CN108484738B

CN108484738B - 辐抗肽突变蛋白及其制备与纯化方法

Info

Publication number: CN108484738B
Application number: CN201810262142.3A
Authority: CN
Inventors: 葛常辉; 杨刚刚; 杨晓明; 张全义; 张全海; 詹轶群; 王磊; 吕中原; 王海滨
Original assignee: Henan Xinxiang Hua Xing Pharmaceutical Factory; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA; Henan Normal University
Current assignee: Henan Xinxiang Hua Xing Pharmaceutical Factory; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA; Henan Normal University
Priority date: 2018-03-28
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2022-03-15
Anticipated expiration: 2038-03-28
Also published as: CN108484738A

Abstract

本发明公开了一种辐抗肽或其突变蛋白的制备和纯化方法，该方法可显著提高蛋白的纯度，便于工业化生产。本发明还提供了一种辐抗肽突变蛋白，该突变蛋白是在辐抗肽蛋白CBLB502的基础上，将ND1和CD1结构域之间的氨基酸序列进行替换，所述突变蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其稳定性显著优于现有技术中的CBLB502蛋白。

Description

辐抗肽突变蛋白及其制备与纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及辐抗肽蛋白CBLB502或其突变蛋白的表达、分离和纯化的制备方法，并涉及由上述方法所得的辐抗肽突变蛋白。

背景技术

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)是Lemaitre等人在1996年研究果蝇过程中发现，目前研究表明，在人体内发现了11个TLRs家族成员，主要表达于免疫细胞等。Toll-like receptors(TLRs)家族是一类在机体固有免疫和获得性免疫应答中发挥重要作用的模式识别受体，它们通过特异性识别细菌、病毒等病原体相关分子模式活化NF-κB信号通路介导炎症反应、抗病毒反应和免疫效应细胞的分化成熟，并以此抵御病原微生物的入侵(Kumar H,et al.Toll-like receptors and innate immunity.BBRC,2009,388:621-625)。

TLR5作为TLRs家族中一员，其唯一配体为细菌的鞭毛蛋白。近期研究表明，细菌鞭毛蛋白或者其保留TLR5结合活性的衍生物(如CBLB502，其含有鞭毛蛋白主要功能结构域的重组蛋白，我们称之为辐抗肽)对γ射线照射后导致的辐射损伤具有保护作用，其抗辐射作用机制是通过结合细胞表面TLR5，激活细胞内的NF-kB信号通路，抑制辐射照射引起的细胞凋亡，进而达到降低辐射损伤的效果(Burdelya LG,et al.An agonist of toll-likereceptor 5has radioprotective activity in mouse and primate models.Science,2008,320:226-230)。此外，还有研究报道表明辐抗肽对肝损伤具有保护作用。

有研究发现TLR5(Toll Like Receptor 5)受体的特异性配体-沙门氏菌鞭毛蛋白及功能同源衍生物CBLB502(含有鞭毛蛋白主要功能结构域的重组蛋白，我们称之为辐抗肽)可以和细胞表面的TLR5结合并激活NF-kB信号通路，在不引发急性炎症反应的情况下，减轻射线引起的肠道上皮细胞、血管内皮细胞和造血细胞凋亡，保护细胞免受辐射损伤并促进组织再生，而并没有降低肿瘤的辐射敏感性(Burdelya LG,et al.An agonist oftoll-like receptor 5has radioprotective activity in mouse and primatemodels.Science,2008,320:226-230)

辐抗肽蛋白来源于沙门氏菌鞭毛蛋白，编码296个氨基酸，分子量约为31KD。在大肠杆菌表达系统中，重组的辐抗肽蛋白趋向于形成包涵体，而且同野生型Fli C蛋白相比，辐抗肽在纯化和储存过程中更容易发生降解。有文献研究表明，这可能与辐抗肽蛋白本身的分子结构设计存在缺陷有关(Song WS,Jeon YJ,Namgung B,et al.A comservedTLR5binding and activation hot spot on flagellin.Scientific Reports.2017,7:40878.)。辐抗肽蛋白在其ND1和CD1结构域之间插入了人为设计的链接序列并保留了部分CD2结构域的部分氨基酸序列，这种分子结构没有充分考虑到鞭毛蛋白蛋白结构的完整性和蛋白折叠特性。改进的办法是将这一部分用类似枯草芽孢杆菌杆菌的环状结构的氨基酸序列将其替换，以增加辐抗肽蛋白的稳定性。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种辐抗肽或其突变蛋白的制备与纯化方法，不同于常规的苯基疏水层析，本发明采用丁基疏水层析方法进行纯化，该纯化方法可显著提高蛋白的纯度。

本发明的主要内容是在获得辐抗肽突变蛋白cDNA的基础上，成功构建了辐抗肽突变蛋白的原核表达载体，此表达载体为温度诱导型表达载体，将此表达载体转化大肠杆菌获得了表达辐抗肽突变蛋白的基因工程菌。利用此基因工程菌建立了一套工程菌诱导表达、包涵体的分离和裂解、蛋白质的体外复性和纯化工艺。利用此工艺可以生产大量的辐抗肽蛋白或者基于辐抗肽序列的突变蛋白。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明按照SEQ ID NO:1所示的核酸序列合成辐抗肽突变蛋白cDNA，经限制性酶切后连接到温度诱导型表达载体pBV220中，构建pBV220-FKT表达载体；用表达载体转化感受态大肠杆菌JM109，构建基因表达工程菌，并诱导表达；利用DEAE阴离子交换柱进行粗纯化；随后，利用DEAE阴离子交换柱进行二次纯化；然后，使用丁基疏水层析进行终纯化，丁基疏水层析是在丁基疏水色谱柱上进行的，上样速度为3L/h～6L/h，优选6L/h；洗脱溶液为0.7MNaCl/10mM PB，流速为6L/h。。

本发明的另一个目的是提供一种辐抗肽突变蛋白，其是在鞭毛蛋白衍生多肽CBLB502的基础上，将ND1和CD1结构域之间的氨基酸序列替换为类似枯草芽孢杆菌的环状结构的氨基酸序列，所述辐抗肽突变蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，其稳定性显著优于现有技术中的辐抗肽蛋白CBLB502。

本发明还提供了一种DNA序列，该DNA序列编码上述辐抗肽突变蛋白；优选地，该DNA序列具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，该表达载体含有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种宿主细胞，该宿主细胞被上述表达载体转化；优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌JM109。

本发明的优点是：

本发明的辐抗肽突变蛋白的稳定性显著高于现有技术中辐抗肽蛋白的稳定性，易于保存，有效降低辐抗肽突变蛋白在保存过程中的降解速度；在保存一段时间后，辐抗肽蛋白的纯度下降到95％以下，而辐抗肽突变蛋白的纯度未见明显下降；

此外，本发明的方法不仅可以用于纯化辐抗肽突变蛋白，还可以替代现有技术用于纯化辐抗肽蛋白，并可以显著提高所制得蛋白的纯度；

本发明的制备纯化方法可以用于辐抗肽蛋白和辐抗肽突变蛋白的50L发酵的大规模辐抗肽蛋白生产，而现有技术仅适合于10L以下发酵的辐抗肽蛋白纯化。

附图说明

图1为pBV220-FKT表达质粒的酶切图谱；其中，M为DL15000DNA Marker，1为pBV220-FKT/Sal I单酶切，2为pBV220-FKT/Sma I单酶切，3为未酶切的pBV220-FKT；

图2为辐抗肽突变蛋白50L发酵在不同时间的电泳鉴定结果图；

图3为均质机破碎电泳鉴定结果；其中，数字表示均质机破碎的次数，上表示为上清液，下表示为沉淀；

图4为DEAE一柱和二柱洗脱电泳鉴定结果；

图5为丁基疏水层析洗脱峰电泳结果；其中，从左至右各条带分别为原样、流穿1、流穿2、洗脱1、洗脱2、水；

图6为HPLC色谱检测辐抗肽突变蛋白纯度的结果；

图7为银染法检测辐抗肽突变蛋白纯度的结果；其中，由左至右各条带分别为Marker，批次1、批次1、批次2、批次2；

图8为对比例中苯基疏水层析洗脱峰的电泳结果；其中，由左至右条带分别为Marker、原样、流穿、洗脱1、洗脱2、洗脱3、峰尾、水；

图9为辐抗肽蛋白CBLB502的电泳检测图；其中，由左至右各条带分别为Marker、批次1、批次2；

图10为辐抗肽突变蛋白生物学活性检测结果示意图；

图11辐抗肽突变蛋白的稳定性检测结果示意图；其中，由左至右各条带分别为marker、辐抗肽蛋白CBLB502、辐抗肽突变蛋白。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1辐抗肽突变蛋白的制备及纯化

1)辐抗肽突变蛋白表达载体构建

通过碱基合成方法按照SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列合成辐抗肽突变蛋白的cDNA，经限制性酶切后连接到pBV220温度诱导型表达载体中，构建pBV220-FKT重组表达载体，载体酶切鉴定结果见图1，然后用此载体转化大肠杆菌JM109，在氨苄青霉素抗性的LB培养基上筛选阳性克隆，并建立工程菌种子库。

2)辐抗肽突变蛋白发酵及电泳鉴定

将含有重组细菌鞭毛蛋白衍生多肽辐抗肽突变载体的JM109工程菌在30℃下震荡培养过夜，次日按1％(体积比)接入2×YT培养基中，30℃下振荡培养8～10小时，按10％(体积比)接入基础培养基中，在50L发酵罐中30℃下培养至OD₆₀₀＝30，迅速升温至42℃，诱导培养3.5～4小时，压缩空气和医用氧做气源，保持通气量1vvm，溶氧控制30～50％，发酵8小时左右开始通氧，发酵过程控制pH7.0～7.2。补料速率在培养阶段控制在补料泵10％～40％，诱导阶段控制在补料泵20％～40％，放罐前半小时停止补料。发酵液于4℃、8000rpm离心20分钟收集菌体，用非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，显示有目的蛋白条带出现，主要目的蛋白的分子量约为31KD(图2)。

3)包涵体纯化和鉴定

将发酵产物菌体以5％(菌体：水重量体积比＝1:10)经预冷的均质机在4℃下均质破碎4轮后，8000rpm离心，将每一轮离心沉淀和上清分别进行非还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，结果表明表达的辐抗肽突变蛋白全部在沉淀中，说明表达的辐抗肽突变蛋白是以无活性的包涵体的形式存在的；同时结果还说明均质机处理第1-2轮时破碎效果较好(图3)。

将菌体破碎沉淀即粗制包涵体依次用20mM Tris-HCl(pH 6.8)、含0.5M NaCl的20mM Tris-HCl(pH 6.8)、20mM Tris-HCl(pH 6.8)以及含1M尿素的20mM Tris-HCl(pH6.8)的洗涤液洗涤，最后所得包涵体用含4M尿素的20mM Tris-HCl(pH 6.8)于4℃搅拌过夜。10000rpm离心30分钟，取离心上清加20mM Tris-HCl(pH 6.8)稀释至尿素终浓度为2M，并用0.45μm滤膜过滤除菌。

4)DEAE Fast Flow一柱粗纯化

将步骤3)所得的尿素蛋白溶液进行DEAE Fast Flow阴离子交换柱粗纯化。将上述尿素溶液的蛋白包涵体溶液上样于用10个柱体积2M尿素20mM Tris-HCl(pH 6.8)平衡后的DEAE Fast Flow阴离子交换层析柱(10cm x 23cm，1.8L)，流速6L/h。取步骤3)所得的尿素蛋白包涵体溶液上样，流速6L/h；上样结束后，用2M尿素20mM Tris-HCl(pH 6.8)平衡5个柱体积，再用20mM Tris-HCl(pH 6.8)平衡5个柱体积至基线平稳。以0.1M NaCl/20mM Tris-HCl(pH 6.8)洗脱，流速6L/h,收集各洗脱峰，还原型SDS-PAGE电泳检测目标蛋白洗脱情况(图4)。

5)DEAE Fast Flow二柱纯化

用10个柱体积20mM Tris-HCl(pH 6.8)溶液平衡另一新DEAE Fast Flow层析柱(10cm x 23cm，1.8L)至基线平稳，流速6L/h；将步骤4)中初纯化所得的目标峰洗脱液用注射用水稀释5倍(用1M Tris-HCI pH 6.8调节其电导与平衡液相同)后上样。上样结束后用20mM Tris-HCl(pH 6.8)平衡5个柱体积，至基线平稳，然后用10mM PB(磷酸缓冲液)pH 6.8继续5个柱体积平衡至基线平稳。以10mM PB，0.1M NaCl，pH6.8进行洗脱，流速6L/h；收集各洗脱峰，还原型SDS-PAGE电泳检测目标蛋白洗脱情况，目的蛋白主要出现在低盐洗脱组分中(图4)。

6)丁基疏水层析

用1.5M NaCl/10mM PB，pH＝6.8，Cd＝120ms/cm溶液柱平衡丁基疏水色谱柱(1.8L，10cm x 23cm)10个柱体积至基线平稳，流速6L/h；将步骤5)所得的洗脱蛋白溶液中加入固体NaCl，调节电导至120ms/cm后上样，流速6L/h；上样结束后用1.5MNaCl/10mM PB，pH＝6.8，Cd＝120ms/cm溶液平衡5个柱体积至基线平稳，然后用0.7MNaCl/10mM PB，pH＝6.8，Cd＝60ms/cm洗脱，流速6L/h；最后用注射用水洗脱。收集各洗脱峰，还原型SDS-PAGE电泳检测目标蛋白洗脱情况，目的蛋白主要出现在0.7MNaCl洗脱组分中(图5)。

7)超滤脱盐及产物检测

将步骤6)所得的蛋白洗脱溶液经10KD膜包脱盐后，获得辐抗肽突变蛋白原液溶液，应用HPLC法和银染法检测辐抗肽突变蛋白的纯度(图6和图7)。

对比例辐抗肽突变蛋白的制备与纯化方法

辐抗肽突变蛋白的制备与纯化方法与实施例1相似，区别之处在于，步骤6)中使用苯基疏水层析方法进行纯化，具体操作如下：

用1.5MNaCl/10mM PB，pH＝6.8，Cd＝120ms/cm溶液柱平衡苯基疏水色谱柱(1.8L，10cm x 23cm)10个柱体积至基线平稳，流速3L/h；将步骤5)所得的洗脱蛋白溶液中加入固体NaCl，调节电导至120ms/cm后上样，流速3L/h；上样结束后用1.5M NaCl/10mM PB，pH＝6.8，Cd＝120ms/cm溶液平衡5个柱体积至基线平稳，然后用0.7MNaCl/10mM PB，pH＝6.8，Cd＝60ms/cm洗脱，流速3L/h；最后用注射用水洗脱。收集各洗脱峰，还原型SDS-PAGE电泳检测目标蛋白洗脱情况(图8)，结果表明苯基疏水层析对于辐抗肽蛋白的纯化没有提高作用。

实施例2未突变辐抗肽蛋白CBLB502的制备与纯化方法

辐抗肽蛋白CBLB502的制备方法与实施例1相似，区别之处在于，在构建表达载体时，通过碱基合成方法体外合成辐抗肽蛋白CBLB502的cDNA，并将其连接到温度诱导性表达载体pBV-220中；随后将含有重组细菌鞭毛蛋白衍生多肽辐抗肽蛋白CBLB502载体的JM109工程菌按照步骤2)-步骤6)的条件进行发酵、表达和纯化，并进行电泳分析，结果显示本发明的方法同样适用于未突变辐抗肽蛋白的制备与纯化(图9)。

实施例3辐抗肽突变蛋白的生物学活性检定

选取对NF-kB刺激活性反应最佳的阳性克隆株接种96孔板，接种培养基为不含潮霉素B只含10％胎牛血清的DMEM，每孔细胞数为1×10⁴，总共8组，每组3个复孔。24小时后给予辐抗肽突变蛋白刺激，给药浓度分别为10^-12～10^-5g/ml，6小时后检测荧光素酶报告基因的数值(图10)。

实施例4辐抗肽突变蛋白的稳定性

将实施例1得到的辐抗肽突变蛋白和实施例2得到的未突变辐抗肽蛋白CBLB502在25℃条件下保存15天后，进行电泳检测蛋白纯度，结果显示辐抗肽突变蛋白稳定性高于辐抗肽蛋白(图11)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

河南新乡华星药厂河南师范大学

<120> 辐抗肽突变蛋白及其制备与纯化方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 918

<212> DNA

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 1

atggcacaag tcattaatac aaacagcctg tcgctgttga cccagaataa cctgaacaaa 60

tctcagtcct cactgagttc cgctattgag cgtctgtcct ctggtctgcg tatcaacagc 120

gcgaaagacg atgcggcagg ccaggcgatt gctaaccgct tcacttctaa tatcaaaggt 180

ctgactcagg cttcccgtaa cgctaacgac ggcatttcta ttgcgcagac cactgaaggt 240

gcgctgaatg aaatcaacaa caacctgcag cgtgtgcgtg agttgtctgt tcaggccact 300

aacgggacta actctgattc cgatctgaaa tctatccagg atgaaattca gcaacgtctg 360

gaagaaatcg atcgcgtttc taatcagact caatttaacg gtgttaaagt cctgtctcag 420

gacaaccaga tgaaaatcca ggttggtgct aacgatggtg aaaccattac catcgatctg 480

caaaaaattg atgtgaaaag ccttggcctt gatgggttca atgttaatat taaagaagct 540

gatggttcaa ttgcagctct tcattcagtt aatgatcttg acgtaacaaa attcgcagat 600

aatgcagcag atactgctga tatcggtttc gatgctagta ccgctaaccc actggcttca 660

attgattctg cattgtcaaa agtggacgca gttcgttctt ctctgggggc aattcaaaac 720

cgttttgatt cagccattac caaccttggc aatacggtaa ccaatctgaa ctccgcgcgt 780

agccgtatcg aagatgctga ctatgcaacg gaagtttcta atatgtctaa agcgcagatt 840

ctgcagcagg ctggtacttc cgttctggcg caggctaacc aggttccgca aaacgtcctc 900

tctttactgc gttaataa 918

<210> 2

<211> 304

<212> PRT

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn

1 5 10 15

Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ser Leu Ser Ser Ala Ile Glu Arg Leu

20 25 30

Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln

35 40 45

Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ser Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala

50 55 60

Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly

65 70 75 80

Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser

85 90 95

Val Gln Ala Thr Asn Gly Thr Asn Ser Asp Ser Asp Leu Lys Ser Ile

100 105 110

Gln Asp Glu Ile Gln Gln Arg Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Asn

115 120 125

Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Gln Met

130 135 140

Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asp Leu

145 150 155 160

Gln Lys Ile Asp Val Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn

165 170 175

Ile Lys Glu Ala Asp Gly Ser Ile Ala Ala Leu His Ser Val Asn Asp

180 185 190

Leu Asp Val Thr Lys Phe Ala Asp Asn Ala Ala Asp Thr Ala Asp Ile

195 200 205

Gly Phe Asp Ala Ser Thr Ala Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala

210 215 220

Leu Ser Lys Val Asp Ala Val Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn

225 230 235 240

Arg Phe Asp Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Thr Asn Leu

245 250 255

Asn Ser Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ala Asp Tyr Ala Thr Glu Val

260 265 270

Ser Asn Met Ser Lys Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val

275 280 285

Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg

290 295 300

Claims

1.一种辐抗肽或其突变蛋白的制备与纯化方法，其特征在于，该方法采用丁基疏水层析方法进行纯化，其中所述辐抗肽为辐抗肽蛋白CBLB502，所述突变蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的制备与纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)体外合成权利要求1所述辐抗肽或其突变蛋白的cDNA，将cDNA连接到pBV220载体中，从而构建表达载体；

2)将表达载体转化感受态大肠杆菌，构建基因表达工程菌，并诱导表达；

3)利用DEAE阴离子交换柱进行粗纯化；

4)使用DEAE阴离子交换柱进行二次纯化；

5)使用丁基疏水层析进行终纯化。

3.根据权利要求2所述的制备与纯化方法，其特征在于，丁基疏水层析是在丁基疏水色谱柱上进行的，上样速度为3L/h～6L/h；洗脱溶液为0.7MNaCl/10mM PB，流速为6L/h。

4.根据权利要求2所述的制备与纯化方法，其特征在于，所述cDNA的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。

5.一种辐抗肽突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成。

6.一种DNA序列，其特征在于，它编码权利要求5所述的辐抗肽突变蛋白。

7.根据权利要求6所述的DNA序列，其特征在于，它由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列组成。

8.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求7所述的DNA序列。

9.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求8所述的表达载体转化。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌JM109。