突变在某种意义上极大地促进了构成干扰素-κ蛋白在溶液中的稳定性，进而提高了蛋白与其受体结合的亲和力。
2、干扰素-κ蛋白的体外活性检测
按照报告基因质粒培养方法，先在HEK293细胞中转染荧光素酶报告基因质粒，然后用抗生素筛选阳性克隆，用有限稀释法筛选到阳性单克隆后，扩增细胞铺板，加入梯度稀释后的干扰素-κ共培养，然后加入荧光指示剂，记录信号并分析，结果如图2所示。
由图2可知，本发明的干扰素-κ突变体的活性明显高于未发生突变的干扰素-κ。未发生突变的干扰素-κ在药物浓度较大时，活性则出现较大波动。这也充分说明，本发明的干扰素-κ突变体即使在较大药物浓度下，也具有较高的活性和稳定性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但是并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可做各种改动和修饰，以本领域技术人员结合所属领域的常规技术概括获得的均在本发明的范围之内。
序列表
<110> 山东晶辉生物技术有限公司
<120> 一种人干扰素-κ突变体及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 181
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
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Gln Asn Leu Arg His Leu Ser Ser Met Ser Asn Ser Phe Pro Val Glu
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Cys Leu Arg Glu Asn Ile Ala Phe Glu Leu Pro Gln Glu Phe Leu Gln
35 40 45
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Ser Leu Gln Ala Phe Asn Ile Phe Ser Gln His Thr Phe Lys Tyr Trp
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Pro Gln Leu Ser Ser Leu Glu Leu Arg Arg Tyr Phe His Arg Ile Asp
130 135 140
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Arg Val Glu Ile Arg Arg Cys Leu Tyr Tyr Phe Tyr Lys Phe Thr Ala
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<211> 181
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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180

Claims (10)

1.一种人干扰素kappa(hIFN-κ)突变体，其特征在于，将天然存在的hIFN-κ的氨基酸序列中第166位的半胱氨酸突变为不能形成二硫键的氨基酸残基。
2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，在所述突变体中，
1)天然存在的hIFN–κ的对应于SEQ ID NO:1中第166位置上的半胱氨酸替换为20种天然氨基酸中的除半胱氨酸外的其他19种氨基酸中的任一种，优选为丝氨酸；或
2)来源于人且与SEQ ID NO:1具有99％同源性的氨基酸序列的对应于SEQ ID NO:1的第166位的半胱氨酸替换为20种天然氨基酸中的除半胱氨酸外的其他19种氨基酸中任一种，优选为丝氨酸；或
3)所述hIFN-κ突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一种编码如权利要求1或2所述的突变体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含权利要求3所述的核苷酸序列；优选地，所述核酸构建体为载体；更优选地，所述载体为质粒载体；最优选地，所述质粒载体选自pET28a、pET30a、pCZN1、pET22b、pET20b和pET-11c的任意一种。
5.一种重组的基因工程细胞，其特征在于，所述基因工程细胞包含权利要求3所述的核酸分子或包含权利要求4所述的核酸构建体；优选地，所述基因工程细胞为表达产生所述hIFN-κ突变体的原核宿主细胞；优选地，所述原核宿主细胞为来自细菌的细胞；更优选地，所述原核宿主细胞为枯草芽孢杆菌细胞或大肠杆菌细胞；最优选地，所述原核宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)的细胞。
6.一种制备hIFN–κ突变体的方法，其特征在于，所述hIFN–κ突变体通过培养权利要求5所述的基因工程细胞获得。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括：
1)培养所述基因工程细胞，添加IPTG进行诱导表达；
2)离心收集菌体，超声破碎后收集包涵体；
3)盐酸胍复性收集获得hIFN-κ突变体；
4)利用层析纯化获得蛋白。
8.权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括检测获得的hIFN-κ突变体与受体结合的亲和力以及体外的细胞活性。
9.一种药物组合物，其包含如权利要求1或2所述的hIFN-κ突变体。
10.权利要求1或2所述的hIFN-κ突变体在制备治疗病毒感染或肿瘤方面的药物中的应用。
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