CN104830765A - 高效胎牛血清替代物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高效胎牛血清替代物，由重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、半乳糖、脂质、微量元素化合物以及维生素组成，所述重组人血白蛋白、所述重组人转铁蛋白、所述半乳糖的重量比为2:50:(15～25)，所述脂质为胆固醇、亚油酸和亚麻酸的混合物。本发明提供的胎牛血清替代物不但避免了传播传染病的风险以及异种蛋白导致过敏症的发生，而且人淋巴细胞体外培养的存活率和增值倍数分别增加至96％和28，提高了淋巴细胞的供应量，降低了培养成本，有利于大规模使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种血清替代物，具体涉及一种高效胎牛血清替代物。
背景技术
培养基为细胞的生长提供了基本的环境和营养因子，包括渗透压、pH值、无机盐、氨基酸、功能性的蛋白、维生素等等。传统的培养基为了提供这些营养因子，大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，比较常见的有新生牛血清、胎牛血清、人AB血清、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、人转铁蛋白等。细胞免疫治疗离不开在体外大量培养淋巴细胞，淋巴细胞的培养又需要大量的培养基，使用动物血清的优点是有足够的量供应，价格便宜，但是使用动物血清的缺点是有潜在传播传染病的风险，以及由于异种蛋白导致过敏症的发生。
CN102352343A(公开日2012年02月15日)公开了一种淋巴细胞培养基，包括基础培养基以及血清替代物，所述血清替代物包括重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、脂质、微量元素化合物以及维生素，用以解决现有淋巴细胞培养基大多采用动物或人的血清及其组分作为添加物，增加了传播疾病风险的问题。
虽然上述现有技术公开了一些胎牛血清替代物，能够满足一定的需要，但这些仍存在一定的缺陷：比如体外培养的淋巴细胞的存活率只有92％左右，增值倍数只有22左右，明显低于对照组，这会影响到上述血清替代物的广泛使用。
因此，对于体外培养淋巴细胞的胎牛血清替代物存在进一步的改进和优化需求，这也是该技术领域内的研究热点和重点之一，更是本发明得以完成的动力和出发点所在。
发明内容
为了克服现有技术存在的胎牛血清替代物使淋巴细胞体外培养的存活率和增值倍数偏低的技术问题，本发明人在进行了大量的深入研究之后，从而完成了本发明。
本发明通过以下技术方案实现，具体而言，涉及一种高效胎牛血清替代物，由重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、半乳糖、脂质、微量元素化合物以及维生素组成，所述重组人血白蛋白、所述重组人转铁蛋白、所述半乳糖的重量比为2:50:(15～25)，所述脂质为胆固醇、亚油酸和亚麻酸的混合物。
所述重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、半乳糖的重量比为2:50:19。
优选的，所述微量元素化合物为硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜和硫酸锌的混合物。
优选的，所述维生素为维生素E。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明提供的胎牛血清替代物不但避免了传播传染病的风险以及异种蛋白导致过敏症的发生，而且人淋巴细胞体外培养的存活率和增值倍数分别增加至96％和28，提高了淋巴细胞的供应量，降低了培养成本，有利于大规模使用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、淋巴细胞培养基的配置
在每1L RPMI 1640培养基中加入重组人血白蛋白2mg，重组人转铁蛋白50mg，半乳糖19mg，胆固醇2mg，亚油酸0.2mg，亚麻酸0.2mg，维生素E 1mg，Tween 802mg，硝酸铁0.1mg，亚硒酸钠0.01mg，硫酸铜0.001mg，硫酸锌0.5mg，乙醇胺1.5mg，抗坏血酸磷酸酯2.5mg，庆大霉素10IU，搅拌使充分溶解，用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节pH值为6.8之间，0.1um滤膜过滤除菌，分装，临用前加入谷氨酰胺300mg。
实施例2、淋巴细胞培养基的配置
在每1L RPMI 1640培养基中加入重组人血白蛋白2mg，重组人转铁蛋白50mg，半乳糖15mg，胆固醇2mg，亚油酸0.2mg，亚麻酸0.2mg，维生素E 1mg，Tween 802mg，硝酸铁0.1mg，亚硒酸钠0.01mg，硫酸铜0.001mg，硫酸锌0.5mg，乙醇胺1.5mg，抗坏血酸磷酸酯2.5mg，庆大霉素10IU，搅拌使充分溶解，用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节pH值为7.0之间，0.1um滤膜过滤除菌，分装，临用前加入谷氨酰胺300mg。
实施例3、淋巴细胞培养基的配置
在每1L RPMI 1640培养基中加入重组人血白蛋白2mg，重组人转铁蛋白50mg，半乳糖25mg，胆固醇2mg，亚油酸0.2mg，亚麻酸0.2mg，维生素E 1mg，Tween 802mg，硝酸铁0.1mg，亚硒酸钠0.01mg，硫酸铜0.001mg，硫酸锌0.5mg，乙醇胺1.5mg，抗坏血酸磷酸酯2.5mg，庆大霉素10IU，搅拌使充分溶解，用0.1mol/L盐酸和0.1mol/L氢氧化钠调节pH值为7.2之间，0.1um滤膜过滤除菌，分装，临用前加入谷氨酰胺300mg。
淋巴细胞增殖实验和存活率检测
使用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，或者复苏冻存的单个核细胞。加入含5％热灭活胎牛血清(FBS)生理盐水300g离心10分钟，去除上清。计数细胞，用上述培养基配成1*106/ml细胞悬液；按每孔加入2ml上述培养基接入6孔板，每组3个复孔，第1天加入1000IU/ml IFN-r，培养24小时后加入50ng/ml CD3单抗(OKT3)，300IU/ml IL-2，100IU/ml IL-1a，以后每3天计数，补加含300IU/mlIL-2培养液至1*106/ml；培养15天，台酚蓝染色计算细胞增殖倍数和存活率，上述三个实施例的存活率均在96％左右，增值倍数均在28左右，与CN102352343A记载的存活率92％和增值倍数22相比，本发明的存活率和增值倍数的增幅明显，降低了培养成本，有利于提高淋巴细胞的供应量。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (4)
1.一种高效胎牛血清替代物，其特征在于，由重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、半乳糖、脂质、微量元素化合物以及维生素组成，所述重组人血白蛋白、所述重组人转铁蛋白、所述半乳糖的重量比为2:50:(15～25)，所述脂质为胆固醇、亚油酸和亚麻酸的混合物。
2.如权利要求1所述的一种高效胎牛血清替代物，其特征在于，所述重组人血白蛋白、重组人转铁蛋白、半乳糖的重量比为2:50:19。
3.如权利要求1所述的一种高效胎牛血清替代物，其特征在于，所述微量元素化合物为硝酸铁、亚硒酸钠、硫酸铜和硫酸锌的混合物。
4.如权利要求1所述的一种高效胎牛血清替代物，其特征在于，所述维生素为维生素E。
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