CN111345282A - 一种细胞冻存液及冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及冻存方法，细胞冻存液包括甲基纤维素、麦芽糖、DMSO、人血白蛋白、右旋糖酐、L‑丝氨酸、i‑肌醇和氯化钠注射液，本发明的细胞冻存液中，DMSO可以防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤；甲基纤维素作为稳定剂和增黏剂，降低冻存过程形中游离水形成冰晶对细胞的伤害；麦芽糖具有良好的抗结晶性，防止冰晶对细胞的损伤。通过上述原料的组合，可以最大程度上防止冰晶对细胞的损耗，并且尽可能地降低了DMSO的含量，因而对PBMC或干细胞或T淋巴细胞等细胞具有较好的保护能力，存活率高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种细胞冻存液及冻存方法。
背景技术
目前，在细胞冷冻保存领域中，为保护细胞免受冷冻损伤，人们广泛采用的是在冻存液中添加冷冻保护剂(CPA)。而二甲基亚砜(DMSO)是细胞冷冻保存中最常用的冷冻保护剂，但过高浓度的DMSO对细胞存在一定的毒性，会引起细胞内蛋白变性，因而不适的DMSO浓度选择会对细胞的保存有着很大影响。现有冻存液冻存的细胞复苏后活细胞得率较少，冻存液对细胞损伤很大，会直接导致细胞死亡。冻存过程中降温方法对细胞存活影响很大，现有技术没有严格控制，致使降温过程细胞死亡率提升。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种细胞存活率高的细胞冻存液及冻存方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种细胞冻存液，包括如下原料：
余量为氯化钠注射液。
本发明的细胞冻存液中，DMSO在深低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中可以防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤；甲基纤维素作为稳定剂和增黏剂，降低冻存过程形中游离水形成冰晶对细胞的伤害；麦芽糖具有良好的抗结晶性，防止冰晶对细胞的损伤；人血白蛋白作为冻存稳定剂，有利于在细胞复苏过程中调节渗透压，防止冻存和复苏时因为渗透压剧烈变化增加细胞死亡率；右旋糖酐可以维持渗透压和pH值，提供适宜细胞生存的理化环境；丝氨酸可以提高细胞活性，增加抗冻存伤害能力，维持冻存过程细胞状态良好；i-肌醇是细胞的生长因子，维持冻存细胞终状态良好。
本发明通过上述原料的组合，可以最大程度上防止冰晶对细胞的损耗，并且尽可能地降低了DMSO的含量，因而对PBMC或干细胞或T淋巴细胞等细胞具有较好的保护能力，存活率高。
其中，所述氯化钠注射液的质量浓度为0.9％。
一种细胞冻存方法，包括如下步骤：
(1)取指数生长期的细胞进行离心，弃上清，所述指数生长期的细胞为PBMC或干细胞或T淋巴细胞；
(2)用预冻存培养基重悬，然后进行离心；
(3)重复步骤(2)1-2次，然后用预冻存培养基重悬，调整细胞密度；
(4)在37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育30-60min；
(5)进行离心，弃上清；
(6)用细胞冻存液进行重悬，然后进行离心，弃上清；
(7)用细胞冻存液进行重悬，调整细胞密度，转移至冻存管；
(8)将冻存管放入程序降温仪中进行梯度降温；
(9)降温完成后，将冻存管转入液氮中进行保存。
其中，所述步骤(1)中的离心条件为23-25℃，15-20min，400-600g。
其中，所述步骤(2)中的离心条件为23-25℃，20-30min，300-400g。
其中，所述步骤(3)中，调整细胞密度为0.5-1×107个细胞/ml。
其中，所述步骤(5)中的离心条件为4-6℃，10-20min，400-600g。
其中，所述步骤(6)的离心条件为4-6℃，10-20min，200-300g。
其中，所述步骤(7)中调整细胞密度为6-8×106个细胞/ml，每支冻存管装入1mL细胞重悬液。
其中，所述步骤(1)和步骤(2)中的预冻存培养基包括如下原料：20-40wt％DMEM培养基，10-30wt％RPMI 1640培养基，0.11-0.14mg/L维生素C，0.03-0.09mg/L三磷酸腺苷，4-7mg/L L-半胱氨酸和0.06-0.08mg/L硫酸铁。
本发明中使用预冻存培养基可降低细胞代谢活性，防止DMOS在冻存过程中对细胞的毒性伤害，减少细胞死亡数量，保护表面受体脱落，有效的维持细胞放入液时终状态的完好程度，有利于细胞复苏后的持续增殖，防止复苏后短时增殖、但很快凋亡的现象。
其中，所述梯度降温的具体操作为：
①降温至4℃；
②以1-3C/mS的降温速率降温至-4℃；
③以6-8C/mC的降温速率降温至-10℃；
④以0.5-0.7C/mC的降温速率降温至-20℃；
⑤以4-6C/mC的降温速率降温至-40℃；
⑥以0.8-1C/mC的降温速率降温至-50℃；
⑦以0.6-0.7C/mC的降温速率降温至-60℃；
⑧以0.3-0.5C/mC的降温速率降温至-80℃。
本发明严格控制降温过程，减少细胞在降温过程中的死亡，增加细胞复苏后活细胞得率。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的细胞冻存液中，DMSO在深低温(零下200度)保存细胞时冻存过程中可以防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤；甲基纤维素作为稳定剂和增黏剂，降低冻存过程形中游离水形成冰晶对细胞的伤害；麦芽糖具有良好的抗结晶性，防止冰晶对细胞的损伤；人血白蛋白作为冻存稳定剂，有利于在细胞复苏过程中调节渗透压，防止冻存和复苏时因为渗透压剧烈变化增加细胞死亡率；右旋糖酐可以维持渗透压和pH值，提供适宜细胞生存的理化环境；丝氨酸可以提高细胞活性，增加抗冻存伤害能力，维持冻存过程细胞状态良好；i-肌醇是细胞的生长因子，维持冻存细胞终状态良好。通过上述原料的组合，可以最大程度上防止冰晶对细胞的损耗，并且尽可能地降低了DMSO的含量，因而对PBMC或干细胞或T淋巴细胞等细胞具有较好的保护能力，存活率高。
2、本发明严格控制降温过程，减少细胞在降温过程中的死亡，增加细胞复苏后活细胞得率。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
一种细胞冻存液，包括如下原料：
余量为氯化钠注射液。
其中，所述氯化钠注射液的质量浓度为0.9％。
一种细胞冻存方法，包括如下步骤：
(1)取指数生长期的细胞进行离心，弃上清，所述指数生长期的细胞为PBMC或干细胞或T淋巴细胞；
(2)用预冻存培养基重悬，然后进行离心；
(3)重复步骤(2)2次，然后用预冻存培养基重悬，调整细胞密度；
(4)在37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育45min；
(5)进行离心，弃上清；
(6)用细胞冻存液进行重悬，然后进行离心，弃上清；
(7)用细胞冻存液进行重悬，调整细胞密度，转移至冻存管；
(8)将冻存管放入程序降温仪中进行梯度降温；
(9)降温完成后，将冻存管转入液氮中进行保存。
其中，所述步骤(1)中的离心条件为24℃，17min，500g。
其中，所述步骤(2)中的离心条件为24℃，25min，350g。
其中，所述步骤(3)中，调整细胞密度为0.7×107个细胞/ml。
其中，所述步骤(5)中的离心条件为5℃，15min，500g。
其中，所述步骤(6)的离心条件为5℃，15min，250g。
其中，所述步骤(7)中调整细胞密度为7×106个细胞/ml，每支冻存管装入1mL细胞重悬液。
其中，所述步骤(1)和步骤(2)中的预冻存培养基包括如下原料：30wt％DMEM培养基，20wt％RPMI 1640培养基，0.12mg/L维生素C，0.06mg/L三磷酸腺苷，5.5mg/L L-半胱氨酸和0.07mg/L硫酸铁。
其中，所述梯度降温的具体操作为：
①降温至4℃；
②以2C/mS的降温速率降温至-4℃；
③以7C/mC的降温速率降温至-10℃；
④以0.6C/mC的降温速率降温至-20℃；
⑤以5C/mC的降温速率降温至-40℃；
⑥以0.9C/mC的降温速率降温至-50℃；
⑦以0.65C/mC的降温速率降温至-60℃；
⑧以0.4C/mC的降温速率降温至-80℃。
用实施例1的方法方别冻存PBMC、干细胞和T淋巴细胞，并分别测算其冻存前、冻存3天后、冻存10天后、冻存30天后、冻存2个月后、冻存6个月后、冻存12个月后的细胞存活率，得到如下表的试验结果：
由上表可以看出，本发明细胞冻存12个月后复苏活率，PBMC为74.03±5.50％，干细胞为72.47±4.72％，T淋巴细胞为74.68±5.81％，对各种细胞均有较好的存活率表现。
实施例2
一种细胞冻存液，包括如下原料：
余量为氯化钠注射液。
其中，所述氯化钠注射液的质量浓度为0.9％。
一种细胞冻存方法，包括如下步骤：
(1)取指数生长期的细胞进行离心，弃上清，所述指数生长期的细胞为PBMC或干细胞或T淋巴细胞；
(2)用预冻存培养基重悬，然后进行离心；
(3)重复步骤(2)1次，然后用预冻存培养基重悬，调整细胞密度；
(4)在37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育30min；
(5)进行离心，弃上清；
(6)用细胞冻存液进行重悬，然后进行离心，弃上清；
(7)用细胞冻存液进行重悬，调整细胞密度，转移至冻存管；
(8)将冻存管放入程序降温仪中进行梯度降温；
(9)降温完成后，将冻存管转入液氮中进行保存。
其中，所述步骤(1)中的离心条件为23℃，15min，400g。
其中，所述步骤(2)中的离心条件为23℃，20min，300g。
其中，所述步骤(3)中，调整细胞密度为0.5-1×107个细胞/ml。
其中，所述步骤(5)中的离心条件为4-6℃，10-20min，400-600g。
其中，所述步骤(6)的离心条件为4-6℃，10-20min，200-300g。
其中，所述步骤(7)中调整细胞密度为6-8×106个细胞/ml，每支冻存管装入1mL细胞重悬液。
其中，所述步骤(1)和步骤(2)中的预冻存培养基包括如下原料：20wt％DMEM培养基，10wt％RPMI 1640培养基，0.11mg/L维生素C，0.03mg/L三磷酸腺苷，4mg/L L-半胱氨酸和0.06mg/L硫酸铁。
其中，所述梯度降温的具体操作为：
①降温至4℃；
②以1C/mS的降温速率降温至-4℃；
③以6C/mC的降温速率降温至-10℃；
④以0.5C/mC的降温速率降温至-20℃；
⑤以4C/mC的降温速率降温至-40℃；
⑥以0.8C/mC的降温速率降温至-50℃；
⑦以0.6C/mC的降温速率降温至-60℃；
⑧以0.3C/mC的降温速率降温至-80℃。
实施例3
一种细胞冻存液，包括如下原料：
余量为氯化钠注射液。
其中，所述氯化钠注射液的质量浓度为0.9％。
一种细胞冻存方法，包括如下步骤：
(1)取指数生长期的细胞进行离心，弃上清，所述指数生长期的细胞为PBMC或干细胞或T淋巴细胞；
(2)用预冻存培养基重悬，然后进行离心；
(3)重复步骤(2)2次，然后用预冻存培养基重悬，调整细胞密度；
(4)在37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育60min；
(5)进行离心，弃上清；
(6)用细胞冻存液进行重悬，然后进行离心，弃上清；
(7)用细胞冻存液进行重悬，调整细胞密度，转移至冻存管；
(8)将冻存管放入程序降温仪中进行梯度降温；
(9)降温完成后，将冻存管转入液氮中进行保存。
其中，所述步骤(1)中的离心条件为25℃，20min，600g。
其中，所述步骤(2)中的离心条件为25℃，30min，400g。
其中，所述步骤(3)中，调整细胞密度为0.5-1×107个细胞/ml。
其中，所述步骤(5)中的离心条件为6℃，20min，600g。
其中，所述步骤(6)的离心条件为6℃，20min，300g。
其中，所述步骤(7)中调整细胞密度为8×106个细胞/ml，每支冻存管装入1mL细胞重悬液。
其中，所述步骤(1)和步骤(2)中的预冻存培养基包括如下原料：40wt％DMEM培养基，30wt％RPMI 1640培养基，0.14mg/L维生素C，0.09mg/L三磷酸腺苷，7mg/L L-半胱氨酸和0.08mg/L硫酸铁。
其中，所述梯度降温的具体操作为：
①降温至4℃；
②以3C/mS的降温速率降温至-4℃；
③以8C/mC的降温速率降温至-10℃；
④以0.7C/mC的降温速率降温至-20℃；
⑤以6C/mC的降温速率降温至-40℃；
⑥以1C/mC的降温速率降温至-50℃；
⑦以0.7C/mC的降温速率降温至-60℃；
⑧以0.5C/mC的降温速率降温至-80℃。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种细胞冻存液，其特征在于：包括如下原料：
2.根据权利要求1所述的一种细胞冻存液，其特征在于：所述氯化钠注射液的质量浓度为0.9％。
3.一种细胞冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取指数生长期的细胞进行离心，弃上清，所述指数生长期的细胞为PBMC或干细胞或T淋巴细胞；
(2)用预冻存培养基重悬，然后进行离心；
(3)重复步骤(2)1-2次，然后用预冻存培养基重悬，调整细胞密度；
(4)在37℃，5％CO2，饱和湿度条件下孵育30-60min；
(5)进行离心，弃上清；
(6)用权利要求1或2所述的细胞冻存液进行重悬，然后进行离心，弃上清；
(7)用权利要求1或2所述的细胞冻存液进行重悬，调整细胞密度，转移至冻存管；
(8)将冻存管放入程序降温仪中进行梯度降温；
(9)降温完成后，将冻存管转入液氮中进行保存。
4.根据权利要求3所述的一种细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤(1)中的离心条件为23-25℃，15-20min，400-600g。
5.根据权利要求3所述的一种细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤(2)中的离心条件为23-25℃，20-30min，300-400g。
6.根据权利要求3所述的一种细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤(3)中，调整细胞密度为0.5-1×107个细胞/ml。
7.根据权利要求3所述的一种细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤(5)中的离心条件为4-6℃，10-20min，400-600g。
8.根据权利要求3所述的一种细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤(6)的离心条件为4-6℃，10-20min，200-300g。
9.根据权利要求3所述的一种细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤(1)和步骤(2)中的预冻存培养基包括如下原料：20-40wt％DMEM培养基，10-30wt％RPMI 1640培养基，0.11-0.14mg/L维生素C，0.03-0.09mg/L三磷酸腺苷，4-7mg/L L-半胱氨酸和0.06-0.08mg/L硫酸铁。
10.根据权利要求3所述的一种细胞冻存方法，其特征在于：所述梯度降温的具体操作为：
①降温至4℃；
②以1-3C/mS的降温速率降温至-4℃；
③以6-8C/mC的降温速率降温至-10℃；
④以0.5-0.7C/mC的降温速率降温至-20℃；
⑤以4-6C/mC的降温速率降温至-40℃；
⑥以0.8-1C/mC的降温速率降温至-50℃；
⑦以0.6-0.7C/mC的降温速率降温至-60℃；
⑧以0.3-0.5C/mC的降温速率降温至-80℃。
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