CN107400169B

CN107400169B - 一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法

Info

Publication number: CN107400169B
Application number: CN201710647036.2A
Authority: CN
Inventors: 史权威; 潘向辉; 李延虎; 杨子义
Original assignee: Beijing Hua'an Innovation Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Hua'an Innovation Biotechnology Co ltd
Priority date: 2017-08-01
Filing date: 2017-08-01
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2037-08-01
Also published as: CN107400169A

Abstract

本发明提供一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法，本发明方法是将大肠杆菌表达的、以包涵体形式存在的肿瘤血管阻断剂融合蛋白的发酵菌体通过高压均质机破碎、高速离心，得到粗制包涵体。用不同洗涤溶液洗涤，得到较净的包涵体，然后经过8M尿素变性溶解包涵体，离心取上清，再用透析法复性。复性后样品经过离子交换、分子筛柱纯化后，得到的目的蛋白SDS‑PAGE电泳纯度和RP‑HPLC纯度均能达到95％以上。本发明提供的纯化方法简便，成本低，易操作，易于产业化生产。

Description

一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法

技术领域

本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体地说，涉及一种从大肠杆菌表达的以包涵体形式存在的一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法。

背景技术

表达外源基因的宿主细胞，在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，从而形成包涵体。这种表达方式具有成本低、产量高、不易被降解、容易纯化等优点，成为当今外源蛋白主要的表达方式。以大肠杆菌菌株为代表的原核表达系统，在短时间内能以低成本获得大量表达蛋白，表达载体带有强的启动子，在IPTG诱导下可高效表达，快速的蛋白合成使产物大量堆积，以致于没有足够的时间进行正确的折叠和二硫键的配对，形成包涵体沉淀。

包涵体的提取方法已较为成熟，但是它却引入了一个变性-复性过程。目前对于包涵体蛋白的纯化方法主要有：①将表达获得的包涵体进行变性，获得再折叠的可溶性蛋白，并采用亲和柱对其进行纯化，将纯化得到的目的蛋白再复性使其重新折叠；②蛋白在重新折叠过程中容易受一些复性条件的影响而发生沉淀，那么对于这些蛋白可以对其表达条件进行摸索，找到其可溶表达的条件，然后再进行直接纯化。影响复性的因素很多，首先是蛋白分子自身的理化特性，其次是目的蛋白质的浓度及复性体系的离子强度、pH值、温度，另外从变性体系到复性体系的转换速度也是重要的影响因素。很多蛋白质的复性过程很难控制，往往会形成蛋白沉淀，一些蛋白质甚至通过稀释或透析方法完全转换为复性体系后，由于环境的改变，而再次出现沉淀。

包涵体在变性前通常要用洗涤液多次清洗以便除去杂质。缺点在于：因反复洗涤，耗时长、往往易损失目的蛋白，造成回收率低，甚至纯度不高等。包涵体变性一般用强的变性剂如尿素(6-8M)、盐酸胍(GdnHCl 6M)，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，实现蛋白结构的重折叠，从而使目的蛋白形成正确的空间结构，恢复其生物活性。如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。还原剂的使用浓度一般是50-100mmol/L 2-BME或DTT。包涵体的复性是蛋白折叠恢复天然构象及活性的过程。蛋白质的立体结构其伸展肽链折叠为天然活性结构的过程受到周围环境等诸多因素的影响。一般认为,蛋白质在复性过程中涉及两种疏水相互作用,一是分子内的疏水相互作用,二是部分折叠的肽链分子间的疏水相互作用。前者促使蛋白质正确折叠,后者导致蛋白质聚集而无活性,两者互相竞争,影响蛋白质复性效率。因此,在复性过程中,抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集,是提高复性效率的关键。

本发明的肿瘤血管阻断剂融合蛋白属于一种肿瘤血管阻断剂多肽、可用于制备治疗肿瘤的药物。该蛋白从N端到C端依次包括：截断的组织因子tTF的氨基酸序列、连接子和肿瘤靶向分子pHLIP的氨基酸序列。肿瘤血管阻断剂多肽能够通过pHLIP定位到肿瘤血管内皮细胞表面，从而特异的在肿瘤血管产生血栓，阻断肿瘤部位血液供应，从而达到治疗肿瘤的目的。本发明所述的肿瘤血管阻断剂融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

发明内容

本发明的目的是提供一种纯化效率高的融合蛋白的纯化方法。

本发明的纯化方法，包括如下步骤：

(1)破菌：能够表达融合蛋白的菌体加入溶解液搅拌破碎后，离心，取沉淀；

(2)沉淀：沉淀经三步洗涤，收集最后一步洗涤后的沉淀，得粗制包涵体；

(3)变性：沉淀加入变性液，重悬至复溶后，搅拌，离心，收集上清液；

(4)复性：过滤上清液，加透析袋中，复性液透析复性；

(5)纯化：柱层析，超滤浓缩置换溶液，排阻层析。

本发明的纯化方法中，步骤(1)是菌体加入溶解液经过重悬、磁力搅拌溶解后，高压均质机破碎3次，得到破碎液，再高速离心，弃上清，收集沉淀。

所述溶解液为pH8.0-8.5的20-50mmol/L Tris-HCl溶液。

优选地，所述融合蛋白为肿瘤血管阻断剂融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

步骤(2)的三步洗涤是指：

洗涤1：将破碎离心后收集的沉淀，用洗涤液A重悬使其完全复溶后，搅拌，离心，收集沉淀；所述洗涤液A为pH8.0-8.5的20-50mmol/L Tris-HCl、2％Triton、150Mm NaCl溶液。

洗涤2：洗涤1得到的沉淀，用洗涤液B重悬使其完全复溶后，搅拌，离心，收集沉淀；所述洗涤液B为pH8.0-8.5的20-50mmol/L Tris-HCl、1％Triton、2M尿素溶液。

洗涤3：洗涤2得到的沉淀，用洗涤液C重悬使其完全复溶后，搅，离心，收集沉淀；所述洗涤液C为pH8.0-8.5的20-50mmol/L Tris-HCl溶液。

进一步地，在洗涤1、洗涤2和洗涤3中，所述的搅拌均是在2-6℃环境下磁力搅拌2-3小时；然后2-6℃、6000-10000g离心10-30min，收集沉淀。

本发明的纯化方法中，步骤(3)所述变性液为pH8.0-8.5的20-50mmol/L Tris-HCl、8M尿素、15mmol/L DTT溶液；沉淀加入变性液后，使沉淀中总蛋白量的终浓度为1-2mg/mL；所述的搅拌是在2-6℃环境下磁力搅拌12-18小时；然后2-6℃、6000-10000g离心10-30min，收集上清液。

步骤(4)用0.45μm的滤膜过滤上清，在0℃下磁力搅拌，复性液透析复性45-50小时；所述复性液为pH8.0-8.5的20-50mmol/L Tris-HCl溶液。

步骤(5)的纯化步骤为：

1)阴离子交换柱层析：先用平衡溶液A充分平衡柱子，使电导和pH值达到和平衡溶液A一样值；将复性过滤后样品以50-100ml/小时线性流速上柱，收集穿液；待紫外吸收值基线平衡后，然后用洗脱溶液A线性梯度洗脱8个柱体积；收集洗脱峰1、洗脱峰2；紫外吸收基线为零时停止收集；再分别用清洗溶液A和清洗溶液B清洗柱子2个柱体积后，用纯化水冲洗柱子；

2)超滤浓缩置换溶液：阴离子交换柱层析所收集目的蛋白峰洗脱峰1用10KDa超滤管浓缩并置换溶液至2ml；

3)分子筛排阻层析：先用平衡液B充分平衡柱子，使电导和pH值达到和平衡溶液B一样值；将超滤浓缩置换溶液后样品上柱，收集目的蛋白峰；紫外吸收基线为零时停止收集。

平衡溶液A：20-50mmol/L Tris-HCl、pH8.0-8.5；

平衡溶液B：20-50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、pH8.0-8.5；

洗脱溶液A:20-50mmol/L Tris-HCl、500mmol/L NaCl、pH8.0-8.5；

清洗溶液A:2M NaCl溶液；

清洗溶液B:0.5M NaOH溶液。

本发明提供了上述纯化方法在制备重组蛋白药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明有别于现有技术的其他蛋白的纯化方法，特别是针对肿瘤血管阻断剂融合蛋白(其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)，纯化效果优异，本发明在包涵体洗涤过程中，采用分步洗涤的方法。第一步洗涤时，在20-50mmol/L Tris-HCl、2％Triton洗涤溶液中加入150mmol/L NaCl，目的在于增加离子强度，增强去垢剂洗涤能力。第二步洗涤时，采用含有2M尿素的洗涤溶液，有助于节约洗涤时间，提高粗制包涵体纯度。同时在第三步洗涤时逐级降低去垢剂的浓度，有助于复性时提高复性率。本发明的纯化方法能够有效纯化肿瘤血管阻断剂融合蛋白，得到的目的蛋白SDS-PAGE电泳纯度和RP-HPLC纯度均能达到95％以上，且蛋白的生物学功能不丧失，纯化后的该蛋白的生物活性高达156U/mg。本发明提供的纯化方法简便，成本低，易操作，易于产业化生产。

附图说明

图1为本发明肿瘤血管阻断剂融合蛋白的SDS-PAGE电泳图，箭头指示处即为经本发明纯化方法获得的融合蛋白条带。

图2为本发明肿瘤血管阻断剂融合蛋白的RP-HPLC纯度检测图，图中保留时间36.566min的峰即为纯化得到的目的蛋白峰。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

本发明涉及的溶液分别为：

溶解溶液：20-50mmol/L Tris-HCl、pH8.0-8.5。

洗涤溶液A：20-50mmol/L Tris-HCl、2％Triton、150Mm NaCl、pH8.0-8.5。

洗涤溶液B:20-50mmol/L Tris-HCl、1％Triton、2MUrea、pH8.0-8.5。

洗涤溶液C：20-50mmol/L Tris-HCl、pH8.0-8.5。

变性溶液：20-50mmol/L Tris-HCl、8M Urea、15mmol/L DTT、pH8.0-8.5。

复性溶液：20-50mmol/L Tris-HCl、(pH8.0-8.5)。

平衡溶液A：20-50mmol/L Tris-HCl、pH8.0-8.5。

平衡溶液B：20-50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、pH8.0-8.5。

洗脱溶液A：20-50mmol/L Tris-HCl、500mmol/L NaCl、pH8.0-8.5。

清洗溶液A:2M NaCl溶液。

清洗溶液B:0.5M NaOH溶液。

根据序列表中氨基酸序列信息，采用全基因合成的方法合成该融合蛋白的基因序列，将基因序列接入到pET30b载体中，从而得到融合蛋白表达载体，再将载体转入BL21大肠杆菌中，根据质粒抗性筛选阳性克隆，即得到含有融合蛋白表达载体的基因工程菌株。

实施例1

1、破菌：工程菌株经过发酵得到的发酵液，在4℃、8000g离心30min后得到的大肠杆菌菌体中加入溶解液经过重悬、磁力搅拌溶解后，高压均质机破碎三遍，得到破碎液，再高速离心，弃上清，收集沉淀。

2、洗涤：破碎离心后所收集沉淀，经过三步洗涤，得到粗制包涵体。

洗涤1：破碎离心后收集的沉淀，用洗涤液A重悬使其完全复溶后，在4℃环境下磁力搅拌2小时。然后4℃、9000g离心20min，收集沉淀。

洗涤2：洗涤1得到的沉淀，用洗涤液B重悬使其完全复溶后，在4℃环境下磁力搅拌2小时。然后4℃、9000g离心20min，收集沉淀。

洗涤3：洗涤2得到的沉淀，用洗涤液C重悬使其完全复溶后，在4℃环境下磁力搅拌2小时。然后4℃、9000g离心20min，收集沉淀。

3、变性:洗涤3所收集沉淀，加入一定体积(按洗涤3后总蛋白量计算加入变性液的体积，使变性后终浓度在1mg/ml-2mg/ml范围内)变性液重悬使其完全复溶后，4℃环境下磁力搅拌15小时。然后4℃、9000g离心20min，收集上清液。

4、复性：将变性后所收集上清液用0.45um滤膜过滤后，加入透析袋中，在℃环境下磁力搅拌，用复性液透析复性48小时。收集复性后样品。

5、纯化:

1)阴离子交换柱层析：先用平衡溶液A充分平衡柱子，使电导和pH值达到和平衡溶液A一样值。将复性过滤后样品以50-100ml/小时线性流速上柱，收集穿液。待紫外吸收值基线平衡后，然后用洗脱溶液A线性梯度洗脱8个柱体积。收集洗脱峰1、洗脱峰2。紫外吸收基线为零时停止收集。然后分别用清洗溶液A和清洗溶液B清洗柱子2个柱体积后，再用纯化水冲洗柱子。

2)超滤浓缩置换溶液：阴离子交换所收集目的蛋白峰洗脱峰1用10KDa超滤管浓缩并置换溶液至2ml。

3)分子筛排阻层析：先用平衡液B充分平衡柱子，使电导和pH值达到和平衡溶液B一样值。将超滤浓缩置换溶液后样品上柱，收集目的蛋白峰。紫外吸收基线为零时停止收集。将收集后样品-80℃冰箱储存。

6、检测:纯化所得蛋白通过SDS-PAGE电泳检测，结果如图1所示，可见清晰、纯净的条带，纯度在95％以上；另将其进行RP-HPLC纯度分析，结果如图2所示，目的蛋白峰保留时间为36.566min，纯度在95％以上，结果达到预期。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京华安科创生物技术有限公司

<120> 一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法

<130> KHP171112016.0

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 259

<212> PRT

<213> 肿瘤血管阻断剂融合蛋白

<400> 1

Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser

1 5 10 15

Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gln

20 25 30

Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys

35 40 45

Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val

50 55 60

Lys Asp Val Lys Gln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala

65 70 75 80

Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn

85 90 95

Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr

100 105 110

Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu

115 120 125

Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg

130 135 140

Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser

145 150 155 160

Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu

165 170 175

Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val

180 185 190

Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu

195 200 205

Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu Phe

225 230 235 240

Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Ala Leu Leu Val Asp Ala Asp

245 250 255

Glu Gly Thr

Claims

1.一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)破菌：能够表达肿瘤血管阻断剂融合蛋白的菌体加入溶解液经过重悬、磁力搅拌溶解后，高压均质机破碎3次，得到破碎液，再高速离心，弃上清，收集沉淀，所述溶解液为pH8.0-8.5的20-50mmol/L Tris-HCl溶液；

(2)沉淀：沉淀经三步洗涤，收集最后一步洗涤后的沉淀，得粗制包涵体；所述三步洗涤是指：

洗涤1：将破碎离心后收集的沉淀，用洗涤液A重悬使其完全复溶后，搅拌，离心，收集沉淀；所述洗涤液A为pH8.0-8.5的20-50 mmol/L Tris-HCl、2％Triton、150 mmol/L NaCl溶液；

洗涤2：洗涤1得到的沉淀，用洗涤液B重悬使其完全复溶后，搅拌，离心，收集沉淀；所述洗涤液B为pH8.0-8.5的20-50 mmol/L Tris-HCl、1％Triton、2M尿素的溶液；

洗涤3：洗涤2得到的沉淀，用洗涤液C重悬使其完全复溶后，搅拌，离心，收集沉淀；所述洗涤液C为pH8.0-8.5的20-50 mmol/L Tris-HCl溶液；

(4)复性：过滤上清液，加透析袋中，复性液透析复性；

(5)纯化：柱层析，超滤浓缩置换溶液和排阻层析；

所述肿瘤血管阻断剂融合蛋白其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，洗涤1、洗涤2和洗涤3中，所述的搅拌均是在2-6℃环境下磁力搅拌2-3小时；然后2-6℃、6000-10000g离心10-30min，收集沉淀。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)所述变性液为pH8.0-8.5的20-50 mmol/L Tris-HCl、8M尿素、15 mmol/L DTT溶液；沉淀加入变性液后，使沉淀中总蛋白量的终浓度为1-2 mg/mL；所述的搅拌是在2-6℃环境下磁力搅拌12-18小时；然后2-6℃、6000-10000g离心10-30min，收集上清液。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(4)用0.45μm的滤膜过滤上清，在4℃下磁力搅拌，复性液透析复性45-50小时；所述复性液为pH8.0-8.5的20-50 mmol/LTris-HCl溶液。

5.根据权利要求1-4任一所述的纯化方法，其特征在于，步骤(5)的纯化步骤为：

1)阴离子交换柱层析：先用平衡溶液A充分平衡柱子，使电导和pH值达到和平衡溶液A一样值；将复性过滤后样品以50-100 ml/小时线性流速上柱，收集穿液；待紫外吸收值基线平衡后，然后用洗脱溶液A线性梯度洗脱8个柱体积；收集洗脱峰1、洗脱峰2；紫外吸收基线为零时停止收集；再分别用清洗溶液A和清洗溶液B清洗柱子2个柱体积后，用纯化水冲洗柱子；

2)超滤浓缩置换溶液：阴离子交换所收集目的蛋白峰洗脱峰1用10KDa超滤管浓缩并置换溶液至2ml；

3)分子筛排阻层析：先用平衡溶液B充分平衡柱子，使电导和pH值达到和平衡溶液B一样值；将超滤浓缩置换溶液后样品上柱，收集目的蛋白峰；紫外吸收基线为零时停止收集。

6.根据权利要求5所述的纯化方法，其特征在于，

平衡溶液A：pH8.0-8.5的20 mmol/L Tris-HCl溶液；

平衡溶液B：pH8.0-8.5的20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl溶液；

洗脱溶液A：pH8.0-8.5的20-50 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl溶液；

清洗溶液A:2M NaCl溶液；

清洗溶液B:0.5M NaOH溶液。

7.根据权利要求1-6任一所述的纯化方法在制备重组蛋白药物中的应用。