JP2023119563A - アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質の精製方法 - Google Patents

アデノ随伴ウイルス結合性タンパク質の精製方法 Download PDF

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Abstract

【課題】 試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を高純度、高効率かつ大量精製可能な方法を提供すること。【解決の手段】 ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に供した後、前記担体から溶出した画分を陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に供して精製することで、前記課題を解決する。【選択図】 図２

Description

本発明は、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス結合性タンパク質の精製方法に関する。特に本発明は、前記タンパク質の工業的な製造に適した精製方法に関する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）に分類される非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ外殻粒子は３種類のタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３）で構成されており、約６０のタンパク質分子がおよそＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３＝１：１：１０の比率で混在し集合することで、直径２０ｎｍから３０ｎｍの正二十面体の形状をしている。
ＡＡＶはヒトを含む広範な種の細胞に感染可能で、血球、筋、神経細胞などの分化を終えた非分裂細胞にも感染すること、ヒトに対する病原性がないため副作用の心配が低いこと、ウイルス粒子が物理化学的に安定であること、などから、先天性遺伝子疾患の治療を目的とした遺伝子導入用のベクターとしての利用価値が注目されている。
ＡＡＶを簡便かつ高純度に精製する方法として、不溶性担体と当該担体に固定化したＡＡＶ結合性タンパク質（ＡＡＶへの結合活性を有したタンパク質）とを含むＡＡＶ吸着剤を用いたアフィニティクロマトグラフィで精製する方法が知られている（特許文献１）。
前記方法でＡＡＶを大量精製するには、ＡＡＶ吸着剤のリガンドであるＡＡＶ結合性タンパク質を高純度かつ大量に製造する必要がある。ＡＡＶ結合性タンパク質がＡＡＶ受容体である場合の前記タンパク質の製造方法は特許文献１に開示されている。具体的には、ポリヒスチジンタグを付加したＡＡＶ受容体を発現可能な組換え大腸菌を培養することで、前記受容体を発現後、発現した前記受容体を含む培養液を金属キレートアフィニティクロマトグラフィを用いて精製することで、ＡＡＶ受容体を製造している。しかしながら精製工程で用いる、金属キレートアフィニティクロマトグラフィ用担体は高価なため大量精製には不向きであり、かつ前記担体に結合している金属イオンの溶出も否定できない。
ＷＯ２０２１／１０６８８２号
本発明の課題は、試料中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を高純度、高効率かつ大量精製可能な方法を提供することにある。
本発明者らは鋭意検討した結果、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィに供した後、陽イオン交換クロマトグラフィに供することで、前記タンパク質を高純度、高効率かつ大量に精製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下の発明を包含する：
［１］試料中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の精製方法であって、以下の（１）から（３）に示す工程を少なくとも含む、前記方法：
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し、当該担体に前記タンパク質を吸着させる工程、
（２）陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を第一の溶出液を用いて溶出させる工程、
（３）前記第一の溶出液で溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し、前記タンパク質を含む画分を回収する工程。
［２］第一の溶出液が、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含む緩衝液である、前記［１］に記載の方法。
［３］前記（３）の工程が、前記第一の溶出液で溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し、当該担体に前記タンパク質以外の不純物を吸着させるとともに当該担体に吸着しない前記タンパク質を含む画分を回収する工程を少なくとも含む、前記［１］または［２］に記載の方法。
［４］陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加する、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分のｐＨが２．２以上３．２以下である、前記［３］に記載の方法。
［５］陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加する、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の導電率が１ｍＳ／ｃｍ以上２５ｍＳ／ｃｍ以下である、前記［３］に記載の方法。
［６］前記（３）の工程が、前記第一の溶出液で溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し当該担体に前記タンパク質を吸着させる工程と、前記担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を第二の溶出液を用いて溶出させる工程とを少なくとも含む、前記［１］または［２］に記載の方法。
［７］第二の溶出液が、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグアニジノ基を有する化合物を含む緩衝液である、前記［６］に記載の方法。
［８］陰イオン交換クロマトグラフィ用担体および陽イオン交換クロマトグラフィ用担体が、それぞれカラムに充填した態様である、前記［１］から［７］のいずれかに記載の方法。
［９］ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、前記［１］から［８］のいずれかに記載の方法；
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
［１０］ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主を培養することで前記タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から発現されたＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程と、回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料から前記タンパク質を精製する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法であって、前記精製工程を前記［１］から［９］のいずれかに記載の方法で行なう、前記方法。
以下に、本発明について詳細に説明する。
本発明において、イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加する、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料の一例として、ＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換された宿主の培養液（後述する粗精製ＡＡＶ結合性タンパク質溶液を含む）や、前記培養液（後述する粗精製ＡＡＶ結合性タンパク質溶液を含む）をイオン交換クロマトグラフィ以外のクロマトグラフィを用いて精製して得られた溶液があげられる。
本明細書において、ＡＡＶ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現プラスミドにより形質転換する宿主として、ＣＯＳ細胞やＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ）細胞に代表される動物細胞、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に代表されるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌（ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌やパエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のような広義のバチルス属細菌も含む）、コリネ菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）に代表されるコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に代表される酵母、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）に代表される糸状菌が例示できる。中でも、取扱いが簡便かつ高密度に培養可能な大腸菌を前記宿主とすると好ましい。なお宿主が大腸菌の場合は、ＷＯ２０２１／１０６８８２号に開示した方法等により、形質転換体を培養することで前記タンパク質を発現することができるが、大腸菌が増殖してＡＡＶ結合性タンパク質を発現することができれば、特に発現ベクターや大腸菌の種類、培養方法に限定はない。
前記宿主の形質転換体の培養液から、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料となる、粗精製ＡＡＶ結合性タンパク質溶液を得るには、発現の形態によって適宜選択すればよい。例えば、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズムに発現する場合は、培養液を遠心分離して得られる宿主細胞を適切な緩衝液で懸濁し細胞溶解（物理的溶解、薬剤による化学的溶解など）後、遠心分離により細胞溶解残渣を除去することで、発現したタンパク質を含む溶解液を得ればよく、発現したタンパク質が宿主細胞のペリプラズムから培養上清に漏出する場合は、培養液を遠心分離して得られる培養上清から発現したタンパク質を回収すればよい。なお薬剤により宿主細胞を溶解する際は、例えば、特開２０１３－２５２０９９号公報に開示した方法や、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（メルク社製）等の市販の試薬を用いて細胞を溶解するとよい。
本発明の精製方法で用いる、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体は、不溶性担体と当該担体に固定化した陰イオン交換基とを含む担体であれば特に限定はない。陰イオン交換基の一例として、タンパク質精製の分野で通常用いられる、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、四級アンモニウム（Ｑ）基、一級アミノ基があげられる。またＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＤＥＡＥ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＱＡＥ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＮＨ２－７５０（以上、東ソー社製）、Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（サイティバ社製）といった市販の陰イオン交換クロマトグラフィ用担体をそのまま用いてもよい。
本発明の精製方法で用いる、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体も、不溶性担体と当該担体に固定化した陽イオン交換基とを含む担体であれば特に限定はない。陽イオン交換基の一例として、タンパク質精製の分野で通常用いられる、カルボキシメチル（ＣＭ）基、スルホプロピル（ＳＰ）基、スルホ基があげられる。またＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳＰ－６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＧｉｇａＣａｐ Ｓ－６５０（以上、東ソー社製）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（サイティバ社製）といった市販の陽イオン交換クロマトグラフィ用担体をそのまま用いてもよい。
なお本明細書の精製方法で用いる、イオン交換クロマトグラフィ用担体の基材である不溶性担体は、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料や精製に用いる溶液（溶出液、平衡化液、洗浄液など）に対して不溶性であれば特に限定はなく、一例として、アガロース、アルギネート（アルギン酸塩）、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖質を原料とした担体や、ポリビニルアルコール、ポリメタクレート、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子を原料とした担体や、シリカ等のセラミックスを原料とした担体があげられる。
本発明の精製方法は、以下の（１）から（３）に示す工程を少なくとも含む方法で、実施する：
（１）ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し、当該担体に前記タンパク質を吸着させる工程（以下、「陰イオン交換クロマト吸着工程」とも表記）、
（２）陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を溶出液を用いて溶出させる工程（以下、「陰イオン交換クロマト溶出工程」とも表記）、
（３）前記第一の溶出液で溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し、前記タンパク質を含む画分を回収する工程（以下、「陽イオン交換クロマト精製工程」とも表記）。
なお陰イオン交換クロマトグラフィ用担体および陽イオン交換クロマトグラフィ用担体を、それぞれ適切なオープンカラム等に充填した態様（以下、それぞれ「陰イオン交換カ
ラム」および「陽イオン交換カラム」とも表記）とすると、本発明の精製方法を簡便に行
なえる点で好ましい。以下、陰イオン交換カラムおよび陽イオン交換カラムを用いた態様
を例に、前記（１）から（３）の工程を詳細に説明する。
（１）陰イオン交換クロマト吸着工程
本工程では、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を陰イオン交換カラムに添加（アプライ）し、当該カラムに充填した陰イオン交換クロマトグラフィ用担体にＡＡＶ結合性タンパク質を吸着させる工程である。前記カラムにおける前記担体の充填量は、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料（アプライ液）の添加量や前記担体のタンパク吸着性能等に基づき、決定すればよい。なお前記試料を陰イオン交換カラムにアプライする前に、前記カラムをあらかじめ、塩を含む適切な緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（トリス塩酸）緩衝液、グリシン－ＮａＯＨ緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等）で平衡化するとよい。
（２）陰イオン交換クロマト溶出工程
本工程では、（１）で陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を、溶出液を用いて溶出させる工程である。なお本工程前に、洗浄液を陰イオン交換カラムに添加し、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着しない夾雑タンパク質（不純物）を除去するとよい。洗浄液の一例として、１１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含むｐＨ６．５以上８．５以下の緩衝液があげられる。本工程で用いる溶出液は、担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を、当該タンパク質が有するＡＡＶへの結合能を維持したまま溶出可能な、塩を含む緩衝液であればよい。なお溶出液に添加する塩を塩化ナトリウムとする場合、濃度を１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下とすると好ましく、１４０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２８０ｍｍｏｌ／Ｌ以下とするとより好ましく、１９０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２６０ｍｍｏｌ／Ｌ以下とするとさらにより好ましい。溶出液のｐＨは６．５以上８．５以下にすると好ましい。
（３）陽イオン交換クロマト精製工程
本工程は、前記（１）および（２）の工程を含む陰イオン交換クロマトグラフィによる精製で得られたＡＡＶ結合性タンパク質の純度をさらに高めるために実施する工程であり、具体的には、前記（２）の工程で、陰イオン交換カラムから溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換カラムに添加し、前記タンパク質を含む画分を回収する工程である。前記カラムにおける陽イオン交換クロマトグラフィ用担体の充填量は、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分（アプライ液）の添加量、ｐＨおよび導電率（例えば、塩化ナトリウムなどの塩濃度）や前記担体のタンパク吸着性能等に基づき、決定すればよい。また前記試料をアプライする前に、陽イオン交換カラムをあらかじめ、前記アプライ液と同じｐＨおよび導電率の緩衝液（平衡化液）で平衡化するとよい。
陽イオン交換カラムからの、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の回収方法の一態様として、
（３－１）陰イオン交換カラムから溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換カラムに添加し、当該カラムに充填した陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に前記タンパク質を吸着させる工程と、
（３－２）前記担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を溶出液を用いて溶出させる工程と、を含む方法があげられる。
なお前記（３－２）の工程前に、平衡化液を用いて陽イオン交換カラムを洗浄し、前記担体に吸着しない夾雑タンパク質を除去するとよい。溶出液の例として、
（Ａ）１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含むｐＨ３．０以上５．０以下の緩衝液や、
（Ｂ）１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグアニジノ基を有する化合物を含むｐＨ３．０以上５．０以下の緩衝液、
があげられる。中でも、前記（Ｂ）の緩衝液を溶出液とすると、高純度なＡＡＶ結合性タンパク質を高い回収率で回収できるため好ましい。なお、前記（Ｂ）の緩衝液を溶出液とする場合、濃度を１５０ｍｍｏｌ／Ｌ以上４００ｍｍｏｌ／Ｌ以下とすると好ましく、１６０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下とするとより好ましく、１９０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下とするとさらにより好ましい。グアニジノ基を有する化合物の例として、グアニジン、アルギニンおよびそれらの塩があげられる。平衡化液は、溶出液の成分に対応した緩衝液を用いればよく、具体的には、
前記（Ａ）の緩衝液を溶出液とする場合は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含むｐＨ３．０以上５．０以下の緩衝液とすればよく、
前記（Ｂ）の緩衝液を溶出液とする場合は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグアニジノ基を有する化合物を含むｐＨ３．０以上５．０以下の緩衝液とすればよい。
また陽イオン交換カラムからの、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の回収方法の別の態様として、
（３－３）陰イオン交換カラムから溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換カラムに添加し、当該カラムに充填した陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に前記タンパク質以外の不純物（夾雑タンパク質）を吸着させるとともに、当該担体に吸着しないＡＡＶ結合性タンパク質を前記カラムからの素通り画分として回収する工程、を含む方法があげられる。
当該別の態様は、陽イオン交換カラムから素通りした画分を回収するのみでＡＡＶ結合性タンパク質以外の夾雑タンパク質（不純物）を除去できる。そのため、特に大量のＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料から当該タンパク質を精製する場合、好ましい方法といえる。
前記（３－３）の工程において、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分のｐＨを２．２以上３．２以下にすると好ましく、２．４以上３．０以下にするとさらに好ましく、２．６以上３．０以下にするとさらにより好ましい。またＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の導電率を１ｍＳ／ｃｍ以上２５ｍＳ／ｃｍ以下にすると好ましく、１ｍＳ／ｃｍ以上１１ｍＳ／ｃｍ以下にするとより好ましく、４ｍＳ／ｃｍ以上１０ｍＳ／ｃｍ以下にするとさらにより好ましい。さらにＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分が、前述した好ましいｐＨ範囲と前述した好ましい導電率範囲とを両方満たすと好ましい。
なお前記（３－３）の工程後に、平衡化液を用いて陽イオン交換カラムを洗浄し、前記担体に夾雑タンパク質（不純物）を吸着させて除去するとともに、カラム内に残存したＡＡＶ結合性タンパク質を押し出して回収するとよい。前記洗浄に用いる平衡化液の例として、前述したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の好ましいｐＨおよび／または好ましい導電率の緩衝液があげられる。
本発明での精製対象タンパク質である、ＡＡＶ結合性タンパク質は、ＡＡＶと結合可能なポリペプチドであれば特に制限はなく、インテグリンなどのラミニン受容体、抗ＡＡＶ抗体やＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）が例示できる。
ＡＡＶ結合性タンパク質がＡＡＶＲである場合の好ましい態様として、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドがあげられる：
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
（ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
なお配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ＡＡＶＲの一態様であるＫＩＡＡ０３１９Ｌ（公式データベース：ＵｎｉＰｒｏｔ、アクセッションナンバー：Ｑ８ＩＺＡ０）のアミノ酸配列であり、配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリン（Ｓｅｒ）から５００番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までのアミノ酸残基は、ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外領域ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）に相当する領域である。
前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに示すポリペプチドは、前述したＫＩＡＡ０３１９ＬのＰＫＤ１およびＰＫＤ２に相当する領域を少なくとも含んでいればよく、例えば、ＰＫＤ２のＣ末端側にある他の細胞外領域ドメイン（ドメイン３（ＰＫＤ３）、ドメイン４（ＰＫＤ４）およびドメイン５（ＰＫＤ５））に相当する領域の全てまたは一部を含んでもよいし、ＰＫＤ１のＮ末端側にあるＭＡＮＳＣ（Ｍｏｔｉｆ Ａｔ Ｎ ｔｅｒｍｉｎｕｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｖｅｎ Ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ）ドメインなどのシグナル配列に相当する領域やシステインリッチな領域の全てまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＮ末端側および／またはＣ末端側にある膜貫通領域ならびに細胞内領域の全てまたは一部を含んでもよい。
前記（ｉｉ）の一例として、配列番号２、４または６に記載のアミノ酸配列のうち２５番目のセリンから２１３番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチドや、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のＡＡＶ結合性タンパク質、があげられる。また前記（ｉｉ）に記載の置換、欠失、挿入、または付加の例として、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示しているアミノ酸残基の置換があげられる。
前記（ｉｉ）における、「１もしくは数個」とは、ＡＡＶＲの立体構造におけるアミノ酸置換の位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、一例として、１個以上５０個以下、１個以上３０個以下、１個以上２０個以下、１個以上１０個以下、１個以上９個以下、１個以上８個以下、１個以上７個以下、１個以上６個以下、１個以上５個以下、１個以上４個以下、１個以上３個以下、１個以上２個以下、１個のいずれかを意味する。「１もしくは数個」のアミノ酸残基の置換は、例えば、ＡＡＶ結合活性を有する限り、ＷＯ２０２１／１０６８８２号で開示のアミノ酸残基の置換以外の位置に生じてよい。
なお前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換」には、前述した特定位置におけるアミノ酸置換の他に、物理的性質および／または化学的性質が類似したアミノ酸間で置換が生じる保守的置換が生じてもよい。保守的置換は、一般に、置換が生じているものと置換が生じていないものとの間でタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン間、セリンとプロリン間、またはグルタミン酸とアラニン間での置換があげられる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社、９、２００５）。また前記（ｉｉ）における「１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加」には、ＡＡＶＲの由来の違いや、種の違いなどに基づく、天然にも存在する変異（ｍｕｔａｎｔまたはｖａｒｉａｎｔ）も含まれる。
前記（ｉｉｉ）におけるアミノ酸配列の相同性は７０％以上あればよく、それ以上の相同性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上）を有してもよい。なお本明細書において「相同性」とは、類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）または同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味してよく、特に同一性を意味してもよい。「アミノ酸配列の相同性」とは、アミノ酸配列全体に対する相同性を意味する。アミノ酸配列間の「同一性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列間の「類似性」とは、それらアミノ酸配列における種類が同一であるアミノ酸残基の比率と側鎖の性質が類似したアミノ酸残基の比率の合計を意味する（実験医学、３１（３）、羊土社）。アミノ酸配列の相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）やＦＡＳＴＡ等のアラインメントプログラム（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍ）を利用して決定できる。
本発明は、試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に供した後、前記担体から溶出した画分を陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に供して精製することを特徴としており、前記タンパク質を高純度、高効率かつ大量に精製できる。また本発明の精製方法は、食品や医薬品分野で汎用されているイオン交換クロマトグラフィを利用しているため、精製した前記タンパク質の安全性の点でも好ましい方法である。
また本発明の精製方法を、ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主を培養することで前記タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から発現されたＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程と、回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料から前記タンパク質を精製する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法における精製工程に採用することで、高純度な前記タンパク質を工業的に大量製造できる。
試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を、陰イオン交換カラムを用いて回収した結果を示した図である。溶出液として、（ａ）は２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを、（ｂ）は１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを、（ｃ）は１８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを、それぞれ含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた結果である。また黒三角で示す溶出ピークが、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークである。 ＡＡＶ結合性タンパク質を含む溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。レーン１は分子量マーカーの、レーン２は陰イオン交換カラムから２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で溶出した画分（実施例２（３）（ａ））の、レーン３は陽イオン交換カラムから３００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－アルギニンを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で溶出した画分（実施例３（４）（ｄ））の、それぞれ結果である。 陰イオン交換カラムから溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、陽イオン交換カラムを用いて回収した結果を示した図である。溶出液として、（ａ）は２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを、（ｂ）は２５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを、（ｃ）は２００ｍｍｏｌ／Ｌグアニジンを、（ｄ）は３００ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－アルギニンを、それぞれ含む酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を用いた結果である。また黒三角で示す溶出ピークが、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークである。 試料中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を、陰イオン交換カラムを用いて回収した結果を示した図である。溶出液として、（ａ）は１２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを、（ｂ）は１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを、（ｃ）は２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを、（ｄ）は２５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを、それぞれ含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた結果である。また黒三角で示す溶出ピークが、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークである。 試料中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を大量精製した結果（クロマトグラム）を示した図である。（Ａ）は試料中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を、容量１００ｍＬの陰イオン交換カラムを用いて回収した結果（実施例６）を示した図であり、（Ｂ）は前記（Ａ）の陰イオン交換カラムから溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、容量４０ｍＬの陽イオン交換カラムを用いて回収した結果（実施例９）を示した図である。また黒三角で示す溶出ピークが、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークである。 試料中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を大量精製した結果（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示した図である。レーン１は陰イオン交換カラムから溶出した画分（実施例６、図５（Ａ）の黒三角で示した溶出ピーク）の、レーン２は陽イオン交換カラムから素通りした画分（実施例９、図５（Ｂ）の黒三角で示した溶出ピーク）の、それぞれ結果である。 陰イオン交換カラムから溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、陽イオン交換カラムを用いて回収した結果を示した図である。前記画分および平衡化液のｐＨを、（ａ）はｐＨ２．４に、（ｂ）はｐＨ２．６に、（ｃ）はｐＨ２．７に、（ｄ）はｐＨ２．８に、（ｅ）はｐＨ３．０に、それぞれ調整したときの結果である。また黒三角で示す溶出ピークが、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークである。 ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。レーン１は分子量マーカーの結果であり、レーン２は陰イオン交換カラムから溶出した画分（実施例６）の結果である。レーン３からレーン６は陽イオン交換カラムから素通りした画分の結果であり、陽イオン交換カラムに添加したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分および平衡化液のｐＨを、レーン３はｐＨ２．４（実施例７（ａ）、図７（ａ）の黒三角で示した溶出ピーク）に、レーン４はｐＨ２．６（実施例７（ｂ）、図７（ｂ）の黒三角で示した溶出ピーク）に、レーン５はｐＨ２．８（実施例７（ｄ）、図７（ｄ）の黒三角で示した溶出ピーク）に、レーン６はｐＨ３．０（実施例７（ｅ）、図７（ｅ）の黒三角で示した溶出ピーク）に、それぞれ調整したときの結果である。 陰イオン交換カラムから溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、陽イオン交換カラムを用いて回収した結果を示した図である。前記画分および平衡化液に含ませる塩化ナトリウムの濃度を、（ａ）は１０ｍｍｏｌ／Ｌ（導電率５ｍＳ／ｃｍ）に、（ｂ）は２０ｍｍｏｌ／Ｌ（導電率６ｍＳ／ｃｍ）に、（ｃ）は３０ｍｍｏｌ／Ｌ（導電率７ｍＳ／ｃｍ）に、（ｄ）は５０ｍｍｏｌ／Ｌ（導電率９ｍＳ／ｃｍ）に、（ｅ）は１００ｍｍｏｌ／Ｌ（導電率１４ｍＳ／ｃｍ）に、それぞれしたときの結果である。また黒三角で示す溶出ピークが、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークである。 ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。レーン１は分子量マーカーの結果であり、レーン２は陰イオン交換カラムから溶出した画分（実施例６）の結果である。レーン３からレーン６は陽イオン交換カラムから素通りした画分の結果であり、陽イオン交換カラムに添加したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分および平衡化液に含ませる塩化ナトリウムの濃度を、レーン３は１０ｍｍｏｌ／Ｌ（導電率５ｍＳ／ｃｍ）（実施例８（ａ）、図９（ａ）の黒三角で示した溶出ピーク）に、レーン４は２０ｍＭ塩化ナトリウム（導電率６ｍＳ／ｃｍ）（実施例８（ｂ）、図９（ｂ）の黒三角で示した溶出ピーク）に、レーン５は３０ｍＭ塩化ナトリウム（導電率７ｍＳ／ｃｍ）（実施例８（ｃ）、図９（ｃ）の黒三角で示した溶出ピーク）に、レーン６は５０ｍＭ塩化ナトリウム（導電率９ｍＳ／ｃｍ）（実施例８（ｄ）、図９（ｄ）の黒三角で示した溶出ピーク）に、レーン７は１００ｍＭ塩化ナトリウム（導電率１４ｍＳ／ｃｍ）（実施例８（ｅ）、図９（ｅ）の黒三角で示した溶出ピーク）に、それぞれしたときの結果である。 試料中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を精製した結果（クロマトグラム）を示した図である。（Ａ）は試料中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を、陰イオン交換カラムを用いて回収した結果（実施例１１（２））を示した図であり、（Ｂ）は陰イオン交換カラムから溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、陽イオン交換カラムを用いて回収した結果（実施例１１（５）および（６））を示した図である。また黒三角で示す溶出ピークが、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークである。 試料中に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質を精製した結果（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を示した図である。レーン１は分子量マーカーの、レーン２は陰イオン交換カラムから溶出した画分（実施例１１（２））の、レーン３は陽イオン交換カラムから素通りした画分（実施例１１（５）および（６））の、それぞれ結果である。 実施例に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を含むポリペプチドのアミノ酸配列を示した図である。 実施例に記載のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を示した図である。
以下、実施例および比較例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら例に限定されるものではない。なお、本実施例で使用したアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を含むポリペプチドのアミノ酸配列を図１に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を図２にそれぞれ示す。
実施例１ アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質を含む試料の調製
本発明の精製方法で精製する、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を、以下に示す方法で調製した。
（１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ８ｇを含むポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を含むプラスミドｐＴｒｃＡＶＲ８ｇ－ＣＲＮＤＴＣＧ－Ｖ１で大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、得られたＡＶＲ８ｇを発現可能な形質転換体を、２５０ｍＬバッフル付きフラスコに入れた５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２×ＹＴ（１．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．６％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）塩化ナトリウム）液体培地５０ｍＬに接種後、３７℃で一晩振とう培養することで前培養液を調製した。なお配列番号２において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ８ｇであり、２２０番目のシステイン（Ｃｙｓ）から２２６番目のグリシン（Ｇｌｙ）までが不溶性担体への固定化用タグであるシステインタグ配列である。またＡＶＲ８ｇは、ＡＡＶ受容体ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）（配列番号１の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基）に対して、以下の（Ｉ）から（ＶＩＩＩ）に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
（Ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号２では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
（ＩＩ）配列番号１の３４２番目（配列番号２では５５番目）のチロシンがシステインに置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３６２番目（配列番号２では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＩＶ）配列番号１の３７１番目（配列番号２では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
（Ｖ）配列番号１の３９０番目（配列番号２では１０３番目）のグリシンがセリンに置換（ＶＩ）配列番号１の３９９番目（配列番号２では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＶＩＩ）配列番号１の４７６番目（配列番号２では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の４８７番目（配列番号２では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２）オートクレーブ滅菌済の本培養培地（４．０％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．３％（ｗ／ｖ）リン酸三ナトリウム・十二水和物、０．９％（ｗ／ｖ）リン酸水素二ナトリウム・十二水和物、０．２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物、０．２％（ｗ／ｖ）塩化アンモニウム、１．０％（ｗ／ｖ）グルコース、１０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、５ｍｇ／Ｌ塩化マンガン・四水和物、５０μｇ／ｍＬカナマイシン）１．２Ｌが入った３Ｌ容量の培養槽に、（１）の前培養液３６ｍＬを添加し、温度３０℃、撹拌数４００ｒｐｍ、ｐＨ６．９から７．１、通気量（空気）１．５Ｌ／分、溶存酸素濃度が飽和濃度の約３０％になるよう、撹拌回転数（最大７００ｒｐｍ）を自動制御する条件で本培養を開始した。なお、培地中のグルコースが消費され枯渇した時点で流加培地（４２．５％（ｗ／ｖ）グルコース、１４．２％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１．２％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・七水和物）をＤＯスタット法で添加した。
（３）本培養開始から１７時間後に０．５ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ（ＩｓｏＰｒｏｐｙｌ β－Ｄ－１－ＴｈｉｏＧａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を１．５ｍＬ添加し、温度２５℃に、撹拌数を６００ｒｐｍに変更して、さらに４６時間培養を行なった。得られた培養液を遠心分離し、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む大腸菌の菌体を回収した。
（４）（３）で回収した菌体１ｇ（湿重量）に対して、抽出液（１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２ｍｍｏｌ／Ｌ硫酸マグネシウム、２５０ｕｎｉｔｓ／Ｌ Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（メルク社製）、０．００５％（ｗ／ｖ）リゾチーム、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（商品名）を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０））を５ｍＬ加えることで、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。
（５）菌体抽出液を遠心分離し、上清を回収後、０．２μｍのフィルターでろ過することで、ＡＡＶ結合性タンパク質抽出液を得、これをＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料とした。
実施例２ 陰イオン交換カラムを用いたＡＡＶ結合性タンパク質の精製（溶出液中の塩濃度の検討、その１）
（１）１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、「平衡化液Ａ」とも表記）であらかじめ平衡化した、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、東ソー社製）を充填した陰イオン交換カラム（容量２ｍＬ）に、実施例１で得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料（５ｍＬ）を、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、前記担体にＡＡＶ結合性タンパク質を吸着させた。
（２）平衡化液Ａ１２ｍＬを用いて、陰イオン交換カラム内の不純物を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（３）（ａ）２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、（ｂ）１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、および（ｃ）１８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムのいずれかを含む、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）１２ｍＬを用いて、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を溶出させ、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した。
（４）１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下、「洗浄液Ａ」とも表記）９ｍＬを用いて、陰イオン交換カラム内に残存したタンパク質を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（５）（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分のうち、（ａ）の緩衝液で溶出した画分を、サイズ排除クロマトグラフィ（使用カラム：ＴＳＫＧｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ、東ソー社製）およびＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳ－ポリアクリルアミド電気泳動）に供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を確認した。
ＡＡＶ結合性タンパク質の回収結果（２８０ｎｍの吸光度変化に基づくクロマトパターン）を図１に示す。また当該クロマトパターン（図１）のうち、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピーク（図１の黒三角で示した溶出ピーク）の面積および高さを算出した結果を表１に示す。（３）の工程で、ＡＡＶ結合性タンパク質の溶出に用いた緩衝液（溶出液）は、いずれもＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークを確認できた。以上の結果から、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２５０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含む緩衝液を溶出液として用いることで、ＡＡＶ結合性タンパク質を陰イオン交換カラムで精製できることがわかる。中でも（ａ）の溶出液（２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））で溶出させたときが、最も多くのＡＡＶ結合性タンパク質を回収していたことから、１９０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含む緩衝液を溶出液として用いることで、陰イオン交換カラムでのＡＡＶ結合性タンパク質の精製を高回収率に行なえることがわかる。
なお（ａ）の溶出液での溶出画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質は４６．６％であった（表１）。当該画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図２のレーン２に示す。
実施例３ 陽イオン交換カラムを用いたＡＡＶ結合性タンパク質の精製（吸着／溶出で精製）
（１）実施例２（３）のうち（ａ）の緩衝液（溶出液）を用いて陰イオン交換カラムから溶出した、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、精製条件（精製条件（ａ）から（ｄ））毎に、あらかじめ表２に示す化合物を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）（平衡化液Ｂ）で置換した脱塩カラム（ＰＤ－１０カラム、サイティバ社製）を用いて、平衡化液Ｂに置換した。
（２）平衡化液Ｂであらかじめ平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ－６５０Ｍ、東ソー社製）を充填した陽イオン交換カラム（容量１ｍＬ）に、（１）で脱塩処理したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分２ｍＬを、流速０．２５ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、前記担体にＡＡＶ結合性タンパク質を吸着させた。
（３）平衡化液Ｂ６ｍＬを用いて、陽イオン交換カラム内の不純物を洗い流す、洗浄工
程を実施した。
（４）精製条件（精製条件（ａ）から（ｄ））毎に、表２に示す化合物を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）（溶出液）１２ｍＬを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を溶出させ、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した（約４ｍＬ）。
（５）５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）３ｍＬを用いて、陽イオン交換カラム内に残存したタンパク質を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（６）（４）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、サイズ排除クロマトグラフィ（使用カラム：ＴＳＫＧｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ、東ソー社製）に供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を測定した。また前記画分のうち、精製条件（ｄ）の溶出液で溶出した画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度確認も行なった。
ＡＡＶ結合性タンパク質の回収結果（２８０ｎｍの吸光度変化に基づくクロマトパターン）を図３に示す。また（４）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の液量、当該画分中に含まれるタンパク質濃度、前記液量および前記タンパク質濃度から算出したタンパク質量、（６）のサイズ排除クロマトグラフィで測定した前記画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の純度、ならびに前記タンパク質量および前記純度から算出したＡＡＶ結合性タンパク質の回収量をまとめた結果を表３に示す。
陽イオン交換カラムから溶出した、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分における、前記タンパク質の純度は８３％から８８％と、陰イオン交換カラムから溶出した前記タンパク質を含む画分（４６．６％、実施例２、表１）よりも純度が向上した。以上の結果から、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を、陰イオン交換カラムに供した後、陽イオン交換カラムに供して精製することで、高純度なＡＡＶ結合性タンパク質が得られることがわかる。
なお本実施例で検討した精製条件のうち、（ｃ）の条件が最もＡＡＶ結合性タンパク質の純度が高く、（ｄ）の条件が最も多くのＡＡＶ結合性タンパク質を回収していた。以上の結果から、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグアニジノ基を有する化合物を含む緩衝液を溶出液として用いることで、ＡＡＶ結合性タンパク質を高純度または高回収率で精製できることがわかる。
（ｄ）の溶出液での溶出画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図２のレーン３に示す。図２のレーン２（陰イオン交換カラムによる精製のみ）とレーン３（陰イオン交換カラムによる精製後、陽イオン交換カラムで精製）との比較からも、陰イオン交換カラムによる精製後陽イオン交換カラムで精製することでＡＡＶ結合性タンパク質を高純度に精製できることがわかる。
実施例４ ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料の調製（その２）
（１）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を含むプラスミドｐＴｒｃＡＶＲ１１ａ－ＣＲＮＤＴＣＧ－Ｖ１で大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、得られたＡＶＲ１１ａを発現可能な形質転換体を、実施例１に記載の方法と同様の方法で培養することで前培養液を調製した。なお配列番号４において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ１１ａであり、２１４番目のシステイン（Ｃｙｓ）から２２０番目のグリシン（Ｇｌｙ）までが不溶性担体への固定化用タグであるシステインタグ配列である。またＡＶＲ１１ａは、ＡＡＶ受容体ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）（配列番号１の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基）に対して、以下の（Ｉ）および（ＩＩＩ）から（ＸＩＩ）に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
（Ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号４では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３６２番目（配列番号４では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＩＶ）配列番号１の３７１番目（配列番号４では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
（Ｖ）配列番号１の３９０番目（配列番号４では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
（ＶＩ）配列番号１の３９９番目（配列番号４では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＶＩＩ）配列番号１の４７６番目（配列番号４では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の４８７番目（配列番号４では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（ＩＸ）配列番号１の３３０番目（配列番号４では４３番目）のアラニンがバリンに置換
（Ｘ）配列番号１の３４２番目（配列番号４では５５番目）のチロシンがセリンに置換
（ＸＩ）配列番号１の３８１番目（配列番号４では９４番目）のバリンがアラニンに置換
（ＸＩＩ）配列番号１の３８２番目（配列番号４では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
（２）実施例１（２）に記載の方法と同様の方法で、３Ｌ容量の培養槽を用いて本培養を開始し、流加培養を行なった。
（３）実施例１（３）に記載の方法と同様の方法で、ＩＰＴＧによる発現誘導を行なった。得られた培養液は遠心分離後、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む大腸菌の菌体を回収した。
（４）実施例１（４）に記載の方法と同様の方法で、（３）で回収した菌体から、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。
（５）菌体抽出液を遠心分離し、上清を回収後、０．２μｍのフィルターでろ過することで、ＡＡＶ結合性タンパク質抽出液を得、これをＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料とした。
実施例５ 陰イオン交換カラムを用いたＡＡＶ結合性タンパク質の精製（溶出液中の塩濃度の検討、その２）
実施例２では、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質の溶出液として１５０ｍｍｏｌ／Ｌから２００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いて検討したが、本実施例では塩化ナトリウムの濃度範囲を広げて検討した。
（１）平衡化液Ａであらかじめ平衡化した、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｍ、東ソー社製）を充填した陰イオン交換カラム（容量５ｍＬ）に、実施例４に記載の方法で得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料（５ｍＬ）を、流速１．２５ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、前記担体にＡＡＶ結合性タンパク質を吸着させた。
（２）平衡化液Ａ３０ｍＬを用いて、陰イオン交換カラム内の不純物を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（３）（ａ）１２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、（ｂ）１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、（ｃ）２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、および（ｄ）２５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムのいずれかを含む、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５ｍＬを用いて、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を溶出させ、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した。
（４）洗浄液Ａ２５ｍＬを用いて、陰イオン交換カラム内に残存したタンパク質を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（５）（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、サイズ排除クロマトグラフィ（使用カラム：ＴＳＫＧｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ、東ソー社製）に供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を確認した。
ＡＡＶ結合性タンパク質の回収結果（２８０ｎｍの吸光度変化に基づくクロマトパターン）を図４に示す。また（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分（図４の黒三角で示した溶出ピーク）の液量、当該画分中に含まれるタンパク質濃度、前記液量および前記タンパク質濃度から算出したタンパク質量、（５）のサイズ排除クロマトグラフィで測定した前記画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の純度、ならびに前記タンパク質量および前記純度から算出したＡＡＶ結合性タンパク質の回収量をまとめた結果を表４に示す。
（３）の工程で、ＡＡＶ結合性タンパク質の溶出に用いた緩衝液（溶出液）は、いずれもＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークを確認できた。以上の結果から、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含む緩衝液を溶出液として用いることで、ＡＡＶ結合性タンパク質を陰イオン交換カラムで精製できることがわかる。中でも（ｃ）または（ｄ）の溶出液（２００ｍｍｏｌ／Ｌまたは２５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含むトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５））で溶出させたときが、最も多くのＡＡＶ結合性タンパク質を回収していたことから、１９０ｍｍｏｌ／Ｌ以上２６０ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含む緩衝液を溶出液として用いることで、陰イオン交換カラムでのＡＡＶ結合性タンパク質の精製を高回収率に行なえることがわかる。
実施例６ 陰イオン交換カラムを用いたＡＡＶ結合性タンパク質の精製（カラムサイズのスケールアップ）
実施例２および実施例５で最適化した精製条件が、カラムサイズをスケールアップしても（すなわち大量精製においても）適用可能か、検討した。
（１）平衡化液Ａであらかじめ平衡化した、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＳｕｐｅｒＱ－６５０Ｓ、東ソー社製）を充填した陰イオン交換カラム（容量１００ｍＬ）に、実施例４に記載の方法で得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料（１００ｍＬ）を、流速２０ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、前記担体にＡＡＶ結合性タンパク質を吸着させた。
（２）平衡化液Ａ６００ｍＬを用いて、陰イオン交換カラム内の不純物を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（３）２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）５００ｍＬを用いて、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を溶出させ、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した。
（４）洗浄液Ａ４００ｍＬを用いて、陰イオン交換カラム内に残存したタンパク質を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（５）（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、実施例３（６）と同様な方法でサイズ排除クロマトグラフィおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を確認した。
ＡＡＶ結合性タンパク質の回収結果（２８０ｎｍの吸光度変化に基づくクロマトパターン）を図５（Ａ）に示す。また（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の液量、当該画分中に含まれるタンパク質濃度、前記液量および前記タンパク質濃度から算出したタンパク質量、（５）のサイズ排除クロマトグラフィで測定した前記画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の純度、ならびに前記タンパク質量および前記純度から算出したＡＡＶ結合性タンパク質の回収量をまとめた結果を表５に示す。
図５（Ａ）より、（３）の工程で、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当する溶出ピークが得られることを確認できた。以上の結果から、実施例５で明らかとなった精製条件（陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いて溶出）が、容量１００ｍＬの陰イオン交換カラムに対しても適用可能なことがわかる。
なお（３）で回収した溶出画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質（サイズ排除クロマトグラフィによるＡＡＶ結合性タンパク質の純度）は４６．３％であった（表５）。当該画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図６のレーン１に示す。
実施例７ 陽イオン交換カラムを用いたＡＡＶ結合性タンパク質の精製（素通し精製、最適ｐＨの検討）
実施例３では陽イオン交換カラムを用いたＡＡＶ結合性タンパク質の精製を、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体への吸着／溶出（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）で行なったが、本実施例では陽イオン交換カラムの素通し（Ｆｌｏｗ ｔｈｒｏｕｇｈ）で行なった。
（１）実施例６に記載の方法で陰イオン交換カラムから溶出した、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分（以下、単に「添加試料」とも表記）を透析膜（分画分子量約１２０００から１４０００）に入れ、当該添加試料溶液量の１００倍量以上の２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（以下、「平衡化液Ｃ」とも表記）を用いて透析処理後、（ａ）ｐＨ２．４、（ｂ）ｐＨ２．６、（ｃ）ｐＨ２．７、（ｄ）ｐＨ２．８、および（ｅ）ｐＨ３．０のいずれかに調整した平衡化液Ｃに溶媒置換した。
（２）（１）の溶媒置換で用いた平衡化液Ｃであらかじめ平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ－６５０Ｍ、東ソー社製）を充填した陽イオン交換カラム（容量５ｍＬ）に、（１）で透析処理および溶媒置換したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分（添加試料）８．５ｍＬをそれぞれ、流速１．２５ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、前記担体にＡＡＶ結合性タンパク質以外の不純物（夾雑タンパク質）を吸着させると同時に、前記担体に吸着せずに素通りしたＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した。
（３）（１）の溶媒置換で用いた平衡化液Ｃ２５ｍＬを陽イオン交換カラムにアプライし、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着しないＡＡＶ結合性タンパク質を洗い流して回収する、押出工程を実施した。
（４）（１）の溶媒置換で用いた平衡化液Ｃと同じｐＨに調整した、５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液２５ｍＬを陽イオン交換カラムにアプライし、陽イオン交換カラム内に残存したタンパク質を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（５）（２）および（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、サイズ排除クロマトグラフィ（使用カラム：ＴＳＫＧｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ、東ソー社製）に供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を測定した。また前記画分のうち、ｐＨが（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、および（ｅ）の平衡化液Ｃを使用して回収した画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度確認も行なった。
ＡＡＶ結合性タンパク質の回収結果（２８０ｎｍの吸光度変化に基づくクロマトパターン）を図７に示す。また（２）および（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の液量、当該画分中に含まれるタンパク質濃度、前記液量および前記タンパク質濃度から算出したタンパク質量、（５）のサイズ排除クロマトグラフィで測定した前記画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の純度、ならびに前記タンパク質量および前記純度から算出したＡＡＶ結合性タンパク質の回収量をまとめた結果を表６に示す。
陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着せず素通りした、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分における、前記タンパク質の純度はいずれも９４％以上あり、陰イオン交換カラムから溶出した前記タンパク質を含む画分（４６．３％、実施例６、表５）よりも純度が向上した。以上の結果から、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を、陰イオン交換カラムに供した後、添加試料および平衡化液ＣのｐＨを２．２以上３．２以下の条件にすることで、陽イオン交換カラムを用いた精製により、高純度なＡＡＶ結合性タンパク質が得られることがわかる。中でも本実施例で検討した精製条件のうち、添加試料および平衡化液ＣのｐＨを２．７から３．０とした条件（（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）の条件）では純度９９％以上と特に高純度なＡＡＶ結合性タンパク質が得られることがわかる。一方、ＡＡＶ結合性タンパク質の回収量の点からは、添加試料および平衡化液ＣのｐＨを２．４から２．７とした条件（（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の条件）で、より多くのＡＡＶ結合性タンパク質を回収できることがわかる。以上の結果から、添加試料および平衡化液ＣのｐＨを２．５以上２．７５以下とすることで、ＡＡＶ結合性タンパク質を高純度かつ高回収率で精製できることがわかる。
本実施例のうち、添加試料および平衡化液ＣのｐＨを（ａ）２．４、（ｂ）２．６、（ｄ）２．８、および（ｅ）３．０のいずれかに調整し、陽イオン交換カラムで回収した、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を、それぞれ図８のレーン３（（ａ）ｐＨ２．４）、レーン４（（ｂ）ｐＨ２．６）、レーン５（（ｄ）ｐＨ２．８）、およびレーン６（（ｂ）ｐＨ２．６）に示す。図８のレーン２（陰イオン交換カラムによる精製のみ）と、レーン３からレーン６（陰イオン交換カラムによる精製後、陽イオン交換カラムで精製）との比較からも、陰イオン交換カラムによる精製後、陽イオン交換カラムで精製することでＡＡＶ結合性タンパク質を高純度に精製できることがわかる。
実施例８ 陽イオン交換カラムを用いたＡＡＶ結合性タンパク質の精製（素通し精製、最適導電率の検討）
（１）実施例６に記載の方法で陰イオン交換カラムから溶出した、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、透析膜（分画分子量約１２０００から１４０００）と、試料溶液量の１００倍量以上の（ａ）１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、（ｂ）２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、（ｃ）３０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、（ｄ）５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、および（ｅ）１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムのいずれかを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ２．７）（以下、「平衡化液Ｄ」とも表記）を用いて透析処理し、溶媒置換した。なお、これら平衡化液Ｄの導電率はそれぞれ、（ａ）５ｍＳ／ｃｍ、（ｂ）６ｍＳ／ｃｍ、（ｃ）７ｍＳ／ｃｍ、（ｄ）９ｍＳ／ｃｍ、および（ｅ）１４ｍＳ／ｃｍである。
（２）導電率が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかに調製した平衡化液Ｄであらかじめ平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ－６５０Ｍ、東ソー社製）を充填した陽イオン交換カラム（容量５ｍＬ）に、（１）で透析処理したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分（添加試料）８．３ｍＬを、流速１．２５ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、前記担体にＡＡＶ結合性タンパク質以外の不純物を吸着させると同時に、吸着せずに素通りしたＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した。
（３）導電率が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）のいずれかに調製した平衡化液Ｄ２５ｍＬを陽イオン交換カラムにアプライし、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着しないＡＡＶ結合性タンパク質を洗い流して回収する、押出工程を実施した。
（４）５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ２．７）２５ｍＬを用いて、陽イオン交換カラム内に残存したタンパク質を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（５）（２）および（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、実施例３（６）と同様な方法でサイズ排除クロマトグラフィおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を測定した。
ＡＡＶ結合性タンパク質の回収結果（２８０ｎｍの吸光度変化に基づくクロマトパターン）を図９に示す。また（２）および（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の液量、当該画分中に含まれるタンパク質濃度、前記液量および前記タンパク質濃度から算出したタンパク質量、（５）のサイズ排除クロマトグラフィで測定した前記画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の純度、ならびに前記タンパク質量および前記純度から算出したＡＡＶ結合性タンパク質の回収量をまとめた結果を表７に示す。
陽イオン交換カラムを吸着せず素通りした、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分における、前記タンパク質の純度はいずれも９５％以上と、陰イオン交換カラムから溶出した前記タンパク質を含む画分（４６．３％、実施例６、表５）よりも純度が向上した。以上の結果から、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を、導電率１ｍＳ／ｃｍ以上２５ｍＳ／ｃｍ以下の平衡化液Ｄに供し、精製することで、高純度なＡＡＶ結合性タンパク質が得られることがわかる。一方、ＡＡＶ結合性タンパク質の回収量の点からは、添加試料および平衡化液Ｄの導電率を５ｍＳ／ｃｍ以上９ｍＳ／ｃｍとした条件（（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の条件）で、より多くのＡＡＶ結合性タンパク質を回収できることがわかる。以上の結果から、添加試料および平衡化液Ｄの導電率を４ｍＳ／ｃｍ以上１０ｍＳ／ｃｍ以下とすることで、ＡＡＶ結合性タンパク質を高純度かつ高回収率で精製できることがわかる。
本実施例で平衡化液Ｄを用いて、陽イオン交換カラムで回収した画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を、それぞれ図１０のレーン３（（ａ）５ｍＳ／ｃｍ）、レーン４（（ｂ）６ｍＳ／ｃｍ）、レーン５（（ｃ）７ｍＳ／ｃｍ）、レーン６（（ｄ）９ｍＳ／ｃｍ）、およびレーン７（（ｄ）１４ｍＳ／ｃｍ）に示す。図１０のレーン２（陰イオン交換カラムによる精製のみ）と、レーン３からレーン７（陰イオン交換カラムによる精製後、陽イオン交換カラムで精製）との比較からも、陰イオン交換カラムによる精製後、陽イオン交換カラムで精製することでＡＡＶ結合性タンパク質を高純度に精製できることがわかる。
実施例９ 陽イオン交換カラムを用いたＡＡＶ結合性タンパク質の精製（カラムサイズのスケールアップ）
実施例７および実施例８で最適化した精製条件が、カラムサイズをスケールアップしても（すなわち大量精製においても）適用可能か、検討した。
（１）実施例６に記載の方法で陰イオン交換カラムから溶出した、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分（添加試料）を、透析膜（分画分子量約１２０００から１４０００）と、試料溶液量の１００倍量以上の２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．７）（導電率が（ｂ）の条件の平衡化液Ｄ、以下、「平衡化液Ｅ」とも表記）を用いて透析処理し、平衡化液Ｅに置換した。
（２）平衡化液Ｅであらかじめ平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ－６５０Ｍ、東ソー社製）を充填した陽イオン交換カラム（容量４０ｍＬ）に、（１）で透析処理したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分７８ｍＬを、流速１０ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、前記担体にＡＡＶ結合性タンパク質以外の不純物を吸着させると同時に、前記担体に吸着せずに素通りしたＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した。
（３）平衡化液Ｅ ２００ｍＬを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着しないＡＡＶ結合性タンパク質を洗い流して回収する、押出工程を実施した。
（４）５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ２．７）２００ｍＬを用いて、陽イオン交換カラム内に残存したタンパク質を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（５）（２）および（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、実施例３（６）と同様な方法でサイズ排除クロマトグラフィおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を測定した。
ＡＡＶ結合性タンパク質の回収結果（２８０ｎｍの吸光度変化に基づくクロマトパターン）を図５（Ｂ）に示す。また（２）および（３）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の液量、当該画分中に含まれるタンパク質濃度、前記液量および前記タンパク質濃度から算出したタンパク質量、（５）のサイズ排除クロマトグラフィで測定した前記画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の純度、ならびに前記タンパク質量および前記純度から算出したＡＡＶ結合性タンパク質の回収量をまとめた結果を表５に示す。
陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着せず素通りした、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分における、前記タンパク質の純度は９９．６％と、陰イオン交換カラムから溶出した前記タンパク質を含む画分（４６．３％、実施例６、表５）よりも純度が向上した。以上の結果から、実施例８での最適精製条件（添加試料を陽イオン交換カラムに供した後、ｐＨ２．２以上３．２以下かつ導電率１ｍＳ／ｃｍ以上２５ｍＳ／ｃｍ以下の緩衝液を前記カラムに供し、前記カラムから素通りした画分を回収）が、容量４０ｍＬの陽イオン交換カラムに対しても適用可能なことがわかる。
なお本実施例で得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図６のレーン２に示す。図６のレーン１（陰イオン交換カラムによる精製のみ）と、レーン２（陰イオン交換カラムによる精製後、陽イオン交換カラムで精製）との比較からも、本発明のＡＡＶ結合性タンパク質の精製方法が、カラムスケールを大きくしても適用できることがわかる。
実施例１０ ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料の調製（その３）
（１）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ９ｖを含むポリペプチド、をコードするポリヌクレオチド（配列番号７）を含むプラスミドｐＴｒｃＡＶＲ９ｖ－ＣＲＮＤＴＣＧ－Ｖ１で大腸菌Ｗ３１１０株を形質転換し、得られたＡＶＲ９ｖを発現可能な形質転換体を、実施例１に記載の方法と同様の方法で培養することで前培養液を調製した。なお配列番号７において、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２２番目のアラニン（Ａｌａ）までがＰｅｌＢシグナルペプチドであり、２５番目のセリン（Ｓｅｒ）から２１３番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ）までがＡＡＶ結合性タンパク質ＡＶＲ９ｖであり、２１４番目のシステイン（Ｃｙｓ）から２２０番目のグリシン（Ｇｌｙ）までが不溶性担体への固定化用タグであるシステインタグ配列である。またＡＶＲ９ｖは、ＡＡＶ受容体ＫＩＡＡ０３１９Ｌの細胞外ドメイン１（ＰＫＤ１）およびドメイン２（ＰＫＤ２）（配列番号１の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基）に対して、以下の（Ｉ）、（ＩＩＩ）から（ＶＩＩＩ）、（Ｘ）および（ＸＩＩ）に示すアミノ酸置換が生じたポリペプチドである。
（Ｉ）配列番号１の３１７番目（配列番号６では３０番目）のバリンがアスパラギン酸に置換
（ＩＩＩ）配列番号１の３６２番目（配列番号６では７５番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＩＶ）配列番号１の３７１番目（配列番号６では８４番目）のリジンがアスパラギンに置換
（Ｖ）配列番号１の３９０番目（配列番号６では１０３番目）のグリシンがセリンに置換
（ＶＩ）配列番号１の３９９番目（配列番号６では１１２番目）のリジンがグルタミン酸に置換
（ＶＩＩ）配列番号１の４７６番目（配列番号６では１８９番目）のセリンがアルギニンに置換
（ＶＩＩＩ）配列番号１の４８７番目（配列番号６では２００番目）のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（Ｘ）配列番号１の３４２番目（配列番号６では５５番目）のチロシンがセリンに置換
（ＸＩＩ）配列番号１の３８２番目（配列番号６では９５番目）のイソロイシンがバリンに置換
（２）実施例１（２）に記載の方法と同様の方法で、３Ｌ容量の培養槽を用いて本培養を開始し、流加培養を行なった。
（３）実施例１（３）に記載の方法と同様の方法で、ＩＰＴＧによる発現誘導を行なった。得られた培養液を遠心分離し、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む大腸菌の菌体を回収した。
（４）実施例１（４）に記載の方法と同様の方法で、（３）で回収した菌体から、菌体内に発現した前記タンパク質を抽出した。
（５）菌体抽出液を遠心分離し、上清を回収後、０．２μｍのフィルターでろ過することで、ＡＡＶ結合性タンパク質抽出液を得、これをＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料とした。
実施例１１ イオン交換カラムを用いたＡＡＶ結合性タンパク質の精製
（１）実施例１０に記載の方法で得られた、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料（５ｍＬ）を、実施例５（１）に記載の方法と同様の方法で陰イオン交換カラムにアプライし、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体にＡＡＶ結合性タンパク質を吸着させた。
（２）実施例５（２）に記載の方法と同様の方法で洗浄工程を実施後、２００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）２５ｍＬを用いて、陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を溶出させ、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した。
（３）実施例５（４）に記載の方法と同様の方法で洗浄工程を実施した。
（４）（２）で陰イオン交換カラムから溶出した、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、透析膜（分画分子量約１２０００から１４０００）を、試料溶液量の１００倍量以上の平衡化液Ｅを用いて透析処理し、溶媒置換した。
（５）平衡化液Ｅであらかじめ平衡化した、陽イオン交換クロマトグラフィ用担体（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＣＭ－６５０Ｍ、東ソー社製）を充填した陽イオン交換カラム（容量５ｍＬ）に、（４）で溶媒置換したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分２４ｍＬを、流速１．２５ｍＬ／ｍｉｎでアプライし、前記担体にＡＡＶ結合性タンパク質以外の不純物を吸着させると同時に、吸着せずに素通りしたＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を回収した。
（６）平衡化液Ｅ２５ｍＬを用いて、陽イオン交換カラムに吸着しないＡＡＶ結合性タンパク質を洗い流して回収する、押出工程を実施した。
（７）５００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ２．７）２５ｍＬを用いて、陽イオン交換カラム内に残存したタンパク質を洗い流す、洗浄工程を実施した。
（８）（５）および（６）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を、実施例３（６）と同様な方法でサイズ排除クロマトグラフィおよびＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、ＡＡＶ結合性タンパク質の純度を測定した。
ＡＡＶ結合性タンパク質の回収結果（２８０ｎｍの吸光度変化に基づくクロマトパターン）を図１１に示す。また（２）、ならびに（５）および（６）で回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の液量、当該画分中に含まれるタンパク質濃度、前記液量および前記タンパク質濃度から算出したタンパク質量、（８）のサイズ排除クロマトグラフィで測定した前記画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質の純度、ならびに前記タンパク質量および前記純度から算出したＡＡＶ結合性タンパク質の回収量をまとめた結果を表８に示す。
（２）（図１１（Ａ））、ならびに（５）および（６）（図１１（Ｂ））の工程で、ＡＡＶ結合性タンパク質に相当するピークを確認できたことから、ＡＡＶ結合性タンパク質を、陰イオン交換カラムおよび陽イオン交換カラムで精製できることがわかる。
なお（２）で回収した溶出画分、ならびに（５）および（６）で回収した素通り画分に含まれるＡＡＶ結合性タンパク質（サイズ排除クロマトグラフィによるＡＡＶ結合性タンパク質の純度）はそれぞれ３１．２％、および８６．６％であった（表８）。以上の結果から、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を、陰イオン交換カラムに供した後、陽イオン交換カラムに供して精製することで、高純度なＡＡＶ結合性タンパク質が得られることがわかる。
当該画分のＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を図１２に示す。図１２のレーン２（陰イオン交換カラムによる精製のみ）と、レーン３（陰イオン交換カラムによる精製後、陽イオン交換カラムで精製）との比較からも、陰イオン交換カラムによる精製後、陽イオン交換カラムで精製することで、ＡＡＶ結合性タンパク質を高純度に精製できることがわかる。

Claims (10)

  1. 試料中に含まれるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）結合性タンパク質の精製方法であって、以下の（１）から（３）に示す工程を少なくとも含む、前記方法：
    （１）ＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料を陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し、当該担体に前記タンパク質を吸着させる工程、
    （２）陰イオン交換クロマトグラフィ用担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を第一の溶出液を用いて溶出させる工程、
    （３）前記第一の溶出液で溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し、前記タンパク質を含む画分を回収する工程。
  2. 第一の溶出液が、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上３００ｍｍｏｌ／Ｌ以下の塩化ナトリウムを含む緩衝液である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記（３）の工程が、
    前記第一の溶出液で溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し、当該担体に前記タンパク質以外の不純物を吸着させるとともに当該担体に吸着しない前記タンパク質を含む画分を回収する工程を少なくとも含む、
    請求項１に記載の方法。
  4. 陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加する、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分のｐＨが２．２以上３．２以下である、請求項３に記載の方法。
  5. 陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加する、ＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分の導電率が１ｍＳ／ｃｍ以上２５ｍＳ／ｃｍ以下である、請求項３に記載の方法。
  6. 前記（３）の工程が、
    前記第一の溶出液で溶出したＡＡＶ結合性タンパク質を含む画分を陽イオン交換クロマトグラフィ用担体に添加し、当該担体に前記タンパク質を吸着させる工程と、
    前記担体に吸着したＡＡＶ結合性タンパク質を第二の溶出液を用いて溶出させる工程とを少なくとも含む、
    請求項１に記載の方法。
  7. 第二の溶出液が、１００ｍｍｏｌ／Ｌ以上５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下のグアニジノ基を有する化合物を含む緩衝液である、請求項６に記載の方法。
  8. 陰イオン交換クロマトグラフィ用担体および陽イオン交換クロマトグラフィ用担体が、それぞれカラムに充填した態様である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. ＡＡＶ結合性タンパク質が、以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかから選択されるポリペプチドである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法；
    （ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含むポリペプチド、
    （ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基において、１もしくは数個の位置での１もしくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド、
    （ｉｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列の３１２番目のセリンから５００番目のアスパラギン酸までのアミノ酸残基を少なくとも含み、ただし当該３１２番目から５００番目までのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対して７０％以上の相同性を有し、かつＡＡＶ結合活性を有するポリペプチド。
  10. ＡＡＶ結合性タンパク質を発現可能な遺伝子組換え宿主を培養することで前記タンパク質を発現させる工程と、得られた培養物から発現されたＡＡＶ結合性タンパク質を回収する工程と、回収したＡＡＶ結合性タンパク質を含む試料から前記タンパク質を精製する工程とを含む、ＡＡＶ結合性タンパク質の製造方法であって、
    前記精製工程を、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法で行なう、前記方法。
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