CN107460122B - 细胞聚球三维培养及药物筛选的装置和该装置的使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置和该装置的使用方法，该装置包括主体芯片，所述主体芯片表面凹陷形成至少一个工作室，所述工作室包括培养基室、药物室以及若干各自连通所述培养基室和药物室的细胞培养室；所述培养基室通过直连的培养基通道与各个所述细胞培养室连通；所述药物室通过用于形成浓度梯度的分流通道与各个所述细胞培养室连通。本发明肝细胞聚球三维培养装置能够准确模拟在体细胞状态、实现高通量毒性筛选。

Description

细胞聚球三维培养及药物筛选的装置和该装置的使用方法
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，具体而言，本发明涉及一种肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置和该装置的使用方法。
背景技术
尽管现在三维培养方式较多，但只是单纯的实现了细胞三维培养，很多并未真正实现在体细胞状态，如缺少灌注剪切力等。
细胞三维培养同时运用于药物筛选，还需要实现高通量。在药物研发阶段进行细胞毒性筛选，常常化合物数量巨大。此外，新药研发过程中由于药物毒性过大是导致新药研究和开发失败的重要原因之一，因此，在药物发现阶段进行药物毒性筛选有助于降低研究和开发费用，指导药物衍生物，提高新药研发的成功率。
综上，如何准确模拟在体细胞状态，构建体外细胞三维培养同时实现药物高通量毒性筛选是药物研发过程中面临的主要问题之一。
发明内容
本发明的目的旨在提供一种准确模拟在体细胞状态，同时能实现高通量毒性筛选的肝细胞聚球三维培养装置。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，包括主体芯片，所述主体芯片表面凹陷形成至少一个工作室，所述工作室包括培养基室、药物室以及若干各自连通所述培养基室和药物室的细胞培养室；所述培养基室通过直连的培养基通道与各个所述细胞培养室连通；所述药物室通过用于形成浓度梯度的分流通道与各个所述细胞培养室连通。
优选地，所述细胞培养室包括缓冲通道、液体入口、接种入口和培养孔，其中每一个缓冲通道的入口端同时与培养基通道和药物室其中一个分流通道的出口连通；所述细胞培养室的个数与分流通道的出口/入口个数相同，也与培养基通道的个数相同。
优选地，所述缓冲通道设为s型。
优选地，所述细胞培养室还设有废液排出通道，所述废液排出通道与接种入口共用通道。
优选地，所述培养孔为阵列式分布，所述培养孔的直径为400um，培养孔之间的间距为400um，深度为500um。
优选地，所述分流通道由一个或多个并列的药物通道从药物室的出口延伸形成，所述分流通道由一个或多个并列的药物通道从药物室的出口延伸形成，所述分流通道的末端均汇聚为单行通道。(是指同一个位置)
优选地，所述药物通道的个数根据药物浓度梯度设置，各个分流通道从药物室出口延伸出的药物通道个数比等于作用于细胞培养室的药物浓度比。
优选地，所述药物通道的宽度为300um，深度为2mm。
优选地，各个所述工作室之间共享一个培养基室，各个所述工作室独立配置一个药物室。
优选地，所述工作室设有四个，且相对于所述培养基室两两对称设置。
优选地，所述培养基通道的宽度为300um，深度为2mm。
优选地，所述主体芯片由聚二甲硅氧烷制成。
优选地，该装置还设有接合芯片和微量注射泵，所述接合芯片用于与主体芯片盖合并提供液体入口，所述微量注射泵用于控制所灌入的各种液体或细胞的流速。(优选地，该装置还设有接合芯片和微量注射泵，所述接合芯片用于与主体芯片盖合并提供液体入口，所述微量注射泵用于控制所灌入的各种液体或细胞的流速。)接合芯片与主体芯片互相重叠，相接合，防止发生细胞培养液或药物从芯片中渗出。
优选地，所述培养基室和药物室的横截面设为圆形。
优选地，所述主体芯片的长宽高分别为85.43mm，59.83mm，8mm。
本发明还提供了上述细胞聚球三维培养及药物筛选装置的使用方法，包括以下步骤：
制备上述的细胞聚球三维培养及药物筛选装置；
将目标细胞以导管进行自动化接种至细胞培养室的培养孔内，接种数量为500cell/孔，接种的速度为5-10ul/min；
将细胞聚球三维培养及药物筛选装置放入37℃，5％CO2的培养箱中静置贴壁，静置时间为2-3h；向细胞培养室持续灌注液体培养基，灌注速度为20ul/12h，每个细胞培养室内形成动态灌注细胞培养，2-3天后，细胞聚集成球；
停止培养基室的灌流，将配置好的已知浓度待测药物灌入药物室，灌入流速为20ul/12h，通过分流通道形成浓度梯度的待测药物灌注作用于细胞，作用时间为48-72h；
测定细胞活率，并对药物毒性进行计算。
上述使用方法中的细胞聚球三维培养及药物筛选装置采用上述任意一项所述的细胞聚球三维培养及药物筛选装置。
相比现有技术，本发明的方案具有以下优点：
(1)本发明提供的肝细胞聚球三维培养装置，通过设置细胞培养基以实现动态灌注细胞培养；同时，在细胞培养室设置了接种孔，使细胞接种更加便捷，同时防止污染；此外还设置了用于培养细胞的培养孔，为细胞聚球三维培养提供充足空间。以上，均使得细胞聚球培养装置更接近体细胞状态。
(2)通过将连接药物室和细胞培养室的主通道设置为单通道或多通道，以实现分流，从而形成浓度梯度，并且设置了多个工作室。具备高通量的特点，有利于进行药物毒性筛选。
(3)本发明提供的药物浓度梯度实施方法，可在同一芯片上实现同一药物多浓度梯度，还可实现多个工作室测定不同化合物的毒性优点，从而实现高通量。
(4)肝细胞聚球三维培养装置中，细胞培养室设置的小孔阵列区，还能满足细胞用于白蛋白功能、尿素等各项生化指标的测定。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1是本发明实施例1肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置的结构示意图；
图2是本发明实施例1肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置的局部放大图；
图3是平板二维培养原代大鼠肝细胞后细胞聚球培养状态图；
图4是本发明实施例1肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置接种大鼠原代肝细胞后细胞聚球培养状态图。
图中，1-主体芯片；10-工作室；101-培养基室；1011-培养基通道；102-药物室；1020-药物通道；1021-分流通道；1022-单行通道；103-细胞培养室；1031-缓冲通道；1032-液体入口；1033-接种入口；1034-培养孔。
具体实施方式
下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。此外，如果已知技术的详细描述对于示出本发明的特征是不必要的，则将其省略。
实施例1
1.肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置
见图1-2，本实例中，细胞聚球三维培养及药物筛选装置用于培养肝细胞，故又称肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置。该装置包括主体芯片1，一块与主体芯片1同样大小的接合芯片，以及与培养装置相通的微量注射泵；所述主体芯片1为聚二甲硅氧烷芯片，所述主体芯片1的长宽高分别为85.43mm，59.83mm，8mm。所述接合芯片用于与主体芯片1盖合并提供液体入口1032，所述微量注射泵用于灌入各种液体或细胞。
所述主体芯片1表面凹陷形成四个工作室10，且两两对称设置，所述工作室10包括培养基室101、药物室102以及若干各自连通所述培养基室101和药物室102的细胞培养室103。所述工作室10之间共享一个培养基室101，各个工作室10独立配置一个药物室102。
所述培养基室101通过直连的培养基通道1011与各个所述细胞培养室103连通，所述培养基室的横截面101设为圆形，所述培养基通道1011的宽度为300um，深度为2mm。
所述药物室102通过用于形成浓度梯度的分流通道1021与各个所述细胞培养室103连通。所述药物室102对应设有三个分流通道1021，所述分流通道1021由一个或多个并列的药物通道1020从药物室102的出口延伸形成，各个所述药物通道1020等宽等深，所述分流通道1021的末端均汇聚为单行通道1022，所述单行通道1022的宽度和深度均与药物通道1020相等。所述药物通道1020的个数根据药物浓度梯度设置，各个分流通道1021从药物室102出口延伸出的药物通道1020个数比为1:2:3，即作用于细胞培养室的药物浓度比为1:2:3。三个分流通道1021均匀地分布在药物室102的一侧，且相邻的两个分流通道1021的轴线之间夹角为60°。所述药物室的横截面102设为圆形，所述药物通道1020的宽度为300um，深度为2mm。
每个工作室10内细胞培养室103设有三个，所述细胞培养室103包括缓冲通道1031、液体入口1032、接种入口1033和培养孔1034，其中每一个缓冲通道1031的入口端同时与培养基通道1011和药物室102其中一个分流通道1021的出口连通；所述细胞培养室103的个数与分流通道1021的出口/入口个数相同，也与培养基通道1011的个数相同。所述缓冲通道1031设为s型。所述细胞培养室103还设有废液排出通道，所述废液排出通道与接种入口1033共用通道。所述培养孔1034为阵列式分布，所述培养孔1034的直径为400um，培养孔1034之间的间距为400um，深度为500um。
在本实施例中，该装置采用3D打印和再灌模技术制作而成，在细胞聚球培养前，需进行高压灭菌、消毒烤干的处理。
2.肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置的使用方法
1)器材准备：
提取大鼠原代肝细胞进行细胞三维培养，SPF级雌性Sprague-Dawley大鼠，体质量200～250g，购自南方医科大学实验动物中心。Ⅳ型胶原酶购自Invitrogen公司。DMEM高糖培养基购自HyClone公司。I型胶原购自sigma公司。氯化钠、氯化钾、二水合氯化钙、HEPES、氢氧化钠、台盼蓝均为分析纯，购自国药化学试剂有限公司。
双人双面超净工作台苏州净化设备有限公司，倒置相差显微镜购自OLYMPUS公司。CO2恒温培养箱与酶标仪购自Thermo Fisher Scientific公司
2)培养板包被：在超净工作台内取10mg/ml的I型胶原加入培养板中，静置，待培养板晾干后用无菌的PBS液清洗2～3次后使用。
3)主要缓冲液的配制：包括前灌注液的配制、胶原酶灌注液的配制和肝细胞洗涤液的配制，如表1-3所示。
表1前灌注液的配制
上述前灌注液用三蒸水定容至1000ml，磁力搅拌器搅拌混匀，调整pH至7.4，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃分装保存。
表2胶原酶灌注液的配制
上述胶原酶灌注液用三蒸水定容至1000ml，磁力搅拌器搅拌混匀，调整pH至至7.6，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃分装保存。
表3肝细胞洗涤液的配制
上述肝细胞洗涤液用三蒸水定容至1000ml，磁力搅拌器搅拌混匀，调整pH至7.4，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃分装保存。
4)大鼠原代肝细胞的分离及活性评价
A.麻醉：大鼠腹腔单次注射3％戊巴比妥钠(剂量45mg/kg)，6-10分钟麻醉妥当后，至于无菌手术台，腹部除毛，术区碘伏消毒3遍，铺无菌洞巾；
B.腹部大十字切口开腹，腹腔内注射肝素钠1250U(12500U/2ml，0.2ml)；
C.将肠袢翻向左下腹，用无菌盐水纱布块覆盖。显露肝门部门静脉并游离2-3cm，游离并结扎脾静脉(不断)，门静脉留置2根结扎线(1根固定门静脉灌注管，1根结扎门静脉远端)，暂不结扎；显露肝下下腔静脉并游离2-3cm，留置1根结扎线；
D.提拉门静脉近端结扎线，使门静脉充盈，远端结扎线打结，用显微剪刀剪开门静脉前壁，行门静脉插管(22G静脉留置套管针)，结扎线固定；
E.以37℃预热的前灌注液经门静脉插管持续灌注肝脏，速度25ml/min(蠕动泵恒流灌注)。同时迅速剪开大鼠肝下下腔静脉前壁，使灌注液流出；并剪开大鼠胸腔，哈巴狗阻断肝上下腔静脉。灌注时间约10min，直至肝下下腔静脉流出的液体中不含或含少量红细胞，肝脏呈米黄色。灌注过程中，可间断阻断流出道，以提高灌注压力使灌注均匀；
F.小心切除肝脏(从上到下，从左到右，勿损伤食道，避免污染)，尽量保持肝包膜完整，置入80mm消毒平皿内，以37℃预热的含钙的Ⅳ型胶原酶(浓度为0.05％)40ml经门静脉插管循环灌注消化肝脏(循环通路：门静脉--肝--肝下下腔静脉--蠕动泵--门静脉)，速度10ml/min，时间约6-8min，直至肝脏变软、肿胀，出现大理石样纹理，棉签轻压肝表面凹陷不易恢复，停止胶原酶灌注；见图3，为平板二维培养原代大鼠肝细胞后细胞聚球培养状态图。
G.把游离的肝脏置入另一消毒平皿，加入4℃预冷的肝细胞洗涤液，没过肝。移至超净工作台。小心撕破肝包膜，轻轻抖落肝细胞。肝细胞悬液经100目筛网过滤，移至15ml离心管，350rpm低速离心3min，移液枪吸去上清，4℃肝细胞洗涤液重悬。然后经200目筛网过滤，移至15ml离心管，350rpm低速离心3min，去上清，4℃肝细胞洗涤液重悬。重复洗涤离心2次后，肝细胞沉淀加入4℃Hyclone培养液重悬为10ml；
H.进行细胞计数和细胞活力检测：取待测细胞悬液0.1ml和0.4％台盼蓝0.1ml，混匀，静置2-3min。从计数板边缘轻轻加1-2滴已染色的细胞悬液，使之充满在计数板与盖玻片间的空隙；
I.于显微低倍镜下计4角4个大方内的活细胞(透明未着色)和死亡细胞(细胞核着色)的总数，然后用下式计算：
细胞浓度(细胞数/ml)＝4个大方格内活细胞数/4×104×稀释倍数
细胞活力＝活细胞数/(活细胞数+死亡细胞数)×100％
5)肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置的使用方法
A.制备上述的细胞聚球三维培养及药物筛选装置。
B.对细胞进行计数，通过微量注射泵用注射器将含肝细胞的培养基由接种入口1033自动化接种至肝细胞聚球三维培养装置的细胞培养室103的培养孔1034内，共12个细胞培养室103，接种数量为500cell/孔，接种细胞速度为5-10ul/min。
C.将肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置放入37℃，5％CO2的培养箱中静置贴壁，静置时间为2-3h，向细胞培养室103持续灌注液体培养基，灌注速度为20ul/12h，每个细胞培养室103内形成动态灌注细胞培养，2～3天后，得到聚集成球的细胞，见图4。
D.停止培养基室101的灌流，将配置好的已知浓度待测药物灌入药物室102，灌入流速为20ul/12h，通过分流通道1021形成浓度梯度的待测药物灌注作用于细胞，作用时间为48-72h。
E.然后测定细胞活率，并测定药物毒性。
综上，参见图3和图4，通过对平板二维培养原代大鼠肝细胞与采用本发明肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置接种大鼠原代肝细胞得到的细胞聚球三维培养状态图进行比较，得出以下结论：采用聚球三维培养，同时结合微流控灌流技术，给细胞提供了模拟体内血流的剪切力，更好地模拟了肝细胞在体内的生长状态。此外，药物浓度梯度的实施方法在一张芯片上进行，便能够方便快捷地实现药物高通量筛选，是对药物代谢进行评价的有效工具。
以上所述仅是本发明的部分实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (19)

1.一种肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，包括主体芯片，所述主体芯片表面凹陷形成至少一个工作室，所述工作室包括培养基室、药物室以及若干各自连通所述培养基室和药物室的细胞培养室；所述培养基室通过直连的培养基通道与各个所述细胞培养室连通；所述药物室通过用于形成浓度梯度的分流通道与各个所述细胞培养室连通；所述细胞培养室包括接种入口和废液排出通道，所述废液排出通道与接种入口共用通道；所述细胞培养室包括培养孔，所述培养孔为阵列式分布；该装置还包括用于控制所灌入的各种液体或细胞的流速的微量注射泵；
所述药物室对应设有三个分流通道，所述分流通道由一个或多个并列的药物通道从药物室的出口延伸形成，各个所述药物通道等宽等深，所述分流通道的末端均汇聚为单行通道，三个分流通道均匀地分布在药物室的一侧，且相邻的两个分流通道的轴线之间夹角为60°。
2.根据权利要求1所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，所述细胞培养室包括缓冲通道和液体入口，其中每一个缓冲通道的入口端同时与培养基通道和药物室其中一个分流通道的出口连通；所述细胞培养室的个数与分流通道的出口/入口个数相同，也与培养基通道的个数相同。
3.根据权利要求2所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，所述缓冲通道设为s型。
4.根据权利要求1所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，所述培养孔的直径为400um，培养孔之间的间距为400um，深度为500um。
5.根据权利要求1所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，所述培养基室和药物室的横截面设为圆形。
6.根据权利要求1所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，所述单行通道药物通道的宽度和深度分别相等；各个分流通道从药物室出口延伸出的药物通道个数比等于作用于细胞培养室的药物浓度比。
7.根据权利要求1所述的肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，所述药物通道的宽度为300um，深度为2mm。
8.根据权利要求1所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，各个所述工作室之间共享一个培养基室，各个所述工作室独立配置一个药物室。
9.根据权利要求8所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，所述工作室设有四个，且相对于所述培养基室两两对称设置。
10.根据权利要求1所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，所述培养基通道的宽度为300um，深度为2mm。
11.根据权利要求1所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，所述主体芯片由聚二甲硅氧烷制成。
12.根据权利要求1所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置，其特征在于，该装置还设有接合芯片，所述接合芯片用于与主体芯片盖合并提供液体入口。
13.肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置；
将目标细胞悬液接种至细胞培养室内；
将肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置放入培养箱中进行动态灌注培养以形成细胞聚球；
将已知浓度待测药物通过药物室形成待测药物的浓度梯度以灌注作用于目标细胞；
测定目标细胞的活率，并对药物毒性进行计算；
其中，所述肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置采用如权利要求1~12任意一项所述的肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置。
14.根据权利要求13所述的肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置的使用方法，其特征在于，所述动态灌注培养通过向细胞培养室持续灌注液体培养基来实现。
15.根据权利要求14所述的肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置的使用方法，其特征在于，所述液体培养基的灌注速度为20ul/12h。
16.根据权利要求13所述的肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置的使用方法，其特征在于，所述目标细胞的接种数量为500cell/孔。
17.根据权利要求13所述的肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置的使用方法，其特征在于，所述目标细胞以导管进行自动化接种，接种流速为5-10ul/min。
18.根据权利要求13所述的肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置的使用方法，其特征在于，所述动态灌注培养前，将肝细胞聚球三维培养及药物筛选装置放入培养箱中静置贴壁，静置时间为2-3h。
19.根据权利要求13所述的肝细胞聚球三维培养及药物筛选的装置的使用方法，其特征在于，所述待测药物的灌入流速为20ul/12h，作用时间为48-72h。
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