CN103131714A

CN103131714A - 珍珠母蛋白n16的制备方法及其在制备防治骨科疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN103131714A
Application number: CN2013100471749A
Authority: CN
Inventors: 苏薇薇; 邵鹏柱; 马结仪; 王永刚; 彭维; 吴忠
Original assignee: GUANGZHOU ZHONGTIAN KANGSHUN BIOLOGICAL MEDICINE CO Ltd; National Sun Yat Sen University
Current assignee: GUANGZHOU ZHONGTIAN KANGSHUN BIOLOGICAL MEDICINE CO Ltd; Sun Yat Sen University; National Sun Yat Sen University
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2013-06-05

Abstract

本发明涉及珍珠母蛋白N16的制备方法以及在制备预防或治疗骨质疏松症、骨折等骨科疾病药物中的应用。本发明利用基因重组法在细菌中表达珍珠母蛋白N16，建立了N16的分离纯化方案。本发明通过细胞、动物实验证明，N16可抑制RANKL诱导前体破骨细胞RAW 264.7细胞的增殖与分化，促进前体成骨细胞MC3T3-E1细胞的分化成熟，增强成骨细胞的矿化功能，治疗去卵巢引起的骨质疏松症，可用于制备防治骨质疏松症、骨折等骨科疾病药物。

Description

珍珠母蛋白N16的制备方法及其在制备防治骨科疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及珍珠母蛋白N16的制备方法及其用于防治骨质疏松症、骨折等骨科疾病的用途。

背景技术

骨质疏松症是指以骨量低及组织微结构退行病变为特征、骨脆性增加和骨折危险度升高的一种全身骨代谢障碍的疾病。该病在中老年人群中尤为常见。据国际骨质疏松基金会的统计数据显示，骨质疏松症目前危害着全球大约三分之一50岁以上的女性和五分之一50岁以上的男性。目前全世界约2亿人患有骨质疏松症，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。我国是世界上人口最多的国家，骨质疏松症发病率在65岁以上的人群中高达90%。随着世界人口的增加和平均寿命的提高，骨质疏松症的威胁将越来越大，为社会医疗体系带来沉重的负担。如何防治骨质疏松症已成为是世界性的难题。

导致骨质疏松的原因是多方面的，包括个体年龄、性别、身体状况等。人体骨骼一直在进行重建，破骨细胞吞噬旧骨，成骨细胞产生新的骨质，替补被吞噬的旧骨，从而维持骨量以及骨的质量。从根本上而言，骨质疏松症的发生是由于骨重建失衡，破骨细胞进行的骨吸收造成的流失的骨量大于成骨细胞进行的骨形成产生的骨量。

目前，治疗骨质疏松症的药物，主要分为骨吸收抑制剂和骨形成促进剂两大类。常用的骨吸收抑制剂有二磷酸盐、雷洛昔芬等。单纯的骨吸收抑制剂具有抑制破骨细胞的成熟与功能的活性，但只能减缓骨量流失，不能从根本上治疗骨质疏松症。而目前市面上常见的治疗骨质疏松症药物是骨吸收抑制剂。虽然骨形成促进剂能增加骨量，相对于骨吸收抑制剂有明显优势，但目前市场上骨形成促进剂只有Teriparatide、Preotact等少类药物，价格昂贵，且长期使用有可能刺激骨吸收，并增加患者产生骨肉瘤的风险，安全性低。可双向调节骨重建平衡能力的抗骨质疏松症药物同时具备促进骨形成和抑制骨吸收的作用，具有明显的优势，但只有雷尼酸锶一种药物可供患者选择。另一方面，在国内，由于生产商、销售商在宣传上的误导，目前充斥市场的含钙制品铺天盖地，均以“补钙”为目的，这与骨质疏松的治疗机理相差甚远。因此，寻找具有双向调节骨重建平衡的新型抗骨质疏松症药物是当前研究的热点。

研究报道，珍珠母的水溶性蛋白具有促进成骨活性，能促进骨损伤修复，显着提高去卵巢大鼠的骨密度，提高新生鼠颅骨的原代培养细胞和MRC-5（人类胎儿成纤维细胞系）细胞的碱性磷酸酶活性，刺激成骨细胞的分化和产生矿化结节，促进骨形成。例如：Ｍ．Ｌamghari等人研究证明从珍珠母得到的水溶性成分在高浓度时能够诱导Wister属大鼠的大腿骨基质干细胞的生长（M.Lamghari，M.J.Almeida，S.Berland，etc.Stimulation of Bone Marrow Cells and Bone Formation by Nacre：In Vivo and In Vitro Studies，Bone，1999,25（2）：91S-94S.)。中国200510101001.6号专利申请公开了一种水溶性珍珠母蛋白提取物，在一定条件下可促进MSCS细胞分化为成骨细胞的作用，并且能促使其形成矿化结节的作用。

珍珠母蛋白具有良好的生物相容性，安全性高。在国内外，珍珠母粉被认为是一种良好的骨组织替代材料。珍珠母移植或透皮注射到动物体内无免疫排斥反应或明显毒副作用。

珍珠母蛋白N16属于非水溶性珍珠母蛋白，分子量为16 kDa，在1999年由Samata等人在珍珠母不溶于水的组分中发现（Samata T, Hayashi N, Kono M, HasegawaK, Horita C, Akera S. A new matrix protein familyrelated to the nacreous layer formation of Pinctadafucata. FEBS Lett. 1999 Nov 26; 462(1-2):225-9.。并认为N16能影响碳酸钙结晶的形状。但目前还没有关于珍珠母非水溶性蛋白N16在治疗骨科疾病药物中应用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种珍珠母蛋白N16的制备方法，并公开其在制备防治骨质疏松症及骨折药物中的应用。

为实现上述目标，本发明通过下述技术方案实现：

珍珠母蛋白N16（下简称为“N16”）的制备，由下述步骤完成：

1、从马氏珠母贝Pinctada fucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA；

2、根据NCBI数据库N16的基因序列，设计引物：

引物N16F为5-GGAATTCCATATGGCTGTCCATTATAAGTGC-3’

引物 N16R为5-CGGGATCCTTAATTGTCAAACCGTTC-3’

其中下划线部位碱基分别为 NdeI 和BamHI限制性内切酶位点；

3、利用PCR法扩增N16基因，扩增所得N16基因连接到表达载体pET3α上，并导入大肠杆菌BL21 (DE3) plysS，用于表达N16蛋白，其表达条件为当大肠杆菌BL21 (DE3) plysS生长到对数期，加入0.1～1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，25～37℃诱导N16的表达6～16h，收集表达菌体；

4、分离纯化步骤：将表达菌体在pH 6.5～8.5的条件下进行包涵体分离，经离子交换层析结合凝胶排阻层析纯化得N16。

其中，PCR法扩增N16基因步骤中的反应程序优选为90～100℃下反应0.5～2分钟，45～60℃下反应 20～60秒，72℃下反应0.5～2分钟，共20～40个循环；最后65～75℃下反应 5～15分钟。

所述的分离纯化步骤可具体为：

（1）在pH 6.5～8.5条件下，以0.01～1 M Tris-HCl作为分散液将表达菌体分散，超声破碎，离心，弃上清液，收集不溶物A以洗涤缓冲液超声溶解，离心，收集不溶物B，所述洗涤缓冲液由1～3 M 尿素, 0.01～1 M Tris和 0.1% 吐温-20配制，pH 6.5～8.5；

（2）再以溶解缓冲液溶解不溶物B ，所述的溶解缓冲液由7～8 M尿素, 0.01～1 M Tris,和5～40 mMβ-巯基乙醇配制， pH 6.5～8.5；室温溶解不溶物B过夜，离心，取上清液，用0.2～0.45μm的滤膜过滤；以阴离子交换柱对N16进行初步纯化以及浓缩，其中，上样缓冲液的pH值为 6.5～8.5，由7～8 M 尿素, 0.01～1 M Tris和5～40 mM β-巯基乙醇配制，洗脱液的pH值为 6.5～8.5，由7～8 M 尿素、 0.01～1 M Tris、5～40 mM β-巯基乙醇和1～2M NaCl配制，洗脱方式为梯度洗脱，收集含N16的洗脱液，超滤浓缩，以Superdex 75或Superdex 200 柱子进行凝胶排阻层析，分离纯化得N16。

实验证明：所制备得到的N16能抑制前体破骨细胞的增殖，抑制RANKL诱导前体破骨细胞分化成为成熟的破骨细胞，抑制破骨细胞标志性酶酸性磷酸酶TRAP的活性，抑制破骨细胞actin ring的形成，抑制破骨细胞分化相关基因的表达，抑制破骨细胞分化成熟。

所制备得到的N16能提高成骨细胞标志性酶碱性磷酸酶ALP的活性，促进成骨细胞矿化结节的形成，提高成骨细胞分化相关基因的表达，促进成骨细胞分化成熟。

N16对去卵巢所致骨质疏松症的治疗实验证明N16对去卵巢致大鼠骨质疏松症的治疗具有明显的效果。

与现有技术相比，本发明具有以下裨益：本发明利用分子克隆技术构建N16蛋白的表达载体并利用大肠杆菌表达N16蛋白，经离子交换层析及凝胶排阻层析得到纯化的N16蛋白，并将纯化后的N16蛋白用于治疗骨质疏松、骨折等骨科疾病。动物实验表明N16蛋白具有抗骨质疏松活性，细胞实验表明，N16蛋白不仅能促进成骨细胞分化，更能抑制破骨细胞分化，从而达到抗骨质疏松和治疗骨折的目的。

附图说明

图1 为本发明中基因重组的N16 15% SDS-PAGE图。

图2 为N16抑制前体破骨细胞RAW 264.7的增殖结果图。

图3为N16抑制前体破骨细胞RAW 264.7分化实验的TRAP染色结果图。黑色箭头所示为成熟的破骨细胞，标尺为200μm。

图4为N16抑制前体破骨细胞RAW 264.7分化实验的多核破骨细胞数目统计结果图。

图5为N16抑制前体破骨细胞RAW 264.7分化实验的TRAP活性测定结果图。

图6为N16抑制破骨细胞肌动蛋白环的形成结果图。图7 为前体成骨细胞MC3T3-E1增殖实验结果图。

图8 为成骨细胞标志性酶ALP活性测定实验结果图。

图9 为矿化结节实验结果图。

图10 为AR-S含量测定结果图。

具体实施方式：

实施例1：N16的制备

从马氏珠母贝Pinctada fucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA。根据NCBI数据库N16的基因序列，设计引物N16F (5’-GGAATTCCATATGGCTGTCCATTATAAGTGC-3’) 和 N16R (5’-CGGGATCCTTAATTGTCAAACCGTTC-3’)，其中下划线部位碱基分别为 NdeI 和BamHI限制性内切酶位点。利用PCR法扩增N16基因，反应程序设为95℃ 1分钟，50℃ 20秒，72℃ 1分钟，共25个循环，最后72℃ 10分钟。扩增所得N16基因连接到表达载体pET3α上，并导入大肠杆菌BL21 (DE3) plysS，用于表达N16蛋白。当大肠杆菌BL21 (DE3) plysS生长到对数期，加入0.4 mM 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，37℃诱导N16的表达16 h后，收集表达菌体。

N16的纯化。将表达菌体分散在20 mM Tris-HCl（pH 7.0）中，超声破碎，离心，弃上清。不溶物以洗涤缓冲液（2 M 尿素, 20 mM Tris, 0.1% 吐温 20, pH 7.0) 超声溶解。离心，收集不溶物，再以溶解缓冲液（8 M 尿素, 20 mM Tris, 40 mM β-巯基乙醇, pH 7.0) 室温溶解过夜。离心，取上清液，0.45μm滤膜过滤。以DEAE柱子对N16进行初步纯化以及浓缩，其中，上样缓冲液为8 M 尿素, 20 mM Tris, 40 mM β-巯基乙醇, pH 7.0，洗脱液为8 M 尿素, 20 mM Tris, 40 mM β-巯基乙醇, 1 MNaCl，pH 7.0，洗脱方式为梯度洗脱。15% SDS-PAGE检测N16。收集含N16的洗脱液，超滤浓缩，以Superdex 75 柱子进行凝胶排阻层析，分离纯化N16。15% SDS-PAGE检测N16的纯度。

结果见图1。重组表达所得到的N16，分子量约为16kDa，与预测结果相吻合。纯度高，无明显可见杂蛋白条带，可用于后续实验。

在N16的制备实验中，根据实施例1的方法，改变PCR法扩增N16基因步骤中的反应程序为90℃下反应2分钟，60℃下反应20秒，72℃下反应0.5分钟，共35个循环；最后65℃下反应 5分钟，在25℃诱导N16的表达6小时后收集表达菌体，在pH 8.5的条件下对表达菌体进行分离纯化，所述的洗涤缓冲液变更为由3 M 尿素, 0.01 M Tris和 0.1% 吐温-20配制，溶解缓冲液变更为由7 M 尿素, 1 M Tris,和5 mM β-巯基乙醇配制，在以DEAE柱子对N16进行初步纯化以及浓缩中，上样缓冲液变更为由7 M 尿素, 1 M Tris和20 mM β-巯基乙醇配制，洗脱液由7M 尿素、1M Tris、5 mM β-巯基乙醇和2 M NaCl配制，用于制备N16,通过 15% SDS-PAGE检测产物所得到的N16，分子量约为16kDa，与预测结果相吻合，可用于后续实验。

再根据实施例1的方法，改变PCR法扩增N16基因步骤中的反应程序为100℃下反应0.5分钟，45℃下反应 60秒，72℃下反应2分钟，共20个循环；最后75℃下反应15分钟。在30℃诱导N16的表达10小时后收集表达菌体，在pH 6.5的条件下对表达菌体进行分离纯化，所述的洗涤缓冲液变更为由1 M 尿素, 1 M Tris和 0.1% 吐温-20配制，溶解缓冲液变更为由7 M 尿素, 0.01M Tris,和15 mMβ-巯基乙醇配制，在以DEAE柱子对N16进行初步纯化以及浓缩中，上样缓冲液变更为由7 M 尿素, 0.01 M Tris和5mM β-巯基乙醇配制，洗脱液由7M 尿素、0.01M Tris、25 mM β-巯基乙醇和1M NaCl配制。制备N16,通过 15% SDS-PAGE检测产物所得到的N16，分子量约为16kDa，与预测结果相吻合，可用于后续实验。

实施例2：N16抑制前体破骨细胞增殖、分化实验。

1. N16抑制前体破骨细胞增殖。

采用小鼠前体破骨细胞株RAW 264.7，于100U/mL青霉素，100g/mL链霉素的DMEM培养液中培养，培养细胞置于37℃、饱和湿度5% C0₂浓度下，2～3天换液1次。取对数生长期生长状态良好的细胞以3～5×10³个/孔接种于96孔培养板，每孔 180μl。37℃、5% C0₂培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，实验组加入不同浓度的N16，每个浓度设4个复孔。同时设阴性对照组（N16=0μM）。继续培养24、48、72小时。MTT法检测细胞增殖情况。

结果见图2。图2设阴性对照组（N16=0 μM）增殖率为100% （One-way ANOVA, *: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001，），与阴性对照组比较。证明N16能抑制前体破骨细胞RAW 264.7细胞的增殖，其抑制作用具有时间依赖性和浓度依赖性。作用48小时和72小时，N16对RAW 264.7细胞增殖半数抑制率的浓度分别约为20 μM和12μM。

2. N16抑制核因子-κB受体活化因子配基（RANKL）诱导RAW 264.7细胞向破骨细胞分化。

采用对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞，以1～3×10³个/孔接种于96孔培养板，每孔180μl。37℃、5% C0₂培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，弃去原培养基，更换为含50ng/ml RANKL的α-MEM培养基。实验组加入不同浓度的N16，每个浓度设4个复孔。同时设阴性对照组（含50ng/ml RANKL，不含N16）和正常对照组（不含50ng/ml RANKL）。继续培养72小时。酸性磷酸酶染色法检测破骨细胞，酸性磷酸酶活性测定试剂盒测定TRAP活性，鬼笔环肽-FITC荧光染色法测定破骨细胞肌动蛋白环的形成。

结果见图3到图6。其中的图3为N16抑制前体破骨细胞RAW 264.7分化实验的TRAP染色结果，黑色箭头所示为多核破骨细胞，标尺为200μm。图4为N16抑制前体破骨细胞RAW 264.7分化实验的多核破骨细胞数目统计结果。图5为N16抑制前体破骨细胞RAW 264.7分化实验的TRAP活性测定结果。（Non-paired Student’s t-test, #: P<0.05,##: P<0.01, ###: P<0.001, 阴性对照组（RANKL）与空白对照组（RANKL-）比较； One-way ANOVA, *: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001,与阴性对照组（RANKL）比较。）

如图3 TRAP染色结果显示，RAW 264.7细胞在RANKL的诱导下，能分化成为多核破骨细胞（核数目>3），细胞体积增大，TRAP表达增多，TRAP染色呈紫红色。N16能抑制RANKL 诱导RAW 264.7细胞分化成为成熟的破骨细胞。统计每组多核破骨细胞的数目并比较每组差异，统计结果见图4。可见N16对多核破骨细胞形成的抑制作用具有浓度依赖性（IC₅₀=0.5 μM）。TRAP是破骨细胞分化的标志性酶。测定TRAP活性，结果见图5。N16抑制RAW 264.7细胞TRAP 的活性（IC₅₀=0.6μM），该抑制作用具有浓度依赖性。肌动蛋白环是破骨细胞吞噬旧骨时所必需形成的结构，对破骨细胞的进行骨吸收具有重要意义。如图6（图6中白色箭头所示为肌动蛋白环，标尺为200μm。）所示，鬼笔环肽-FITC荧光染色结果显示，在不含N16的RANKL诱导的RAW 264.7细胞中形成了明显的肌动蛋白环。在含N16的实验组中，肌动蛋白环形成的数目减少，体积变小。N16抑制肌动蛋白环的形成。上述实验表明，N16对破骨细胞的分化具有抑制作用。

3. N16抑制破骨细胞分化相关基因的表达。

采用对数生长期生长状态良好的RAW264.7细胞，以,3～5×10⁴个/孔接种于6孔培养板。37℃、5% C0₂培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，弃去原培养基，更换为含50ng/ml RANKL的α-MEM培养基。实验组加入不同浓度的N16。同时设阴性对照组（含50ng/ml RANKL，不含N16）和空白对照组（不含50ng/ml RANKL）。继续培养72小时。弃去原培养基，Trizol法提取mRNA，逆转录得cDNA，实时定量PCR法（qPCR）测定破骨细胞分化相关基因的表达情况。

表1 实施例2中所用到的引物

TRAP、c-Src、Cathepsin K和转录因子NFATc1与破骨细胞分化相关。TRAP是破骨细胞分化标志性酶，缺乏c-Src、Cathepsin K会损伤破骨细胞的骨吸收功能。转录因子NFATc1是RANKL诱导破骨细胞成熟通路中的重要因子。RANKL通过MAPK细胞信号通路，激活转录因子NFATc1，从而引起一系列下游破骨细胞分化相关因子的表达，从而诱导破骨细胞分化成熟。表2中的数据为实验组与空白对照组相应基因表达量比较的倍数。阴性对照组中，TRAP、c-Src、Cathepsin K和转录因子NFATc1在RANKL的诱导下，表达量增高。加入N16后，能抑制TRAP、c-Src、Cathepsin K和转录因子NFATc1的表达，表明N16能抑制破骨细胞的分化成熟。

表2 N16对破骨细胞分化相关基因的表达影响（mean ± SD）

(One-way ANOVA, *: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001，与阴性对照组比较).

实施例3：N16促进成骨细胞分化实验

1.N16对成骨细胞增殖影响实验

采用小鼠前体成骨细胞MC3T3-E1，于100U/mL青霉素，100g/mL链霉素的α-MEM培养液中培养，培养细胞置于37℃、饱和湿度5% C0₂浓度下，2～3天换液1次。取对数生长期生长状态良好的细胞以3～5×10³个/孔接种于96孔培养板，每孔 180μl。37℃、5% C0₂培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，实验组加入不同浓度的N16，每个浓度设4个复孔。继续培养48、72、96小时。MTT法检测细胞增殖情况。

结果见图7。N16作用48、72、96小时，对MC3T3-E1细胞的增殖没有显著影响，说明N16对MC3T3-E1细胞没有毒性。

2. N16提高成骨细胞标志性酶碱性磷酸酶活性。

取对数生长期生长状态良好的MC3T3-E1细胞以5×10³个/孔接种于96孔培养板，每孔 180μl。37℃、5% C0₂培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，培养基更换为分化培养基（含50 μg/ml 维生素C和10mM β-甘油磷酸钠）。加入不同浓度的N16，每个浓度设4个复孔。继续培养96小时。碱性磷酸酶测定试剂盒测定每组ALP活性，BCA法测定蛋白浓度。以测得的ALP活性除以各自的蛋白浓度和反应时间，得到酶的单位。比较各组酶活力单位的差异。

结果见8。碱性磷酸酶是成骨细胞分化的早期标志。N16作用96小时，能提高MC3T3-E1细胞ALP活性。其中，0.6、 1.25 和2.5 μM N16 分别使MC3T3-E1细胞ALP活性提高了18.5%、 20.5%和26.4%，表明N16能促进成骨细胞分化。

2001年，Moutahir-Belqasm 等的研究表明，50μg /ml 和100μg/ml 珍珠母水溶性蛋白分别提高了成骨细胞ALP活性20%和7%（Moutahir-Belqasm,E，Balmain，N．，Lieberrher,M．，Borzeix,S．，Berland，S．，Barthelemy,M．，Peduzzi,J．，Miler，C．，Lopez.Effect of water-solube matrix of nacre(Pinetada maxima)on alkaline phosphatase activity and Bcl-2 expressionin primary cultured osteoblasts from neonatal rat calvaria．Journal of Materials Science：Materials in Medicine 2001．12：1-6．）而在本次发明中，0.6μM（约7.74μg /ml）、 1.25μM（约16.13μg /ml）和2.5 μM （约32.25μg/ml） N16 分别使MC3T3-E1细胞ALP活性提高了18.5%、 20.5%和26.4%，效果明显优于珍珠母水溶性蛋白。

3.N16促进成骨细胞矿化结节的产生。

取对数生长期生长状态良好的MC3T3-E1细胞以5×10⁴个/孔接种于24孔培养板，37℃、5% C0₂培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，培养基更换为分化培养基（含50 μg/ml 维生素C和10 mM β-甘油磷酸钠）。加入不同浓度的N16，每个浓度设3个复孔。继续培养21天，每3天换一次液。第21天，茜素红（AR-S）染色，检测矿化结节。拍照后，采用10%（wt/vol）西吡氯铵溶解与钙离子特异性结合的茜素红染料，分光光度法测定其含量，比较各组茜素红染料的差异，以此代表各组矿化结节程度的差异。

结果见图9及图10。矿化结节是成骨细胞分化的最终阶段的标志，能和茜素红染料结合形成红色斑点。红色颜色越深，代表形成的矿化结节越多，成骨细胞越成熟，功能越强。从图9可见，N16能促进成骨细胞矿化结节的形成。图10显示，N16对成骨细胞矿化结节形成具有促进作用。1.25、 2.5和5 μM N16分别使MC3T3-E1细胞矿化程度提高了2.4、 4.2和 3倍。结果表明，N16能促进成骨细胞分化成熟，增强成骨细胞的矿化功能。

4. N16促进成骨细胞分化相关基因的表达。

采用对数生长期生长状态良好的MC3T3-E1细胞，以3～5×10⁴个/孔接种于6孔培养板， 37℃、5% C0₂培养箱中孵育24小时。细胞贴壁生长后，培养基更换为分化培养基（含50 μg/ml 维生素C和10 mMβ-甘油磷酸钠）。加入不同浓度的N16。继续培养72 h，弃去原培养基，Trizol法提取总mRNA，逆转录得cDNA，实时定量PCR法（qPCR）测定成骨细胞分化相关基因的表达情况。

表3 实施例3中所用到的引物

在成骨分化过程中，成骨细胞标志基因的表达量会显著升高。本实验测定了成骨细胞分化相关基因OPN、OCN和Runx2的表达量。表4中数据为数据为阴性对照组相应基因表达量的倍数。当基因表达量的改变大于2倍时，表示基因的表达量有改变。从表4可知，N16在1.25μM和2.5μM浓度下，促进了MC3T3-E1细胞OPN、OCN 和Runx2的表达，表明N16对成骨细胞的分化成熟具有促进作用。

表4 N16对破骨细胞分化相关基因的表达影响（mean ± SD）

实施例4： N16对去卵巢所致骨质疏松症的治疗实验

选6月龄雌性SD大鼠，体重300±20g，随机分为空白对照组（Ⅰ组）、模型对照组（Ⅱ组）、N16蛋白组（Ⅲ组，给药量为20μg/kg）、尼尔雌醇对照组（Ⅵ组），每组8只。除空白对照组外，其他各组实施去卵巢手术，空白对照组进行假手术。实施手术三周后，每周皮下注射给药5次，连续给药8周。测定各组动物股骨骨密度（BDM）、骨小梁面积及血清钙（Ca）、磷（P）、骨钙素（BGP）、碱性磷酸酶（ALP ）及动物24h空腹尿肌酐（Cr）、钙（Ca）及磷（P）含量。实验结果如下：

与空白组比较，模型组双侧股骨BMD明显降低，血清骨钙素含量、ALP活力均显著降低，尿液中Ca/Cr比值升高，表明动物出现骨质疏松症状，造模成功。与模型组比较，N16蛋白组及尼尔雌醇组双侧BMD均明显升高，见表5。N16蛋白组与模型组比较，血清Ca、P含量没有显著差异，但血清骨钙素、ALP活力显著高于模型组（表6）；去卵巢造成尿液中Ca/Cr、P/Cr比值升高，采用N16后，该比值明显降低（表7）。上述结果表明：N16蛋白对去卵巢致大鼠骨质疏松症的治疗具有明显的效果。

表5 各组大鼠股骨骨密度（BMD）测定结果

(One-way ANOVA, *: P<0.05, **: P<0.01, ***: P<0.001，与Ⅰ组比较；#：P<0.05, ##: P<0.01, ###: P<0.001，与Ⅱ组比较。下表亦同。)

将本发明数据与2004年陈连剑等人（陈连剑,李成,李婷. 珍珠活性蛋白抗骨质疏松的实验研究. 中药材第27卷第5期2004年5月）在对珍珠活性蛋白抗骨质疏松的实验研究中的实验数据对比，在本发明中，N16在动物实验中的给药量为20μg/kg，低于陈连剑等人的珍珠母活性蛋白在抗去卵巢大鼠骨质疏松实验中的用量（50μg/kg），且N16蛋白组中各检测指标与模型组相比多具有非常显著性差异，而珍珠母活性蛋白组与模型组相比只有显著性差异，可见N16的效果较珍珠母活性蛋白更明显，具有意料之外的实验结果。

表6 各组大鼠血清骨生化指标的测定结果

表7 各组大鼠24 h空腹尿液中骨生化指标的测定结果

Claims

1.珍珠母蛋白N16的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1.1从马氏珠母贝Pinctada fucata中提取总mRNA，经逆转录，产生单链cDNA；

1.2根据NCBI数据库N16的基因序列，设计引物：

引物N16F为5-GGAATTCCATATGGCTGTCCATTATAAGTGC-3’

引物 N16R为5-CGGGATCCTTAATTGTCAAACCGTTC-3’

其中下划线部位碱基分别为 NdeI 和BamHI限制性内切酶位点；

1.3利用PCR法扩增N16基因，扩增所得N16基因连接到表达载体pET3α上，并导入大肠杆菌BL21 (DE3) plysS，用于表达N16蛋白，其表达条件为当大肠杆菌BL21 (DE3) plysS生长到对数期，加入0.1～1mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，25～37℃诱导N16的表达6～16h，收集表达菌体；

1.4分离纯化步骤：将表达菌体在pH 6.5～8.5的条件下进行包涵体分离，经离子交换层析结合凝胶排阻层析纯化得珍珠母蛋白N16。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述1.3步骤中PCR法扩增N16基因的反应程序设为90～100℃下反应 0.5～2分钟，45～60℃下反应 20～60秒，72℃下反应0.5～2分钟，共20～40个循环；最后65～75℃下反应 5～15分钟。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述的分离纯化步骤具体为：

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于:所述1.3步骤中PCR法扩增N16基因的反应程序设为95℃下反应 1分钟，50℃下反应 20秒，72℃下反应1分钟，共25个循环，最后72℃下反应10分钟；所述的表达条件是异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的加入量为0.4 mM，37℃诱导N16的表达16 h；所述的Tris-HCl分散液的浓度为20 mM ，pH 7.0；

所述洗涤缓冲液由2 M 尿素、20 mM Tris和 0.1% 吐温-20配制，pH 7.0；所述的溶解缓冲液由8 M尿素、20 mM Tris和40 mMβ-巯基乙醇配制, pH 7.0；室温溶解不溶物B过夜，离心，取上清液后以0.45μm滤膜过滤，以DEAE柱子对N16进行初步纯化以及浓缩，其中，上样缓冲液pH 7.0，由8 M 尿素、20 mMTris和 40 mMβ-巯基乙醇配制,洗脱液pH 7.0，由8 M尿素、20mM Tris、40 mM β-巯基乙醇和1 M NaCl配制。

5.珍珠母蛋白N16在制备预防或治疗骨质疏松症药物中的应用。

6.珍珠母蛋白N16在制备治疗骨折药物中的应用。