CN106834225A - 一种免疫细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明属于体外培养免疫细胞领域，具体涉及一种免疫细胞培养基。本发明培养基包括以下成分：基础培养基，壳聚糖，精氨酸，谷氨酰胺，维生素A，维生素C，嵌段式聚醚F‑68，硫酸锌，γ‑干扰素，胰岛素，柠檬酸铁，氯化铁，EDTA‑2Na和酚红钠。本发明免疫培养基，不仅克服了现有技术中的培养基中添加的人或动物血清及组分受限供体的相异性导致质量每批间存在差异的缺陷等问题，而且显著提高免疫细胞的增殖速度、细胞存活率和杀瘤率。本发明免疫细胞培养基成分明确、简单、成本低，符合免疫细胞生长所需的条件，便于免疫细胞大规模生产。

Description

一种免疫细胞培养基
技术领域
本发明属于体外培养免疫细胞领域，具体涉及一种免疫细胞培养基。
背景技术
肿瘤过继免疫治疗(adoptive immunotherapy，ACI)是指通过向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的。它包括非特异性激活和特异性激活的效应细胞，前者是采用非特异性刺激因子(IL2、干扰素)刺激前体效应细胞，使其活化为具有抗肿瘤活性的效应细胞，如LAK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced kill cells，CIK)等；特异性激活的效应细胞是指采用肿瘤抗原作刺激物所诱导的抗肿瘤效应细胞，如树突状细胞(DC)，细胞毒T淋巴细胞(CD8+细胞)等。
无血清培养基是指不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基，可以应用于培养免疫细胞，例如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞、B细胞、NK细胞等)、树突状细胞(也称DC细胞)、单核/巨噬细胞等。
关于细胞培养体系，现有技术中除了常规的培养板、培养皿、培养瓶等二维的细胞培养体系，现在已研发出三维培养体系，例如目前市售的高密度细胞培养桶，是一种既可以适用于贴壁细胞，又可以适用于悬浮细胞的三维培养体系，可以快速地培养大量细胞，且可以进行为期半年以上的长期细胞培养，不需要经常更换耗材，与传统的培养板、培养皿和培养瓶相比，更方便、成本更低，因此受到本领域研发人员的广泛关注。
然而，现有技术中的无血清培养基大多适用于中等规模的细胞培养体系，一般来说无法适用于大规模的、高密度的细胞培养；另一方面，现有的无血清培养基仅适用于培养板、培养皿、培养瓶等二维的细胞培养体系，无法适用于高密度细胞培养桶这样的三维培养体系。
中国专利申请(CN106047807A)公布了一种适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基，其包括基础培养基、人白蛋白12-16g/L、转铁蛋白20-25mg/L、人重组胰岛素24-30mg/L，L-谷氨酰胺8-10g/L、HEPES 5-7g/L以及白介素-23x105-8x105IU/L。
因此，开发专用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的培养基是目前免疫细胞生产所迫切需要的。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种免疫细胞培养基。本发明免疫细胞培养基组分简单、生产成本低，极大地提高了免疫细胞的增殖速度和存活率，不仅适用于免疫细胞中小规模的生产，同时也适用于免疫细胞的高密度培养体系。
本发明通过以下技术方案实现：
一种免疫细胞培养基，包括以下成分及其浓度：基础培养基6.5-13g/L，壳聚糖1.5-3g/L，精氨酸395-455mg/L，谷氨酰胺17-21g/L，维生素A 30-45mg/L，维生素C 15-20mg/L，嵌段式聚醚F-6840-50mg/L，硫酸锌1-2mg/L，γ-干扰素250-330IU/mL，胰岛素25-30μg/L，柠檬酸铁4.5-7mg/L，氯化铁0.15-1.5mg/L，EDTA-2Na 3.15-4.5mg/L和酚红钠6.35-6.5mg/L。
优选地，所述免疫细胞培养基由以下成分及浓度组成：基础培养基干粉8.5g/L，壳聚糖2.75g/L，精氨酸415mg/L，谷氨酰胺19.3g/L，维生素A 37.4mg/L，维生素C 18.65mg/L，嵌段式聚醚F-6843.45mg/L，硫酸锌1.75mg/L，γ-干扰素289IU/mL，胰岛素26.75μg/L，柠檬酸铁6.43mg/L，氯化铁1.32mg/L，EDTA-2Na3.68mg/L和酚红钠6.45mg/L。
优选地，所述培养基中基础细胞培养基为DMEM、Ham F12、PRMI1640中任一种。
本发明免疫细胞培养基成分是经过科学方法筛选得到的，壳寡糖(分子式：C12H24N2O9，CAS号：148411-57-8)是自然界中唯一的碱性多糖，具有多种生理活性，如抗菌，抗病毒，抗肿瘤以及增强免疫力等。精氨酸在一定浓度范围内对免疫细胞对单核吞噬细胞、T淋巴细胞(除杀伤亚群外)、B淋巴细胞及NK细胞均有直接或间接的有益作用。淋巴细胞增殖分化、中性粒细胞和巨噬细胞分泌过氧化物和吞噬异物都需要利用谷氨酰胺，培养液内谷氨酰胺缺乏或利用率降低会严重阻碍免疫细胞增殖和免疫功能的正常发挥，最终导致细胞凋亡。谷氨酰胺在淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞内具有高利用率，在细胞生长过程中起到非常重要发的调节作用。维生素A、维生素C和硫酸锌对免疫细胞生长均具有促进作用。柠檬酸铁，氯化铁，EDTA-2Na组合可替代转铁蛋白。嵌段式聚醚F-68(CAS号：9003-11-6)用于防剪切保护。
优选地，所述免疫细胞培养基制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取相应浓度的基础培养基干粉、壳聚糖、精氨酸、维生素A、维生素C、嵌段式聚醚F-68、硫酸锌、柠檬酸铁、氯化铁、EDTA-2Na和酚红钠，溶于体积为800mL，温度为20-30℃超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液I；
(2)向上述溶液I中加入相应浓度的谷氨酰胺、γ-干扰素和胰岛素，搅拌均匀，加入温度为20-30℃超纯水至体积为1L，得溶液II；
(3)用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调溶液II的pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。
本发明免疫细胞培养基与现有技术相比，具有以下技术优势：
(1)本发明免疫培养基，不仅克服了现有技术中的培养基中添加的人或动物血清及组分受限供体的相异性导致质量每批间存在差异的缺陷等问题，而且显著提高免疫细胞的增殖速度和细胞存活率；
(2)本发明免疫细胞培养基显著提高了免疫细胞的杀瘤率；
(3)本发明免疫细胞培养基成分明确、简单、成本低，符合免疫细胞生长所需的条件，便于免疫细胞大规模生产。
附图说明
图1：不同培养基中淋巴细胞杀瘤率对比柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1一种免疫细胞培养基
一种免疫细胞培养基由以下成分及浓度组成：PRMI1640干粉8.5g/L，壳聚糖2.75g/L，精氨酸415mg/L，谷氨酰胺19.3g/L，维生素A 37.4mg/L，维生素C18.65mg/L，嵌段式聚醚F-6843.45mg/L，硫酸锌1.75mg/L，γ-干扰素289IU/mL，胰岛素26.75μg/L，柠檬酸铁6.43mg/L，氯化铁1.32mg/L，EDTA-2Na 3.68mg/L，酚红钠6.45mg/L。
一种免疫细胞培养基制备方法，包括以下步骤：
(1)准确称取相应浓度的基础培养基干粉、壳聚糖、精氨酸、维生素A、维生素C、嵌段式聚醚F-68、硫酸锌、柠檬酸铁、氯化铁、EDTA-2Na和酚红钠，溶于体积为800mL，温度为20-30℃超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液I；
(2)向上述溶液I中加入相应浓度的谷氨酰胺、γ-干扰素和胰岛素，搅拌均匀，加入温度为20-30℃超纯水至体积为1L，得溶液II；
(3)用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调溶液II的pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。
实施例2一种免疫细胞培养基
一种免疫细胞培养基由以下成分及浓度组成：基础培养基干粉6.5g/L，壳聚糖1.5g/L，精氨酸395mg/L，谷氨酰胺17g/L，维生素A 30mg/L，维生素C 15mg/L，嵌段式聚醚F-6840mg/L，硫酸锌1mg/L，γ-干扰素250IU/mL，胰岛素25μg/L，柠檬酸铁4.5mg/L，氯化铁0.15mg/L，EDTA-2Na 3.15mg/L，酚红钠6.35mg/L。
制备方法与实施例1类似。
实施例3一种免疫细胞培养基
一种免疫细胞培养基基础培养基干粉13g/L，壳聚糖3g/L，精氨酸455mg/L，谷氨酰胺21g/L，维生素A45mg/L，维生素C 20mg/L，嵌段式聚醚F-6850mg/L，硫酸锌2mg/L，γ-干扰素330IU/mL，胰岛素30μg/L，柠檬酸铁7mg/L，氯化铁1.5mg/L，EDTA-2Na 4.5mg/L，酚红钠6.5mg/L。
制备方法与实施例1类似。
对比例1一种免疫细胞培养基
一种免疫细胞培养基由以下成分及浓度组成：基础培养基干粉8.5g/L，葡萄糖2.75g/L，精氨酸415mg/L，谷氨酰胺19.3g/L，维生素A 37.4mg/L，维生素C18.65mg/L，嵌段式聚醚F-6843.45mg/L，硫酸锌1.75mg/L，γ-干扰素289IU/mL，胰岛素26.75μg/L，柠檬酸铁6.43mg/L，氯化铁1.32mg/L，EDTA-2Na 3.68mg/L，酚红钠6.45mg/L。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1相比区别在于，将壳聚糖替换为葡萄糖。
对比例2一种免疫细胞培养基
一种免疫细胞培养基由以下成分及浓度组成：基础培养基干粉8.5g/L，壳聚糖2.75g/L，精氨酸480mg/L，谷氨酰胺19.3g/L，维生素A 37.4mg/L，维生素C18.65mg/L，嵌段式聚醚F-6843.45mg/L，硫酸锌1.75mg/L，γ-干扰素289IU/mL，胰岛素26.75μg/L，柠檬酸铁6.43mg/L，氯化铁1.32mg/L，EDTA-2Na 3.68mg/L，酚红钠6.45mg/L。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1相比区别在于，加入精氨酸浓度提升至480mg/L。
对比例3一种免疫细胞培养基
一种免疫细胞培养基由以下成分及浓度组成：基础培养基干粉8.5g/L，壳聚糖2.75g/L，精氨酸415mg/L，谷氨酰胺28g/L，维生素A 37.4mg/L，维生素C18.65mg/L，嵌段式聚醚F-6843.45mg/L，硫酸锌1.75mg/L，γ-干扰素289IU/mL，胰岛素26.75μg/L，柠檬酸铁6.43mg/L，氯化铁1.32mg/L，EDTA-2Na 3.68mg/L，酚红钠6.45mg/L。
制备方法与实施例1类似。
与实施例1相比区别在于，加入谷氨酰胺浓度提升至28mg/L。
试验例1培养基质量测试
测试培养基：实施例1-3制备得到的培养基以及对比例1-3制备得到的培养基
测试内容：
(1)无菌检测
使用平板法检测，取羊血琼脂平板1块和沙保弱琼脂平板1块，平衡至室温。取上述测试培养基为样品经4000rpm离心15min后从样品管底部吸取样品，每块平板100μL，用接种针划线。将平板放入37℃培养箱中，培养48h后观察结果为阴性，样品合格。
(2)内毒素检测
使用凝胶法检测，取上述测试培养基为样品经稀释后，同阴性对照、阳性对照、供试品阳性对照分别加入经无菌检查用水复融后的鲎试剂中，每种平行两管。结果为阴性对照管为阴性，阳性对照管为阳性，供试品阳性对照管为阳性且样品管为阴性，样品合格。
(3)支原体检测为PCR法检测
将上述测试培养基为样品进行沸水浴10min后经12000rpm离心3min后使用，采用25μL体系对待测样品、阳性对照、阴性对照进行PCR扩增；扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像仪上观察检测结果。检测结果为阴性，样品合格。
试验例2对T细胞增殖的加速作用
使用T淋巴细胞分离液密度梯度离心分离外周血单个核细胞，或者复苏冻存的单个核细胞。加入含5％热灭活胎牛血清(FBS)生理盐水300g离心10分钟，去除上清液。计数细胞，用相应的培养基配成1x106/mL细胞悬液，培养基使用前加入谷氨酰胺300mg。分为6组，各组所用培养基如表1所示。按每孔加入2mL培养基接入6孔板，每组3个复孔。第1天加入1000IU/mL IFN-r，培养24小时后加入50ng/mL CD3单抗(OKT3)300IU/mL IL-2，100IU/mLIL-1a。以后每3天计数，补加含300IU/mLIL-2培养液至1x106/mL。培养15天，台酚蓝染色计算细胞增殖倍数和存活率，试验结果如表1所示。
由表1可知，实施例1-3培养基中T淋巴细胞增殖速度明显快于对比例1-3培养基中T淋巴细胞增殖速度，其中实施例1培养基中T淋巴细胞增殖速度是对比例1培养基中细胞增殖速度的2.5倍；实施例1-3培养基中T淋巴细胞的存活率高于对比例1-3培养基中T淋巴细胞存活率。其中实施例1培养基中T淋巴细胞的存活率是对比例1培养基中T淋巴细胞存活率的1.4倍。
表1 T淋巴细胞增殖倍数和存活率
培养基 增殖倍数 存活率(％)
实施例1 85±6.34 98±1.38
实施例2 65±8.26 96±2.04
实施例3 77±10.18 96±1.26
对比例1 34±5.44 69±1.40
对比例2 40±6.28 71±0.88
对比例3 43±4.52 60±1.02
试验例3淋巴细胞杀瘤率测定
试验例2中分离培养至15天的免疫细胞为效应细胞，分别用实施例1-3及对比例1-3中配制的的培养基洗涤1次，分别配制成1×106个/mL细胞悬液。以K562细胞为靶细胞，分别用实施例1-3及对比例1-3中配制的培养基洗涤1次，分别配制成密度为1×105个/mL悬液。按效、靶细胞比10:1接种到96孔板中，37℃、5％二氧化碳培养24小时。使用CCK-8试剂盒测吸光度值，计算杀瘤率。
杀瘤率％＝1-(试验孔-效应细胞孔)/(靶细胞孔-空白孔)，结果见图1所示，
从图1中看出，采用本发明的实施例培养基培养出的免疫细胞的杀瘤率明显高于对比例。

Claims (4)

1.一种免疫细胞培养基，其特征在于，包括以下成分及其浓度：基础培养基6.5-13g/L，壳聚糖1.5-3g/L，精氨酸395-455mg/L，谷氨酰胺17-21g/L，维生素A 30-45mg/L，维生素C15-20mg/L，嵌段式聚醚F-68 40-50mg/L，硫酸锌1-2mg/L，γ-干扰素250-330IU/mL，胰岛素25-30μg/L，柠檬酸铁4.5-7mg/L，氯化铁0.15-1.5mg/L，EDTA-2Na 3.15-4.5mg/L和酚红钠6.35-6.5mg/L。
2.根据权利要求1所述免疫细胞培养基，其特征在于，由以下成分及浓度组成：基础培养基干粉8.5g/L，壳聚糖2.75g/L，精氨酸415mg/L，谷氨酰胺19.3g/L，维生素A 37.4mg/L，维生素C 18.65mg/L，嵌段式聚醚F-68 43.45mg/L，硫酸锌1.75mg/L，γ-干扰素289IU/mL，胰岛素26.75μg/L，柠檬酸铁6.43mg/L，氯化铁1.32mg/L，EDTA-2Na 3.68mg/L和酚红钠6.45mg/L。
3.根据权利要求1或2所述免疫细胞培养基，其特征在于，所述培养基中基础细胞培养基为DMEM、Ham F12、PRMI1640中任一种。
4.根据权利要求1-3任一所述免疫细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准确称取相应浓度的基础培养基干粉、壳聚糖、精氨酸、维生素A、维生素C、嵌段式聚醚F-68、硫酸锌、柠檬酸铁、氯化铁、EDTA-2Na和酚红钠，溶于体积为800mL，温度为20-30℃超纯水中，搅拌至溶解完全，得溶液I；
(2)向上述溶液I中加入相应浓度的谷氨酰胺、γ-干扰素和胰岛素，搅拌均匀，加入温度为20-30℃超纯水至体积为1L，得溶液II；
(3)用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调溶液II的pH至7.2，得溶液III；
(4)将溶液III用0.22μm滤膜正压过滤除菌，即得。
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