CN105713873A - 一种免疫细胞体外扩增培养的无血清培养基及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于免疫细胞的无血清培养基及其制备方法。通过实验证明：用本发明的免疫细胞无血清培养基培养的免疫细胞性状更稳定，细胞生长及增殖效果更好。且本发明的免疫细胞无血清培养基化学成分明确、具有批间差异小、质量稳定、可以保证培养基批次间的一致性，无动物源性和无人源性，安全性高，克服了添加人或动物血清带来的潜在风险，有助于研究各种免疫细胞的作用机制，推动国内细胞治疗的安全性的标准化，减少患者意外感染的风险，对免疫治疗的推广应用具有重要意义。

Description

一种免疫细胞体外扩增培养的无血清培养基及其应用
技术领域
本发明属于细胞生物学、分子生物学和医学领域的研究领域，涉及一种免疫细胞体外扩增培养的无血清培养基，更具体地说，涉及用于免疫细胞体外扩增培养的无血清培养基及其应用。
背景技术
细胞免疫治疗技术是一种疗效显著的全新的抗肿瘤治疗的方法。通过采集人体免疫细胞，经过体外富集、活化，并扩增，使其靶向性杀伤力增强，再输回到人体，达到治疗多种免疫疾病的目的。然而体外培养扩增，需要适合免疫细胞生长扩增的培养基，包括适宜的渗透压，为细胞提供生长所必需的营养物质，同时也要保护细胞免受代谢过程中产生的毒性物质的损害。
传统的细胞培养主要是在基础培养基中添加一定浓度的人或动物血清。但由于血清成分复杂，虽含有许多对细胞有利成分，也含有对细胞有害的成分，并且本身有携带细菌、病毒、蛋白传染性疾病的风险。人血清昂贵，不适宜大规模扩增。由于血清供体的不同，导致批次间存在很大差异。因此，血清在细胞临床大规模培养中有很多不利因素。
目前很多人研究无血清培养基，一些公司也已经开发了无血清培养基产品，比如LONZA公司开发的X-VIVO系列的无血清培养基等等，这些无血清培养基成分不明确，而且价格昂贵，大大增加了免疫细胞治疗的成本，不利于广泛推广。中国专利申请201110081988公开了一种人源性无血清培养基及其制备方法，其配方包括用治疗用人血清白蛋白溶液、人重组胰岛素溶液、人转铁蛋白溶液、人胆固醇溶液、人过氧化氢酶溶液、2-巯基乙醇溶液、抗坏血酸溶液、亚油酸溶液、乙醇胺溶液、人玻连蛋白溶液和L-谷胺酰胺溶液11种原料。添加人血白蛋白、人转铁蛋白等人源性组分的无血清培养基虽然对原料血浆进行了相关病原体的筛查，并在生产工艺中加入了去除和灭活细菌的措施，但在理论上仍存在传播某些已知和未知病原体的潜在风险。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于培养细胞的无血清培养基。
本发明的用于培养细胞的无血清培养基包括重组人血白蛋白、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、β-巯基乙醇、乙醇胺、胆固醇、亚油酸、油酸、硫酸铜、硫酸锌、柠檬酸铁和碳酸氢钠。
上述无血清培养基中，所述重组人血白蛋白、所述重组人胰岛素和所述重组人转铁蛋白均指能通过基因工程手段进行体外表达得到的，是能够重复人工制备的。避免了动物源性和人源性所带来的潜在风险。
上述无血清培养基中，
所述重组人血白蛋白、所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白、所述β-巯基乙醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸、所述油酸、所述硫酸铜、所述硫酸锌、所述柠檬酸铁和所述碳酸氢钠的质量比为0.1-10g：1-50mg：5-200mg：1-10mg：1-50mg：1-100mg：0.1-5mg：0.1-5mg：0.0001-0.01mg：0.1-5mg：0.1-10mg：3.024g。
上述无血清培养基中，
所述重组人血白蛋白、所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白、所述β-巯基乙醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸、所述油酸、所述硫酸铜、所述硫酸锌、所述柠檬酸铁和所述碳酸氢钠的质量比为4g：15mg：70mg：4mg：5mg：10mg：0.4mg：0.4mg：0.001mg：0.8mg：0.8mg：3.024g。
上述无血清培养基中，
所述培养基还包括基础培养基、重组人γ-干扰素和重组人白细胞介素-2；
所述基础培养基为细胞基础培养基；所述细胞基础培养基具体为IMDM基础培养基；
所述培养基由所述IMDM基础培养基、所述重组人血白蛋白、所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白、所述β-巯基乙醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸、所述油酸、所述硫酸铜、所述硫酸锌、所述柠檬酸铁、所述碳酸氢钠、所述重组人γ-干扰素和所述重组人白细胞介素-2组成。其中，所述重组人γ-干扰素和所述重组人白细胞介素-2是均在细胞培养的过程中加入。
上述无血清培养基中，所述培养基的pH为6.8-7.2。
上述无血清培养基中，
所述重组人血白蛋白在所述无血清培养基中的浓度为0.1-10g/L；
所述重组人胰岛素在所述无血清培养基中的浓度为1-50mg/L；
所述重组人转铁蛋白在所述无血清培养基中的浓度为5-200mg/L；
所述β-巯基乙醇在所述无血清培养基中的浓度为1-10mg/L；
所述乙醇胺在所述无血清培养基中的浓度为1-50mg/L；
所述胆固醇在所述无血清培养基中的浓度为1-100mg/L；
所述亚油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；
所述油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；
所述硫酸铜在所述无血清培养基中的浓度为0.0001-0.01mg/L；
所述硫酸锌在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；
所述柠檬酸铁在所述无血清培养基中的浓度为0.1-10mg/L；
所述碳酸氢钠在所述无血清培养基中的浓度为2.5-3.5g/L
所述重组人γ-干扰素在所述无血清培养基中的浓度为100-1000IU/mL；
所述重组人白细胞介素-2在所述无血清培养基中的浓度为100-500IU/mL。
上述无血清培养基中，
所述重组人血白蛋白在所述无血清培养基中的浓度为4g/L；
所述重组人胰岛素在所述无血清培养基中的浓度为15mg/L；
所述重组人转铁蛋白在所述无血清培养基中的浓度为70mg/L；
所述β-巯基乙醇在所述无血清培养基中的浓度为4mg/L；
所述乙醇胺在所述无血清培养基中的浓度为5mg/L；
所述胆固醇在所述无血清培养基中的浓度为10mg/L；
所述亚油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.4mg/L；
所述油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.4mg/L；
所述硫酸铜在所述无血清培养基中的浓度为0.001mg/L；
所述硫酸锌在所述无血清培养基中的浓度为0.8mg/L；
所述柠檬酸铁在所述无血清培养基中的浓度为0.8mg/L；
所述碳酸氢钠在所述无血清培养基中的浓度为3.024g/L；
所述重组人γ-干扰素在所述无血清培养基中的浓度为600IU/mL；
所述重组人白细胞介素-2在所述无血清培养基中的浓度为300IU/mL。
本发明的无血清培养基在具体的使用中，先将一袋一升装IMDM干粉(Gibco12200036)、重组人血白蛋白(Invitria公司，Cellastim)、重组人胰岛素(大肠杆菌重组表达，LIFE公司)、重组人转铁蛋白(酵母重组表达，Invitria公司)、β-巯基乙醇(Invitrogen，21985-023)、乙醇胺(Sigma,E0135)、胆固醇(Sigma,C1231)、亚油酸(Sigma,L1012)、油酸(Sigma,O1383)、硫酸铜(Sigma,C8027)、硫酸锌(Sigma,Z0251)、柠檬酸铁(Sigma,F3388)、碳酸氢钠(Sigma,S5761)和水混匀，得到免疫细胞无血清培养体系；再将待培养的免疫细胞加入上述免疫细胞无血清培养体系中，并在细胞培养的过程中，加入重组人γ-干扰素(山东泉港药业)和重组人白细胞介素-2(北京双鹭药业)。
本发明的另一个目的是提供上述培养基的新用途。
本发明提供了上述培养基在细胞体外扩增培养中的应用。
本发明还提供了上述培养基在提高细胞存活率和/或菌落数和/或杀瘤率中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种细胞的培养方法。
本发明提供的细胞的培养方法包括如下步骤：用上述培养基培养细胞。
上述培养基或上述应用或上述方法中，所述细胞为免疫细胞；所述免疫细胞具体为离体外周血单核细胞。
通过实验证明：用本发明的免疫细胞无血清培养基培养的免疫细胞性状更稳定，细胞生长及增殖效果更好。且本发明的免疫细胞无血清培养基化学成分明确、具有批间差异小、质量稳定、可以保证培养基批次间的一致性，无动物源性和无人源性，安全性高，克服了添加人或动物血清带来的潜在风险，有助于研究各种免疫细胞的作用机制，推动国内细胞治疗的安全性的标准化，减少患者意外感染的风险，对免疫治疗的推广应用具有重要意义。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、免疫细胞无血清培养基的配制
将一袋一升装IMDM干粉(Gibco12200036)、重组人血白蛋白(Invitria公司，Cellastim)、重组人胰岛素(大肠杆菌重组表达，LIFE公司)、重组人转铁蛋白(酵母重组表达，Invitria公司)、β-巯基乙醇(Invitrogen，21985-023)、乙醇胺(Sigma,E0135)、胆固醇(Sigma,C1231)、亚油酸(Sigma,L1012)、油酸(Sigma,O1383)、硫酸铜(Sigma,C8027)、硫酸锌(Sigma,Z0251)、柠檬酸铁(Sigma,F3388)、碳酸氢钠(Sigma,S5761)和超纯水混匀，得到免疫细胞无血清培养体系。搅拌溶解，调节PH值至7.0，并用0.22μm滤膜过滤除菌。4℃保存。
在细胞培养的过程中再向上述免疫细胞无血清培养体系中加入重组人γ-干扰素(山东泉港药业)和重组人白细胞介素-2(北京双鹭药业)，得到免疫细胞无血清培养基。
其中，各个溶质组分及其在免疫细胞无血清培养基中的浓度分别为：重组人血白蛋白4g/L；重组人胰岛素15mg/L；重组人转铁蛋白70mg/L；β-巯基乙醇4mg/L；乙醇胺5mg/L；胆固醇10mg/L；亚油酸0.4mg/L；油酸0.4mg/L；硫酸铜0.001mg/L；硫酸锌0.8mg/L；柠檬酸铁0.8mg/L；碳酸氢钠3.024g/L；重组人γ-干扰素(INF-r)600IU/mL；重组人白细胞介素-2(IL-2)300IU/mL。
实施例2、免疫细胞无血清培养基在培养免疫细胞中的应用
一、外周血单个核细胞的分离和纯化
用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞，具体步骤如下：
1、将外周血(市医院)转移到50ml离心管中，500g离心5min，用移液管将上层血浆移入新的离心管。
2、用生理盐水稀释血细胞，用移液管混合均匀后缓慢注入到已加有淋巴分离液的离心管中，2000r/min离心20分钟。此时离心管中由上到下分为四层。第一层：血浆或细胞组织均浆液层；第二层：乳白色淋巴细胞层；第三层：透明细胞分选液层；第四层：红细胞层。
3、用移液管吸出第一层液体弃去，吸取第二层细胞于新的离心管中，采用普通的IMDM培养基(GIBCO)1500r/min离心10分钟，洗涤两次，即得到外周血单个核细胞(PBMC)悬液。
4、末次离心后，弃上清，加入IMDM培养基重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。
细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出细胞存活率为98.9％。
二、免疫细胞的体外培养
1、实验分组
(1)无血清组
用实施例1中配制的免疫细胞无血清培养基配成浓度为1×106个/mL外周血单个核细胞(PBMC)悬液。
(2)有血清组
将胎牛血清(GIBCO，10099141)与实施例1中配制的免疫细胞无血清培养基混匀，得到含有血清的免疫细胞培养基，并用含有血清的免疫细胞培养基配成浓度为1×106个/mL外周血单个核细胞(PBMC)悬液。
2、免疫细胞的培养
培养步骤1中的无血清培养基配制成的细胞悬液和添加血清后配成成的细胞悬液，得到培养后的无血清培养基配制成的细胞悬液和添加血清后配成成的细胞悬液。具体的培养方法如下：
按每孔2mL细胞悬液加入6孔板中，每组3个平行孔。第一天加入1000IU/mL的rhINF-r，放于37℃、5％CO2二氧化碳培养箱中培养，24小时后加入600IU/mLrhIL-2。以后每隔7天，进行半量换液，使用实施例1配置的免疫细胞无血清培养基换液和加入600U/mLIL-2，计数至1×106个/mL细胞浓度。共培养21天，得到培养后的无血清培养基配制成的细胞悬液和添加血清后配制成的细胞悬液。培养期间观察细胞生长或死亡情况，并在培养过程中及时观察了解细胞生长情况，换液前，在倒置相差显微镜下观察培养基颜色、细胞形态、细胞纯度。
三、培养后细胞的检测
1、微生物检测
根据《中国药典》(2010年版附录Ⅻ)对培养后的无血清培养基配制成的细胞悬液和添加血清后配制成的细胞悬液进行微生物检测(细菌、支原体和细菌内毒素)。结果表明：培养后的无血清培养基配制成的细胞悬液和添加血清后配制成的细胞悬液均无菌生长、无支原体污染和无细菌内毒素。
上述无菌检查方法如下：随机取硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基、选择性培养基、营养肉汤培养基、营养琼脂培养基和改良马丁琼脂培养基各10份，接种0.5ml细胞悬液，5份置35℃培养，5份置25℃培养14天，每日观察有无菌生长。
上述支原体检查方法如下：将细胞培养上清液接种于指示细胞(无污染的Vero细胞)培养液中，采用二苯甲酰胺荧光燃料进行染色，荧光显微镜下观察仅只是细胞的细胞核呈现黄绿色荧光，表明无支原体生长。
上述细菌内毒素检查方法按照凝胶法进行检查。
2、细胞存活率
取一滴细胞悬液和一滴台盼蓝燃料混匀，滴至血细胞计数板的计数室中，静置2min，显微镜下观察计数，做10个平行试验。细胞存活率透亮而不着色的为活细胞，染成蓝色的为死细胞。计算细胞存活率。细胞存活率计算公式为活细胞数目/(活细胞数目+死细胞数目)×100％。
结果表明：台盼蓝染色检测无血清组的细胞存活率为96.9％，有血清组的细胞存活率为95.3％，说明无血清组和有血清组的存活率相当。
3、细胞生长状态
对培养后的无血清培养基配制成的细胞悬液和添加血清后配制成的细胞悬液中的细胞形态进行观察。
结果表明为：培养后的无血清培养基配制成的细胞悬液和添加血清后配制成的细胞悬液中的细胞形状为多边形，形态饱满，生长良好。
4、细胞毒性试验
分别检测培养后的无血清培养基配制成的细胞悬液和添加血清后配制成的细胞悬液中的细胞杀瘤率。具体步骤如下：
(1)以用免疫细胞无血清培养基培养15天的免疫细胞为效应细胞，用实施例1中免疫细胞无血清培养基洗涤1次，配制成1×106个/mL细胞悬液。
(2)以K562细胞为靶细胞，用实施例1中配制的免疫细胞无血清培养基洗涤1次，配制成密度为1×105个/mL悬液。
(3)将效应细胞和靶细胞按照个数比分别为5:1、10:1和20:1共同接种到96孔板中，37℃、5％二氧化碳培养24小时。并用MTT法测吸光度值，计算杀瘤率。杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/(靶细胞孔-空白孔)。
将上述步骤(1)中的免疫细胞无血清培养基换成含有血清的免疫细胞培养基，其他步骤不变，计算杀瘤率。
结果表明：本发明的免疫细胞无血清培养基培养出的免疫细胞的杀瘤率平均为78.7％，含有血清的免疫细胞培养基培养出的免疫细胞的的杀瘤率平均为69.9％。说明本发明的免疫细胞无血清培养基培养出的免疫细胞的杀瘤率明显提高。

Claims (10)

1.一种用于培养细胞的无血清培养基，所述培养基包括重组人血白蛋白、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、β-巯基乙醇、乙醇胺、胆固醇、亚油酸、油酸、硫酸铜、硫酸锌、柠檬酸铁和碳酸氢钠。
2.根据权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于：
所述重组人血白蛋白、所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白、所述β-巯基乙醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸、所述油酸、所述硫酸铜、所述硫酸锌、所述柠檬酸铁和所述碳酸氢钠的质量比为0.1-10g：1-50mg：5-200mg：1-10mg：1-50mg：1-100mg：0.1-5mg：0.1-5mg：0.0001-0.01mg：0.1-5mg：0.1-10mg：3.024g。
3.根据权利要求1或2所述的无血清培养基，其特征在于：
所述重组人血白蛋白、所述重组人胰岛素、所述重组人转铁蛋白、所述β-巯基乙醇、所述乙醇胺、所述胆固醇、所述亚油酸、所述油酸、所述硫酸铜、所述硫酸锌、所述柠檬酸铁和所述碳酸氢钠的质量比为4g：15mg：70mg：4mg：5mg：10mg：0.4mg：0.4mg：0.001mg：0.8mg：0.8mg：3.024g。
4.根据权利要求1-3中任一所述的无血清培养基，其特征在于：
所述培养基还包括基础培养基、重组人γ-干扰素和重组人白细胞介素-2；
所述重组人γ-干扰素和所述重组人白细胞介素-2均在细胞培养的过程中加入。
5.根据权利要求1-4中任一所述的无血清培养基，其特征在于：
所述培养基的pH为6.8-7.2；
所述基础培养基为细胞基础培养基；所述细胞基础培养基具体为IMDM基础培养基。
6.根据权利要求1-5中任一所述的无血清培养基，其特征在于：
所述重组人血白蛋白在所述无血清培养基中的浓度为0.1-10g/L；
所述重组人胰岛素在所述无血清培养基中的浓度为1-50mg/L；
所述重组人转铁蛋白在所述无血清培养基中的浓度为5-200mg/L；
所述β-巯基乙醇在所述无血清培养基中的浓度为1-10mg/L；
所述乙醇胺在所述无血清培养基中的浓度为1-50mg/L；
所述胆固醇在所述无血清培养基中的浓度为1-100mg/L；
所述亚油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；
所述油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；
所述硫酸铜在所述无血清培养基中的浓度为0.0001-0.01mg/L；
所述硫酸锌在所述无血清培养基中的浓度为0.1-5mg/L；
所述柠檬酸铁在所述无血清培养基中的浓度为0.1-10mg/L；
所述碳酸氢钠在所述无血清培养基中的浓度为2.5-3.5g/L；
所述重组人γ-干扰素在所述无血清培养基中的浓度为100-1000IU/mL；
所述重组人白细胞介素-2在所述无血清培养基中的浓度为100-500IU/mL。
7.根据权利要求1-6中任一所述的无血清培养基，其特征在于：
所述重组人血白蛋白在所述无血清培养基中的浓度为4g/L；
所述重组人胰岛素在所述无血清培养基中的浓度为15mg/L；
所述重组人转铁蛋白在所述无血清培养基中的浓度为70mg/L；
所述β-巯基乙醇在所述无血清培养基中的浓度为4mg/L；
所述乙醇胺在所述无血清培养基中的浓度为5mg/L；
所述胆固醇在所述无血清培养基中的浓度为10mg/L；
所述亚油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.4mg/L；
所述油酸在所述无血清培养基中的浓度为0.4mg/L；
所述硫酸铜在所述无血清培养基中的浓度为0.001mg/L；
所述硫酸锌在所述无血清培养基中的浓度为0.8mg/L；
所述柠檬酸铁在所述无血清培养基中的浓度为0.8mg/L；
所述碳酸氢钠在所述无血清培养基中的浓度为3.024g/L；
所述重组人γ-干扰素在所述无血清培养基中的浓度为600IU/mL；
所述重组人白细胞介素-2在所述无血清培养基中的浓度为300IU/mL。
8.权利要求1-7中任一所述的培养基在细胞体外扩增培养中的应用；
或权利要求1-7中任一所述的培养基在提高细胞存活率和/或菌落数和/或杀瘤率中的应用。
9.一种细胞的培养方法，包括如下步骤：用权利要求1-7中任一所述的培养基培养细胞。
10.根据权利要求1-7中任一所述的培养基或权利要求8所述的应用或权利要求9所述的方法，其特征在于：所述细胞为免疫细胞。
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