CN110818776B - 一种亲和肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物分离领域，具体涉及一种亲和肽及其应用，所述亲和肽的氨基酸序列为：Ala Glu Phe Tyr Cys。该亲和肽能与kappa链抗体特异性结合，纯化kappa链抗体的效果与Protein L相当，廉价易得且安全性好。

Description

一种亲和肽及其应用
技术领域
本发明涉及生物分离领域，具体地，本发明涉及一种亲和肽及其应用。
背景技术
抗体是一种由浆细胞分泌，能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。由于其特异性的结合能力可以作为治疗疾病的药物、疾病诊断的试剂和亲和分离的介质等，在生物、医药和化工等领域中有着广泛的应用，具有重大的社会和经济效益。
天然抗体分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。依据轻链的构型，可分为kappa(κ)链和lambda(λ)链，分别对应κ型抗体和λ型抗体。显然，将κ型抗体和λ型抗体有效分离是进一步深化抗体研究和应用的的基础之一
目前，工业中抗体的分离纯化采用Protein A/G/L亲和纯化介质，然而，其中的Protein A/G亲和纯化介质不能有效分离κ型抗体和λ型抗体；Protein L亲和纯化介虽然可以吸附κ型抗体，但是Protein A/G/L普遍存在介质价格昂贵、易失活、清洗困难、配体脱落污染等问题。而其他的分离手段和介质也都不尽如人意，存在非特异性吸附、配体免疫原性和毒性等问题。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种亲和肽，同时提供了上述亲和肽的应用，上述亲和肽作为亲和纯化介可以实现和Protein L亲和纯化介纯化kappa链抗体相当的效果。
本发明的一种亲和肽氨采用的技术方案如下：一种亲和肽，所述亲和肽的氨基酸序列为：Ala Glu Phe Tyr Cys。
优选地，所述亲和肽能与kappa链抗体特异性结合。
如上所述的亲和肽在混合抗体分离中的应用。
优选地，所述亲和肽在非疾病的诊断和治疗目的的kappa链抗体提取中的应用。
优选地，所述亲和肽在制备用于提取kappa链抗体的亲和介质中的应用。
一种亲和介质，包括凝胶基质以及如上所述亲和肽。所述凝胶基质可以为葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶、丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。
本发明的有益效果为：
1)高效：亲和肽可以与kappa链抗体特异性结合。
2)安全：该抗体亲和肽无免疫原性，其残基序列取自20种必需氨基酸，安全无毒。
3)经济：多肽由固相合成而得，技术成熟，抗体吸附肽廉价易得且便于质量管控。
4)Cys末端的巯基提供唯一交联端，可以实现定向交联，便于介质制备。
因而采用该抗体亲和肽作为亲和配体，可以实现kappa链抗体从抗体混合物中的提取。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：多肽的合成
1)活化树脂：称取1000mg的Fmoc Cys-wang Resin，在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中浸泡30min溶胀。
2)脱保护：压滤除去DMF，加入含20％哌啶的DMF溶液氮气吹沸反应15min，压滤除去；用异丙醇洗涤树脂三次，DMF洗三次，而后用茚三酮法检测树脂Fmoc脱除状况。
3)缩合反应：称取1.4mmol FMOC-Tyr，以O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸(TBTU)、1-羟基苯并三氮唑(HOBt)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的DMF混合溶液为反应液，室温下氮气吹沸反应2h；反应后，用异丙醇洗涤树脂三次，然后用DMF洗涤树脂三次，茚三酮法检测，完成第一个氨基酸Tyr的连接。
4)重复步骤2)～3)：按多肽的顺序自C端向N端延伸多肽；重复脱保护、洗涤、缩合的过程依次将Tyr、Phe、Glu和Ala连接完毕，完成多肽的连接。
5)多肽切割：用氮气将多肽-树脂复合物吹干，采用三氟乙酸(TFA)、苯酚(phenol)、H2O、苯甲硫醚(thioanisole)、1,2-乙二硫醇(EDT)和三异丙基硅烷(TIS)混合物为切割试剂，磁力搅拌2小时，除去树脂，滤液直接抽入冷冻乙醚中，3000r/min离心收集沉淀，冻干至恒重即得粗肽。
6)粗肽用高效液相色谱(HPLC)纯化至95％以上，质谱鉴定。
实施例2：亲和介质的制备
1)取10mg抗体亲和肽(氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)溶解于10mL 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)缓冲液，pH7.4。
2)取巯基活化后的葡聚糖凝胶1mL。
3)将步骤1)和2)中的化合物混合反应12小时。
4)反应完毕后，以Hepes缓冲液洗涤凝胶颗粒，得到亲和介质。
实施例3：亲和肽分离纯化kappa链抗体
1)配制10mmol/L Hepes缓冲液，pH7.0，NaCl含量0.15M，设定流速1mL/min。
2)以步骤1)中配制液体为流动相，运行AKTA蛋白纯化系统。
3)取实施例2中的亲和介质1mL和Protein L介质1mL分别填装分离柱。
4)分别上样抗体溶液1mL，收集流出液3mL。
5)配制pH2的0.1M HCl-Gly缓冲液作为洗脱液。
6)分别上样洗脱液3mL，收集洗脱液3mL。
7)分别测定吸附前、吸附后流出液和洗脱液中kappa链抗体含量和纯度，计算总提取率，结果参见下表1。
表1.亲和肽介质和Protein L介质吸附特性比较
Figure BDA0002301673070000041
由表1可知，本发明的亲和肽可以有效实现kappa链抗体从混合物中的提取，并且本发明的亲和肽对于kappa链抗体的纯化效果与Protein L介质接近。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南阳师范学院
<120> 一种亲和肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Glu Phe Tyr Cys
1 5

Claims (6)

1. 一种亲和肽，其特征在于，所述亲和肽的氨基酸序列为：Ala Glu Phe Tyr Cys。
2.根据权利要求1所述的一种亲和肽，其特征在于，所述亲和肽能与kappa链抗体特异性结合。
3.权利要求1所述的一种亲和肽在混合抗体分离中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种亲和肽的应用，其特征在于，所述亲和肽在非疾病的诊断和治疗目的的kappa链抗体提取中的应用。
5.根据权利要求4所述的一种亲和肽的应用，其特征在于，所述亲和肽在制备用于提取kappa链抗体的亲和介质中的应用。
6.一种亲和介质，其特征在于，包括凝胶基质以及如权利要求1或权利要求2中的亲和肽。
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