CN104312969B - 脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用。所述细胞网络模型包括原代同源的中枢神经系统毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元，按其在体内相对空间位置及数量关系进行立体化共培养，利用低氧调控系统/普通细胞培养系统和无糖细胞培养液/正常细胞培养液，模拟体内脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤时中枢神经系统中的氧糖剥夺/复氧糖环境。本发明首次提出经插件内腔中枢神经系统毛细血管内皮细胞培养液给药的药物研究模式，更符合生物体药代动力学，用于脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤产生与发展机制的深入研究，为临床诊断标志物以及药物研究与评价提供新的细胞网络模型。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种以中枢神经系统毛细血管内皮细胞(endothelial cells,E)、星形胶质细胞(astrocytes,A)及神经元(neurons,N)所形成的原代同源三细胞四维模型为基础的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型及其构建方法和应用。
背景技术
脑与脊髓急性缺血性卒中具有高发病率、高死亡率、高致残率以及高复发率等特点，是严重危害人类生命与健康的重大医学问题。临床上一直通过发病后急性给药以及对高危人群预防给药的方式来干预脑与脊髓急性缺血性卒中，但收效甚微。
近年来，人们对脑与脊髓急性缺血性卒中及其干预药物研究越来越多，对其产生与发展的机制也越来越明确，但与已有经典药物相比尚未取得重要突破，也并没有任何一种特效药物对大多数脑与脊髓急性缺血性卒中患者适用。
实验室研究中，传统的体外细胞药物研发模型所筛选的新药虽然在基础实验阶段具有明显的作用效果，但在进入体内实验后其成功率却很低，其主要原因是脑与脊髓急性缺血性卒中的发生发展过程是一个包含了多基因、多因素、多细胞相互作用的复杂途径。
目前急性缺血/再灌注损伤的体外研究模型主要为某一细胞单独培养，相关的药物研究模式更是将药物直接暴露于靶细胞，如N、A，忽略了中枢神经系统中多细胞间、细胞与间质间相互作用的系统关系，以及生物体内药物自循环系统经血脑屏障进入中枢神经系统的药物代谢途径，同体内真实情况相差甚远，甚至导致所培养细胞丧失其在体内重要的生物学特性。另一方面，如果不进行体外实验，直接进入体内动物实验，虽然能完整地保留系统的各种特征，但是过于复杂的体内环境和大量不可控因素以及动物之间的个体差异等因素将导致相关的实验结果产生偏差，这将对研究造成很大的障碍。
近年来，越来越多的研究者开始重视这一问题，关于中枢神经系统体外研究模型也在不断改善，多细胞共同培养也备受关注，从最初在一个平面培养环境中将几种中枢神经系统细胞混合培养，到利用支架材料实现多细胞立体化共培养，很多研究者都做了大量的尝试。在体外培养时每一种中枢神经系统细胞的培养液和培养条件均不相同，如何能优化出一种可以提供多种不同细胞共同生长且保持原有生物学状态的培养条件是实现多种不同中枢神经系统细胞在一个空间内体外共培养的前提。目前，现有体外共培养模型的细胞来源千差万别，有些是来源于人或动物细胞系，有些是原代细胞，也有通过干细胞转化，有的是将以上几大类甚至不同种属的细胞进行共培养。此外，共培养模型的细胞种类也各不相同，目前大多选择E、A、N以及周细胞中的两种或三种。共培养模型的支架材料选择更是各式各样，其中一大类是insert插件，而目前的研究为了能获得更好的E紧密连接实验参数值，大多研究者选择孔径为0.4μm的插件，这对单纯研究E紧密连接没有问题，但是如果要在插件底外侧面加入A进行共培养时，0.4μm的孔径是无法保证A的突起可以顺利穿过的；另一大类是微流控装置，这种方式虽然能通过较少的细胞数量实现多细胞共培养，但也正因如此，很多的实验由于细胞数量过少而无法完成，更加无法模拟各种细胞在体内的相对数量关系。
总而言之现有的中枢神经系统体外研究模型没有一种能更好的适用于脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤及其相关药物研究。因为在发生脑与脊髓急性缺血/再灌注时不仅仅只是N氧糖剥夺/复氧糖的变化，这一过程最重要的还有同N关系密切的A以及形成血脑屏障的E的状态改变。其中在相关药物研究中E的作用尤其重要，因为在体内任何一种药物都需要通过血液循环经血脑屏障到达中枢神经系统，而E和E间所形成的紧密连接正是构成血脑屏障的重要基础，而目前神经、精神疾病药物研究的一个瓶颈就是很多体外研究忽略了这一药代动力学过程，这主要是由于现阶段脑与脊髓急性缺血/再灌注体外研究模型无法模拟体内重要细胞相互作用、相互影响、相互制约的真实情况，而是将要药物直接作用于中枢神经系统靶细胞中，因此而产生的研究结果和体内的真实情况相差甚远，这应是为何目前的很多药物研究无法实现从体外研究到体内研究的转化的一个重要原因。基于上述原因，目前迫切需要建立一种更加接近于体内环境的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤及其相关药物研究用体外模型。
CN201310065078.7的发明专利公开“中枢神经系统药物研究的原代同源三细胞四维模型及构建方法”，其按照体内中枢神经系统E、A和N的相对空间结构，构建了原代同源EAN三细胞四维模型。但是按照该模型的构建方法所获得的E的紧密连接程度往往偏低，无法满足损伤实验和药物研究的要求。
发明内容
本发明的目的是提供了一种以E、A及N所形成的原代同源三细胞四维模型为基础的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型。
本发明的再一目的是提供上述脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型的构建方法，以原代同源E、A及N三种重要细胞，按其在体内的相对空间位置及数量关系进行立体化共培养，利用低氧调控系统/普通细胞培养系统和无糖细胞培养液/正常细胞培养液，模拟体内脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤。
本发明的另一目的是提供上述脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型的应用，采用经插件内腔E培养液给药方式，模拟生物体内药物自循环系统经血脑屏障进入中枢神经系统的药物代谢途径，将该模型作为药物筛选平台应用于相关防治干预研究，以解决目前研究所存在的上述技术问题。
根据本发明的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型，其包括原代同源的E、A及N，
其中，将原代培养已经纯化的A进行胰酶消化，同时将长满E的插件从培养孔取出倒置放于无菌培养皿中，将A悬液植于插件底膜外侧面，之后该无菌培养皿置于普通细胞培养系统孵育；然后，插件翻转插入装有E完全培养液的培养孔，同时在插件内加入E完全培养液，待E和A共培养后，将E和A共培养的插件放置于已经成熟稳定的N培养孔中，既构建了基础EAN细胞网络模型，其构造如图1所示：在培养孔中插有Transwell插件，插件外腔有N完全培养液，内腔有E完全培养液；N生长于培养孔底面；所述插件底部内侧面涂有胶原蛋白Ⅳ，以模拟中枢神经系统E-A间隙基底膜蛋白层；插件底部内侧面胶原蛋白Ⅳ上层生长有E，插件底部外侧面生长有A，其突起通过插件底孔穿向E底面；
其中，通过将基础EAN从普通细胞培养系统(37℃，5％CO2)中取出，在低氧调控系统中，在无糖无氧E、N培养液中、于37℃，95％N2和5％CO2混合气条件下实施氧糖剥夺处理，然后将细胞模型重新置于普通细胞培养系统内继续培养30分钟、3小时或3天，既细胞模型进入复氧糖环境，以模拟脑与脊髓急性缺血后再灌注，复氧糖的三个时间窗分别对应临床上急性缺血后再灌注的超急性期、急性期和亚急性期。
根据本发明的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤的细胞网络模型构建方法包括以下步骤：
1、中枢神经系统原代同源基础EAN细胞网络模型(basal network of thematured brain/spinal capillary endothelial cells-astrocytes-neurons,BNEAN)的构建
用现有技术分别提取SD大鼠大脑皮质的E、A、N(其中A和N取自新生24小时SD大鼠，E取自成年220～280g雄性SD大鼠)并分别进行原代培养；将原代培养5-9天已成熟的E种植到已包被胶原蛋白的插件底膜内侧面，插件内、外腔均为E完全培养液，大约2-6天待E长满插件底面并且形成紧密连接(根据本实验室电阻值及荧光素钠透过率测定计算以及荧光染色形态学分析)时，将原代培养10天左右已经纯化的A进行胰酶消化，同时将长满E的插件从培养孔取出倒置放于无菌培养皿中，将A细胞悬液植于插件底膜外侧面；之后该无菌培养皿置于普通细胞培养系统(37℃，5％CO2)孵育3小时；3小时后，插件翻转插入装有E完全培养液的培养孔，同时在插件内加入E完全培养液。待EA共培养4-5天(A基本长满插件底膜外腔面)，将EA共培养的插件放置于生长1周左右已经成熟稳定的N培养孔中，既构建了BNEAN细胞网络模型，其构造如图1所示：在培养孔中插有Transwell插件，插件外腔有N完全培养液，内腔有E完全培养液；N生长于培养孔底面；所述插件底部内侧面涂有胶原蛋白Ⅳ，以模拟中枢神经系统E-A间隙基底膜蛋白层；插件底部内侧面胶原蛋白Ⅳ上层生长有E，插件底部外侧面生长有A，其突起通过插件底孔穿向E底面。
2、脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型(diseased network of thematured brain/spinal capillary endothelial cells-astrocytes-neurons by oxygenand glucose deprivation/reoxygenation and recovery of glucose,DNEANogd/r)的构建
根据三种细胞的生长状态，选择成功构建后1-2天的BNEAN进行体外DNEANogd/r的构建。本发明利用具有O2和CO2浓度自动监测和调节功能的小型低氧调控系统(美国，Coy)在体外为细胞提供无氧环境。实验开始前一天，将N和E无糖培养液置于低氧调控系统中平衡过夜，以充分排除液体内溶解的O2。实验时，将BNEAN从普通细胞培养系统(37℃，5％CO2)中取出，在低氧调控系统中，以无糖无氧E、N培养液分别完全置换插件内、外腔的E、N完全培养液，再将细胞置于37℃，95％N2和5％CO2混合气培养舱中开始氧糖剥夺处理2小时。此时，整个细胞模型处于急性缺氧缺糖环境中，以模拟脑与脊髓急性缺血时中枢神经系统的状态。急性缺氧缺糖处理完成后，将插件内、外腔无糖细胞培养液分别更换为正常的E和N完全培养液，同时将细胞模型重新置于普通细胞培养系统内继续培养30分钟、3小时或3天，既细胞模型进入复氧糖环境，以模拟脑与脊髓急性缺血后再灌注，复氧糖的三个时间窗分别对应临床上急性缺血后再灌注的超急性期、急性期和亚急性期。
本发明还提供了脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型用于药物干预(pharmacological intervention of the DNEANogd/r,PNEANogd/r)、药物筛选的应用。本发明针对脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤的治疗特点，将其药物研究模式分为两大类：预处理给药和损伤后急性给药。①预处理给药：在进行体外急性缺血/再灌注前，于E培养液中加入药物预处理3小时，之后进行氧糖剥夺/复氧糖处理；②损伤后急性给药：按照2中的步骤进行氧糖剥夺2小时，之后在复氧糖的同时于E培养液中加入药物。本发明中所涉及的药物相关研究均采用经E培养液给药模式，以模拟体内药物自循环系统经血脑屏障进入中枢神经系统的药物代谢动力学特征。
本发明首次以来源于同一种属动物(包括大鼠、小鼠及人等各种高级动物)相同部位(脑/脊髓)的EAN三种原代细胞按其在体内相对空间位置及数量关系进行立体化共培养，建立了脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤模型。本发明所涉及的三种基础细胞均采用来自同一种属的相同部位的原代细胞按其在体内相对空间位置及数量关系进行立体化共培养，最大限度地保留了三种基本细胞在体内的生物学状态，能够更准确地反映体内信息。本发明利用低氧调控系统/普通细胞培养系统和无糖细胞培养液/正常细胞培养液，来模拟体内脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤时中枢神经系统中的氧糖剥夺/复氧糖环境。本发明首次提出一种经插件内腔E培养基给药的药物研究模式，而非以往的体外研究将药物直接作用于中枢神经系统中的某一或某几种靶细胞，更符合生物体本身的药代动力学，即，药物自循环系统经血脑屏障进入中枢神经系统。本发明既可用于脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤产生与发展机制的深入研究，亦可作为临床诊断标志物以及药物(药物靶点、药物效应、药物毒副作用、药代动力学等)研究与评价的新细胞网络模型。
附图说明
图1为本发明实施例BEAN模型构造示意图。
图2为本发明实施例BEAN模型构建时间轴示意图。
图3是BNEAN组加入与药物体积等量的DMSO后正常培养8h在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片；
图4是DNEANogd/r组加入与药物体积等量的DMSO3h，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片；
图5是PcNEANogd/r组加入0.1mg/ml GBE预处理3小时，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片；
图6是PcNEANogd/r组加入0.4mg/ml GBE预处理3小时，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片；
图7是PcNEANogd/r组加入1.6mg/ml GBE预处理3小时，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片
具体实施方式
实施例1
一、主要试剂的配制
1.N完全培养液：
将N基础培养液(Gibco 10888022)95％(V/V)、B27(Invitrogen 7504044)2％(V/V)、青链霉素1％(V/V)和L–谷氨酰胺2mM按照以上的比例进行混合，使用前放入37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育30分钟以上。
2.N种植培养液：
将DMEM高糖培养液(Gibco 11960044)90％(V/V)、胎牛血清10％(V/V)、青链霉素1％(V/V)和L–谷氨酰胺2mM按照以上的比例进行混合，使用前放入37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育30分钟以上。
3.N无糖培养液：
将N无糖基础培养液(Gibco 0050128DJ)95％(V/V)、B272％(V/V)、青链霉素1％(V/V)和L–谷氨酰胺2mM按照以上的比例进行混合，使用前放入37℃，95％N2、5％CO2低氧调控系统的细胞培养箱中孵育12h以上。
4.E完全培养液：
将87％MCDB131(Gibco M-131-500)(V/V)、1％青链霉素(V/V)、1％L–谷氨酰胺(2mM)、10％胎牛血清(V/V)和1％内皮细胞生长因子(Microvascular Growth Supplement,MGS)(Gibico S-005-25)按照上述比例进行混合，使用前加入ECGS，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育30分钟以上。注意在原代提取过程中所使用的培养液，需要添加嘌呤霉素(6μg/ml)和肝素(100μg/ml)，防止内皮细胞片段断裂成小片段。
5.E无糖培养液：
将87％DMEM无糖培养液(Gibco 11966-025)(V/V)、1％青链霉素(V/V)、1％L–谷氨酰胺(2mM)、10％胎牛血清(V/V)和1％MGS(Gibico S-005-25)按照上述比例进行混合，使用前放入37℃，95％N2、5％CO2低氧调控系统的细胞培养箱中孵育12h以上。
6.A完全培养基：
将95％DMEM高糖培养液(Gibco 11960044)(V/V)、1％青链霉素(V/V)、1％L–谷氨酰胺(2mM)和10％胎牛血清(V/V)按照上述比例进行混合，使用前放入37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育30分钟以上。
二、脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤的细胞网络模型构建
1.中枢神经系统原代同源基础EAN细胞网络模型(basal network of thematured brain/spinal capillary endothelial cells-astrocytes-neurons,BNEAN)的构建
用现有技术分别提取SD大鼠大脑皮质的E、A、N(其中A和N取自新生24小时SD大鼠，E取自成年220～280g雄性SD大鼠)并分别进行原代培养；将原代培养5-9天已成熟的E种植到已包被胶原蛋白的插件底膜内侧面，插件内、外腔均为E完全培养液，大约2-6天待E长满插件底面并且形成紧密连接(根据本实验室电阻值及荧光素钠透过率测定计算以及荧光染色形态学分析)时，将原代培养10天左右已经纯化的A进行胰酶消化，同时将长满E的插件从培养孔取出倒置放于无菌培养皿中，将A细胞悬液植于插件底膜外侧面；之后该无菌培养皿置于普通细胞培养系统(37℃，5％CO2)孵育3小时；3小时后，插件翻转插入装有E完全培养液的培养孔，同时在插件内加入E完全培养液。待EA共培养4-5天(A基本长满插件底膜外腔面)，将EA共培养的插件放置于生长1周左右已经成熟稳定的N培养孔中，既构建了BNEAN细胞网络模型，其构造如图1所示：在培养孔中插有Transwell插件，插件外腔有N完全培养液，内腔有E完全培养液；N生长于培养孔底面；所述插件底部内侧面涂有胶原蛋白Ⅳ，以模拟中枢神经系统E-A间隙基底膜蛋白层；插件底部内侧面胶原蛋白Ⅳ上层生长有E，插件底部外侧面生长有A，其突起通过插件底孔穿向E底面。
2.脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型(diseased network of thematured brain/spinal capillary endothelial cells-astrocytes-neurons by oxygenand glucose deprivation/reoxygenation and recovery of glucose,DNEANogd/r)的构建
根据三种细胞的生长状态，选择成功构建后1-2天的BNEAN进行体外DNEANogd/r的构建。本发明利用具有O2和CO2浓度自动监测和调节功能的小型低氧调控系统(美国，Coy)在体外为细胞提供无氧环境。实验开始前一天，将N和E无糖培养液置于低氧调控系统中平衡过夜，以充分排除液体内溶解的O2。实验时，将BNEAN从普通细胞培养系统(37℃，5％CO2)中取出，在低氧调控系统中，以无糖无氧E、N培养液分别完全置换插件内、外腔的E、N完全培养液，再将细胞置于37℃，95％N2和5％CO2混合气培养舱中开始氧糖剥夺处理2小时。此时，整个细胞模型处于急性缺氧缺糖环境中，以模拟脑与脊髓急性缺血时中枢神经系统的状态。急性缺氧缺糖处理完成后，将插件内、外腔无糖细胞培养液分别更换为正常的E和N完全培养液，同时将细胞模型重新置于普通细胞培养系统内继续培养30分钟、3小时或3天，既细胞模型进入复氧糖环境，以模拟脑与脊髓急性缺血后再灌注，复氧糖的三个时间窗分别对应临床上急性缺血后再灌注的超急性期、急性期和亚急性期。
三、脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤的细胞网络模型监测及阳性药物的药效评价
(一)实验方法
1.药品与试剂选择的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤阳性保护药物为银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)购自NUNC，以DMSO溶解，各样本的终浓度均以μmol/L表示。实验用SD大鼠均由大连医科大学实验动物中心提供。MTT(Sigma)，Tritonx100(Solarbio)，NaF(Sigma)，LDH试剂盒(自南京建成)，TUNEL细胞凋亡试剂盒(Roche)生物技术有限公司，Transwell插件(Millipore)，抗体均购自Abcam公司。
2.实验分组
(1)正常(BNEAN)组：加入与药物体积等量的DMSO后正常培养8h。
(2)损伤(DNEANogd/r)组：加入与药物体积等量的DMSO 3h，糖氧剥夺2h，复氧糖3h。
(3)阳性药物预处理(PcNEANogd/r)组：加入GBE(浓度分别为0.1mg/ml、0.4mg/ml和1.6mg/ml)预处理3小时，糖氧剥夺2h，复氧糖3h。
3.倒置相差显微镜观察细胞状态
利用显微镜粗调螺旋调节物镜高度，依次观察E、A、N基础状态、损伤状态以及药物干预状态下的形态，显微镜相机拍照(Nikon，日本)。
4.长有E、A插件的电阻值测定
利用电阻仪(Millicell ERS-2，美国)测定insert插件内侧面E的电阻值，长电极在插件外部，短电极在插件内部，短电极不能与插件中的半透膜接触，长电极需与培养孔中的底部尽量接近但不能接触。同时确保两电极与培养板平面成90°夹角。当读数稳定后，记录数值。每个插件至少测量三次，并且每次测量时都要改变位置。用电阻仪在不同的时间测定电阻值，可间接反映E间紧密连接的变化。
5.长有E、A插件的荧光素钠(NaF)透过率测定
将模型中插件内的E培养液更换为Ring-Hepes Buffer(136mM NaCl、0.9mMCaCl2、0.5mM MgCl2、2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、10mM NaH2PO4、25mM glucose、10mM Hepes、pH 7.4)，同时加入浓度为25mM的Na-F，设定6个时间点，分别为10min、15min、20min、30min、45min、60min。每到一个时间点，将insert放入一个放有新的含有Ring-Hepes Buffer的培养孔中。最后收集所有培养孔和插件内的Ring-Hepes Buffer，利用荧光酶标仪分别测定其中的Na-F的浓度，利用公式进行测定荧光素钠(NaF)透过率。公式为Pd(cm/s)＝(Cdow/t)×(1/S)×(Vdow/Vup)；其中：Cdow是下室NaF的浓度，t(s)是时间间隔，S(cm2)是内皮细胞层的面积，Vdow(m3)是下室溶液体积，Vup是上室NaF浓度。测定不同状态下NaF透过率，可反映血脑屏障通透性。
6.细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)测定
取不同状态下插件内、外腔细胞培养上清，按试剂盒说明书检测上清中LDH含量，以判断细胞损伤程度。
7.MTT检测细胞活性
弃去培养液，用PBS冲洗，每1ml培养液中加入100μl MTT(MTT用锡纸包裹，加入时注意避光)，放入孵箱继续培养3h后终止培养，将待测液吸出，加入与MTT等量DMSO，在摇床上震荡混匀10min待紫色结晶颗粒充分溶解后，按组别分别加入96孔板中，每孔200ul，在酶联免疫检测仪波长490nm处测量各孔的吸光值。
8.TUNEL法细胞凋亡检测
取出插件，弃去培养孔中培养液，用PBS漂洗3次，4％多聚甲醛中固定；用0.3％的Triton X-100中处理15min，PBS浸洗二次，每次5min；按试剂盒说明书操作，在荧光显微镜下计数凋亡细胞和总细胞数，计算细胞凋亡率。
(二)实验结果
1、相差显微镜观察N形态变化
图3是BNEAN组加入与药物体积等量的DMSO后正常培养8h在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片；
图4是DNEANogd/r组加入与药物体积等量的DMSO3h，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片；
图5是PcNEANogd/r组加入0.1mg/ml GBE预处理3小时，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片；
图6是PcNEANogd/r组加入0.4mg/ml GBE预处理3小时，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片；
图7是PcNEANogd/r组加入1.6mg/ml GBE预处理3小时，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后在倒置相差显微镜下200倍的细胞图片；
从相差显微镜下观察细胞形态来看，BNEAN组细胞生长状态良好，胞体饱满突起细长弯曲，突起数量较多交织成网状；DNEANogd/r组的N出现贴壁能力减弱，部分细胞漂浮，突起皱缩等现象；三个浓度PNEANogd/r组生长状况略好于DNEANogd/r组，N有一定程度的损伤，明显可见胞体中有空泡产生，且突起减少。
2.E紧密连接程度的比较
通过比较BNEAN组、DNEANogd/r组以及不同浓度阳性药物预处理的PcNEANogd/r组中长有E、A插件的电阻值和NaF透过率来判断各组间E紧密连接程度的变化。插件上E跨膜电阻和NaF透过率均是反映整个模型紧密连接最灵敏的指标。其中电阻值越高、NaF透过率越低，表示E间紧密连接功能越好。实验结果见表1和表2。
表1各实验组中长有E、A插件的电阻值比较
| 组分 | 药物浓度(mg/ml) | 1电阻值(Ω×cm2) |
| BNEAN组 | 171.875±9.561** | |
| DNEANogd/r组 | 68.130±8.961 | |
| PcNEANogd/r组 | 0.1 | 81.428±7.453 |
| 0.4 | 108.873±7.317** | |
| 1.6 | 109.500±8.455** |
1电阻值计算公式：本实施例选用的是6孔培养板插件，底面积S为cm2**P<0.01vs DNEANogd/r组
表2各实验组中长有E、A插件的NaF透过率比较
| 组分 | 药物浓度(mg/ml) | 1NaF透过率(cm/s) |
| BNEAN组 | 9.343±0.649** | |
| DNEANogd/r组 | 27.915±1.332 | |
| PcNEANogd/r组 | 0.1 | 22.960±0.620 |
| 0.4 | 14.438±0.699** | |
| 1.6 | 14.620±0.585** |
1NaF透过性系数公式：P总＝VR/(A×CO)×dc/dt，VR＝所测样品的总体积(ml)，A＝插件底面积(cm2)，本实施例选用的是6孔培养板插件，底面积S为cm2；CO＝检测物质的初浓度(μg/ml)；dc＝所测样品的浓度差(μg/ml)；dt＝所测样品的时间差(s)；NaF透过率＝1/P总值-1/P空白值
**P<0.01vs DNEANogd/r组
由表1和表2可以看出，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后插件上E跨膜电阻显著下降，NaF透过率显著增加，提示E紧密连接受损；0.4和1.6mg/ml阳性药物预处理可以明显保护糖氧剥夺/复氧糖对E紧密连接的损伤。
3.细胞培养上清中LDH测定
分别比较BNEAN组、DNEANogd/r组以及不同浓度阳性药物预处理的PcNEANogd/r组插件内、外腔细胞培养上清LDH释放量，以判断细胞的损伤程度，结果见表3。
表3各实验组插件内、外腔细胞培养上清LDH测定
| 组分 | 药物浓度(mg/ml) | 内腔LDH(U/L) | 外腔LDH(U/L) |
| BNEAN组 | 58.980±3.111** | 60.020±3.462** | |
| DNEANogd/r组 | 121.800±6.174 | 177.097±3.462 | |
| PcNEANogd/r组 | 0.1 | 89.070±0.999* | 144.685±8.266 |
| 0.4 | 70.432±2.031** | 76.855±3.272** | |
| 1.6 | 69.427±0.9** | 69.093±3.515** |
*P<0.05vs DNEANogd/r组，**P<0.01vs DNEANogd/r组
由表3可以看出，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后插件内、外腔细胞上清LDH释放量均显著增加，提示细胞受损，细胞膜完整性破坏；不同浓度阳性药物预处理可以明显抑制糖氧剥夺/复氧糖对E、A、N三细胞的损伤。
4.MTT法检测细胞活性
经MTT处理后，分别测定BNEAN组、DNEANogd/r组以及不同浓度阳性药物预处理的PcNEANogd/r组N在490nm波长处光吸收值，以间接反映活细胞数量，结果见表4。
表4各实验组神经元MTT(490nm)吸光值
| 组分 | 药物浓度(mg/ml) | MTT(OD) |
| BNEAN组 | 0.777±0.004** | |
| DNEANogd/r组 | 0.207±0.01 |
| PcNEANogd/r组 | 0.1 | 0.350±0.027 |
| 0.4 | 0.565±0.004** | |
| 1.6 | 0.518±0.002** |
**P<0.01vs DNEANogd/r组
由表4可以看出，糖氧剥夺2h，复氧糖3h后神经元MTT(OD)值显著下降，提示N存活率下降；0.4和1.6mg/ml阳性药物预处理可以明显抑制糖氧剥夺/复氧糖对N的损伤。
四、申请号CN201310065078.7与本实施例细胞模型在基础条件、急性缺血/再灌注损伤及阳性药物药效评价的比较
(一)实验方法
1.实验分组
同具体实施方法“三”中的实验分组操作相同，将本实施例和申请号为CN201310065078.7的细胞模型分别分为：
(1)正常(BNEAN)组：加入与药物体积等量的DMSO后正常培养8h。
(2)损伤(DNEANogd/r)组：加入与药物体积等量的DMSO 3h，糖氧剥夺2h，复氧糖3h。
(3)阳性药物预处理(PcNEANogd/r)组：加入GBE(浓度分别为0.1mg/ml、0.4mg/ml和1.6mg/ml)预处理3小时，糖氧剥夺2h，复氧糖3h。
分别检测不同处理状态下两种细胞模型的长有E、A插件的电阻值、NaF透过率以及N细胞活性，具体实验方法同上
(二)实验结果
1.两种细胞模型E紧密连接程度的比较
通过比较两种细胞模型BNEAN组、DNEANogd/r组以及不同浓度阳性药物预处理的PcNEANogd/r组中长有E、A插件的电阻值和NaF透过率来分别判断每种细胞模型各组间以及各种状态两种模型间E紧密连接程度的变化。插件上E跨膜电阻和NaF透过率均是反映整个模型紧密连接最灵敏的指标。其中电阻值越高、NaF透过率越低，表示E间紧密连接功能越好。实验结果见表5和表6。
表5各实验组中长有E、A插件的电阻值比较
1电阻值计算公式：本实施例选用的是6孔培养板插件，底面积S为cm2
**本实施例模型P<0.01vs DNEANogd/r组
#CN201310065078.7模型P<0.05vs DNEANogd/r组
##CN201310065078.7模型P<0.01vs DNEANogd/r组
&各种状态，CN201310065078.7模型P<0.05vs本实施例模型
&&各种状态，CN201310065078.7模型P<0.01vs本实施例模型
表6各实验组中长有E、A插件的NaF透过率比较
1NaF透过性系数公式：P总＝VR/(A×CO)×dc/dt，VR＝所测样品的总体积(ml)，A＝插件底面积(cm2)，本实施例选用的是6孔培养板插件，底面积S为cm2；CO＝检测物质的初浓度(μg/ml)；dc＝所测样品的浓度差(μg/ml)；dt＝所测样品的时间差(s)；NaF透过率＝1/P总值-1/P空白值
**本实施例模型P<0.01vs DNEANogd/r组
#CN201310065078.7模型P<0.05vs DNEANogd/r组
##CN201310065078.7模型P<0.01vs DNEANogd/r组
&各种状态，CN201310065078.7模型P<0.05vs本实施例模型
&&各种状态，CN201310065078.7模型P<0.01vs本实施例模型
由表5和表6可以看出，在基础模型中，本实施例E紧密连接程度要强于申请号为CN201310065078.7的细胞模型；两种模型在相同损伤条件刺激以及药物干预下，结果是完全不同的，主要原因是申请号为CN201310065078.7所公开的细胞模型无法获得有理想紧密连接程度的E层，因而在损伤以及药物干预处理时便无法起到应有的屏障功能。
2.MTT法检测细胞活性
经MTT处理后，分别测定两种细胞模型BNEAN组、DNEANogd/r组以及不同浓度阳性药物预处理的PcNEANogd/r组N在490nm波长处光吸收值，以间接反映两组不同状态下N活性，结果见表7。
表7各实验组神经元MTT(490nm)吸光值
**本实施例模型P<0.01vs DNEANogd/r组
#CN201310065078.7模型P<0.05vs DNEANogd/r组
##CN201310065078.7模型P<0.01vs DNEANogd/r组
&各种状态，CN201310065078.7模型P<0.05vs本实施例模型
&&各种状态，CN201310065078.7模型P<0.01vs本实施例模型
由表7可以看出，在基础状态下，两种细胞模型的N活性没有差异，但是在相同损伤条件刺激下，申请号CN201310065078.7细胞模型中的N活性明显低于本实施例(P<0.01)，而在三种给药浓度的干预下，CN201310065078.7细胞模型中的N在0.1mg/mlGBE预处理后，其活性明显增强，但是随着药物浓度的增加其活性逐渐降低，提示在CN201310065078.7细胞模型中，由于其E的紧密连接程度不够，因而使得药物通过E、A进入模型下腔较为容易，从而使得在相同的给药浓度下，申请号CN201310065078.7细胞模型下腔的实际药物浓度要高于本实施例。
Claims (2)
1.一种脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型，其特征在于，所述脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤的细胞网络模型由包括以下步骤的方法构建，
(1)中枢神经系统原代同源基础EAN细胞网络模型的构建
(1-1)分别培养原代同源的中枢神经系统中毛细血管内皮细胞、星形胶质细胞及神经元；
(1-2)将原代培养后已成熟的中枢神经系统毛细血管内皮细胞种植到已包被胶原蛋白的插件底膜内侧面，插件内、外腔均为中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液，待中枢神经系统毛细血管内皮细胞长满插件底面并且形成紧密连接时，将原代培养后已经纯化的星形胶质细胞进行胰酶消化，同时取出长满中枢神经系统毛细血管内皮细胞的插件倒置放于无菌培养皿中，将星形胶质细胞悬液植于插件底膜外侧面；之后该无菌培养皿置于普通细胞培养系统孵育3小时；
(1-3)插件翻转插入装有中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液的培养孔，同时在插件内加入中枢神经系统毛细血管内皮细胞完全培养液，待中枢神经系统毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养至星形胶质细胞基本长满插件底膜外腔面，将中枢神经系统毛细血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养的插件放置于已经成熟稳定的神经元培养孔中，即构建了基础细胞网络模型，
(2)脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型的构建
(2-1)将中枢神经系统毛细血管内皮细胞无糖培养液和神经元无糖培养液置于低氧调控系统中平衡过夜，以充分排除液体内溶解的O2，实验时，取出基础细胞网路模型，在低氧调控系统内，以无糖无氧中枢神经系统毛细血管内皮细胞和神经元培养液分别完全置换插件内、外腔的中枢神经系统毛细血管内皮细胞和神经元完全培养液，再将细胞置于37℃，95％N2和5％CO2混合气培养舱中开始氧糖剥夺处理2小时，此时，整个细胞模型处于急性缺氧缺糖环境中，以模拟脑与脊髓急性缺血时中枢神经系统的状态；
(2-2)急性氧糖剥夺处理完成后，将插件内、外腔无糖细胞培养液分别更换为正常的中枢神经系统毛细血管内皮细和神经元完全培养液，同时将细胞模型重新置于普通细胞培养系统内继续培养30分钟、3小时或3天，以模拟脑与脊髓急性缺血后再灌注。
2.根据权利要求1所述的脑与脊髓急性缺血/再灌注损伤细胞网络模型，其特征在于，所述神经元无糖培养液按体积比包括：
95％的神经元无糖基础培养液、2％B27、以及1％青链霉素和浓度为2mM L–谷氨酰胺，
所述中枢神经系统毛细血管内皮细胞无糖培养液按体积比包括：
87％DMEM无糖培养液、体积比为1％的青链霉素、1％浓度为2mM的L–谷氨酰胺、10％胎牛血清以及1％MGS。
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